專利名稱：：一種快速檢測醇沉液糖含量的方法
技術領域：
：本發明屬于醫藥領域，特別涉及一種快速檢測丹參注射液醇沉工藝過程中醇沉液糖含量的方法。
背景技術：
：丹參注射液主要用于治療心絞痛、急性心肌梗塞和腦缺氧，還可以用于血栓閉塞性脈管炎、硬皮病、視網膜中央動脈栓塞、神經性耳聾、白噻氏綜合征、結節性紅斑腦血栓形成的后遺癥等。丹參注射液的主要有效成分是丹參中水溶性酚酸類成分，如丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、咖啡酸、丹酚酸A和丹酚酸B等。丹參注射液主要生產步驟由提取、醇沉、水沉、脫炭和配制等數個工藝組成。乙醇沉淀是中藥注射劑生產過程中應用十分廣泛的除雜步驟，具有很強的除雜能力。主要可去除蛋白質、多糖等大分子化合物，部分去除小分子糖類、鞣質和色素，而去除量最大的是糖類。對于丹參注射液而言醇沉是丹參注射液提取工段之后的第一個除雜步驟，是除雜最關鍵的步驟。另外，丹參注射液的醇沉工藝也占整個注射劑生產流程40%以上的時間。所以對丹參注射液醇沉工藝過程中糖含量進行快速監測和優化控制，可提高丹參注射液質量、提高生產效率。目前常用的糖類檢測方法有高效液相色譜法、氣相色譜法或毛細管電泳電化學檢測法。所用設備昂貴，分析時間也較長。部分方法需對待測樣品衍生化，樣品前處理復雜。無法適用于工業生產中糖類的快速檢測。
發明內容本發明針對上述技術存在的不足，提供一種快速檢測丹參注射液醇沉工藝過程中糖含量的方法，通過先收集實際醇沉過程中醇沉液作為校正集樣本，再使用液相色譜法檢測得到校正集樣本中葡萄糖、果糖和蔗糖的含量，然后掃描得到校正集樣本的紫外-可見光譜圖作為標準光譜圖，最后建立紫外-可見光光譜和糖含量之間的定量模型。具體通過以下步驟實現(1)醇沉液校正集樣本的獲取將丹參藥材水煎得到的提取液濃縮至密度大于1.lg/mL，然后邊攪拌邊加入95%乙醇(v/v)至酒精計測得上清液中乙醇表觀含量為70%(v/v)，期間不定時吸取不同乙醇表觀含量的醇沉液，冷藏后得到的上清液為丹參注射液的一次醇沉液校正集樣本。將一次醇沉液回收乙醇并濃縮到密度大于1.0g/mL，然后再次加入95X乙醇(v/v)至酒精計測得上清液中乙醇表觀含量為85%(v/v)，期間不定時吸取不同乙醇表觀含量的醇沉液，冷藏后得到的上清液為丹參注射液的二次醇沉液校正集樣本；(2)高效液相色譜法測定醇沉液校正集樣本的果糖、葡萄糖和蔗糖含量色譜條件色譜柱為Waterscarbohydrate高效糖柱(250mmX4.6mmi.d.，4ym)，流動相為乙腈-水(86:14)，流速為0.8mL/min，柱溫為30。C，進樣量為20iiL;檢測器蒸發光散射檢測器(ELSD)，漂移管溫度為9(TC，霧化氣為高純氮氣，霧化氣流速為2L/min，增益為1;對照品溶液的制備取D-果糖、D-葡萄糖(C6H1206*H20)和蔗糖對照品適量，精密稱定，分別加水制成每lmL含D-果糖60mg、D-葡萄糖50mg和蔗糖lOOmg的溶液，作為對照品儲備液。分別精密量取各對照品溶液適量，加水稀釋制成每lmL含D-果糖6mg、D-葡萄糖5mg和蔗糖10mg的混合對照品儲備液1及每lmL含D-果糖0.6mg、D-葡萄糖0.5mg和蔗糖0.5mg的混合對照品儲備液2。取混合對照品儲備液1、2適量，分別加流動相稀釋20倍，搖勻，濾過，取續濾液，即得混合對照品溶液1、2;供試品溶液的制備取醇沉液校正集樣本，過濾，精密量取續濾液適量加75%乙腈(v/v)稀釋4倍，混勻，10000rpm離心10min，取上清液，即為供試品溶液；含量測定分別精密吸取混合對照品溶液1、2和供試品溶液各20ii1，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按二點法計算丹參注射液醇沉液中果糖、葡萄糖和蔗糖含量，作為參比數據。