專利名稱：免疫可檢測性的改善的制作方法
技術領域：
本發明涉及檢測血液或血液衍生的樣品中的蛋白質的領域。
背景技術：
目前，蛋白質組分析中廣泛使用且公認的技術是常常與2D凝膠電泳或層析技術組合采用的質譜術。然而，小型化且并行化技術平臺的最近開發已經打開了支持和補充質譜分析的可能性。發明概述首先，提供了用于改善至少一種蛋白質在任選稀釋的血液、血清或血漿樣品中的免疫可檢測性的方法，包括將樣品加熱至50-85°C的溫度，之后進行樣品與至少一種親和配 體間的接觸的步驟。其次，提供了用于檢測和/或量化來自受試者的血液、血清或血漿中的蛋白質的方法a)提供第一和第二任選稀釋的來自所述受試者的血液、血清或血漿樣品；b)將所述第一樣品加熱至50_85°C的溫度；c)在b)的加熱后，使所述第一樣品與至少一種親和配體接觸，所述親和配體能夠與通過加熱提高免疫可檢測性的靶蛋白選擇性相互作用；d)使尚未進行加熱的所述第二樣品與至少一種親和配體接觸，所述親和配體能夠與通過加熱沒有提高免疫可檢測性的靶蛋白選擇性相互作用；e)檢測步驟c)和d)中形成的抗體與相應的靶蛋白間的相互作用，由此檢測和/或量化所述血液、血清或血漿中的蛋白質。再次，提供了用于鑒定醫學狀況的生物標志的方法，包括a)提供來自患有所述醫學狀況(condition)的第一組受試者和沒有所述醫學狀況的第二組受試者的血液、血清或血漿樣品，b)任選地在稀釋后，將所述樣品加熱至50_85°C的溫度，c)使所述樣品與能夠與至少一種蛋白質選擇性相互作用的至少一種親和配體接觸以測定各組中的所述至少一種蛋白質的水平，d)比較所述水平以鑒定在來自第一組的樣品中比在來自所述第二組的樣品中高或低的程度出現的蛋白質，如此鑒定所述醫學狀況的生物標志。下文更為詳細地描述了上述方法的各個實施方案。附圖簡述在
圖1-4中，實線表示血漿中的蛋白質，而虛線表示血清中的蛋白質。圖I顯示了在以不同溫度(X軸)熱處理后血漿或血清中展現出至少2倍升高的免疫可檢測性的蛋白質的數目(y軸)。圖2顯示了在以不同溫度(X軸)熱處理后血漿或血清中展現出至少2倍降低的免疫可檢測性的蛋白質的數目(y軸)。圖3顯示了在以不同溫度(X軸)熱處理后血漿或血清中展現出至少2倍升高的免疫可檢測性的蛋白質的數目(y軸)。圖4顯示了在以不同溫度(X軸)熱處理后血漿或血清中展現出至少2倍降低的免疫可檢測性的蛋白質的數目(y軸)。圖5顯示了來自與于23°C、56°C和72°C處理后的血清中的蛋白質相互作用的6種不同親和配體的信號。框圖從原始熒光信號強度數據產生，并且基于三次重復分析的結果。MFI =中值熒光強度，AU =任意單位。圖6顯示了來自與于23°C、56°C和72°C處理后的血漿中的蛋白質相互作用的6種不同親和配體的信號。框圖從原始熒光信號強度數據產生，并且基于三次重復分析的結果。MFI =中值熒光強度，AU =任意單位。圖7顯示了于72°C處理后的來自PSA低或高的患者(PSA > 60ng/ml)的血漿中的蛋白質水平差異。結果以火山圖(volcano plot)呈現，其中將相對倍數變化(x軸)相對于t檢驗結果的顯著性(P值)(y軸)繪圖。實線代表P值<0.01，而虛線代表P值<0.05。·點框代表....圖8顯示了于23°C處理后的來自PSA低或高的患者(PSA > 60ng/ml)的血漿中的蛋白質水平差異。結果以火山圖呈現，其中將相對倍數變化(X軸)相對于t檢驗結果的顯著性(P值)(y軸)繪圖。實線代表P值< O. 01，而虛線代表P值< O. 05。點框代表火山圖中定位具有較小的倍數變化和顯著性數值的蛋白質的區域放大。發明詳述作為本公開內容的第一方面，如此，提供了用于改善至少一種蛋白質在任選稀釋的血液、血清或血漿樣品中的免疫可檢測性的方法，包括將樣品加熱至50-85°C的溫度，之后進行樣品與至少一種親和配體間的接觸的步驟。作為第一方面的結構，提供了用于檢測血液、血清或血漿樣品中的蛋白質的方法，包括a)將所述樣品加熱至50_85°C的溫度；b)使所述樣品與至少一種親和配體接觸，所述親和配體能夠與已知靶蛋白選擇性相互作用；c)檢測至少一種親和配體與來自樣品的相應靶蛋白間的相互作用，由此檢測樣品中的蛋白質。本公開內容基于如下的發現，S卩如果在分析前將血漿或血清樣品加熱，那么抗體以較高的程度檢出血漿和血清樣品的一些蛋白質。不限于任何具體的科學理論，通過加熱似乎促進抗體與其在血清或血漿蛋白質中的相應表位間的相互作用。本公開內容的發現可以帶來許多益處。使用加熱，可有可能檢出先前使用免疫學方法檢測不到的蛋白質。因此，可以獲得復雜生物學樣品的蛋白質內容物的更廣泛圖像。還有，加熱可以實現以較低水平存在于此類復雜生物學樣品中的蛋白質的檢測。這可以是特別感興趣的，因為已經報告了許多感興趣的生物標志以較低濃度范圍存在。如此，本公開內容的加熱可以是用于提高蛋白質組研究的靈敏性的有用工具。在本公開內容的上下文中，蛋白質的“免疫可檢測性”指蛋白質的線性或構象表位可以通過能夠與此類表位選擇性相互作用的親和配體，諸如抗體檢出的程度。此外，在本公開內容的上下文中，“改善”蛋白質的免疫可檢測性指在基于表位識別的分析中與來自尚未實施加熱時的蛋白質的信號(或輸出)相比，提高來自蛋白質的信號(或輸出)。因此，為了測定是否已經改善免疫可檢測性，可以在同時采集的兩份來自患者的樣品中測量來自所討論的蛋白質的信號，其中在測量前已經加熱樣品之一。