專利名稱：河豚魚成分熒光定量pcr檢測試劑及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及熒光定量PCR檢測試劑，具體涉及河豚魚成分熒光定量PCR檢測試劑及其制備方法和應用。
背景技術：
河豚魚肉質細嫩，味道鮮美，營養豐富，享有“魚中之王”的美譽，備受美食家的青睞，在日本和韓國也很受喜愛。但是河豚魚內臟、卵巢、血液、魚皮、魚頭等部位含有劇毒，如加工處理不當或誤食常會引起中毒，甚至死亡。一般人由于沒有相關的專業知識，有時也會因為不能識別河豚魚而誤食引起中毒死亡，尤其是對于各種已經加工成魚片、魚糜等產品，很難靠人的感觀來識別的；近年來，有人故意和無意把河豚魚下腳料加工成魚片或魚糜，混在其他魚產品中，銷售倒市場上，甚至是國外，引起了食物中毒事件，這一定程度上影響了我國的魚糜制品的信譽和銷售。為防止魚糜中摻雜河豚魚成分引起中毒事件，日本檢疫部門專門建立了河豚魚成分的檢測方法，其建立的方法是基因序列分析的方法，該方法操作復雜，耗時費力，對分析人員的檢測技術要求也比較高。我國尚無河豚魚成分檢測方法的研究報道。
目前對河豚魚的檢測方法，尚沒有相關成分檢測的報道，多集中于河豚魚毒素的檢測。人們對河豚毒素的檢測方法的研究，相繼出現了小鼠生物實驗法、熒光法、ELISA方法、氣相色譜-質譜聯用、毛細管等速電泳、紫外分光光度法、高效液相色譜法、薄層色譜法等檢測方法。對物種成分的檢測研究，目前主要集中在牛羊源成分和轉基因成分等的檢測研究。物種成分的檢測方法主要包括生物學鑒定、ELISA法、近紅外光譜法和聚合酶鏈式反應(PCR)技術等。生物學鑒定和近紅外光譜法，費時間，工作量非常大，檢測靈敏度不高。由于飼料樣品中所含的骨膠等物質會與抗體發生交叉反應從而干擾ELISA結果，使得ELISA法的檢測靈敏度低，所以只能用來作為粗篩的方法。PCR是用于檢測混入放入其他物種成分，具有較好的敏感性和特異性，但需要進行DNA電泳等PCR后處理，接觸有毒試劑溴化乙錠，易發生交叉污染而造成假陽性結果。
熒光定量PCR(Real-time fluorescent PCR)是近幾年發展起來的PCR技術與熒光檢測相結合的方法，其原理是使用能特異標記核苷酸序列的熒光物質，利用熒光信號的積累實時監測整個PCR過程，具有檢測周期短、特異性與靈敏度高以及無需PCR后處理等優點。以TaqMan水解探針為例，探針一端標記熒光基團，另一端標記淬滅基團，通常狀態下，熒光基團與淬滅基團發生熒光共振能量轉移現象，熒光基團的熒光被淬滅基團吸收。當PCR進入退火階段時，熒光探針特異的結合在兩條引物之間，在延伸階段被聚合酶的5′端外切酶活性切開。熒光基團與淬滅基團分離，儀器檢測出熒光。由于熒光信號伴隨著PCR模板的擴增而增長，因此可以根據熒光信號是否增長來確定模板是否擴增。熒光PCR儀在反應過程中連續的檢測熒光信號的變化，當熒光信號增強到某一閾值時，此時的循環次數(Ct)就被記錄下來。該Ct值與反應體系中起始模板量的對數值有嚴格的線性關系。因此，除了可定性確定反應體系中是否含有目標DNA之外，還可以對反應體系中的模板DNA進行相對定量。熒光定量PCR檢測方法由于操作簡便，快速靈敏，對環境污染小等優點而被廣泛的應用于各種轉基因、牛羊源成分的檢測中。
因此，研究建立特異、敏感、可對低含量的河豚魚成分進行準確檢測的方法，在檢疫方面具有重要的實際應用價值。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種對混入魚糜制品中的河豚魚成分具有特異性高、敏感性強，快速檢測的熒光定量PCR檢測試劑。
本發明還提供了該檢測試劑的制備方法和應用。
本發明系選擇河豚魚線粒體細胞色素B基因的保守片段為靶目標，應用primerExpress 3.0軟件，設計合成引物和探針；將設計的多對引物和探針進行最佳配對篩選實驗，得到最合適的引物和探針。
本發明所述的河豚魚成分熒光定量PCR檢測試劑包含一對特異性引物和一條特異性熒光探針，擴增目標片段長度為102bp，引物和探針序列為 引物Takifugu TF5′-TCTTCACGAA ACAGGCTCCA AC-3′ Takifugu TR5′-GTGAAGCCCA GGAGGTCTTT GTA-3′ 探針5′-FAM-CGCAGACAAA ATCCCATTCC ACCCATA-TAMRA-3′， 該檢測試劑還包括PCR檢測試劑的常用緩沖液。
