專利名稱：一種檢測農產品中2,4-二氯苯氧乙酸的壓電免疫傳感方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測方法，具體是一種檢測農產品中2，4-二氯苯氧乙酸的壓電 免疫傳感方法。
背景技術：
2， 4-D是一種應用廣泛的植物生長調節劑，其測定方法有萃取_光度法、液相色譜 法、液相色譜質譜法、薄層色譜法、衍生氣相色譜法等。但這些傳統方法都有一定的局限性， 如樣品前處理復雜、操作繁瑣費時、測定周期長、設備昂貴、靈敏度低等。免疫傳感器是利 用電化學免疫傳感器的高靈敏度、簡便、快速等特點，結合生物識別系統(抗原抗體特異性 結合)而形成的一種自動化分析檢測系統，具有操作簡單、快速、靈敏度高等優點，在2，4-D 的測定中引起高度重視，因此，研究一種高靈敏度、簡便、快速的2，4-D免疫傳感測定新方 法有非常重要的意義。
發明內容
本發明要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種農產品中2，4-D含量 的檢測方法。本發明能較好的滿足2， 4-D測定的需要，且方法簡單，快速，靈敏度高，為檢測 2，4-D提供了一種新的途徑。 為了達到上述目的，本發明提供的檢測農產品中2，4-D含量的方法包括以下步 驟2，4-D與BSA的偶聯；在金電極表面制備無試劑型2，4-D壓電免疫傳感器；制備納米金
標記的羊抗鼠IgG抗體；制作標準工作曲線；樣品檢測。 本發明解決其技術問題所采用的技術方案還可以進一步完善。所述2，4-D與BSA 的偶聯可以由以下步驟制備稱取3. 315g 2，4-D(0.015mmo1)溶解在0. 5mL的無菌DMF中， 再稱取NHS 4. 028g(0. 035,1) 、EDC 6. 71g (0. 035,1)同時加入2， 4-D的無菌DMF中，室 溫下攪拌反應5小時(130rpm， 28°C )。再稱取0. 024gBSA溶于2. 4mL pH 11的硫酸緩沖液 中，然后將含有2， 4-D的無菌DMF緩慢加入到BSA的硫酸緩沖液中，約15min加完，在室溫 下慢速攪拌反應4小時，4t:過夜。將反應液放入透析袋，在500mL 10%的DMF液中4t:透 析二次，4h/次；再在500mL的0. 01M的PBS中透析四次。制得2，4-D與BSA的偶聯物。將 2， 4-D-BSA保存在4°C的PBS中，備用。 所述無試劑型2，4-D壓電免疫傳感器可以由以下步驟制備(l)石英晶振表面 的半胱胺鹽酸鹽溶液自組裝向洗凈的石英晶振內加入10. OmM半胱胺鹽酸鹽溶液，并于 25°C自組裝2. 5小時，石英晶振表面用純水清洗三次，即在晶振表面獲得一層致密均勻的 半胱胺自組裝單層膜；(2)修飾后的石英晶振表面抗原固定化用2. 5% (V/V)戊二醛溶液 50 ii L活化組裝后金電極表面的羧基；經PBS和去離子水清洗后，吹干。將自組裝了半胱胺 自組裝單層膜的金電極電極表面滴加30 ii L濃度為10. 0 ii g *mL—1的BSA_2，4_D溶液于晶振 表面，置于37t:恒溫水浴箱中溫育1小時，用PBS和去離子水清洗，晾干；再在電極表面上滴加40 ii Ll% BSA(pH 7. 4)并置于37。C恒溫水浴箱中溫育1小時，以封閉電極表面多余的 蛋白結合位點，防止免疫測定過程中的非特異性吸附產生誤差，經PBS和去離子水清洗后， 吹干，即獲得無試劑型2，4-D電化學免疫傳感器。 所述的制作標準工作曲線方法為取不同濃度的2，4_D標準溶液和2，4_D抗體 (單抗)混合液，取常規量滴到已制備好的無試劑型2，4-D壓電免疫傳感器，37t:環境下反 應1小時；接著加入納米金標記抗體(二抗)，37t:環境下反應1小時，對免疫傳感器表面 的頻率變化連續檢測直到穩態，獲得穩定的數值。