如果來自加熱樣品中的蛋白質的信號高于來自非加熱樣品中的蛋白質的信號，那么免疫可檢測性得到改善。為了改善所述比較的精確性，可以實施對每份樣品的超過一次測量和/或對每個種類的超過一份樣品的測量。在一些實施方案中，若信號(按絕對值計)已經升高I. 5倍或2倍，則可以認為免疫可檢測性得到改善。“樣品與至少一種親和配體間的接觸”使檢測和/或量化樣品中的蛋白質成為可能。因此，可以采用親和配體的選擇性來測定親和配體識別的蛋白質的存在和/或多度。可以使用各種設置和形式來實施接觸，如下文進一步討論的。作為本公開內容的第二方面，提供了用于檢測和/或量化來自受試者的血液、血清或血漿中的蛋白質的方法a)提供第一和第二任選稀釋的來自所述受試者的血液、血清或血漿樣品； b)將所述第一樣品加熱至50_85°C的溫度；c)在b)的加熱后，使所述第一樣品與至少一種親和配體接觸，所述親和配體能夠與通過加熱提高免疫可檢測性的靶蛋白選擇性相互作用；d)使尚未進行加熱的所述第二樣品與至少一種親和配體接觸，所述親和配體能夠與通過加熱沒有提高免疫可檢測性的靶蛋白選擇性相互作用；e)檢測步驟c)和d)中形成的抗體與相應的靶蛋白間的相互作用，由此檢測和/或量化所述血液、血清或血漿中的蛋白質。第二方面基于發明人的洞察力，即一些蛋白質的免疫可檢測性在本公開內容的熱處理期間得到改善，而一些其它蛋白質的免疫可檢測性沒有升高或者甚至降低。因而，若在已經加熱的樣品中實施前種蛋白質的檢測，而在非加熱樣品中實施后種蛋白質的檢測，則可以實現對更大范圍的蛋白質優化的靈敏性。本領域技術人員無需過度負擔僅通過實施相同蛋白質的兩次測量，一次在加熱樣品中而一次在非加熱樣品中，然后比較所得的信號便可以確定蛋白質的免疫可檢測性得到改善與否。如果信號在熱處理的樣品中較高，那么蛋白質作為通過加熱提高免疫可檢測性的蛋白質選擇，并且在未來的分析中使相應的親和配體與熱處理的樣品接觸。作為本公開內容的第三方面，提供了用于鑒定醫學狀況的生物標志的方法，包括a)提供來自患有所述醫學狀況的第一組受試者和沒有所述醫學狀況的第二組受試者的血液、血清或血漿樣品，b)任選地在稀釋后，將所述樣品加熱至50_85°C的溫度，c)在加熱后使所述樣品與能夠與至少一種蛋白質選擇性相互作用的至少一種親和配體接觸以測定各組中的所述至少一種蛋白質的水平，d)比較所述水平以鑒定在來自第一組的樣品中比在來自所述第二組的樣品中高或低的程度出現的蛋白質，如此鑒定所述醫學狀況的生物標志。本公開內容的第三方面基于發明人的如下發現，即來自正常的和患病的患者的加熱樣品的比較揭示在分析非加熱樣品時檢測不到的蛋白質表達差異。因此，可以使用本公開內容的方法來鑒定先前認識不到的生物標志。這在圖7和圖8中顯示，其中顯示了來自正常受試者和患有前列腺癌的受試者的加熱的和非加熱的樣品中的某些蛋白質的水平，并且鑒定出前列腺癌的兩種蛋白質生物標志。第三方面的醫學狀況可以例如是疾病或另一種醫學病癥，諸如癌癥。本領域技術人員了解在步驟d)中如何比較來自兩組的水平，并確定水平間的差異是否足以推斷所述蛋白質是生物標志。在第三方面的一個實施方案中，若蛋白質濃度在來自第一組的樣品中比在第二組的樣品中高至少25 %，諸如高至少50 %，諸如高至少100 %，則在步驟d)中將其鑒定為生物標志。此外，若檢測系統中來自蛋白質的信號在來自第一 組的樣品中比在第二組的樣品中高至少25 %，諸如高至少50 %，諸如高至少100 %，則其可以鑒定為生物標志。在這里，要比較的濃度或信號可以是樣品中的濃度的均值或中值數值。還有，情況可以是僅在一些樣品中檢出蛋白質，并且在此類情況中，若蛋白質在來自第一組比來自第二組更高百分比的樣品中檢出，則可以在步驟d)中將其鑒定為生物標志。若蛋白質在來自患病組的樣品中以較低的程度檢出，則其也可以鑒定為生物標
O在本公開內容的實施方案中，所述方法僅涉及檢測和/或量化血液、血漿或血清的非免疫球蛋白蛋白質。免疫球蛋白蛋白質的一些表位的可檢測性受到免疫球蛋白蛋白質是否與其抗原結合影響。不限于任何具體的科學理論，發明人認為靶蛋白的此類相互作用的形成或解離不是加熱效果的來源。另外，將樣品加熱可以改變免疫球蛋白蛋白質的結合活性，并且由此危及其功能性的鑒定。因此，在本公開內容的方法的實施方案中，至少一種親和配體能夠與至少一種非免疫球蛋白蛋白質選擇性相互作用。在本公開內容的方法中，將樣品加熱至50_85°C的溫度。在下文的例示性實施方案和圖I中，顯示了此類溫度范圍導致免疫可檢測性升高。在本公開內容的方法的實施方案中，將樣品加熱至64-85 °C，諸如66-78 °C，諸如70-74°C，諸如約72°C的溫度。在下文的例示性實施方案和圖I、圖3和圖4中，顯示了在此范圍內的溫度比50-85°C的更寬范圍至少在一些方面更好。通常，本公開內容的加熱在時間上受限制，這意味著首先將樣品加熱至某個溫度，于所述溫度保持一段時間，然后冷卻，通常至室溫左右的溫度，諸如20-25°C。因此，通常不以增加的溫度實施加熱后的步驟，諸如與親和配體接觸。發明人已經發現了，可以在熱循環儀中實施加熱和任選地冷卻。(熱循環儀通常在PCR中使用)。然而，也可以使用其它加熱手段。可以將加熱時間保持較低，以提供有效的使用勞力和材料，并且由此改善的分析經濟。例如，這在蛋白質組學中可以是有益的，其中可以在一大批受試者中分析許多蛋白質。發明人已經顯示了，加熱小于I小時，或甚至小于半小時的時段足以獲得滿意的結果。如此，在本公開內容的實施方案中，加熱實施一段O. 5-55分鐘，諸如1-40分鐘，諸如1-29分鐘，諸如5-20分鐘，諸如約15分鐘的時間。在下述例子中，在加熱前將樣品的蛋白質標記。隨后，將標記物與熒光團起反應，并在最終的檢測步驟中檢測。發明人已經顯示了，此類標記提供了有效的分析方案，并且在加熱前標記比在加熱后標記產生更高數目的具有升高的免疫可檢測性的蛋白質。此外，可以將樣品在標記和加熱之間稀釋(例如，10-100倍)。
