專利名稱：一種免疫學檢測試劑盒及其制備和使用方法
技術領域：
本發明涉及一種用于心腦血管疾病相關檢查的免疫學檢測試劑盒，及其制備 和使用方法。特別涉及人體血漿中脂蛋白相關磷脂酶A2 (Lipoprotein-associated Phospholipase A2，縮寫為Lp_PLA2)蛋白檢測試劑盒及其制備和使用方法。
背景技術：
心腦血管疾病業已成為世界上危害人類健康的頭號“殺手”，對心腦血管疾病的檢 測、預防和治療，尤其是冠狀動脈的硬化和栓塞的檢測、預防和治療一直是全世界醫學研究 中努力不懈的目標。目前，三維立體的心血管造影雖然能夠精確了解冠狀動脈的阻塞程度， 對于血管搭橋手術或血管內的支架支撐擴張術提供關鍵的信息，但是卻無法準確預測缺血 性心臟病突發的時間，頻率和嚴重性。血液檢查中，除了早期使用的常規血脂膽固醇，低密 度脂蛋白(LDL)，高密度脂蛋白(HDL)，以及相互比例等檢測外，為了尋找更能在短期內預 測或反映是否有心臟病發生的敏感指標，研究的重點逐步把目標轉移到了一系列比較新的 血液檢測上，其中包括纖維蛋白原，C-反應蛋白(C-Reactive Protein, CRP)，血栓前體蛋 白(Thrombus Precursor Protein，TpP)，肌酸激酶 Creatine Kinase-MB (CK-MB)等。雖然 這些檢查都有一定的意義，臨床上也都已經逐步演化成了心腦血管疾病人的一整套常規檢 查，但是每個檢查還是存在一定的局限性。于是，臨床研究又把目標放在尋找更新，更有效 的指標上。目前，最新、最有效，也是世界上研究目標最集中的是用于預測冠心病和腦動脈 粥樣硬化病人是否在短期內發生血管內栓塞(心肌梗塞和腦血栓)可能性的前期發病因 子“血漿中脂蛋白相關磷脂酶A2” (Lipoprotein-associated Phospho-Iipase A2，縮寫為 Lp-PLA2)的體外血液檢測。Lp-PLA2又稱為血小板活化因子乙酰水解酶，蛋白分子量為50kDa，由成熟的巨噬 細胞和淋巴細胞合成和分泌，并受炎性介質的調節，主要與低密度脂蛋白LDL結合，能水解 血小板活化因子使之失去活性，又能水解低密度脂蛋白上的氧化卵磷脂，生成促炎物質溶 血卵磷脂和氧化游離脂肪酸，具有促炎癥和促動脈粥樣硬化的作用。因此Lp-PLA2從炎癥 細胞中產生和釋放也可以被解讀成為一個極佳的前炎癥反應指標，通過檢測循環系統中的 LP-PLA2酶水平，可以獨立的預測心腦血管的病發。越來越多研究表明Lp-PLA2具有促動脈 粥樣硬化作用，與心腦血管栓塞風險直接有關，因此已經成為短期內預測冠心病和腦動脈 血管栓塞新的診斷指標和將來的治療目標。盡管Lp-PLA2是一項嶄新的血液檢測，對于Lp_PLA2的研究也僅有不長的歷史， 但從美國多家醫療單位在最近的這幾年間進行的參與人數達二萬多病人的大規模臨床研 究中，目前已經顯示了 Lp-PLA2檢測對于心腦血管疾病突發預測的有效性。同時，檢測 LP-PLA2也可以同時預測腦動脈粥樣硬化性病變造成的腦動脈血栓性中風。顯然，檢測 Lp-PLA2將具有重大的臨床意義和市場前景。目前在免疫學檢測中最常用的方法是酶聯免疫法(ELISA)。ELISA法最大的缺點 就是步驟多，費時，而且由于使用了級聯放大作用，在增加檢測靈敏度的同時，也帶來了準確性降低的問題。尤其在疾病檢測方面，高準確性是很重要的一個指標。所以，亟需尋找一 種更準確的免疫學檢測方法來替代ELISA用于疾病檢測中。
發明內容