本發明所述的河豚魚成分熒光定量PCR檢測試劑的制備方法，由下述步驟組成 一、選擇河豚魚線粒體細胞色素B基因的保守片段為靶目標，該保守片段的擴增目標核苷酸序列為 tcttcacgaa acaggctcca acaaccccct aggaattaat tcaaacgcag50 acaaaatccc attccaccca tacttctctt acaaagacct cctaggcttc100 ac102 二、應用primer Express 3.0軟件，設計引物和探針； 三、引物和探針的合成采用β-乙腈磷酸胺化學合成法，使用全自動DNA合成儀進行OligoDNA的合成； 四、探針合成同時進行兩端熒光標記，探針5′端標記的熒光報告基團為FAM，3′端標記的是不發熒光的淬滅基團TAMRA； 五、將設計合成的多對引物和探針進行最佳配對篩選實驗后，初步確定候選引物和探針； 六、經過大量的反應條件優選、對比試驗和驗證試驗，并經過大量實際樣品的檢測應用評估，得到擴增效率和特異性好的上述一對引物和一條探針。這樣就制備得到對河豚魚成分特異性高、敏感性強的熒光定量PCR檢測試劑；該方法設計合理，定性準確。
本發明的河豚魚成分熒光定量PCR檢測試劑是將PCR技術與熒光檢測相結合，構建并篩選出上述擴增效率高和特異性好的一對引物和一條探針，該檢測試劑可以對魚糜中混入的河豚魚成分作出準確定性和快速靈敏的檢測，該檢測試劑對河豚魚成分具有特異性好和穩定性好的優點。該檢測試劑還克服了常規PCR費時、易污染以及擴增后需電泳檢測等缺點，可對樣品中的河豚魚成分進行快速準確的定性檢測，具有簡單、易操作、結果直觀、敏感性高、重復性好等優點。具體優點如下 1、本發明與常規PCR檢測試劑相比，具有特異、敏感的優點；本發明可對樣品中低含量的河豚魚成份進行準確檢測。
2、本發明與常規PCR的檢測試劑相比，具有適用范圍廣，使用安全的優點；適用范圍廣；本發明克服了常規PCR的產物須電泳檢測、接觸有毒試劑的缺點，降低了生物安全隱患，提高了使用安全性。
3、本發明與常規PCR的檢測試劑相比，具有檢測量大和快速檢測的優點；可同時進行大量樣品檢測，具有高通量性，可減少DNA或PCR產物污染的風險；常規PCR的檢測時間一般6小時以上，本發明無需擴增后的電泳分析，樣品檢測時間在4小時之內。
4、與常規PCR相比，熒光定量PCR作出一個客觀的估計，判斷出陽性、陰性和可疑結果，Ct值為40.0可確定為陽性和陰性的臨界值。
5、本試劑所組成的試劑盒可在收到樣品后4小時之內作出定性檢測結果。該熒光定量RT-PCR試劑盒是一種檢測實際樣品中河豚魚成分的特異、敏感和穩定的方法。
具體實施例方式 以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。
1、設計引物和探針 本發明選擇河豚魚線粒體細胞色素B基因的保守片段為靶目標，通過GenBank中報道的各種河豚魚細胞色素B基因序列(基因序列號EU274422.1)進行同源性分析比較，選定河豚魚特征基因的保守片段(102bp)，應用primer Express 3.0軟件，設計引物和探針。引物和探針的合成采用β-乙腈亞磷酸胺化學合成法，使用全自動DNA合成儀進行OligoDNA的合成探針，合成同時進行兩端熒光標記，探針5′端標記的熒光報告基團為FAM，3′端標記的是不發熒光的淬滅基團為TAMRA。將設計合成的多對引物和探針進行最佳配對篩選實驗后，確定擴增效率和特異性最好的上述一對引物和一條探針，擴增目標片段長度為102bp的上述擴增目標核苷酸序列。
2、DNA提取 采用異硫氰酸胍法快速提取樣品總DNA。取30mg樣品粉末于1.5mL離心管中，加入600μL異硫氰酸胍(5mol/L)裂解液，充分混勻后室溫靜置30min以上，12000r/min離心10min，取上清；等體積氯仿抽提1次，取上清，再加入等體積異丙醇，室溫沉淀10min，然后12000r/min離心10min，棄上清；75％乙醇洗滌1次，晾干后，加入30μL雙蒸水溶解 3、CytB熒光定量PCR擴增 CytB熒光定量PCR采用20μL體積反應液，在羅氏型熒光定量PCR儀(Ligntcycler2.0)中，按下列反應參數進行，94℃預變性10sec；94℃變性10sec，58℃延伸20sec，擴增40個循環。