在本公開內容的實施方案中，如此，可以用標記物在加熱前標記樣品的蛋白質，所述標記物在樣品與至少一種親和配體間接觸后在檢測步驟中直接或間接可檢測。標記物可以例如包含生物素。也就是說，標記可以例如是生物素化。標記物可以本身(直接地)或者經由二級標記物(間接地)可檢測。如此，在本公開內容的方法的實施方案中，可以在與親和配體接觸后將經標記的蛋白質與二級標記物接觸，所述二級標記物在隨后的檢測步驟中可檢測。二標記物可以例如是熒光團。可以在加熱前稀釋本公開內容的方法的樣品。一般認為稀釋在基于免疫學檢測的分析中降低背景信號(干擾(noise))及來自靶蛋白的信號。在本公開內容的實施方案中，可以在加熱前將樣品稀釋10-10000倍，諸如100-2500倍，諸如200-1000倍，諸如約500倍。例如，可以使用包含添加劑諸如兔IgG和/或酪蛋白的緩沖液來稀釋樣品。這些添加劑可以淬滅樣品中的蛋白質與(特異性)親和配體間的非特異性結合，由此降低檢測中的干擾。
緩沖液中的淬滅抗體濃度可以是O. 05-5mg/ml,諸如O. l_2mg/ml,諸如約O. 5mg/ml，并且緩沖液中的酪蛋白濃度可以是O. 01-10% (w/v)，諸如0.05-2% (w/v)，諸如約O. I % (w/v)。為了提供數種蛋白質的同時檢測及由此對血液、樣品或血漿的蛋白質內容物的有效分析，可以在同一反應區室中將樣品與超過一種親和配體接觸。為了檢測同一樣品中的超過30種不同蛋白質，在小型化且并行化系統中使用親和配體是有益的，其中可以將配體與珠偶聯，所述珠在隨后的檢測步驟中分析。此外，可以給此類珠提供連接隨后的檢測步驟中的信號與親和配體及繼而蛋白質的身份(identity)。有時，此類珠稱為“編碼顆粒”；參見 Kingsmore, S. F. Nat Rev. Drug Discovery 2006, 5 (4), 310-320。使用傳統的三明治式測定法，提供能夠檢測來自同一樣品的超過30種不同蛋白質的設置實際上是非常困難且費時的。因此，在本公開內容的方法的實施方案中，在樣品與至少4，諸如至少10，諸如至少30,諸如至少50種不同親和配體間接觸前實施加熱。通過采用與蛋白質偶聯的直接或間接可檢測的標記物和具有與親和配體偶聯的身份的可檢測模塊，可以將檢測步驟中的假陰性數目保持較低，因為可以忽略不提供來自與蛋白質有關的標記物和與親和配體有關的模塊的信號的任何實體。上文呈現的實施方案主要參照第一方面進行描述。然而，本領域技術人員了解，力口以必要的變更，實施方案還適用于第二和第三方面。在本公開內容的上下文中，“至少一種親和配體”指至少一種種類的親和配體，其中所述種類由親和配體的特異性限定。如此，本領域技術人員了解，一種種類的親和配體可以指一組多克隆抗體，它們都能夠與同一抗原選擇性相互作用。因而，“不同親和配體”指具有不同特異性的親和配體。認為選擇或制造合適的親和配體及選擇適合于依照本公開內容的檢測和/或量化的形式和條件在本領域普通技術的能力范圍內。然而，為了例示，下文給出了可以證明有用的親和配體的例子及用于檢測和/或量化的形式和條件的例子。如此，在本公開內容的實施方案中，可以自下組選擇親和配體抗體、其片段和其衍生物，即基于免疫球蛋白支架的親和配體。抗體及其片段或衍生物可以是分離的和/或單特異性的。抗體包含任何起源，包括鼠、兔、人的單克隆和多克隆抗體和其它抗體，及包含來自不同物種的序列的嵌合抗體，諸如部分人源化抗體，例如部分人源化小鼠抗體。可以通過用選定的抗原免疫動物來生成多克隆抗體。可以使用由K0hlei·和Milstein( K0hlerG和MilsteinC(1976)Eur. J. Immunol. 6 :511-519)開發的雜交瘤技術來生成限定特異性的單克隆抗體。本公開內容的抗體片段和衍生物能夠與它們作為片段或衍生物來源的抗體一樣與相同抗原選擇性相互作用。抗體片段和衍生物包含Fab片段，其由完整免疫球蛋白蛋白質的重鏈第一恒定域(CHl)、輕鏈恒定域(CL)、重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)組成；Fv片段,其由兩個抗體可變域VH和VL組成(Skerra A和Pliickthun A(1988) Science240 =1038-1041);單鏈Fv片段(scFv)，其由通過柔性肽接頭連接在一起的兩個VH和VL域組成(Bird RE 和 Walker Bff (1991)Trends Biotechnol. 