(3)紫外掃描得到醇沉液校正集樣本的紫外_可見光譜圖取丹參醇沉液校正集樣本，過濾，精密量取續濾液適量，加水稀釋100025000倍，混勻，10000rpm離心10min，取上清液。紫外掃描的光譜區間是190nm400nm，分辨率為0.lnm-lnm。光譜掃描三次之后，取平均值作為校正集樣本數據集；(4)采用偏最小二乘法或者主成分回歸法構建定量模型使用Unscramb或者Minitab軟件處理數據。在構建光譜圖和糖含量定量模型時使用的方法是偏最小二乘法或者主成分回歸法。使用交叉驗證法確定最佳主成分數。當定量模型的相關系數到0.9以上時，認為模型已經建立完成；(5)未知樣品中糖含量的快速測定取未知糖含量的丹參注射液第一次醇沉或第二次醇沉工藝過程中獲取的醇沉上清液，加水稀釋。此時的稀釋倍數要求和建立標準集樣本時相同。混勻后10000rpm離心10min，取上清液進行紫外掃描。紫外掃描的光譜范圍和分辨率要求和建立標準集樣本時相同。將光譜數據代入構建的定量模型中，作為預測集，就可得到未知樣品中果糖、蔗糖或者葡萄糖的含量。本發明的另一個目的是提供該方法在丹參注射液醇沉工藝過程中測定醇沉液糖含量中的應用，所述糖為果糖、蔗糖或葡萄糖。本發明的方法設計合理，操作過程簡單、快速，所需設備為價格低廉的紫外-可見分光光度計，定量模型構建完畢后，無需專業背景的人員也可完成定量分析過程，因此，可以很好地在丹參注射液生產企業進行推廣，作為醇沉工藝過程質量控制的一種手段。圖1為一次醇沉中圖2為一次醇沉中圖3為一次醇沉中圖4為二次醇沉中圖5為二次醇沉中葡萄糖濃度的關聯和預測效果圖。果糖濃度的關聯和預測效果圖。蔗糖濃度的關聯和預測效果圖。果糖濃度的關聯和預測效果圖。葡萄糖濃度的關聯和預測效果圖。5圖6為二次醇沉中蔗糖濃度的關聯和預測效果圖。具體實施例方式本發明結合實施例作進一步的說明。實施例1取2L丹參的水提濃縮液置于醇沉罐中，在機械攪拌下緩慢加入95X(v/v)乙醇，直到用酒精計測量乙醇濃度達到70%(v/v)。一邊加入乙醇的同時，一邊不定時取樣，冷藏后的上清液作為醇沉液校正集樣本。將該樣本過濾，精密量取續濾液適量，加水稀釋5000倍后用紫外-可見分光光度計在190nm至400nm波長范圍內掃描得到圖譜數據，儀器分辨率設置為O.lnm。樣品的葡萄糖的濃度采用高效液相色譜法測定。用偏最小二乘法構建光譜數據和葡萄糖濃度關聯模型，采用交叉驗證確定主成分數為3，關聯效果圖1所示。由于相關系數大于0.9，所以認為模型建立完成。取5L丹參的水提濃縮液，加入醇沉罐中，在機械攪拌下緩慢加入95X(v/v)乙醇。一邊加入乙醇的同時，一邊不定時取樣，冷藏后的上清液過濾，精密量取續濾液適量，加水稀釋5000倍后用紫外-可見分光光度計在190nm至400nm波長范圍內掃描得到光譜圖，儀器分辨率設置為0.lnm。將光譜數據代入已構建的模型中，預測得到未知樣品的葡萄糖濃度。采用高效液相色譜法測定了未知樣品的實際濃度，預測值和實際值的對比參見表1、圖1。預測結果和實際濃度符合良好。表l葡萄糖濃度的實測值和預測值編號實測值(mg/L)預測值(mg/L)16153619526020602635887585745313524453122313062896288171759174581602145891501131710104511606<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例2取2L丹參的水提濃縮液置于醇沉罐中，在機械攪拌下緩慢加入95X(v/v)乙醇，直到用酒精計測量乙醇濃度達到70%(v/v)。一邊加入乙醇的同時，一邊不定時取樣，冷藏后的上清液作為醇沉液校正集樣本。