為了提高診斷的準確性，本發明提供一種免疫學檢測試劑盒，其中包括用可直接 檢測的標記物標記的待測蛋白的抗體，其中所述待測蛋白包括纖維蛋白原、C-反應蛋白、血 栓前體蛋白、肌酸激酶和人體脂蛋白相關磷脂酶A2中的一種或多種。該試劑盒可以通過檢 測多種指標來提高診斷的準確性，而且該試劑盒不需要通過底物的信號放大作用就能夠得 到檢測結果，簡化了步驟，同時提高了準確性。此外，使用該檢測試劑盒，能夠一步檢測樣品 中待測蛋白的豐度或濃度，避免了多步操作的繁雜和因級聯放大造成的準確性低的假陽性 的問題。優選上述可直接檢測的標記物為量子點標記，C點標記或納米金標記。這三種標 記物具有信號強、易檢測等優點，除卻了在酶聯免疫檢測中通過作用于底物而將檢測信號 經級聯放大等多步操作過程，使檢測更加快捷，準確。優選待測蛋白為Lp-PLA2蛋白，可將 檢測Lp-PLA2蛋白的豐度或濃度用于預測冠心病和腦動脈粥樣硬化病人是否有短期內發 生冠狀動脈栓塞和腦血栓等心腦血管疾病的風險預測和診斷中。上述試劑盒中可包括待測 蛋白的標準品，例如重組的，在蛋白N-端或C-端帶有His-標簽的待測蛋白作為檢測標準， 用來繪制標準曲線，或者用以證實檢驗過程的正確性和準確性。在一個實施方式中，本發明的試劑盒所檢測的樣本可以是人體的血漿或血清蛋白。優選上述抗體是單抗，更優選上述試劑盒進一步包括識別待測蛋白的其他抗原決 定簇的抗體。這種情況下，可以使用雙抗原夾心法來檢測待測蛋白，進一步提高其準確性。 上述識別待測蛋白的其他抗原決定簇的抗體可以是單抗，也可以是多抗，這種多抗可以是 經由帶有抗原決定簇的多肽免疫的哺乳類動物(鼠，兔，羊，牛等)的血清中分離的IgG多 抗。在一個優選的實施方式中，上述試劑盒中的待測蛋白包括纖維蛋白原、C-反應蛋 白、血栓前體蛋白、肌酸激酶和人體脂蛋白相關磷脂酶A2中的兩種以上，不同的待測蛋白 的抗體用不同的標記物進行標記。本發明還提供上述免疫性檢測試劑盒的制備方法，包括步驟制備待測蛋白的抗 體，并用可直接檢測的標記物標記所述抗體。其中制備抗體的方法可以為使用雜交瘤技術 制備單克隆抗體的方法。該方法還可以包括制備識別待測蛋白中的其他抗原決定簇的抗體 的步驟。在一個實施方式中，還包括用發酵法制備重組的待測蛋白作為標準物的步驟。這 種重組蛋白可以是帶His標簽的蛋白，也可以是帶有其他標簽的重組蛋白，例如GST標簽等 生物工程中常用標簽。本發明進一步提供一種上述試劑盒的使用方法，其中包括步驟(1)將待測樣品 與用可直接檢測的標記物標記的待測蛋白抗體一起孵育，使待測樣品中可能存在的待測蛋 白與所述抗體結合；(2)通過檢測標記物，檢測樣品中待測蛋白的含量水平。在一個優選的實施方式中，在步驟1)之前還可以包括包被待測蛋白的另一抗體的步驟，和將待測樣品與所述另一抗體一起孵育以使待測樣品可能存在的待測蛋白與所述 另一抗體結合的步驟，其中，所述另一抗體與所述用可直接檢測的標記物標記的待測蛋白 抗體分別識別不同的抗原決定簇。更優選地，該方法還包括用作為檢測標準的待測蛋白檢測并生成標準曲線的步
馬聚ο總而言之，本發明的試劑盒具有以下優點(1)檢測快速省時，這是因為省卻了使用二抗與酶聯底物等物質放大信號的步驟， 使整個檢測所需時間幾乎減少一半；(2)檢測的準確率提高，誤差率降低，這是因為是一步到位檢測的方法避免了間接 放大信號過程中產生的各種可能誤差，從而使檢測的假陽性和假陰性都同時降低；(3)當待測蛋白為兩種以上時，可以通過同時檢測兩種以上的指標來提高檢測的 準確率；(4)當待測蛋白為人體脂蛋白相關磷脂酶A2蛋白時，可以預測冠心病和腦動脈粥 樣硬化病人是否有短期內發生冠狀動脈栓塞和腦血栓等心腦血管疾病風險。
圖1是根據本發明的一個實施方式的試劑盒的生產流程圖。圖2是根據本發明的一個實施方式的試劑盒的使用流程圖。圖 3 是pcDNA3. l_his_hLp-PLA2 質粒的示意圖。pcDNA3. l_his_hLp-PLA2 的哺乳動 物表達質粒圖譜全長的人Lp-PLA2的N端帶有6個組氨酸標簽。該蛋白被克隆到pcDNA3. 1 載體的KpnI和XbaI限制性內切酶位點，受CMV啟動子的控制。圖4A為Hi s-Lp-PLA2的氨基酸序列。圖 4B 為 His-Lp_PLA2 的 DNA 序列。圖5A為ELISA檢測結果分布圖。圖5B為量子點565nm檢測結果分布圖。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作詳細描述。本領域普通技術人員通過這 些具體實施方式