9 :132-137) ；Bence Jones 二聚體(Stevens FJ 等(1991) Biochemistry 30 :6803-6805);胳馬它(cameI id)重鏈二聚體(Hamers-Casterman C 等(1993)Nature 363:446-448)和單一可變域(Cai X 和 GarenA (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93 :6280-6285 ；Masat L 等(1994) Proc. Natl. Acad.Sci. U. S. A. 91 :893-896)、和單一域支架,如例如來自鉸口S (nurse shark)的新抗原受體(NAR) (Dooley H等(2003)Mol. Immunol. 40 :25-33)和基于可變重域的微型抗體(Skerra A·和 PlUckthun A(1988)Science240 :1038-1041)。在本公開內容的上下文中，“單特異性抗體”是已經對其自身抗原進行過親和純化，由此分開此類單特異性抗體與其它抗血清蛋白和非特異性抗體的多克隆抗體群之一。此親和純化產生選擇性結合其抗原的抗體。為了獲得可以在本公開內容的方法中使用的單特異性抗體，可以通過基于兩步免疫親和力的方案來純化多克隆抗血清以獲得對靶蛋白選擇性的單特異性抗體。使用固定化的標簽蛋白作為捕捉劑在最初的消減步驟中除去針對抗原片段的通用親和標簽的抗體。在第一消減步驟后，將血清在具有作為捕捉劑的抗原的第二親和柱上加載，以富集對抗原特異性的抗體(還可參見Nilsson P等(2005)Proteomics5 :4327-4337)。多克隆和單克隆抗體及其片段和衍生物代表需要選擇性生物分子識別的應用中，諸如依照本公開內容的蛋白質檢測和/或量化中的親和配體的傳統選擇。然而，本領域技術人員知道，由于不斷需要選擇性結合配體的高通量生成和低成本生成系統，已經開發出新的生物分子多樣性技術。這已經實現免疫球蛋白及非免疫球蛋白起源兩者的新型親和配體的生成，所述新型親和配體有時已經證明為在生物分子識別應用中與結合配體同等有用，并且可以替換免疫球蛋白或者與免疫球蛋白一起使用。親和配體選擇需要的生物分子多樣性可以通過多種可能的支架分子之一的組合工程化改造來生成，然后使用合適的選擇平臺來選擇特異性和/或選擇性親和配體。支架分子可以是免疫球蛋白蛋白質起源的(Bradbury AR和Marks JD(2004)J. Immunol. Meths. 290 :29-49)、非免疫球蛋白蛋白質起源的(Nygren PA 和 SkerraA (2004) J. Immunol. Meths. 290 :3_28)、或寡核苷酸起源的(Gold L 等(1995) Annu. Rev.Biochem. 64 :763-797)。已經在新結合蛋白的開發中使用大量非免疫球蛋白蛋白質支架作為支持結構。可用于生成依照本公開內容使用的親和配體的此類結構的非限制性例子是葡萄球菌蛋白A及其域和這些域的衍生物，諸如蛋白Z(Nord K等(1997)Nat. Biotechnol. 15 :772-777)；脂籠蛋白(Beste G 等(1999)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 :1898-1903);錨蛋白重復域(Binz HK 等(2003) J. Mol. Biol. 332 :489-503);纖維素結合域(CBD) (Smith GP 等(1998) J. Mol. Biol. 277 :317-332 ;Lehtio J 等(2000)Proteins 41:316-322) ； Y 晶體蛋白(crystallines) (Fiedler U 和 Rudolph R, W001/04144);綠色突光蛋白(GFP) (PeelleB 等(2001)Chem. Biol.8 :521-534);人細胞毒性 T 淋巴細胞相關抗原 4(CTLA-4) (HuftonSE 等(2000)FEBS Lett. 475 :225-231 ;Irving RA 等(2001)J. Immunol. Meth. 248 :31-45)；蛋白酶抑制劑，諸如 Knottin 蛋白(ffentzel A 等(2001) J. Bacteriol. 183 :7273-7284 ；Baggio R 等(2002)J. Mol. Recognit. 15 :126-134)和 Kunitz 域(Roberts BL 等(1992)Gene 121 :9-15 ；Dennis MS 和 Lazarus RA(1994)J. Biol. Chem. 269 :22137-22144) ；PDZ域(Schneider S 等(1999) Nat. Biotechnol. 17 170-175);妝適體，諸如硫氧還蛋白(LuZ 等(1995)Biotechnologyl3 :366-372 ;Klevenz B 等(2002)Cell. Mol. Life Sci. 59 1993-1998);葡萄球菌核酸酶(Norman TC 等(1999) Science 285:591-595);淀粉酶抑肽(tendamistat)(McConell SJ 和 Hoess RH(1995)J. Mol. Biol. 250 :460-479 ；Li R 等(2003)Protein Eng. 16 :65-72);基于纖連蛋白 III 型域的 Trinectins (Koide A 等(1998)J. Mol. Biol. 284 :1141-1151 ;Xu L 等(2002) Chem. Biol. 9 :933-942);和鋅指(Bianchi E等(1995)J. Mol. Biol. 247 :154-160 ；Klug A (1999)J. Mol. Biol. 293 :215-218 ；Segal DJ等 (2003)Biochemistry 42 :2137-2148)。