將該樣本過濾，精密量取續濾液適量，加水稀釋1000倍后用紫外-可見分光光度計在190nm至400nm波長范圍內掃描得到圖譜數據，儀器分辨率設置為0.2nm。樣品的果糖濃度采用高效液相色譜法測定。用主成分回歸法構建光譜數據和果糖濃度關聯模型，采用交叉驗證確定主成分數為3，關聯效果參圖2。由于相關系數大于0.9，所以認為模型建立完成。取5L丹參的水提濃縮液，加入醇沉罐中，在機械攪拌下緩慢加入95X(v/v)乙醇。一邊加入乙醇的同時，一邊不定時取樣，冷藏后的上清液過濾，精密量取續濾液適量，加水稀釋1000倍后用紫外-可見分光光度計在190nm至400nm波長范圍內掃描得到光譜圖，儀器分辨率設置為0.2nm。將光譜數據代入已構建的模型中，預測得到未知樣品的果糖濃度。采用高效液相色譜法測定未知樣品的實際濃度，預測值和實際值的對比參見表2、圖2。預測結果和實際濃度符合良好。表2果糖濃度的實測值和預測值<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例3取2L丹參的水提濃縮液置于醇沉罐中，在機械攪拌下緩慢加入95X(v/v)乙醇，直到用酒精計測量乙醇濃度達到70%(v/v)。一邊加入乙醇的同時，一邊不定時取樣，冷藏后的上清液作為醇沉液校正集樣本。將該樣本過濾，精密量取續濾液適量，加水稀釋1000倍后用紫外-可見分光光度計在190nm至400nm波長范圍內掃描得到圖譜數據，儀器分辨率設置為lnm。樣品中蔗糖的濃度采用高效液相色譜法測定。用主成分回歸法構建光譜數據和蔗糖濃度關聯模型，采用交叉驗證確定主成分數為5，關聯效果參見圖3。由于相關系數大于0.9，所以認為模型建立完成。取5L丹參的水提濃縮液，加入醇沉罐中，在機械攪拌下緩慢加入95X(v/v)乙醇。一邊加入乙醇的同時，一邊不定時取樣，冷藏后的上清液過濾，加水稀釋iooo倍后用紫外_可見分光光度計在190nm至400nm波長范圍內掃描得到光譜圖，儀器分辨率設置為lnm。將光譜數據代入已構建的模型中，可以預測得到未知樣品的蔗糖濃度。采用高效液相色譜法測定了未知樣品的實際濃度，預測值和實際值的對比參見表3、圖3。預測結果和實際濃度符合良好。表3蔗糖濃度的實測值和預測值<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例4將2L丹參提取液一次醇沉上清液過濾后回收乙醇，將濃縮得到的回收液置于醇沉罐中，在機械攪拌下緩慢加入95%(v/v)乙醇，直到用酒精計測量乙醇濃度達到85%(v/v)。一邊加入乙醇的同時，一邊不定時取樣，冷藏后的上清液作為醇沉液校正集樣本。將該樣本過濾，精密量取續濾液適量，加水稀釋25000倍后用紫外-可見分光光度計在190nm至400nm波長范圍內掃描得到圖譜數據，儀器分辨率設置為0.4nm。樣品中果糖的濃度采用高效液相色譜法測定。用偏最小二乘法構建光譜數據和果糖濃度關聯模型，采用交叉驗證確定主成分數為3，關聯效果參見圖4。由于相關系數大于0.9，所以認為模型建立完成。取5L丹參提取液一次醇沉后的回收液，加入醇沉罐中，在機械攪拌下緩慢加入95%(v/v)乙醇。一邊加入乙醇的同時，一邊不定時取樣，冷藏后的上清液作為醇沉液校正集樣本。將該樣本過濾，精密量取續濾液適量，加水稀釋25000倍后用紫外-可見分光光度計在190nm至400nm波長范圍內掃描得到光譜圖，儀器分辨率設置為0.4nm。將光譜數據代入已構建的模型中，預測得到未知樣品的果糖濃度。采用高效液相色譜法測定未知樣品的實際濃度，預測值和實際值的對比參見表4、圖4。預測結果和實際濃度符合良好。表4果糖濃度的實測值和預測值<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例5將2L丹參提取液一次醇沉上清液過濾后回收乙醇，濃縮后回收液置于醇沉罐中，在機械攪拌下緩慢加入95%(v/v)乙醇，直到用酒精計測量乙醇濃度達到85%(v/v)。