專利名稱：大腸菌檢測方法以及其中使用的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于檢測試驗樣品中微生物的存在的方法。在另一方面，本發明還涉及用于實施這種方法的診斷試劑盒。
背景技術：
在飲用水檢測和食品安全檢測中，大腸菌的存在與否被認為是重要的品質依據， 并且在飲用水和某些食品(例如，乳制品)中允許的大腸菌的量在世界各地的多個國家中是有規定的。大腸菌包括糞便大腸菌，例如大腸桿菌。食品或水樣品中存在的糞便大腸菌被用作食品或水的糞便污染以及可能存在的其他病原微生物的主要指示物。用于檢測、鑒定和/或計數水樣品中的微生物的方法可見于(例如)美國公共衛 H^l (American Public Health Association)gjft/jCXfMti]^ (American Water Works Association)和水環境聯合會(Water Environment Federation)聯合出版的第 21
^"Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater"("SMEffff") (水和廢水檢驗標準方法)。SMEffff描述了下述膜過濾技術，其常常用于水檢測中，以便獲得以相對低濃度存在于相對大量的水中的微生物的直接計數。在實施這項技術中，使特定體積的水穿過膜過濾器，將該膜在培養基或裝置中孵育特定時間段，隨后將所得微生物菌落進行計數。膜過濾技術可用于監測樣品的微生物品質，這些樣品來自旨在生產飲用水的工藝，以及來自于各種天然的、未處理的水源。用于檢測、鑒定和/或計數食品樣品中的微生物的方法通常根據食品的特性以及可能存在于樣品中的微生物的類型而有所不同。用于檢測食品樣品的方法概要包括 由美國公共衛生協會(Washington，D. C.)公布的第27版‘、tandard Methods for the Examination of Dairy Products”(乳品檢驗標準方法)，以及由美國食品藥品管理局 (the U. S. Food and Drug Administration, Washington, D. C.)公布的“Bacteriological Analytical Manual”( “BAM”)(細菌學分析手冊)。通常將固體食品懸浮于水性介質中， 并混合和/或研磨以得到可用于微生物定量分析方法中的食品材料的勻漿液。然而，上述參考方法通常相對昂貴、涉及復雜的步驟、和/或需要相對復雜的儀器和/或相對較高受訓程度的人員。例如，大多數膜過濾技術需要滅菌設備、真空歧管和結果的人工判讀。另一個缺點為膜過濾器可被小顆粒(例如，泥沙、粉塵、銹或其他懸浮顆粒) 堵塞。諸如離心之類的技術需要用于采樣大體積(例如，大于50毫升的體積)的專用電源設備，并且從這種體積中回收相對低數量的微生物需要相對長的時間段。用于樣品的微生物分析的培養裝置通常可僅容納相對小的樣品種菌體積(例如，大約1毫升)。這種局限性在水檢測領域中尤其成問題，因為美國環境保護局(U. S. Environmental Protection Agency)水質檢測條例(例如)規定檢測大(100毫升)水樣品體積。
發明內容
因此，我們認識到迫切需要用于快速檢測、鑒定和/或計數病原微生物的方法。所述方法將優選不僅快速而且成本低、簡單(不涉及復雜的設備或程序)、和/或在多種條件下(例如，不同類型樣品基質和/或病原微生物、不同微生物負荷、以及不同樣品體積)有效。具體地講，我們認識到需要用于檢測、鑒定和/或定量試驗樣品(例如，用于飲用水和食品安全檢測)中的大腸菌的簡單、有效和/或高性價比的方法。簡而言之，在一個方面，本發明提供了用于檢測樣品中存在或不存在大腸菌的方法。所述方法包括(a)提供至少一個疑似包含至少一種大腸菌菌株的樣品(優選地，為流體形式；更優選地，水樣品)；(b)提供至少一個培養裝置，其包括至少一種水合的或可水合的培養基；(c)提供至少一種粒狀濃集劑，其在培養基為水合的情況下與培養裝置中的培養基相接觸時為基本上光學透明的；(d)設置粒狀濃集劑與樣品相接觸(優選地，通過混合進行)，使得大腸菌菌株的至少一部分結合至粒狀濃集劑或被粒狀濃集劑捕集，以形成結合大腸菌的粒狀濃集劑；(e)設置結合大腸菌的粒狀濃集劑與培養裝置的培養基相接觸；(f)孵育包括與培養基(所述培養基為水合的)相接觸的結合大腸菌的粒狀濃集劑的培養裝置；以及(g)在不將大腸菌菌株與粒狀濃集劑分離的情況下，光學檢測大腸菌菌株的存在 (例如，大腸菌菌株的至少一個菌落的存在)。優選地，大腸菌為產氣大腸菌(更優選地，大腸桿菌(Escherichia coli))，培養裝置包括含有至少一種可發酵營養物質的培養基(更優選地，培養裝置為包括含有至少一種可發酵營養物質的培養基的平膜培養裝置)，粒狀濃集劑包括微粒(更優選地，無機微粒)，和/或光學檢測包括檢測至少一種顏色變化(更優選地，至少一種顏色變化以及鄰近大腸菌菌株的至少一個菌落的至少一個氣泡的存在)。所述方法還優選包括離析(優選地，通過重力沉降)結合大腸菌的粒狀濃集劑、從樣品中分離所得離析的結合大腸菌的粒狀濃集劑、鑒定大腸菌菌株、和/或定量或計數大腸菌濃度。光學檢測步驟可為人工的或自動的。已經發現，某些相對低成本的粒狀濃集劑可有效濃集大腸菌(包括(例如)相對大體積的樣品(例如，100毫升水樣品)中的相對低含量的大腸菌)，使得細菌不但保持活性以用于檢測或分析，而且令人驚訝地可在存在(并且沒有分離或去除)粒狀濃集劑的情況下進行光學檢測或分析(甚至通過自動光學檢測系統)。這種粒狀濃集劑可用于濃集存在于樣品(例如，食品或水樣品)中的大腸菌菌株，以使得可更容易和快速地分析大腸菌菌株中的一個或多個。