上文所提及的非免疫球蛋白蛋白質支架的例子包括呈現用于生成新的結合特異性的單一隨機化環的支架蛋白質、具有為了生成新的結合特異性而隨機化自蛋白質表面突出的側鏈的剛性二級結構的蛋白質支架、和展現出用于生成新的結合特異性的不連續高變環區的支架。在非免疫球蛋白蛋白質外，還可以使用寡核苷酸作為親和配體。稱作適體或誘餌的單鏈核酸折疊成定義明確的三維結構，并以高親和力和特異性結合其靶物。(Ellington AD 和 Szostak Jff(1990)Nature 346 :818-822 ；Brody EN 和 Gold L(2000)J. Biotechnol. 74 :5-13 ;Mayer G 和 Jenne A (2004) BioDrugsl8 :351-359)。寡核苷酸配體可以是RNA或DNA，并且可以結合一大批靶分子類別。對于自上文所提及的任何支架結構的變體的集合選擇期望的親和配體，許多選擇平臺可用于分離針對選定的靶蛋白的特異性新配體。選擇平臺包括但不限于噬菌體展不(Smith GP (1985) Science 228 :1315-1317)、核糖體展不(Hanes J 和 PliickthunA(1997)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94 :4937-4942)、酵母雙雜交系統(Fields S 和 SongO (1989) Nature 340 :245-246)、酵母展示(Gai SA 和 Wittrup KD (2007) Curr Opin StructBiol 17 :467-473)、mRNA 展示(Roberts Rff 和 Szostak Jff (1997) Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 94:12297-12302)、細菌展示(Daugherty PS (2007) Curr Opin Struct Biol 17 :474-480, Kronqvist N 等(2008)Protein Eng Des Sel 1-9, Harvey BR 等(2004)PNAS101(25) :913-9198)、微珠展示(Nord O 等(2003) J Biotechnoll06 :1_13，W001/05808)、SELEX (指數富集配體系統進化)(Tuerk C 和 Gold L (1990) Science 249 :505-510)和蛋白質片段互補測定法(PCA) (Remy I 和 Michnick Sff (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 5394-5399)。如此，在本公開內容的實施方案中，親和配體可以是源自上文所列的任何蛋白質支架的非免疫球蛋白親和配體，或寡核苷酸分子。可以在基于親和配體諸如抗體與抗原間的相互作用的測定法中以技術人員已知的用于檢測和/或量化結合劑的任何方式實現本公開內容的檢測和/或量化。因而，可以使用上文所描述的任何親和配體來定量和/或定性檢測蛋白質在血液或血液衍生樣品中的存在。這些一級親和配體可以用各種標志物自身標記或者可以繼而通過二級、經標記的親和配體檢測以容許檢測、顯現和/或量化。這可以使用許多標記物之任一種或多種來實現，所述標記物可以使用技術人員已知的，并且因此不牽涉任何過度實驗的許多技術之任一種或多種來與一級或二級親和配體綴合。可以與一級和/或二級親和配體綴合的標記物的非限制性例子包括熒光染料或金屬(例如，熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、熒胺)、發色染料(例如，視紫質)、化學發光化合物(例如，魯米諾、咪唑)和生物發光蛋白質(例如，螢光素、螢光素酶)、半抗原(例如，生物素)。多種其它有用的熒光劑和生色團記載于Stryer L (1968) Science 162 :526-533及Brand L 和 Gohlke JR(1972)Annu. Rev. Biochem. 41 =843-868 也可以用酶(例如，辣根過 氧化物酶、堿性磷酸酶、beta-內酰胺酶)、放射性同位素(例如，3H、14C、32P、35S或125I)和顆粒(例如，金)標記親和配體。在本公開內容的上下文中，顆粒指適合于標記分子的顆粒，諸如金屬顆粒。此外，也可以用熒光半導體納米晶體(量子點)標記親和配體。量子點具有卓越的量子產率，而且與有機熒光團相比更具光穩定性，并且因此更容易檢出(Chan等(2002)Curr Opi Biotech. 13 :40-46)。可以使用各種化學，例如胺反應或硫醇反應來將不同類型的標記物與親和配體綴合。然而，可以使用與胺和硫醇不同的反應基團，例如醛、羧酸和谷氨酰胺。上述方法方面可以以數種已知形式和設置之任一種(其非限制性部分在下文討論)使用。