可更清楚本發明的上述優點和其他優點。本發明試劑盒的一個優選的實施方式包括標記的抗Lp-PLA2蛋白的抗體，其標記 物可以是量子點或納米金，也可以是C點。利用該標記的抗體與待測樣品中的Lp-PLA2蛋 白結合后，可以通過直接檢測量子點或納米金或C點來檢測樣品中的Lp-PLA2蛋白。從而 獲知關于心臟疾病情況的相關信息。本發明試劑盒的一個優選的實施方式包括兩種單克隆抗體，分別針對Lp-PLA2蛋 白上有一定距離的兩個不同的抗原決定簇。將其中一個單抗用量子點標記，另一個單抗首 先用來包被，然后將待測樣品與其共孵育，使樣品中的Lp-PLA2蛋白與之結合。再加入上述 標記的單抗與Lp-PLA2蛋白結合。檢測標記物的量，就能直接得到樣品中Lp-PLA2蛋白的 豐度或濃度信息。本發明的試劑盒不僅可以用于檢測LP-PLA2蛋白，還可以用來檢測例如纖維蛋白!^,C-SlSSS (C-Reactive Protein,CRP),ifil^& (ThrombusPrecursor Protein, TpP)，肌酸激酶Creatine Kinase-MB (CK-MB)等人體血清蛋白以及一切其他用于心腦血管 疾病相關檢測中的蛋白。只是其中的抗體需要換成相應的抗體。本發明試劑盒的制備方法中，優選可直接檢測的標記物為量子點標記或納米金標 記。一個優選實施方式中，制備所述抗體的方法為使用雜交瘤技術制備單克隆抗體的方法。 進一步優選的實施方式中，還包括制備識別的抗原決定簇與所述單抗識別的抗原決定簇不 同的另一種單抗的步驟，這種單抗也可以用雜交瘤技術制備，例如用發酵罐培養法或鼠腹 腔注射法生成雜交瘤。本發明試劑盒還可以包括用發酵法制備重組的Lp-PLA2蛋白作為標準物的步驟。 該標準物可以用來作為陽性對照或制作標準曲線。根據試劑盒的成分，確定本發明的試劑盒的使用方法，例如還包括包被待測蛋白 的另一單抗時，可以使用“雙抗體夾心法”檢測。例如，先包被試劑盒的抗體與所述標記了 的抗體分別識別Lp-PLA2蛋白中的不同抗原決定簇。用未標記的單抗先包被試劑盒，然后 將待測樣品與之結合，再加入標記好的單抗，最后檢測標記物的量，用以直接解讀被檢測蛋 白的豐度或濃度信息。也可以將標記抗體與待測蛋白直接結合來檢測。在檢測病人血樣中的待測蛋白的同時，還包括用作為檢測標準的已知濃度的重組 待測蛋白加以檢測并生成標準曲線。在本發明的Lp-PLA2檢測中，其設定的標準曲線由已 知濃度為50ng，100ng，200ng，400ng和800ng/ml的重組人體His_Lp-PLA2蛋白組成。下面結合具體實施例說明本發明實施例11、單抗的制備用以下合成的Lp-PLA2蛋白抗原決定簇多肽鏈1) PANWNSPLRPGEKYC ；2) SFGQTKIPRGNGPYC ； 3)PSQDNDRLDTLffIPC ；4)CDHGKPVKNALDLKF ； 5)QHIMLQNSSGIEKYN 免疫小 鼠，制備單抗雜交瘤，選擇其中二個雜交瘤以發酵罐培養或老鼠腹腔注射法生產Lp-PLA2 蛋白的單克隆抗體A和B，其具體操作可參見(Kohler et al.，Nature 256:495,1975; Kohler et al. , Eur. J. Immunol. 6 :511,1976 ；Kohler et al. , Eur. J. Immunol. 6 :292, 1976 ；Hammerling et al. ,InMonoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier, N. Y.，1981)純化和濃縮單抗A和B，并分別進行配方、調節濃度和滅菌分裝。