令人驚訝地是，用于本發明方法中的粒狀濃集劑通常不會顯著干擾大腸菌代謝 (包括酶和/或氣體產生)和菌落生長，或干擾檢測、鑒定和/或定量大腸菌通常所依據的大腸菌菌落指示物特性(例如，顏色變化和/或氣泡)。因此，令人驚訝地是，孵育和檢測期間所存在的粒狀濃集劑通常不會顯著降低大腸菌檢測的精確度，包括專門鑒定大腸桿菌 (這對于通過食品和/或飲用水品質檢測來保持公共健康至關重要，如上所述)所需的更嚴格檢測。本發明的方法可在水檢測中(其中水樣品通常包含相對低數量的大腸菌)提供增加的采樣效率(例如，相對于0. ImL常規未濃集的平板接種體積，能夠使樣品體積增加約兩個數量級和/或使可檢測微生物濃度降低約兩個數量級)，并且可通過使用粒狀濃集劑避免與使用用于濃集的膜過濾器相關的過濾器堵塞問題。通過能夠有效的樣品濃集，所述方法可與可僅容納相對小樣品種菌體積(例如，約1毫升)的培養裝置相容。本發明的方法相對簡單并且成本低(不需要復雜設備、昂貴的菌株特異性材料或高受訓程度的人員)并且可在現場相對快速地實施(優選實施例能夠在約22至M小時內檢測大腸菌)，而不需要較復雜現有技術的大腸菌檢測方法(例如，膜過濾)通常所需的專門配備的實驗室裝置。另外，所述方法可對多種大腸菌和多種樣品(不同樣品基質，并且不同于至少一些現有技術的方法，甚至為具有低大腸菌含量和/或大體積的樣品)有效。 因此，本發明的方法的至少一些實施例可滿足上述對于在多種條件下快速檢測病原微生物 (特別是大腸菌)的低成本、簡單方法的迫切需要。在另一方面，本發明還提供了用于實施本發明方法的診斷(或樣品檢測)試劑盒， 所述試劑盒包括(a)至少一種培養裝置，其包括至少一種水合的或可水合的培養基；和(b)至少一種粒狀濃集劑，其在培養基為水合的情況下與培養裝置中的培養基相接觸時為基本上光學透明的。
具體實施例方式在以下詳細說明中，描述了各組數值范圍(例如，特定部分中的碳原子數的數值范圍、特定組分的量的數值范圍等等)，并且在每組數值范圍內，范圍的任何下限可與范圍的任何上限配對。這種數值范圍另外旨在包括包含在該范圍內的所有數(例如，1至5包括 1,1. 5、2、2· 75,3,3. 80、4、5 等等)。如本文所用，術語“和/或”意指所列要素的一個或全部，或所列要素的任何兩個或更多個的組合。術語“優選的”和“優選地”是指本發明的實施例在某些情況下可提供一定的益處。 然而，其他實施例在相同或其他情況下也可能是優選的。此外，對一個或多個優選實施例的表述并不暗示其它實施例是不可用的，且并非意圖將其它實施例排除在本發明范圍之外。當術語“包含”及其變型出現在具體實施方式
和權利要求中時不具有限制的意思。本文所用的“一種(個)”、“所述(該)”、“至少一種(個)”以及“一種或多種(一個或多個)”可互換使用。因此，例如，疑似包含“一種”靶大腸菌的液體樣品可被理解為是指該液體樣品可包含“一種或多種”靶大腸菌。上述“發明內容”部分并非旨在描述本發明的每個實施例或每種實施方式。以下具體實施方式
更具體地描述了示例性實施例。在整個具體實施方式
中，通過實例的列表提供指導，這些實例可以各種組合使用。在每種情況下，所述列表僅用作代表性的組類，并且不應解釋為排他性列表。本專利申請中使用的“大腸菌菌株”是指可通過檢測方法區分的特定類型的大腸菌(例如，不同屬的大腸菌、屬內不同種的大腸菌、或種內不同隔離群的大腸菌)；“濃集劑”是指結合包括大腸菌在內的微生物的材料或組合物(優選地，微生物捕集或結合效率為至少約60% ；更優選地，至少約70% ；甚至更優選地，至少約80% ；最優選地，至少約90% )；“培養裝置”是指可用于在將允許至少一個細胞發生分裂的條件下繁殖微生物(包括大腸菌)的裝置(優選地，培養裝置包括用于降低或最小化偶發污染可能性的殼體和/ 或支持微生物生長的營養物質源)；“檢測”是指鑒定微生物(例如，靶大腸菌)的至少一種組分，由此確定微生物的存在；“遺傳檢測”是指對來自靶大腸菌的遺傳物質組分(如DNA或RNA)的鑒定；“免疫檢測”是指對來自靶大腸菌的抗原物質(如蛋白質或蛋白多糖)的鑒定；“微生物”是指具有適于分析或檢測的遺傳物質的任何細胞或粒子(包括(例如) 細菌、酵母、病毒和細菌內生孢子)；“光學檢測”是指對通過培養裝置或培養基(包含至少一個微生物或微生物菌落) 透射的、吸收的、發射的、反射的、折射的、散射的、或者說是轉換的(優選地，至少部分透射的)且用作至少一個大腸菌菌株存在的指示物或探針的至少一種波長的光的鑒定(包括下述光學檢測方法，例如，人視覺檢查、顯微成像、發光檢測、熒光檢測、其他模擬或數字光學成像方法(基于(例如)通過成像裝置(例如，照相機、錄像設備、或掃描儀)的反射、吸收、 透射、和/或亮度(優選地，至少部分透射)測定)等等，以及它們的組合；優選的方法包括人視覺檢查、數字光學成像(更優選地，使用掃描儀的數字光學成像)，以及它們的組合)；“樣品”是指所采集的(例如，待分析的)物質或材料；“樣品基質”是指除微生物以外的樣品組分；“基本上光學透明的”(關于粒狀濃集劑)是指相對于不存在粒狀濃集劑的對應光學檢測而言，粒狀濃集劑不會將約200nm到約1微米范圍的至少一種波長(優選地，約 400nm到約700nm范圍的至少一種可見波長)的光(“檢測波長”)的光學檢測衰減或降低超過50%，并因此不妨礙將該波長用作至少一個大腸菌菌株存在的指示物或探針(例如，粒狀濃集劑未顯著改變或損害大腸菌生長標記(例如(如)菌落形態、顏色或顏色變化、和/ 或氣泡)的觀察或成像；優選地，相對于不存在粒狀濃集劑的對應光學檢測而言，粒狀濃集劑將檢測波長的光學檢測衰減或降低小于或等于約35% (更優選地，小于或等于約25% ； 甚至更優選地，小于或等于約20%或約15% ；還更優選地，小于或等于約10% ；最優選地， 小于或等于約5%))；并且“靶大腸菌”是指需要進行檢測的任何大腸菌菌株。腿