顯現親和配體上的標記物的方法可以包括但不限于熒光測定、發光測定和/或酶技術。通過將熒光標記物暴露于特定波長的光，此后檢測和/或量化特定波長區的發射光來檢測和/或量化熒光。可以通過在化學反應期間形成的發光來檢測和/或量化加有發光標簽的親和配體的存在。酶反應的檢測是由于源自化學反應的樣品色移。不同類型的ELISA是基于酶反應的方法的例子。本領域技術人員知道，為了適當的檢測和/或量化，可以修飾多種不同方案。不限于任何具體的科學理論，發明人認為使用本公開內容的加熱提高線性表位的免疫可檢測性。在本公開內容的方法的實施方案中，親和配體如此可以能夠與線性/連續表位選擇性相互作用。舉例而言，可以通過用包含表位，但不形成(剛性)二級結構的肽免疫動物來生成能夠與線性/連續表位選擇性相互作用的抗體。使用蛋白質表位標志標簽(Protein Epitope Signature Tag7PrEST)免疫(其經常生成識別線性/連續表位的抗體)來生成下文實施例部分中所采用的抗體。
實施例材料和方法珠偶聯依照略有修飾的制造商的方案將單特異性抗體與羧化的珠(C00H Micorspheres,Luminex-Corp.)偶聯。對于前列腺癌方法，使用離心過濾單元(Ultrafree_MC,Millipore)以40 μ g/ml的終濃度將每種抗體3. 2 μ g與IO6個珠偶聯。將珠在具有NaN3的含有蛋白質的緩沖液(ELISA的封閉試劑，Roche)中貯存。將所有偶聯的珠在超聲清潔器(Branson，Ultrasonic Corporation)中在超聲處理的情況中重懸5分鐘,之后于4°C|C存。在溶液中創建IOOplex珠混合物,優化,如先前所描述的(Schwenk等(2007)Mol Cell Proteomics6，125-132)，并在整個研究中利用。對于下文呈現的第一和第二種方法，利用羧化磁珠(MagPlex Micorspheres,Luminex-Corp.)。與上文所述方案的差異是在微量滴定板(Greiner Bioone)中偶聯珠,并且清洗珠，將板放到磁體(LifeS印t，Dexter)上。最后，在溶液中創建76plex珠混合物。血清和血漿標記和測定方法首先，將樣品(血漿或血清)于室溫融化，并以10，OOOrpm離心10分鐘。將30 μ I每種樣品轉移到微量滴定板(Abgene)中，然后將板密封，渦旋振蕩，并離心(以3，OOOrpm持續I分鐘)。接著，將3μ I每種樣品轉移到新的微量滴定板中，接著使用液體處理儀·(PlateMate 2x2，Matrix)來將22 μ I Ix PBS添加至每個樣品，然后將板密封，渦旋振蕩，并離心(以3，OOOrpm持續I分鐘)。隨后，以10倍摩爾過量添加生物素酰-四氧雜十五烷酸的N-羥基琥珀酰亞氨基酯(NHS-PE04-生物素，Pierce)以產生總體1/10樣品稀釋，接著于4°C在微量滴定板搖動器(Thermomixer,Eppendorf)中溫育超過2小時。通過添加超過生物素250倍摩爾過量的Tris-HCI，pH 8. O來停止反應，并于4°C再溫育20分鐘。然后，將樣品立即使用或于_80°C貯存。在不除去未摻入的生物素的情況中利用所有樣品，并以1/50稀釋，即，I μ I樣品和49 μ I測定緩沖液，其由補充有0. 5mg/ml非特異性兔IgG (Bethyl)的含0. 1% (w/v)酪氨酸的PBS(PVXC)中的0.5% (w/v)聚乙烯醇和0.8% (w/v)聚乙烯吡咯烷酮(Sigma)組成。作為對照，包括非特異性兔 IgG (Jackson ImmunoResearch)和 HAS 結合Aff ibody (AffibodyAB)。接著，將板于72°C熱處理15分鐘，接著于23°C在熱循環儀(DNA Engine Tetrad循環儀，PTC225，BioRad)中溫育15分鐘。然后，將板離心(以3，OOOrpm持續I分鐘)，并將45 μ I每種樣品添加至5 μ I珠混合物。在搖動器上于23°C發生溫育過夜，并且這接著是用3x 50 μ I PBST (lx PBS pH 7. 4,0. 1% Tween20)在孔中清洗珠。對于用磁珠進行的第一和第二種方法，與磁珠沉積結合使用微量滴定板(Greiner Bioone)以進行板清洗。對于所敘述的前列腺癌方法，采用濾膜底部微量滴定板(Millipore),并利用真空裝置(Millipore)來清洗珠。清洗后面接著與50 μ I含有PBS中的O. I %低聚甲醛的停止溶液一起溫育10分鐘。接著，將Ix 50 μ I PBST和50 μ I O. 5 μ g/ml在PBST中的經R-藻紅蛋白標記的鏈霉抗生物素蛋白(Invitrogen)添加至珠混合物,并在搖動器上于23°C溫育20分鐘。最后,將孔在3x 50 μ I PBST中清洗，并在100 μ I PBST中測量。讀出和數據分析使用Luminex IS 2. 3軟件每次單一特異性分析的每個顏色代碼ID計算100個事件在Luminex LX200儀上實施測量。經由經R-藻紅蛋白標記的抗兔IgG抗體(JacksonImmunoResearch)來測定每種抗體的偶聯效率。為了展現抗體-蛋白質相互作用，選擇中值熒光強度(MFI)。使用Microsoft Office Excel2003或R，即統計學計算和圖形學的一種語言和環境(lhaka，R等(1996) J. Comput. Graph. Stat. 5，299-3214)來實施數據分析和圖