引物和探針的濃度進行精確篩選，以獲得最低的Ct值和較高的熒光強度增加值(ΔRn)。每次檢測時，設立陽性對照和陰性對照陽性對照采用克隆河豚魚線粒體細胞色素B基因的保守片段的質粒；陰性對照空質粒每個樣品檢測做3管平行試驗。在陰性對照為陰性、陽性對照為陽性時，整個試驗有效，可進一步判斷結果。每個樣品須作多個備份，以進行穩定性、重復性試驗。
4、河豚魚成分熒光定量PCR的特異性和敏感性試驗 采用對暗鰭腹刺魨 黑腮兔頭魨、棕班腹刺魨、陽性質粒、青占魚、竹莢魚、魷魚、帶魚、三文魚進行特異性比較檢測。結果只有鰭腹刺魨黑腮兔頭魨、棕班腹刺魨、陽性質粒出現了擴增曲線。提取陽性質粒，用分光光度計測定其OD值來計算模板DNA的拷貝數，再對其進行十倍比稀釋，進行敏感性試驗，檢測限量可以到100拷貝數左右 5、河豚魚成分熒光定量PCR的穩定性和重復性試驗 在評估熒光定量PCR檢測河豚魚成分方法中的組內和組間試驗的重現性、穩定性時，用陽性樣品和陰性樣品，在同樣反應條件下，反復進行熒光定量PCR檢測，每次試驗的每個樣品做6個平行的反應管，重復12次。
6、引物和探針及其濃度的篩選 選擇引物、探針、模板的最佳濃度配比，獲得熒光定量PCR反應的最低Ct值和最高ΔRn，提高擴增效率和敏感性。應用不同DNA模板濃度的標準陽性樣品，對設計的引物與探針，采用矩陣法優選得到所述引物和探針的最佳濃度。
7、對樣品的檢測 對魚糜中混入河豚魚成分的樣品進行熒光定量PCR檢測，結果表明，陽性樣品均具有典型的擴增曲線，Ct值小于35.0，陰性對照及陰性樣品均無典型擴增曲線，也無Ct值。三個平行試驗的結果穩定一致。證明熒光定量PCR檢測河豚魚成分的特異性強、敏感度高和重復性好。
8、河豚魚成分熒光定量PCR標準化試劑盒和檢測程序 8.1標準化試劑盒組份(20μL反應×25次) 按照優化的反應條件配制。
8.2操作方法 8.2.1DNA提取 (1)取樣品組織25mg磨碎混勻，放入1.5mL的離心管中，加入180μL Buffer ATL。
(2)加入20μL蛋白酶K，振蕩混勻，在56℃溫育至到組織被完全溶解，在溫育過程中適時振蕩消化樣品。
(3)振蕩15秒，加入200μL Buffer AL到樣品中，振蕩混勻，再加入200μL酒精(96-100％)，振蕩混勻，得到樣品混合物。
(4)將上述樣品混合物加入濾膜離心管(Dneasy Mini spin column)，再裝入2mL收集管中離心，8000rpm，1分鐘，收集濾膜離心管。
(5)接著將收集的Dneasy Mini spin column裝入新的2mL收集管中，加入500μLBuffer AW1離心，1分鐘，8000rpm，再次收集濾膜離心管。
(6)將再次收集的Dneasy Mini spin column再裝入新的2mL收集管中，加入500μLBuffer AW2離心，3分鐘，14000rpm，又一次收集濾膜離心管。
(7)將又一次收集的Dneasy Mini spin column裝入一干凈的1.5mL收集管中，加入200μL BufferAE，直接加在濾膜上，在常溫下溫育1分鐘，離心，1分鐘，8000rpm，收集濾液。-20℃保存備用。
9.2.2反應組份配制 (1)取一支200μL光學PCR反應管，反應總體積為20μL，向反應管中加入下列反應物
(2)設立對照 陽性對照和陰性對照各設2管。
8.2.3擴增 在羅氏型熒光定量PCR儀(Ligntcycler 2.0)中，按下列反應參數進行，94℃預變性10sec；94℃變性10sec，58℃延伸20sec，擴增40個循環。
8.2.4結果分析和判定 (1)結果分析條件設定 閾值線設定原則根據儀器噪聲情況進行調整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的最高點為準。
(2)質控標準 ——陰性對照無Ct值，并且無典型擴增曲線。
——陽性對照的Ct值應小于35.0，并出現典型的擴增曲線， (3)結果描述及判定 ——陰性 無Ct值或無擴增曲線，表示樣品中無河豚魚成分。
——陽性 Ct值應小于等于35.0，且出現典型的擴增曲線，表示樣品中存在河豚魚成分。
——有效原則 Ct值在35.0～40.0的樣本建議重做。重做結果無Ct值或無典型擴增曲線判為陰性，否則判為陽性。