本發明的方法可用于疑似包含大腸菌的基本上任何樣品。大腸菌為細菌的腸桿菌科的成員，并且包括桿形的、革蘭氏陰性的、不形成孢子的微生物。某些大腸菌為在孵育時 (例如，在約35-37°C的溫度下)能發酵乳糖(以產生酸和二氧化碳氣體)的產氣微生物。 大腸菌可存在于人和動物的腸內(糞便大腸菌)但也可存在于水生環境中、污垢中以及植被上。本發明的方法可用于檢測樣品中大腸菌(更優選地，產氣大腸菌；最優選地，大腸桿菌，其中約95%為產氣的)的存在。大腸菌菌屬包括埃希桿菌屬(Escherichia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、志賀氏桿菌屬(Shigella)和哈夫尼亞菌屬(Hafnia)。大腸桿菌(E. coli) 可通過其在某些類型的培養基上的生長和顯色反應(例如，得自其產生β葡糖苷酸酶的顏色變化，β葡糖苷酸酶可由約97%的大腸桿菌產生)而與大多數其他大腸菌區分開。由于大腸桿菌為幾乎唯一的糞便大腸菌，因此其存在可用作樣品的糞便污染的間接證據。可用于實施本發明的方法的合適樣品包括(但不限于)醫學樣品、環境樣品、食品樣品、飼料樣品、臨床樣品和實驗室樣品，以及它們的組合。醫學或獸醫樣品可包括(例如) 來自生物源(例如，人或動物)的細胞、組織或流體。環境樣品可為(例如)來自醫學或獸醫設施、工業設施、土壤、水源、食品制備區(食品接觸和非接觸區)、實驗室或已潛在遭受生物恐怖的區域。食品和/或水加工、處理和制備領域的樣品為優選的，因為這些樣品在大腸菌和其他細菌性病原體的污染方面通常受到特別關注。以液體形式或者以固體在液體中的分散體或懸浮液形式獲得的樣品可直接使用， 或可進行濃集(例如，通過離心法)或稀釋(例如，通過添加緩沖(控制PH的)溶液)。固體或半固體形式的樣品可直接使用或可根據需要通過(例如)用流體介質(例如，消毒水或緩沖溶液)洗滌或沖洗或者懸浮或分散于流體介質中的方法來提取。優選地，固體或半固體樣品可進行物理地(例如，勻化)和/或化學地(例如，通過與表面活性劑混合)處理， 以有助于其微生物(包括大腸菌)懸浮于流體介質中。可從表面(例如，通過擦拭或沖洗)獲取樣品。優選地，樣品為流體(例如，液體、 氣體或者固體或液體在液體或氣體中的分散體或懸浮液)。可用于實施本發明的方法的樣品實例包括食品(例如，新鮮產品或即食型午餐或 “熟食”肉類)；飲料(例如，汁或碳酸飲料)；水(包括飲用水)；生物學液體、細胞或組織； 等等。優選樣品包括食品、飲料、水，以及它們的組合(飲料、水以及它們的組合是更優選的；水為甚至更優選的；并且飲用水為最優選的)。可適用于實施本發明的方法的流體樣品的非限制性實例包括地表水、人或動物用水、生物藥物制劑用水、懸浮于水性溶劑中的食品或乳品、飲料、果汁、工業用水、清洗水、灌溉用水、冷卻水、循環水、鍋爐水、鍋爐補給水、地下水、再生水、經處理的水和廢水。樣品體積可根據具體應用而不同。當所述方法用于食品病原體檢測分析或用于飲用水安全性檢測時，樣品的體積可通常為毫升至升的范圍(例如，100毫升至3升)。在工業應用中，例如生物工藝或制藥配方中，所述體積可為成千上萬升。在本發明的方法中使用粒狀濃集劑可從樣品中以濃集狀態分離出包括大腸菌的微生物，并且另外可允許將包括大腸菌的微生物與可阻礙所使用的檢測程序的樣品基質組分分離開。可任選地，可通過其他微生物濃集方法來補充粒狀濃集劑的使用。例如，如果需要附加的濃集，可在將粒狀濃集劑用于實施本發明的方法之前或之后利用或實施離心或基于排除尺寸的過濾(包括膜過濾)。培養裝置適用于實施本發明的方法的培養裝置包括下述那些裝置，其包含至少一種可用于允許或促進包括大腸菌的微生物生長或代謝的培養基。培養裝置的培養基可包含至少一種營養物質(優選地，至少一種可發酵營養物質)以支持至少一個大腸菌菌株的生長或代謝， 以及可任選包含至少一種指示物以有利于菌株的檢測。優選地，培養裝置為平膜培養裝置 (例如，包括至少一個自支承基膜或基底和至少一個蓋膜或片材)。可支持多種微生物生長的營養物質的非限制性實例包括蛋白胨類、酵母提取物、 葡萄糖等等，以及它們的組合。用于生長和/或鑒定包括大腸菌在內的某些微生物或微生物群所需要或期望的具體營養物質或營養物質組合為本領域中已知的(例如，紫紅膽鹽瓊脂(VRBA)可用于大腸菌生長)。如果需要，培養裝置的培養基還可包含至少一種選擇劑(例如，鹽、表面活性劑或抗生素)，以便相對可存在于樣品中的非靶微生物來提供有利于靶大腸菌生長和/或檢測的環境。培養基還可包含膠凝劑。合適的膠凝劑包括可溶于冷水的天然和合成的膠凝劑。 此類膠凝劑的非限制性實例包括瓜耳膠、黃原膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、聚丙烯酰胺、刺槐豆膠、褐藻膠等等，以及它們的組合。可將培養基置于基本上任何合適的容器或殼體(例如，培養皿、燒杯或燒瓶)內以降低或最小化偶發污染的可能性。優選地，可在將結合大腸菌的粒狀濃集劑設置為與培養基相接觸之前對培養基和容器或殼體進行滅菌。可用于實施本發明的方法的合適培養裝置包括含有形式為預成形水凝膠基質 (例如，瓊脂、瓊脂糖、或果膠酸鈣)的培養基的那些培養裝置；干燥、可再水合、平膜培養裝置(例如，描述于美國專利號4，476，226 (Hansen等人)；5，089，413 (Nelson等人)； 5，232，838 (Nelson 等人)；6, 331, 429 (Ushiyama)；和 6，638，755 (Mizuochi 等人)中的那些；上述專利的描述以引用方式并入本文中)；具有與水性混合物流體連通的多孔支承體的培養裝置；等等，以及它們的組合。可用的多孔支承體可具有多種物理形式(例如，織造織物、非織造物、凝膠、泡沫、 網孔、稀松布、釉料、微復制型膜等等)中的任何一種。可用的多孔支承體可由親水材料(例如，濾紙或玻璃纖維濾器)構造。或者，多孔支承體可由經處理以賦予材料親水性的疏水材料或固有地能夠通過(例如)毛細管作用運輸水性溶劑或溶液的疏水材料構造。優選地， 多孔支承體將不包含可通過水性溶劑運輸并且妨礙檢測靶大腸菌的材料。用于實施本發明的方法的優選培養裝置包括干燥、可再水合、平膜培養裝置以及它們的組合。3M Petrifilm 大腸菌計數平板和3M Petrifilm 大腸桿菌/大腸菌計數平板(得自3M公司(M.Paul，MN))為優選的干燥、可再水合、平膜培養裝置(后者為更優選的)。這些平板為可用于繁殖、檢測和/或計數大腸菌的樣品即用型培養裝置。另外，后一種平板包含有利于在簡單的一步檢測、鑒定和計數方法中來鑒定大腸桿菌的指示物(通過檢測至少一種顏色變化和鄰近至少一個大腸菌菌落的至少一個氣泡的存在)。本發明的方法通過其使用粒狀濃集劑而尤其可用于將稀釋的、相對大體積(例如，100毫升水)樣品中的微生物濃集成最終的1毫升體積，從而可使用標準吸液技術直接轉移至平板。