/Jn ο結果a)第一種方法經由EU項目MoIPAGE獲得來自一名正常患者的血清和 血漿樣品。選擇如下的研究抗體，其靶向不同類的蛋白質諸如已知的血清蛋白質。此研究中總共包括135種單特異性抗體(msAb)，其靶向93種獨特的蛋白質編碼基因的產物。單特異性抗體獲自HPA項目(www. proteinatlas. org)。作為對照,包括非特異性兔IgG(JacksonImmunoResearch)和HSA結合Aff ibody (Aff ibody AB)。一式三份分析所有血清和血衆樣品。因此，對血漿和血清兩者調查每個溫度的一個時間間隔。因而，將樣品稀釋、標記、并在測定緩沖液中制備。然后，處理包括于23°C、37°C、45°C、56°C持續30分鐘，及于72°C持續15分鐘和于96°C持續5分鐘。在各個熱處理時間間隔后將所有樣品冷卻至23°C，然后與珠混合物組合。為了優化免疫可檢測性，在生物素化后于一定的溫度范圍熱處理樣品。測試中包括的溫度是23°〇、371、451、561、721和961。在圖I中，將展現出至少兩倍信號強度升高的蛋白質數目相對于熱處理溫度繪圖。72°C導致最高數目的具有升高的信號的蛋白質。56°C也導致相當數目的具有升高的信號的蛋白質，但是結果不優于72°C，尤其在血清樣品中。96°C僅導致少數具有升高的信號的蛋白質。在圖2中，展現出至少兩倍信號強度降低的蛋白質數目相對于熱處理溫度的圖顯示了加熱的副效應。在這里，顯示了 96°C導致相對較高數目的具有降低的信號的蛋白質，尤其在血清樣品中。于96°C，具有降低的信號的蛋白質數目在血清樣品和血漿樣品兩者中實際上都高于具有升高的信號的蛋白質數目。將溫度從56°C提高至72°C，具有降低的信號的蛋白質數目在血清中是升高的，而在血漿中是降低的。加熱至37°C和45°C顯示對信號強度沒有或僅有次要的影響。b)第二種方法經由EU項目MoIPAGE獲得來自一名正常患者的血清和血漿樣品。選擇如下的研究抗體，其靶向不同類的蛋白質諸如已知的血清蛋白質。此研究中總共包括135種單特異性抗體(msAb)，其靶向93種獨特的蛋白質編碼基因的產物。單特異性抗體獲自HPA項目(www. proteinatlas. org)。作為對照,包括非特異性兔IgG(JacksonImmunoResearch)和HSA結合Aff ibody (Aff ibodyAB)。因此，對血衆和血清兩者調查兩個溫度的四個時間間隔。將樣品稀釋、標記、并相應地在測定緩沖液中制備。然后，與于23°C的30分鐘相比，對56°C和72°C兩者選擇5、10、15和30分鐘的時間間隔。在各個熱處理時間間隔后將所有樣品冷卻至23°C，然后與珠混合物組合。對于于23°C處理30分鐘，于56°C處理30分鐘和于72°C處理15分鐘,一式三份分析樣品。在圖3中，與在第一種方法中一樣，將展現出至少兩倍信號強度升高的蛋白質數目相對于熱處理溫度繪圖。此外，72°C在血清和血漿兩者中都導致最高數目的具有升高的信號的蛋白質。56°C在血漿中導致相當數目的具有升高的信號的蛋白質，但是結果沒有72 °C那樣好。在圖4中，展現出至少兩倍信號強度降低的蛋白質數目相對于熱處理溫度的圖顯示了第二種方法的加熱的副效應。將溫度從56°C提高至72°C，對于血清和血漿兩者，具有降低的信號的蛋白質數目較小。這是令人驚訝的，因為一般認為與熱誘導的凝固相比，蛋白質更易于沉淀。圖5顯示了于23°C、56°C和72°C熱處理后的血清中靶定的92種蛋白質之6種的檢測水平。圖6顯示了血漿中實現的相應結果。使用非標準化的中值熒光強度水平在框圖中匯總了數據。在分別于23°C處理30分鐘，加熱至56°C達30分鐘，及加熱至72V達15分鐘后直接比較來自個別靶蛋白的信號強度。一些蛋白質的信號強度在加熱后降低，而一些其它蛋白質的信號強度升高。然而，值得注意的是，對于圖的所有蛋白質，信號在72°C處理后比在56°C處理后高。實際上，在第二種方法中檢出的所有蛋白質中，對于一種單一蛋白質，信號僅在溫度從56°C提高至72 °C時是降低的。總之，加熱至范圍為約50°C至約850C的溫度似乎對使用免疫學檢測時在血液或血液衍生樣品中的蛋白質分析具有有益的影響。72°C左右的溫度范圍，諸如64-85°C、66-78 °C或70-74°C似乎是特別有益的。
c)前列腺癌分組自瑞典隆德和馬爾默大學醫院(Lund and Malmo University Hospitals,