單抗A滅菌分裝 后即為檢測液A劑。取單抗B，用量子點標記。以下為二種量子點-抗體標記中可以施行的方法。1)使用Invitrogen公司或其他商業公司出售的，其最大熒光輻射在565nm光的波 段或其他波段范圍的，已經包被有鏈霉親和素(sti^ptavidin)的CdSe-ZnS量子點(其中 由CdSe組成量子點的核，而由ZnS組成其殼)，然后與生物素結合的抗體相混合，通過生物 素與鏈霉親和素之間的強親和力的結合就可以快速形成量子點標記的抗體。至于生物素與 抗體的結合技術是生物科技業的一項已經廣為掌握的標準技術，因此在此不再贅述。2)也可以使用Invitrogen公司的Qdot ITK Amino (PEG)量子點或其他商 業公司的類似量子點，將其直接標記在抗體或間接標記在鏈霉親和素或其他蛋白上。因 為這些量子點最外層包被有amine-derivatized PEG，可以直接與胺反應性基團，比如有異硫氰酸酯和succinimidyl esters或有羧基等基團的蛋白和其他水溶性的生物聚合物 結合。操作上，以10μM/lmM的比例將Qdot ITKTMAmino(PEG)量子點加入于BS3溶液 (Bis [sulfosuccinimidyl] suberate)中，經混合在室溫中反應半小時。然后用NAP-5柱(一 種由Amersham Biosciences生產的除鹽柱)將過分連接的量子點除去。然后將量子點加 入盛放于玻璃容器內的，有著40倍摩爾濃度的被標記抗體或其他蛋白溶液中，輕度混合后 在室溫中再反應2個小時。然后加入IM的甘氨酸至最后濃度達50mM，用于淬滅其發光。被 標記的抗體或其他蛋白最后可以通過Superdex200或其他類似的分子篩分離柱進行提純， 并經0. 2 μ m的針筒過濾裝置而達無菌保存，得到檢測液B劑。上述檢測液A和B的生產都需經過質量監控的過程。2、標準物的制備采用分子工程重組技術制備出人體His-Lp-PLA2重組蛋白，其蛋白的氨基酸 與核酸序列參見圖4(圖4A為氨基酸序列，圖4B為核酸序列)。含有重組蛋白基因的 pcDNA3. l-his-hLp-PLA2質粒示意圖請參見圖3。經轉染的HEK293或CHO細胞株用發酵罐 表達重組的Lp-PLA2蛋白，其重組表達和發酵過程可參見《分子克隆》。細胞經收獲后，用細 胞裂解液裂解，離心后取上清液，再經含鎳親和分離柱(例如Qiagen公司的Ni-NTA樹脂親 和分離柱)純化該重組蛋白，再用IOOmM的Imidazole將該重組蛋白從分離柱洗脫，然后透 析，濃縮，最后經過配方、濃度調配和滅菌分裝成五個濃度作為檢測標準物。3、用該試劑盒檢測樣品流程如圖2所示。用檢測液抗體A劑事先包被96孔板，并經的牛血清白蛋白 封閉后，將病人的稀釋血樣(新鮮血清或抗凝血漿或在零度以下儲藏不超過一周的血清或 抗凝血漿)和已知濃度的檢測標準物——重組的Lp-PLA2蛋白溶液置入包被板中。在含有 飽和濕度的攝氏37度中孵育二個小時，然后洗滌。放入已標記有量子點顆粒的檢測液B劑。直接用熒光光譜儀讀數，將待測樣品檢 測得到的數字與檢測標準物比較，得出分析結果。實施例2如實施例1 一樣的過程的檢測，只是待測蛋白為纖維蛋白原，或C-反應蛋白 (C-Reactive Protein, CRP),或血栓前體蛋白(Thrombus Precursor Protein, TpP),或肌 酸激酶Creatine Kinase-MB(CK-MB)等人體血清蛋白或一切其他在心腦血管疾病相關檢測 中的蛋白。結果選用實施例1的檢測盒試劑對28例經確診患有冠狀性心臟病的病人和21例相同 年齡的正常對照組進行檢測其Lp-PLA2蛋白濃度，并同時與使用ELISA法檢測取得的結果 進行對照。(參見圖5A和圖5B)結果表明，采用ELISA法檢測，在28例疾病組中有二例呈現假陰性，在21例正常 對照組中有一例呈現假陽性。而本發明的試劑盒檢測結果中僅出現一例病人組的結果處于 邊緣值之間，但二組結果都沒有出現假陰性與假陽性。盡管此次檢測的檢測案例較少，無法 在統計學處理上具有絕對的說服力，但是還是能夠顯示實施例1的檢測試劑盒相對具有更 高準確性。上文中通過幾個實施例具體說明了本發明的技術方案，應理解的是，本發明并不限于此處公開的實施方式，其保護范圍由所附權利要求書所限定，對此處所公開的實施方 式的各種適當修改均應落在本發明的保護范圍內。