濃集劑MM適用于實施本發明的方法的濃集劑包括可結合包括大腸菌在內的微生物并且為基本上光學透明的(如上文定義)那些顆粒材料或組合物。如果需要，粒狀濃集劑可通過其在下述特定光學檢測方法中的光學透明性水平進行預篩檢，所述特定光學檢測方法為測定用于探測包含粒狀濃集劑和水合培養基的樣品的選定波長的光的光學檢測程度(相對于同一波長在用于探測包含水合培養基而不含粒狀濃集劑的相應對照樣品時的光學檢測程度)。根據(例如)待使用粒狀濃集劑的量和/或其平均粒度，優選的是選擇不會顯著吸收選定波長的光和/或折射率相對接近地匹配于水合培養基的折射率的濃集劑。例如， 這二者的折射率差可選擇為小于約0. 2 (優選地，小于約0. 1 ；更優選地，小于約0. 05 ；甚至更優選地，小于約0. 02 ；最優選地，小于約0. 01)。優選地(尤其是在用于涉及相對大樣品體積和/或相對低大腸菌濃度的水品質檢測中)，相對于不含濃集劑的相應對照樣品，粒狀濃集劑可捕集或結合存在于樣品中的包括大腸菌在內的微生物的至少約60% (更優選地， 至少約70% ；甚至更優選地，至少約80% ；最優選地，至少約90% )。合適的粒狀濃集劑包括粒狀無機材料(例如，金屬氧化物、金屬硅酸鹽、二氧化硅、金屬碳酸鹽、金屬磷酸鹽、硅藻土、表面改性的硅藻土等等，以及它們的組合)；具有官能團的粒子(例如，胺-官能化玻璃微珠)；具有生物分子、生物分子片段和/或生物分子衍生物的粒子(例如，具有表面結合抗體、蛋白質或維生素的微珠)；具有無機材料涂層的粒子；等等；以及它們的組合。如果需要，粒子可包括具有表面涂層或表面結合基團(例如， 無機表面涂層或表面結合生物分子)的磁芯，前提條件是這種粒子可以足夠小的量存在使得可保持基本光學透明性(如上文所述)。粒狀無機材料、具有官能團的粒子(優選地，官能化玻璃微珠；更優選地，胺-官能化玻璃微珠)以及它們的組合是優選的，其中粒狀無機材料是更優選的。優選的粒狀無機材料包括選自如下的那些金屬硅酸鹽(例如，硅酸鎂)；二氧化硅；金屬碳酸鹽(例如， 碳酸鈣)；金屬磷酸鹽(例如，羥基磷灰石)；金屬氧化物、金或鉬改性的硅藻土；以及它們的組合。金屬碳酸鹽(優選地，碳酸鈣)；二氧化鈦、金或鉬改性的硅藻土(優選地，二氧化鈦改性的硅藻土)；二氧化硅；金屬磷酸鹽(優選地，羥基磷灰石)；無定形金屬硅酸鹽(優選地，無定形的球化硅酸鎂)；以及它們的組合是更優選的。無定形的球化硅酸鎂為最優選的。優選地是，粒狀濃集劑包括微粒。微粒的優選粒度范圍為約1微米(更優選地，約 2微米；甚至更優選地，約3微米；最優選地，約4微米)至約100微米(更優選地，約50微米；甚至更優選地，約25微米；最優選地，約20微米)；其中任何下限可與范圍中的任何上限配對。使用上述濃集劑進行的濃集或捕集通常不特異性針對任何特定菌株、種或類型的微生物，并因此提供對樣品中微生物全體群落的濃集。然后，可使用任何已知的光學檢測方法用菌株特異性探針從捕集的微生物群落中檢測特定的微生物菌株。當分散或懸浮于水體系中時，無機材料顯示具有表征材料和水體系pH的表面電荷。整個材料-水界面上的電位稱為“ζ電位”，其可由電泳遷移率(即，由材料顆粒在設置于水體系中的帶電電極之間的移動速率)進行計算。優選地，濃集劑在約7的pH下具有負ζ電位。金屬硅酸鹽適用于實施本發明方法的金屬硅酸鹽濃集劑包括金屬的無定形硅酸鹽，金屬例如為鎂、鈣、鋅、鋁、鐵、鈦等等(優選地，鎂、鋅、鐵、和鈦；更優選地，鎂)，以及它們的組合。優選為至少部分熔融顆粒形式的無定形金屬硅酸鹽(更優選地，無定形、球化金屬硅酸鹽；最優選地，無定形的球化硅酸鎂)。金屬硅酸鹽為已知的并且可通過已知方法進行化學合成， 或者通過開采和加工天然存在的原礦獲得。無定形、至少部分熔融顆粒形式的金屬硅酸鹽可通過下述已知方法中的任何一種來制備，所述已知方法為在可控條件下熔融或軟化相對小的進料粒子(例如，平均粒度至多為約25微米)以制備大致橢圓形或球形粒子(即，具有通常為大致圓形且不含尖角或尖銳邊緣的放大二維圖像的粒子，包括真正或基本上圓形和橢圓形的形狀以及任何其他的圓形或彎曲形狀)。這種方法包括原子化、火拋光、直接熔融等等。優選方法為火焰熔融，其中通過直接熔融或火拋光固體進料粒子形成至少部分熔融的、基本上玻璃狀的粒子(例如， 如同描述于美國專利號6，045，913 (Castle)的方法，其說明書以引用方式并入本文中)。最優選地，這種方法可通過將無規則形狀進料粒子的相當大一部分(例如，約15至約99體積％ ；優選地，約50至約99體積％ ；更優選地，約75至約99體積％ ；最優選地，約90至約 99體積％ )轉換成大致橢圓形或球形的粒子而用于制備無定形、球化金屬硅酸鹽。一些無定形金屬硅酸鹽為市售的。例如，無定形的球化硅酸鎂可商購獲得以用于化妝品制劑(例如，以 3M Cosmetic Microspheres CM-111 得自 3M 公司(St. Paul，MN))。無定形金屬硅酸鹽濃集劑還可包括其他材料(包括金屬(例如，鐵或鈦)的氧化物、結晶金屬硅酸鹽、其他結晶材料等等)。然而，濃集劑優選基本上不含結晶二氧化硅。適用于實施本發明的方法的尤其優選的濃集劑包括含有無定形金屬硅酸鹽并且具有下述表面組成的那些濃集劑，所述表面組成具有的金屬原子與硅原子的比率小于或等于約0. 