一邊加入乙醇的同時，一邊不定時取樣，冷藏后的上清液作為醇沉液校正集樣本。將該樣本過濾，精密量取續濾液適量，加水稀釋25000倍后用紫外-可見分光光度計在190nm至400nm波長范圍內掃描得到圖譜數據，儀器分辨率設置為O.lnm。樣品的葡萄糖濃度采用高效液相色譜法測定。用偏最小二乘法構建光譜數據和果糖濃度關聯模型，采用交叉驗證確定主成分數為3，關聯效果參見圖5。由于相關系數大于0.9，所以認為模型建立完成。取5L丹參提取液一次醇沉后的回收液，加入醇沉罐中，在機械攪拌下緩慢加入95%(v/v)乙醇。一邊加入乙醇的同時，一邊不定時取樣，冷藏后的上清液作為醇沉液校正集樣本。將該樣本過濾，精密量取續濾液適量，加水稀釋25000倍后用紫外-可見分光光度計在190nm至400nm波長范圍內掃描得到光譜圖，儀器分辨率設置為0.5nm。將光譜數據代入已構建的模型中，預測得到未知樣品的葡萄糖濃度。采用高效液相色譜法測定了未知樣品的實際濃度，預測值和實際值的對比參見表5、圖5。預測結果和實際濃度符合良好。表5葡萄糖濃度的實測值和預測值<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例6將丹參一次醇沉上清液過濾，回收乙醇，回收液置于醇沉罐中，在機械攪拌下緩慢加入95%(v/v)乙醇，直到用酒精計測量乙醇濃度達到85%(v/v)。一邊加入乙醇的同時，一邊不定時取樣，冷藏后的上清液作為醇沉液校正集樣本。將該樣本過濾，精密量取續濾液適量，加水稀釋20000倍后用紫外-可見分光光度計在190nm至400nm波長范圍內掃描得到圖譜數據，儀器分辨率設置為lnm。樣品中蔗糖的濃度采用高效液相色譜法測定。用偏最小二乘法構建光譜數據和果糖濃度關聯模型，采用交叉驗證確定主成分數為3，關聯效果參見圖6。由于相關系數大于0.9，所以認為模型建立完成。取5L丹參提取液一次醇沉后的回收液，加入醇沉罐中，在機械攪拌下緩慢加入95%(v/v)乙醇。一邊加入乙醇的同時，一邊不定時取樣，冷藏后的上清液作為醇沉液校正集樣本。將該樣本過濾，精密量取續濾液適量，加水稀釋20000倍后用紫外-可見分光光度計在190nm至400nm波長范圍內掃描得到光譜圖，儀器分辨率設置為lnm。將光譜數據代入已構建的模型中，預測得到未知樣品的蔗糖濃度。采用高效液相色譜法測定了未知樣品的實際濃度，預測值和實際值的對比參見表6、圖6。預測結果和實際濃度符合良好。表6蔗糖濃度的實測值和預測值編號實測值(mg/L)預測值(mg/L)14489448924258403034014390143536354953289332062653263672212219111<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>權利要求一種快速檢測醇沉液糖含量的方法，其特征在于，通過以下步驟實現(1)醇沉液校正集樣本的獲取將丹參藥材水煎得到的提取液濃縮至密度大于1.1g/mL，然后邊攪拌邊加入95％乙醇(v/v)至酒精計測得上清液中乙醇表觀含量為70％(v/v)，期間不定時吸取不同乙醇表觀含量的醇沉液，冷藏后得到的上清液為丹參注射液的一次醇沉液校正集樣本，將一次醇沉液回收乙醇并濃縮到密度大于1.0g/mL，然后再次加入95％乙醇(v/v)至酒精計測得上清液中乙醇表觀含量為85％(v/v)，期間不定時吸取不同乙醇表觀含量的醇沉液，冷藏后得到的上清液為丹參注射液的二次醇沉液校正集樣本；(2)高效液相色譜法測定醇沉液校正集樣本的果糖、葡萄糖和蔗糖含量色譜條件色譜柱為Waterscarbohydrate高效糖柱，250mm×4.6mmi.d.