Sweden)的病理學部獲得血漿樣品。自經歷前列腺特異性抗原(PSA)水平常規測試的男性患者，收集20份具有正常PSA水平的樣品和20份具有高PSA水平的樣品。后一組具有60-3, 000ng/ml的PSA水平，其充當前列腺癌的指標，因此此組稱為癌癥組。正常組具有小于1.5ng/ml的PSA水平。超出規定的PSA水平，不易得到患者信息，并且已經獲得匿名的樣品以符合倫理要求。在沒有任何先前的疾病偏愛的情況中而僅由于其在HPA項目(ymiproteinatlas. org)內使用的驗證方法中的性能來選擇研究的抗體。此研究中總共包括96種單特異性抗體(msAb),其革巴向95種不同血清蛋白質。另外，自Roche (Basel)和HyTest(Finland)獲得三種抗PSA抗體(HPX抗體)，并且作為陽性對照包括在內。以隨機化布置分析所有血衆樣品，并經由log2轉化、整數標準化(integral normalization)、和概率商標準化(probabilistic quotient normalization)加工獲得的強度值。通過Student氏t檢驗及結合要通過火山圖顯現的相對倍數變化來鑒定在正常與癌癥樣品間展現出顯著不同檢測的蛋白質，如圖7和圖8中所顯示的。圖顯示了標準化的熒光強度率(X軸)和相應的假發現率校正的P值(y軸)，反映了差別檢出某些蛋白質如何顯著(the significance of how certain proteins are differentially detected)。每種靶物的P值越低，蛋白質差別存在的概率越高。圖內部的水平線分別標示通常使用的P 值 0. 05 和 0. Olo在圖7中，將樣品于72°C熱處理，如材料和方法部分中所描述的。發現與正常患者(低PSA水平)相比，三種HPX抗體在癌癥組(高PSA水平)中以顯著更高水平檢出PSA。另外，兩種新的標志物蛋白HPA0464(p < 0.01)和HPA0481(p < 0. 05)在癌癥組中似乎受到下調，并且僅在72°C加熱后發現。在圖8中，樣品沒有進行熱處理，并且對于這些患者，抗PSA抗體的總體顯著性降低。在這里，發現兩種新的蛋白質，其中在具有診斷為前列腺癌的風險升高的患者中，HPA0006的目標水平較高，而HPA0058的目標水平較低。因此，一些蛋白質的免疫可檢測性通過加熱升高，而一些其它蛋白質的免疫可檢測性在無加熱后更好。
總之，兩種蛋白質(HPA0464和HPA0481)在來自患有前列腺癌的受試者的熱處理樣品中比在來自健康受試者的熱處理樣品中以更低的程度檢出(圖7)。然而，在非熱處理樣品中沒有看到此差異(圖8)。因此，熱處理對于在此類分析中將兩種蛋白質鑒定為前列 腺癌生物標志是必要的。
權利要求
1.用于改善至少一種蛋白質在任選稀釋的血液、血清或血漿樣品中的免疫可檢測性的方法，包括將樣品加熱至64-85°C的溫度，之后進行樣品與至少一種親和配體間的接觸以檢測和/或量化所述至少一種蛋白質的步驟。
2.依照權利要求I的方法，其中將所述樣品加熱至66-78°C，諸如70-74°C，諸如約.72 °C的溫度。
3.依照權利要求I或2的方法，其中在所述樣品與至少4，諸如至少10，諸如至少30，諸如至少50種不同親和配體間接觸前實施加熱。
4.依照前述權利要求中任一項的方法，其中將所述溫度維持O.5-45分鐘，諸如1-30分鐘，諸如1-29分鐘，諸如5-20分鐘。
5.依照前述權利要求中任一項的方法，其中在加熱前用標記物標記所述樣品的蛋白質，所述標記物在所述樣品與所述至少一種親和配體間的接觸后在檢測步驟中直接或間接地可檢出。
6.依照權利要求5的方法，其中所述標記物含有生物素。
7.依照前述權利要求中任一項的方法，其中在加熱前將所述樣品稀釋10-10000倍，諸如 100-2500 倍。
8.依照權利要求7的方法，其中用包含兔IgG和/或酪蛋白的緩沖液稀釋所述樣品。
9.依照權利要求8的方法，其中所述緩沖液中的兔IgG的濃度是O.05-5mg/ml，諸如.0.l-2mg/ml,而所述緩沖液中的酪蛋白的濃度是O. 01-1% (w/v),諸如O. 05-2% (w/v)。
10.依照前述權利要求中任一項的方法，其中所述至少一種親和配體是至少一種抗體。
11.依照前述權利要求中任一項的方法，其中所述至少一種親和配體是與可鑒定的模塊，諸如可鑒定的珠偶聯的。
12.用于檢測和/或量化來自受試者的血液、血清或血漿中的蛋白質的方法 a)提供第一和第二任選稀釋的來自所述受試者的血液、血清或血漿樣品； b)將所述第一樣品加熱至50-85°C的溫度； c)在b)的加熱后，使所述第一樣品與至少一種親和配體接觸，所述親和配體能夠與通過加熱提高免疫可檢測性的靶蛋白選擇性相互作用； d)使尚未進行加熱的所述第二樣品與至少一種親和配體接觸，所述親和配體能夠與通過加熱沒有提高免疫可檢測性的靶蛋白選擇性相互作用； e)檢測步驟c)和d)中形成的抗體與相應的靶蛋白間的相互作用，由此檢測和/或量化所述血液、血清或血漿中的蛋白質。
13.用于鑒定醫學狀況的生物標志的方法，包括 a)提供來自患有所述醫學狀況的第一組受試者和沒有所述醫學狀況的第二組受試者的血液、血清或血漿樣品， b)任選地在稀釋后，將所述樣品加熱至50-85°C的溫度， c)在加熱后使所述樣品與能夠與至少一種蛋白質選擇性相互作用的至少一種親和配體接觸以確定各組中的所述至少一種蛋白質的水平， d)比較所述水平以鑒定在來自所述第一組的樣品中比在來自所述第二組的樣品中更高或更低的程度出現的蛋白質，如此鑒定所述醫學狀況的生物標志。
全文摘要
在本公開內容中，提供了一種用于改善至少一種蛋白質在任選稀釋的血液、血清或血漿樣品中的免疫可檢測性的方法，包括將樣品加熱至64-85℃的溫度，之后進行樣品與至少一種親和配體間的接觸以檢測和/或量化所述至少一種蛋白質的步驟。
文檔編號G01N33/53GK102803964SQ200980160052
公開日2012年11月28日 申請日期2009年6月26日 優先權日2009年6月26日
發明者M.烏倫, J.施溫克 申請人:阿特拉斯抗體有限公司