5 (優選地，小于或等于約0. 4 ；更優選地，小于或等于約0. 3 ；最優選地，小于或等于約0.2)，如通過X射線光電子能譜(XPS)所測定。這種濃集劑包括描述于美國臨時專利申請號60/977，180 (3M Innovative I^roperties公司)中的那些，其中濃集劑及其制備方法的描述以引用方式并入本文中。優選地，尤其優選的濃集劑的表面組成還包括至少平均約10原子％的碳(更優選地，至少平均約12原子％的碳；最優選地，至少平均約14原子％的碳)，如通過X射線光電子能譜(XPQ所測定。XPS為可測定樣品表面的最外側約3至10納米(nm)的元素組成并且對周期表中除氫和氦之外的所有元素均敏感的技術。XPS為對于大多數原子而言檢測極限位于0. 1原子％至1原子％濃度范圍的定量技術。XPS的優選表面組成評價條件可包括相對于接受立體角為士 10度的樣品表面測得的90度的飛離角。這種優選的金屬硅酸鹽濃集劑與(例如)普通金屬硅酸鹽(例如普通滑石)相比可具有帶更高負電的ζ電位。另外令人驚訝地是，這種濃集劑比滑石可更有效地濃集諸如細菌之類的微生物(其表面通常往往帶負電)。優選的是，這種濃集劑在約7的pH下具有負ζ電位(更優選地，在約7的pH下具有約-9毫伏至約-25毫伏范圍的Smoluchowski ζ 電位；甚至更優選地，在約7的pH下具有約-10毫伏至約-20毫伏范圍的Smoluchowski ζ電位；最優選地，在約7的pH下具有約-11毫伏至約-15毫伏范圍的Smoluchowski ζ電位)。表面改件的硅藻土適用于實施本發明方法的表面改性的硅藻土濃集劑包括下述濃集劑，所述濃集劑包括其表面至少一部分上具有表面處理物的硅藻土，所述表面處理物包含表面改性劑，所述表面改性劑包括金屬氧化物(優選地，二氧化鈦；然而可使用其他金屬氧化物(單獨或結合使用)，前提條件是這種金屬氧化物可以足夠小的量存在使得可保持基本光學透明性 (如上文所述))、細納米級金或鉬，或者它們的組合。這種濃集劑包括描述于美國臨時專利申請號60/977，200 (3Μ Innovative Properties公司)中的那些，其中所述濃集劑及其制備方法的描述以引用方式并入本文中。表面處理物還優選包括選自氧化鐵、氧化鋅、氧化鋁等等，以及它們的組合(更優選地，氧化鐵)的金屬氧化物。盡管已知諸如金之類的貴金屬具有抗微生物特性，但令人驚訝的是，用于本發明的方法中的含金濃集劑不僅可有效用于濃集微生物而且還可使得它們具有活性以便進行檢測或分析。可用的表面改性劑包括細納米級金；細納米級鉬；細納米級金與至少一種金屬氧化物(優選地，二氧化鈦、氧化鐵，或它們的組合)的組合；二氧化鈦；二氧化鈦與至少一種其他(即，除二氧化鈦之外)金屬氧化物的組合；等等；以及它們的組合。優選的表面改性劑包括細納米級金；細納米級鉬；細納米級金與至少氧化鐵或二氧化鈦的組合；二氧化鈦； 二氧化鈦與至少氧化鐵的組合；以及它們的組合。更優選的表面改性劑包括細納米級金；細納米級鉬；細納米級金與氧化鐵或二氧化鈦的組合；二氧化鈦；二氧化鈦與氧化鐵的組合；以及它們的組合(甚至更優選地，細納米級金；細納米級金與氧化鐵或二氧化鈦的組合；二氧化鈦與氧化鐵的組合；二氧化鈦；以及它們的組合)。細納米級金、細納米級金與氧化鐵或二氧化鈦的組合、二氧化鈦，以及它們的組合是更優選的，其中二氧化鈦為最優選的。表面改性的硅藻土濃集劑中的至少一些與未經處理的硅藻土相比具有帶至少稍高正電的ζ電位，并且濃集劑可令人驚訝地比未經處理的硅藻土能顯著更有效地濃集諸如細菌之類的微生物(其表面通常往往帶負電)。優選的是，這種濃集劑在約7的pH下具有負ζ電位(更優選地，在約7的pH下具有約-5毫伏至約-20毫伏范圍的ζ電位；甚至更優選地，在約7的pH下具有約-8毫伏至約-19毫伏范圍的ζ電位；最優選地，在約7的 PH下具有約-10毫伏至約-18毫伏范圍的ζ電位)。包含細納米級金或鉬的表面改性的硅藻土濃集劑可通過這樣制備通過物理氣相沉積(任選地，通過氧化氣氛中的物理氣相沉積)將金或鉬沉積在硅藻土上。如本文所用， 術語“細納米級金或鉬”是指所有維度上的尺寸均小于或等于5納米(nm)的金或鉬團粒 (例如，粒子或原子簇)。優選地，所沉積的金或鉬的至少一部分在所有維度(例如，粒徑或原子簇直徑)上的平均尺寸范圍為至多(小于或等于)約IOnm(更優選地，至多約5nm;甚至更優選地，至多約3nm)。在最優選的實施例中，至少一部分金是超納米級的(即，至少兩個維度上的尺寸小于0. 5nm,并且所有維度上的尺寸小于1. 5nm)。可通過透射電子顯微鏡(TEM)分析法來測定單個金或鉬納米粒子的尺寸，這是本領域中熟知的。硅藻土(或硅藻土粉)為由硅藻(一種海洋棲居微生物)殘余物產生的天然硅土材料。因此，其可得自天然來源并且也為市售的(例如，得自Alfa Aesar, A Johnson Matthey Company,Ward Hill,ΜΑ) 0硅藻土粒子通常包括小的、開放的二氧化硅網絡(形式為對稱立方體、圓柱體、球體、板、矩形盒等等)。這些粒子的孔結構通常可為顯著均一的。硅藻土可以原始開采材料或以純化和任選碾磨的粒子進行使用。優選地，硅藻土為具有直徑尺寸范圍為約1微米至約50微米(更優選地，約3微米至約10微米)的碾磨粒子形式。可任選將硅藻土在使用之前進行熱處理以去除有機殘余物的任何殘跡。如果使用熱處理，則優選熱處理為500°C或更低，因為較高溫度可產生不利地高含量的結晶二氧化娃。提供于硅藻土上的金或鉬的量可在寬范圍上變化。由于金和鉬為昂貴的，因此期望使用不超過實現所需濃集活性程度而所需要的合理量。另外，因為納米級金或鉬在使用 PVD沉積時可具有高度移動性，如果使用過多的金或鉬，則活性可因金或鉬中的至少一些聚集成較大團粒而損失。由于這些原因，按硅藻土和金或鉬的總重量計，硅藻土上的金或鉬的負載重量范圍優選為約0. 