改變2， 4-D標準溶液的濃度，按上述步驟 測定一系列不同濃度的2，4-D標準溶液，用免疫傳感器表面的頻率變化值與2，4-D濃度繪 制標準工作曲線。 所述的樣品測定方法為取處理好的樣品溶液和2， 4-D抗體(單抗)混合液，取常 規量滴到已制備好的無試劑型2，4-D壓電免疫傳感器，37t:環境下反應l小時；接著加入納 米金標記抗體(二抗)，37t:環境下反應1小時，對免疫傳感器表面的頻率變化連續檢測直 到穩態，獲得穩定數值。將頻率變化值與繪制好的標準工作曲線對照獲得農產品樣品溶液 中2，4-D的數值。 2，4-D壓電免疫傳感器的檢測原理本發明是基于利用壓電免疫傳感器具有高靈 敏度、簡便、快速、可靠等特點，結合生物識別系統(抗原抗體特異性結合)而形成的一種 自動化分析檢測系統，實現農產品中2，4-D含量的檢測。本發明利用自組裝技術和靜電吸 附作用，將2，4-D-BSA全抗原固定在通過由自組裝半胱胺和靜電吸附納米金修飾的石英晶 振金電極表面，解決了抗原固定的難題，然后在電極上滴加anti-2， 4-D和2， 4-D的混合物， 由于2，4-D和2，4-D-BSA都能與anti-2， 4-D發生高特異性的免疫反應，如果樣品中2，4_D 含量高，由于大部分2，4-D抗體已經與樣品中2，4-D反應了，結合到金電極表面的2，4-D抗 體就少，這樣納米金標記的二抗結合上去的量也就少。2，4-D和2，4-D-BSA競爭與anti-2， 4-D反應后，用納米金標記的羊抗鼠IgG將信號進一步放大，然后用石英晶體分析儀及聯機 計算機測定。本發明實際上其放大倍數與樣品中2，4-D含量成反比，即樣品中2，4-D越少， 連接到金電極上的抗體反而越多，納米金標記的二抗上去的也越多，質量放大越明顯。
本發明效果是在2，4-D濃度為13. 3ng/mL-666. 7ng/mL范圍內成線性關系，檢測 下限為13. Ong/ml，能滿足農產品中2，4-D測定的需要。
圖1是本發明的農產品實際樣品2，4-D含量的檢測圖。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明做進一步描述。
—、試劑與儀器 半胱胺(Cys， ACROS公司)、BSA_2， 4_D偶聯抗原(BSA_2， 4_D)由植物激素與生長 發育湖南省重點實驗室合成、配制；戊二醛為Fluka公司產品；鼠抗2， 4-D抗體委托北京博 奧森生物技術有限公司制備；羊抗鼠IgG抗體(G-Anti-MsIgG)和牛血清白蛋白(BSA)從 北京鼎國生物技術有限公司購買；氯金酸和檸檬酸鈉購于上海化學試劑公司；不同pH值的 PBS溶液用0. 01M Na2HP04和KH2P04配制;Piranha試劑為按體積比3 : 7配制的H202_H2S04混合液；其它試劑均為分析純；實驗中所用的水為二次蒸餾水。 9腿z， AT-切型雙面鍍金石英晶振(QCM)購于北京晨星無線電設備廠，使用前用 0型橡膠圈和塑料片將一側封閉而另一側粘有一個總體積為300 L的檢測池；聯機的壓 電分析儀(QCA922)購于美國的普林斯頓應用研究所；CSS501型恒溫箱購于重慶實驗裝備 廠；TCL-16A型臺式高速冷凍離心機為長沙平凡儀器儀表有限公司產品；掃描電子顯微鏡 (SEM，JSM 6700F)為日本JEOLLtd.公司產品。
二、實施方法 這種檢測農產品中2，4_D的方法，主要包括以下步驟來實現