序列表
<110>寧波檢驗檢疫科學技術研究院
<120>河豚魚成分熒光定量PCR檢測試劑及其制備方法和應用
<160>4
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根據河豚魚線粒體細胞色素B基因設計的用于檢測河豚魚成分的特異性熒光探針序列
<400>1
5′-CGCAGACAAA ATCCCATTCC ACCCATA-3′27
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根據河豚魚線粒體細胞色素B基因設計的用于檢測河豚魚成分的特異性引物序列
<400>2
5′-TCTTCACGAA ACAGGCTCCA AC -3′22
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根據河豚魚線粒體細胞色素B基因設計的用于檢測河豚魚成分的特異性引物序列
<400>3
5′-GTGAAGCCCA GGAGGTCTTT GTA-3′23
<210>4
<211>102
<212>DNA
<213>河豚魚線粒體細胞色素B基因
<400>4
tcttcacgaa acaggctcca acaaccccct aggaattaat tcaaacgcag 50
acaaaatccc attccaccca tacttctctt acaaagacct cctaggcttc 100
ac 10權利要求
1.河豚魚成分熒光定量PCR檢測試劑，其特征在于該檢測試劑包含一對特異性引物和一條特異性熒光探針，擴增目標片段長度為102bp，引物和探針序列分別如下所述
引物Takifugu TF5′-TCTTCACGAA ACAGGCTCCA AC-3′
Takifugu TR5′-GTGAAGCCCA GGAGGTCTTT GTA-3′
探針5′FAM-CGCAGACAAA ATCCCATTCC ACCCATA-TAMRA-3′。
2.權利要求1所述的河豚魚成分熒光定量PCR檢測試劑的制備方法，其特征在于由下述步驟組成
(1)選擇河豚魚線粒體細胞色素B基因的保守片段為靶目標，該保守片段的擴增目標核苷酸序列為
tcttcacgaa acaggctcca acaaccccct aggaattaat tcaaacgcag50
acaaaatccc attccaccca tacttctctt acaaagacct cctaggcttc100
ac102
(2)應用primer Express 3.0軟件，設計合成引物和探針；
(3)引物和探針的合成采用β-乙腈磷酸胺化學合成法，使用全自動DNA合成儀進行OligoDNA的合成；
(4)探針合成同時進行兩端熒光標記，探針5′端標記的熒光報告基團為FAM，3′端標記的是不發熒光的淬滅基團TAMRA；
(5)將設計合成的多對引物和探針進行最佳配對篩選實驗后，初步確定候選引物和探針；
(6)經過大量的反應條件優選、對比試驗和驗證試驗，并經過大量實際樣品的檢測應用評估，得到擴增效率和特異性好的上述一對引物和一條探針。
3.權利要求1所述的河豚魚成分熒光定量PCR檢測試劑在制備河豚魚成分熒光定量PCR標準化試劑盒中的應用。
全文摘要
本發明公開了河豚魚成分熒光定量PCR檢測試劑及其制備方法和應用，系選擇不同種河豚魚之間比較保守的細胞色素B基因片段為靶目標序列，經過精心設計并合成，包含一對特異性引物和一條特異性熒光探針，擴增目標片段長度為102bp，引物和探針序列為引物Takifugu TF5′-TCTTCACGAAACAGGCTCCAAC-3′，Takifugu TR5′-GTGAAGCCCAGGAGGTCTTTGTA-3′，探針5′-FAM-CGCAGACAAAATCCCATTCCACCCATA-TAMRA-3′；本發明是一種對混入魚糜制品中的河豚魚成分具有特異性高、敏感性強，快速檢測的熒光定量PCR檢測試劑；本發明的方法設計合理，定性準確。
文檔編號G01N21/64GK101768640SQ20101003973
公開日2010年7月7日 申請日期2010年1月8日 優先權日2010年1月8日
發明者黃素文, 楊文潮, 王建峰, 陳先鋒, 黃紹棠, 聞偉剛, 章勝喬, 張超, 倪健波 申請人:寧波檢驗檢疫科學技術研究院