005(更優選地，0. 05)至約10重量％、更優選為約0. 005(甚至更優選地， 0. 05)至約5重量％、并且甚至更優選為約0. 005(最優選地，0. 05)至約2.5重量％。可以通過PVD技術(例如，通過濺射)沉積金和鉬，從而在載體表面上形成濃集活性物質的細納米級粒子或原子簇。據信，金屬主要以元素形式沉積，但也可存在其它氧化態。除了金和/或鉬之外，還可在同一硅藻土載體和/或與含金和/或鉬載體混合的其他載體上提供一種或多種其他金屬。這種其它金屬的例子包括銀、鈀、銠、釕、鋨、銅、銥等等，以及它們的組合。如果使用這些其它金屬，則可由與所使用的金或鉬源靶相同或不同的靶源將它們共沉積到載體上。或者，可在沉積金和/或鉬之前或之后將這些金屬提供于載體上。可在沉積金和/或鉬之前有利地將需熱處理活化的金屬施加到載體上并進行熱處理。物理氣相沉積是指金屬從含金屬的源或靶向載體介質的物理轉移。可以各種不同的方式實施物理氣相沉積。代表性的方法包括濺射沉積(優選的)、蒸鍍和陰極電弧沉積。 可使用這些或其他PVD方法中的任何一種來制備用于實施本發明的方法的濃集劑，但PVD 技術的特性可賦予所得活性。可通過利用目前使用的或者將來為此目的開發的任何類型的設備來實施PVD。為了確保載體表面受到足夠的處理，優選在充分混合(例如，翻滾、流化、碾磨等) 待處理的載體介質的同時進行物理氣相沉積。美國專利No. 4，618，525 (Chamberlain等人) 中描述了用于PVD沉積的翻滾粒子的方法，其說明書以引用方式并入本文中。當在細粒子或細粒子聚集體(例如，平均直徑小于約10微米)上實施PVD時，優選在至少一部分PVD 過程期間對載體介質即進行混合又進行粉碎(例如，研磨或碾磨到一定程度)。可以在寬范圍內的基本上任意所需的溫度條件下實施物理氣相沉積。然而，如果在相對較低的溫度下沉積金屬(例如，溫度低于約150°C、優選低于約50°C、更優選在環境溫度(例如，約20°C至約27°C)或更低)，則沉積的金屬可具有更大的活性(也許是因為缺陷更多和/或移動性及聚結程度更低)。基于有效性和經濟性的考慮，環境條件下的操作通常可以是優選的，因為在沉積過程中不需要進行加熱或冷凍。可在惰性濺射氣體氣氛中(例如，在氬、氦、氙、氡或者它們中的兩者或更多者的混合物(優選地，氬)中)實施物理氣相沉積，并且可任選在氧化氣氛中實施物理氣相沉積。優選地，氧化氣氛包含至少一種含氧氣體(更優選地，含氧氣體選自氧、水、過氧化氫、 臭氧，以及它們的組合；甚至更優選地，含氧氣體選自氧、水，以及它們的組合；最優選地， 氧)。氧化氣氛中還包含惰性濺射氣體，如氬、氦、氙、氡或者它們中的兩種或更多種的混合物(優選為氬)。在PVD過程期間，真空室中的(所有氣體的)總氣壓可以為約1毫托至約 25毫托(優選為約5毫托至約15毫托)。按真空室中的所有氣體的總重量計，氧化氣氛可包含約0. 05重量％至約60重量％的含氧氣體(優選地，約0. 1重量％至約50重量％ ；更優選地，約0. 5重量％至約25重量％ )。可任選將硅藻土載體介質在金屬沉積之前進行煅燒，但這會增加其結晶二氧化硅含量。由于金和鉬在通過PVD沉積時立即具有活性，因此通常不需要在金屬沉積之后進行熱處理，這與通過一些其他方法的沉積不同。然而如果需要，也可實施這種熱處理或煅燒以提高活性。一般來講，熱處理可涉及在約125°C至約1000°C范圍的溫度下對載體加熱約1秒至約40小時、優選為約1分鐘至約6小時的時間段，加熱可以在任何合適的氣氛中進行，例如空氣、惰性氣氛(例如氮、二氧化碳、氬)、還原性氣氛(例如氫)等等。采用的具體熱條件可取決于包括載體性質在內的各種因素。一般來講，熱處理可以在低于使載體組分發生分解、降解、或者說是不當地受到熱損害的溫度下實施。根據諸如載體性質、金屬量等等之類的因素，如果在過高的溫度下對系統進行熱處理，則活性可能會在一定的程度上受到損害。包含金屬氧化物的表面改性的硅藻土濃集劑可通過這樣制備通過水解可水解金屬氧化物前體化合物將金屬氧化物沉積于硅藻土上。合適的金屬氧化物前體化合物包括可被水解以形成金屬氧化物的金屬絡合物和金屬鹽。可用的金屬絡合物包括下述絡合物，其具有醇鹽配體、過氧化氫配體、羧酸鹽官能化配體等等，以及它們的組合。可用的金屬鹽包括金屬硫酸鹽、硝酸鹽、鹵化物、碳酸鹽、草酸鹽、氫氧化物等等，以及它們的組合。使用金屬鹽或者過氧化氫或羧酸鹽官能化配體的金屬絡合物時，可通過化學或熱方法來誘導水解。在化學誘導水解中，可將金屬鹽以溶液形式引入硅藻土的分散體中，并且通過加入堿溶液來增加所得組合的PH直至金屬鹽作為金屬的氫氧化物絡合物沉淀于硅藻土上。合適的堿包括堿金屬和堿土金屬的氫氧化物和碳酸鹽、銨和烷基銨的氫氧化物和碳酸鹽等等，以及它們的組合。金屬鹽溶液和堿溶液的濃度通常可為約0. 1至約2M。優選地，在攪拌(優選地，快速攪拌)硅藻土分散體的情況下實施將金屬鹽加入至硅藻土中。可將金屬鹽溶液和堿溶液單獨(以任一順序)或同時引入到硅藻土分散體中， 以便使所得金屬氫氧化物絡合物與硅藻土的表面進行優選基本上均一的反應。在反應期間可任選加熱反應混合物以加快反應速度。一般來講，所添加的堿量可等于金屬的摩爾數乘以金屬鹽或金屬絡合物上的非氧或非羥基抗衡離子數。或者，當使用鈦或鐵的鹽時，可熱誘導金屬鹽水解以形成金屬的氫氧化物絡合物并且與硅藻土的表面相互作用。在這種情況下，通常可將金屬鹽溶液加入到下述硅藻土分散體(優選地，攪拌分散體)中，所述硅藻土分散體已加熱至足夠高的溫度(例如，大于50°C)以便促進金屬鹽的水解。優選的是，溫度為約75°C至100°C，但如果在高壓釜設備中進行反應，則可使用較高的溫度。當使用金屬醇鹽絡合物時，可誘導金屬絡合物水解以通過金屬醇鹽在醇溶液中的部分水解來形成金屬的氫氧化物絡合物。金屬醇鹽溶液在存在硅藻土的情況下的水解可產生沉積于硅藻土表面上的金屬氫氧化物物質。或者，可通過在存在硅藻土的情況下使金屬醇鹽在氣相中與水反應，從而將金屬醇鹽水解并沉積到硅藻土表面上。