1. 2，4-D與BSA的偶聯:稱取3. 315g 2， 4_D (0. 015mmol)溶解在0. 5mL的無菌DMF 中，再稱取NHS 4. 028g(0. 035mmol) 、 EDC 6. 71g (0. 035mmol)同時加入2， 4_D的無菌DMF 中，室溫下攪拌反應5小時(130rpm， 28°C )。再稱取0. 024gBSA溶于2. 4ml pHll的硫酸緩 沖液中，然后將含有2， 4-D的無菌DMF緩慢加入到BSA的硫酸緩沖液中，約15min加完，在 室溫下慢速攪拌反應4小時，4t:過夜。將反應液放入透析袋，在500M110X的DMF液中4°C 透析二次，4h/次；再在500mL的0. 01M的PBS中透析四次。制得2，4_D與BSA的偶聯物。 將2， 4-D-BSA保存在4°C的PBS中，備用。 2.無試劑型2，4-D壓電免疫傳感器的制備向洗凈的石英晶振內加入10. OmM半 胱胺鹽酸鹽溶液，并于25°C自組裝2. 5小時，石英晶振表面用純水清洗三次，即在晶振表 面獲得一層致密均勻的半胱胺自組裝單層膜；用2.5% (V/V)戊二醛溶液50iiL活化組裝 后金電極表面的羧基。經PBS和去離子水清洗后，吹干。在電極表面滴加30iiL濃度為 10. 0 ii g mL—1的BSA-2， 4-D溶液于晶振表面，置于37。C恒溫水浴箱中溫育1小時，用PBS 和去離子水清洗，晾干。再在電極表面上滴加40 ii L 1% BSA(pH 7. 4)并置于37。C恒溫水 浴箱中溫育1小時，以封閉電極表面多余的蛋白結合位點，防止免疫測定過程中的非特異 性吸附產生誤差，經PBS和去離子水清洗后，吹干，即獲得無試劑型2， 4-D壓電免疫傳感器。
3.制備納米金標記的羊抗鼠IgG抗體。 4.標準工作曲線的制作取不同濃度的2，4-D標準溶液和2，4-D抗體(單抗) 混合液，取常規量滴到已制備好的無試劑型2， 4-D壓電免疫傳感器，37t:環境下反應1小 時；接著加入納米金標記抗體(二抗)，37t:環境下反應1小時，對免疫傳感器表面的頻率 變化連續檢測直到穩態，獲得穩定的數值。改變2， 4-D標準溶液的濃度，按上述步驟測定 一系列不同濃度的2，4-D標準溶液，用免疫傳感器表面的頻率變化值與2，4-D濃度繪制 標準工作曲線在2，4-D濃度為13. 3ng/mL-666. 7ng/mL范圍內成線性關系，校正曲線是y =-279. 1+255. 5x，相關系數R為0. 9957，檢測下限為13. Ong/mL。 5.樣品檢測取處理好的樣品溶液和2，4_D抗體(單抗)混合液，取常規量滴到 已制備好的無試劑型2，4-D壓電免疫傳感器，37t:環境下反應l小時；接著加入納米金標記 抗體(二抗)，37t:環境下反應1小時，對免疫傳感器表面的頻率變化連續檢測直到穩態，獲 得穩定數值。將頻率變化與繪制好的標準工作曲線對照獲得農產品樣品溶液中2，4-D的數 值。 本方法檢測實例利用該傳感器對用生長調節劑處理過的棉花幼葉中2，4-D殘留 量進行了檢測取棉花幼葉鮮樣1. 5000g，于1. 5mL離心管中冰浴研磨，加入600 y L 100% 的甲醇，混勻后浸提過夜，4800g離心10min，取上清液于一新離心管中，剩余殘渣用200 y L100%的甲醇浸提2h， 4800g離心10min，取上清，合并兩次上清液，移入一新5mL離心管中。 用3000 ii L超純水稀釋提取液，過Waters S印-pak C18柱，用200iiL 20X甲醇和250iiL 30%甲醇分別洗脫后，用300iiL 100X甲醇洗脫并收集IAA，用于后續的檢測和分析。接 著，將收集好的2 ， 4-D用100 ii L 100 %甲醇溶解后，取20 ii L進行HPLC檢測，同時，取20 y L 滴加入PBS溶液中，用2，4-D電化學免疫傳感器檢測，其檢測數據表明(圖l)，本方法與 HPLC測定的結果基本一致。
權利要求
一種檢測農產品中2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的壓電免疫傳感方法，其特征在于包括以下步驟(1)2，4-D與BSA的偶聯；(2)在石英晶振表面制備無試劑型2，4-D壓電免疫傳感器；(3)制備納米金標記的羊抗鼠IgG抗體；(4)制作標準工作曲線；(5)樣品檢測。