權利要求
1.一種免疫學檢測試劑盒，其中包括用可直接檢測的標記物標記的待測蛋白抗體，其 中所述待測蛋白為心腦血管疾病檢查的相關蛋白。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其中所述待測蛋白包括纖維蛋白原、C-反應蛋白、血栓 前體蛋白、肌酸激酶和人體脂蛋白相關磷脂酶A2中的一種或多種。
3.如權利要求1所述的試劑盒，其中所述可直接檢測的標記物為量子點、C點或納米^^ ο
4.如權利要求1所述的試劑盒，其中所述待測蛋白為人體脂蛋白相關磷脂酶A2蛋白。
5.如權利要求1-4中任一項所述的試劑盒，其中包括待測蛋白樣本是重組的蛋白作為 檢測標準。
6.如權利要求1-5中任一項所述的試劑盒，其中用于試劑盒所檢測的樣本是人體的血 漿或血清蛋白。
7.如權利要求1-6中任一項所述的試劑盒，其中所述抗體為單抗。
8.如權利要求1-7中任一項所述的試劑盒，其中進一步包括識別待測蛋白的其他抗原 決定簇的抗體。
9.如權利要求8所述的試劑盒，其中所述識別待測蛋白的其他抗原決定簇的抗體為多抗。
10.如權利要求1-9中任一項所述的試劑盒，其中所述待測蛋白包括纖維蛋白原、C-反 應蛋白、血栓前體蛋白、肌酸激酶和人體脂蛋白相關磷脂酶A2中的兩種以上，不同的待測 蛋白的抗體用不同的標記物進行標記。
11.一種制備如權利要求1-10所述的免疫學檢測試劑盒的方法，包括步驟制備待測 蛋白的抗體，并用可直接檢測的標記物標記所述抗體。
12.如權利要求11所述的制備方法，其中制備所述抗體的方法為使用雜交瘤技術制備 單克隆抗體的方法。
13.如權利要求11或12所述的制備方法，還包括步驟制備識別所述待測蛋白中的其 他抗原決定簇的抗體。
14.如權利要求11-13中任一項所述的制備方法，其中還包括步驟用發酵法制備重組 的所述待測蛋白作為標準物。
15.如權利要求14所述的制備方法，其中所述重組的待測蛋白帶有His標簽。
16.一種權利要求1-10中任一項所述的試劑盒的使用方法，其中包括步驟1)將待測樣品與用可直接檢測的標記物標記的待測蛋白抗體一起孵育，使待測樣品中 可能存在的待測蛋白與所述抗體結合；2)通過檢測標記物，檢測樣品中待測蛋白的含量水平。
17.根據權利要求16所述的方法，其中在步驟1)之前還包括包被待測蛋白的另一抗體 的步驟，和將待測樣品與所述另一抗體一起孵育以使待測樣品可能存在的待測蛋白與所述 另一抗體結合的步驟，其中，所述另一抗體與所述用可直接檢測的標記物標記的待測蛋白 抗體分別識別不同的抗原決定簇。
18.根據權利要求16或17所述的方法，其中還包括用作為檢測標準的待測蛋白檢測并 生成標準曲線的步驟。
全文摘要
本發明提供一種免疫學檢測試劑盒及其制備和使用方法，所述試劑盒中包括用可直接檢測的標記物標記的待測蛋白抗體，所述待測蛋白為心腦血管疾病檢查的相關蛋白。所述待測蛋白包括纖維蛋白原、C-反應蛋白、血栓前體蛋白、肌酸激酶和人體脂蛋白相關磷脂酶A2中的一種或多種。使用該試劑盒可一步法檢測樣品中的待測蛋白豐度或濃度，節省了步驟和時間，并且與ELISA等傳統的需要級聯放大信號的方法相比，提高了準確度。
文檔編號G01N33/68GK102121938SQ20101000026
公開日2011年7月13日 申請日期2010年1月7日 優先權日2010年1月7日
發明者仇思東, 李惠, 鐘建 申請人:美國Rq生物科技有限公司