在這種情況下，可在(例如)流化床反應器或轉筒式反應器中于沉積期間攪動硅藻土。金屬氧化物前體化合物在存在硅藻土的情況下進行上述水解之后，可通過沉淀或通過過濾或通過其他已知的技術來分離所得的經表面處理的硅藻土。可將分離產物通過用水洗滌來純化并隨后進行干燥(例如，在50°C至150°C )。雖然通常使經表面處理的硅藻土在干燥之后進行官能化，但可任選在通常不損失官能性的情況下通過在空氣中加熱至約250°C至650°C進行煅燒來去除揮發性副產物。當將金屬醇鹽用作金屬氧化物前體化合物時，優選進行該煅燒步驟。一般來講，利用鐵的金屬氧化物前體化合物時，所得的表面處理包括氧化鐵納米顆粒。當氧化鐵與硅藻土的重量比為約0.08時，X射線衍射(XRD)不會顯示明確的氧化鐵材料的存在。相反，在3.80、3.68和2.94入下觀察額外的乂射線反射。該材料的TEM檢查顯示出硅藻土表面相對均勻地涂布有球形納米顆粒狀氧化鐵材料。氧化鐵材料的微晶尺寸小于約20nm，且大部分微晶的直徑小于約lOnm。這些球形微晶在硅藻土表面上的堆積在外觀上為致密的，并且硅藻土表面由于這些微晶的存在而似乎為粗糙的。一般來講，利用鈦的金屬氧化物前體化合物時，所得的表面處理包括納米顆粒二氧化鈦。當將二氧化鈦沉積至硅藻土上時，所得產物在煅燒至約350°c之后的XRD可顯示出存在銳鈦型二氧化鈦的小微晶。利用相對較低的鈦/硅藻土比率時或者在其中使用鈦和鐵氧化物前體的混合物的情況下，通過X射線分析通常觀察不到銳鈦的跡象。由于二氧化鈦為熟知的強效光氧化催化劑，因此本發明中的經二氧化鈦改性的硅藻土濃集劑可用于濃集微生物以進行分析，并且隨后還可任選用作光活化劑以殺滅殘余微生物和去除使用之后的非所需有機雜質。因此，經二氧化鈦改性的硅藻土可分離待分析的生物材料并隨后進行光化學清潔以便再用。另外可將這些材料用于其中期望進行微生物去除以及抗微生物效果的過濾應用中。SM可通過多種已知的或將來開發的提供兩種材料之間接觸的方法中的任何一種來實施本發明的方法中的樣品接觸步驟。例如，可將粒狀濃集劑添加至樣品，或者可將樣品添加至粒狀濃集劑。可將具有粒狀濃集劑的浸漬片浸于樣品溶液中、可將樣品溶液傾注到具有粒狀濃集劑的膜上、可將樣品溶液傾注到具有粒狀濃集劑的導管或凹槽中、或者可使樣品溶液穿過具有粒狀濃集劑的過濾器(例如，織造或非織造材料過濾器或膜過濾器)。然而，優選的是，在多種容器中的任何一種(任選地但也優選地，帶蓋的、閉合的或密封的容器；更優選地，帶蓋的試管、瓶子或廣口瓶)中合并(使用任何添加順序)粒狀濃集劑和樣品。用于實施本發明的方法的合適容器將由具體樣品決定，并且可在尺寸和性質上大不相同。例如，容器可為小容器(例如，10毫升容器(例如，試管))或較大的容器(例如，100毫升至3升的容器(例如，錐形瓶或聚丙烯大口徑瓶))。可將直接接觸樣品的容器、粒狀濃集劑以及任何其他裝置或添加劑在使用前進行滅菌(例如，通過受控熱、環氧乙烷氣體或輻射來進行)，以便減少或防止任何可導致檢測誤差的樣品污染。足以捕集或濃集特定樣品中的微生物(包括大腸菌)以便成功檢測的粒狀濃集劑的量將有所不同(取決于(例如)粒狀濃集劑的特性、光學透明程度和捕集效率，以及樣品體積)，并且可易于由本領域技術人員確定。例如，對于一些應用可使用約100毫克濃集劑/100毫升樣品。粒狀濃集劑的優選存在量足以提供至少約60 %的捕集效率同時仍保持基本光學透明性。如果需要，可通過將粒狀濃集劑至少通過樣品一次來實現接觸(例如，通過依賴重力沉降(例如)約10分鐘的一段時間)。可通過混合(例如，通過攪拌、搖動或使用振動臺)使得濃集劑顆粒反復經過或沉降穿過樣品的大部分，來增強接觸。對于微升級的小體積(通常，小于0.5毫升)來說，諸如通過渦旋或“章動”，混合可以是快速的，例如，如美國專利號5，238，812 (Coulter等人)所述，將其說明內容以引用方式并入本文中。對于大于或等于0. 5毫升(通常0. 5毫升至3升)的較大體積來說，可通過以“翻跟頭”的方式輕輕翻轉粒狀濃集劑和樣品來實現混合，例如，如美國專利號5，576，185 (Coulter等人)所述， 將其說明內容以引用方式并入本文中。可借助于例如被設置成固定試管或其他類型反應容器并以“翻跟頭”方式緩慢旋轉該試管或容器的裝置來實現所述翻轉。可在所需時間段內實施接觸(例如，對于約100毫升或更少的樣品體積，可用的接觸時間為至多約60分鐘；優選地，約15秒至約10分鐘或更長；更優選地，約15秒至約5分鐘)。因此，在實施本發明的方法中，合并的樣品和粒狀濃集劑的混合(例如，攪動、搖動或攪拌)和/或預孵育(例如，在環境溫度下)(例如，在將結合大腸菌的粒狀濃集劑設置在培養裝置中之前)為任選但也優選的，以便增加與粒狀濃集劑的微生物接觸。優選的接觸方法包括將含微生物的樣品(優選地，流體)與粒狀濃集劑進行混合(例如，持續約15秒至約5分鐘)和預孵育(例如，持續約3分鐘至約60分鐘)。如果需要，可在粒狀濃集劑與樣品的組合中包含一種或多種添加劑(例如，裂解試劑、生物發光分析試劑、核酸捕集試劑(例如，磁珠)、微生物生長培養基、緩沖液(例如，用于潤濕固體樣品；包括(例如)使用吸附緩沖液)、微生物著色試劑、洗滌緩沖液(例如，用于洗掉未結合的材料)、 洗脫試劑(例如，血清白蛋白)、表面活性劑(例如，得自Union Carbide Chemicals and Plastics (Houston, TX)的Triton X-100非離子型表面活性劑)、機械研磨/洗脫劑(例如，玻璃微珠)、光學檢測分析組分(例如，指示劑或染料)等等)。如果需要，可將粒狀濃集劑(單獨地或者與例如載體材料組合，形式為液體(例如，水或油)、固體(例如，織物、聚合物、紙張或無機固體)、凝膠、乳劑、泡沫或糊劑)施用或擦拭至非多孔或多孔的、固體的、經微生物污染的、或微生物可污染的材料或表面上(例如，作為樣品采集的方法)。