2. 根據權利要求1所述的檢測農產品中2，4-D的方法，其特征包括 根據權利要求1所述的2，4-D與牛血清白蛋白(BSA)的偶聯，其特征在于稱取3. 315g2，4-D溶解在0. 5mL的無菌二甲基甲酰胺(DMF)中，再稱取N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS) 4. 028g、二氯乙烷(EDC) 6. 71g同時加入2，4_D的無菌DMF中，室溫下攪拌反應5小時 (130rpm，28。C )。再稱取0. 024g BSA溶于2. 4mLpH 11的硫酸緩沖液中，然后將含有2，4_D 的無菌DMF緩慢加入到BSA的硫酸緩沖液中，在室溫下慢速攪拌反應4小時，4t:過夜。將 反應液放入透析袋，在500mL 10%的DMF液中4。C透析二次(4h/次)；再在500mL的0. OIM 的PBS中透析4次。制得2， 4-D與BSA的偶聯物。將2， 4-D-BSA保存在4°C的PBS中，備 用。根據權利要求1所述的無試劑型2，4-D壓電免疫傳感器由以下步驟制備向洗凈的石 英晶振內加入10. OmM半胱胺鹽酸鹽溶液，并于25°C自組裝2. 5小時，石英晶振表面用純水 清洗三次，即在晶振表面獲得一層致密均勻的半胱胺自組裝單層膜；用2. 5% (V/V)戊二醛 溶液50iiL活化組裝后金電極表面的羧基。經PBS和去離子水清洗后，吹干。在電極表面滴 力口 30 ii L濃度為10. 0 ii g. mL—1的BSA_2， 4_D溶液于晶振表面，置于37"恒溫水浴箱中溫育 1小時，用PBS和去離子水清洗，晾干。再在電極表面上滴加40ii L 1% BSA(pH 7. 4)并置 于37t:恒溫水浴箱中溫育1小時，經PBS和去離子水清洗后，吹干，即獲得無試劑型2， 4-D 壓電免疫傳感器。根據權利要求1所述標準工作曲線的制作，其特征在于取不同濃度的2， 4-D標準溶液 和2，4-D抗體(單抗)混合液，取常規量滴到已制備好的無試劑型2，4-D壓電免疫傳感器， 37t:環境下反應1小時；接著加入納米金標記抗體(二抗)，37t:環境下反應1小時，實驗 過程中傳感器的頻率變化由石英晶體分析儀及聯機計算機實時記錄。對免疫傳感器表面的 頻率變化連續檢測直到穩態，獲得穩定的數值。改變2， 4-D標準溶液的濃度，按上述步驟測 定一系列不同濃度的2， 4-D標準溶液，用免疫傳感器表面的頻率變化值與2， 4-D濃度繪制 標準工作曲線。根據權利要求1所述的檢測農產品中2，4-D的方法，其特征在于取處理好的樣品溶液 和2，4-D抗體(單抗)混合液，取常規量滴到已制備好的無試劑型2，4-D壓電免疫傳感器， 37t:環境下反應1小時；接著加入納米金標記抗體(二抗)，37t:環境下反應1小時，對免 疫傳感器表面的頻率變化連續檢測直到穩態，獲得穩定數值。將頻率變化與繪制好的標準 工作曲線對照獲得農產品樣品溶液中2，4-D的數值。
全文摘要
本發明涉及了一種檢測農產品中2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)含量的壓電免疫傳感方法，主要包括以下步驟來實現1)2，4-D與BSA的偶聯；2)電極修飾與免疫傳感器的制備；3)制備納米金標記的羊抗鼠IgG抗體；4)標準曲線的制備；5)樣品檢測。本發明有益的效果是在檢測中，利用納米金標記的羊抗鼠IgG將信號放大，提高檢測靈敏度，從而實現2，4-D的高靈敏定量測定，該方法在2，4-D濃度為13.3ng·mL-1～666ng·mL-1范圍內時成線性關系，檢測下限為13ng·mL-1。同時，該方法具有方法簡便，結果可靠，成本較低等優點。
文檔編號G01N27/414GK101782574SQ20101010103
公開日2010年7月21日 申請日期2010年1月26日 優先權日2010年1月26日
發明者劉清, 王若仲, 肖浪濤, 藺萬煌 申請人:湖南農業大學