，4μm，流動相為乙腈∶水為86∶14，流速為0.8mL/min，柱溫為30℃，進樣量為20μL，檢測器蒸發光散射檢測器，漂移管溫度為90℃，霧化氣為高純氮氣，霧化氣流速為2L/min，增益為1；對照品溶液的制備取D-果糖、D-葡萄糖和蔗糖對照品，精密稱定，分別加水制成每1mL含D-果糖60mg、D-葡萄糖50mg和蔗糖100mg的溶液，作為對照品儲備液，分別量取各對照品溶液，加水稀釋制成每1mL含D-果糖6mg、D-葡萄糖5mg和蔗糖10mg的混合對照品儲備液1及每1mL含D-果糖0.6mg、D-葡萄糖0.5mg和蔗糖0.5mg的混合對照品儲備液2，取混合對照品儲備液1和2，分別加流動相稀釋20倍，搖勻，濾過，取續濾液，即得混合對照品溶液1和2；供試品溶液的制備取醇沉液校正集樣本，過濾，量取續濾液加75％乙腈(v/v)稀釋4倍，混勻，10000rpm離心10min，取上清液，即為供試品溶液；含量測定分別精密吸取混合對照品溶液1、2和供試品溶液各20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按二點法計算丹參注射液醇沉液中果糖、葡萄糖和蔗糖含量，作為參比數據；(3)紫外掃描得到醇沉液校正集樣本的紫外-可見光譜圖取丹參醇沉液校正集樣本，過濾，量取續濾液，加水稀釋，混勻，10000rpm離心10min，取上清液，紫外掃描的光譜區間是190nm～400nm，分辨率為0.1nm-1nm，獲得校正集樣本數據集；(4)采用偏最小二乘法或者主成分回歸法構建定量模型使用Unscramb或者Minitab軟件處理數據，在構建光譜圖和糖含量定量模型時使用的方法是偏最小二乘法或者主成分回歸法，使用交叉驗證法確定最佳主成分數，當定量模型的相關系數到0.9以上時，認為模型已經建立完成；(5)未知樣品中糖含量的快速測定取未知糖含量的丹參注射液第一次醇沉或第二次醇沉工藝過程中獲取的醇沉上清液，加水稀釋，混勻后10000rpm離心10min，取上清液進行紫外掃描，將光譜數據代入構建的定量模型中，作為預測集，就可得到未知樣品中果糖、蔗糖或者葡萄糖的含量。2.根據權利要求l所述的一種快速檢測醇沉液糖含量的方法，其特征在于，步驟(3)所述的校正集樣本過濾，續濾液加水稀釋的倍數為1000-25000。3.根據權利要求l所述的一種快速檢測醇沉液糖含量的方法，其特征在于，步驟(3)所述的校正集樣本數據集為紫外光譜掃描三次之后的平均值。4.根據權利要求l所述的一種快速檢測醇沉液糖含量的方法，其特征在于，步驟(5)測定未知樣品中糖含量時樣品的稀釋倍數、紫外光譜掃描的光譜范圍、分辨率參數設置均與校正集樣品時相同。5.根據權利要求1所述的一種快速檢測醇沉液糖含量的方法在丹參注射液醇沉工藝過程中測定醇沉液糖含量中的應用，所述糖為果糖、蔗糖或葡萄糖。全文摘要本發明提供一種快速檢測丹參注射液醇沉工藝過程中醇沉液葡萄糖、果糖和蔗糖含量的方法。該方法先收集實際醇沉過程中醇沉液作為校正集樣本，再使用液相色譜法檢測得到校正集樣本中葡萄糖、果糖和蔗糖的含量，然后掃描得到校正集樣本的紫外-可見光譜圖作為標準光譜圖，最后建立紫外-可見光光譜和糖含量之間的定量模型。在分析待測樣品時，先用水稀釋樣品，并且掃描樣品的紫外-可見光光譜，然后將待測樣品的光譜數據輸入定量模型中，即可得到葡萄糖、果糖和蔗糖含量的計算值。本發明的測量方法簡單、快速、無污染，可用于丹參注射液醇沉工藝中的糖含量的快速測定，有助于監控醇沉工藝過程，提高過程質量控制水平。文檔編號G01N30/74GK101776654SQ20101003959公開日2010年7月14日申請日期2010年1月8日優先權日2010年1月8日發明者瞿海斌,程翼宇,閻安憶,龔行楚申請人:浙江大學