由此可在單個步驟中同時采集樣品并且使其與粒狀濃集劑接觸。離析和/或分離可任選但優選地，本發明的方法還包括離析從樣品接觸步驟中產生的結合大腸菌的粒狀濃集劑。優選可通過至少部分依賴于重力沉降(重力沉淀，例如，經約5分鐘至約30 分鐘的時間段)實現這種離析。然而，在一些情況下，可取的是加快離析(例如，通過離心或過濾)，或者采用任何所述離析方法的組合。本發明的方法還可任選但優選地包括將所得的結合大腸菌的粒狀濃集劑與樣品分離。對于流體樣品，這可涉及去除或分離因離析產生的上清液。可通過本領域中熟知的多種方法來實施上清液的分離(例如，通過潷析或虹吸，以便將結合大腸菌的粒狀濃集劑留在用于實施本方法的容器或管的底部)。本發明的方法可人工實施(例如，以批次方式)或可為自動的(例如，以便能夠進行連續或半連續處理)。孵育本發明的方法中的最初孵育步驟可通過將所得的結合大腸菌的粒狀濃集劑設置為與培養裝置的培養基相接觸來啟動，其中培養基在后續孵育期間為水合形式。這種接觸可在存在或不存在樣品的情況下(優選在不存在樣品的情況下)進行，這取決于任選離析和/或分離步驟是否已經實施。然后可將培養裝置(包含接觸水合培養基的結合大腸菌的粒狀濃集劑)在足以使至少一個細胞發生分裂的時間段和溫度下孵育。例如，可使用約12小時、15小時或18小時至約48小時(優選地，至少約18小時至約22小時)的孵育時間段和范圍為約35°C至約37°C的孵育溫度。可在培養基與結合大腸菌的粒狀濃集劑開始接觸之前或之后(例如，緊隨其后或之后幾分鐘或幾小時內)(或與此同時)進行培養基的水合(例如，通過添加水或水性稀釋組合物，其可任選包含樣品和/ 或結合大腸菌的粒狀濃集劑)。培養基優選在孵育時間段期間保持基本上水合的(和/或優選基本上保持接觸)。可任選地，可將結合大腸菌的粒狀濃集劑與水合或可水合培養基進行混合(例如，以便形成結合大腸菌的粒狀濃集劑與水合培養基的更均勻混合物)。腿已由粒狀濃集劑捕集或結合(例如，通過吸附)的大腸菌可通過基本上任何目前已知或將來開發的所需光學檢測方法來檢測。這類方法包括(例如)人視覺檢查、發光檢測、熒光檢測、顯微鏡法(例如，使用透射光顯微鏡或落射熒光顯微鏡，其可用于觀察利用熒光染料標記的微生物)、其他模擬或數字光學成像方法(基于(例如)通過成像裝置(例如，照相機、錄像設備或掃描儀)的反射、吸收、透射和/或亮度測定)等等，以及它們的組合。優選的方法包括人視覺檢查、數字光學成像(更優選地，使用掃描儀的數字光學成像)， 以及它們的組合。可在不將大腸菌菌株與粒狀濃集劑分離的情況下實施所存在的大腸菌菌株的這類光學檢測(利用一個或多個檢測波長，在所述檢測波長下粒狀濃集劑顯示具有足夠的光學透明性(稱為“基本上光學透明的”)，如上文所定義)。因此，可在培養裝置進行孵育之后，在培養裝置中進行分析(即，就地分析)。如果需要，可給光學檢測增添多種已知或將來開發的技術中(例如，免疫檢測方法和遺傳檢測方法)的任意一種，或者將光學檢測加入到多種已知或將來開發的技術中 (例如，免疫檢測方法和遺傳檢測方法)的任意一種中。大腸菌捕集之后的檢測方法可任選包括去除樣品基質組分的洗滌、染色等等。光學檢測可人工實施(例如，通過人視覺檢查)或可為自動的。用于檢測和/或計數(清點或定量)培養裝置中的微生物菌落的自動光學檢測系統為本領域中已知的。此類自動系統通常包括成像系統、確定菌落計數的圖像分析算法以及顯示和任選儲存及操作菌落計數數據和圖像的數據管理系統。用于計數瓊脂平板上的菌落的示例性系統以商品名 Protocol 購自 Synbiosis (Cambridge, UK)并且描述于美國專利號 6，002, 789 (Olsztyn 等人)中，所述系統的說明以引用方式并入本文中。用于計數3M Petrifilm 計數平板(得自3M公司(St. Paul,MN))上的菌落的系統描述于美國專利號5，403，722 (Floeder等人)； 7，298，885 (Green等人)；和7，298，886 (Plumb等人)中；所述系統的說明以引用方式并入本文中。通常，用于計數微生物菌落的自動光學檢測系統是通過菌落或來自菌落的代謝產物吸收、反射、發射、透射、折射或散射光的能力來檢測靶微生物的存在。因此，可通過諸如 (例如)色度測定法、熒光測定法或發光測定法(例如，化學發光或生物發光)之類的方法來光學檢測菌落。在用于大腸菌的至少一些測試中，大腸菌菌落可通過存在于包含乳糖的培養基中的PH指示劑的顏色變化進行檢測并且試驗性地鑒定為大腸菌。顏色變化可反映出培養基的PH變換，這可指示菌落由乳糖產生了酸性產物。因此，當觀察到這種顏色變化時，可推測菌落為大腸菌菌落。可在下述測試中確認所推測的大腸菌菌落為大腸菌，即當在菌落附近觀察到一個或多個氣泡時。一些大腸菌(包括95%的大腸桿菌)可由乳糖產生氣體(S卩，二氧化碳)。 可通過目測方法或自動系統(如美國專利號7，四8，886 (Plumb等人)中所述的自動菌落計數系統)光學地觀察這種氣泡。3M Petrifilm 大腸桿菌/大腸菌計數平板和3M Petrifilm 大腸菌計數平板 (得自3M公司6t.Paul，MN))為在水合和封閉時包含半固體、含乳糖的培養基的培養裝置， 所述培養基在其一側連續接觸自支承膜或基底并且在其另一側連續接觸覆蓋膜或片材。這種平膜培養裝置尤其適用于捕集由發酵乳糖的大腸菌微生物產生的氣泡。某些培養裝置提供了用于確切鑒定存在于培養裝置中的特定大腸菌菌株的手段， 例如選擇試劑和/或差異性試劑。例如，3M Petrifilm 大腸桿菌/大腸菌計數平板包含葡糖苷酸酶活性指示劑，其能夠鑒定為大腸桿菌的大腸菌菌落(例如，當觀察到藍色沉淀形成時)。然而，其他培養裝置可僅提供臨時鑒定。當進行這種臨時鑒定時，有時希望通過進行額外的測試以對大腸菌的種類進行確認。因此，如果需要，本發明的方法可包括一種或多種額外的確認性測試。當培養裝置已進行孵育并且至少一種大腸菌菌株的存在已得到光學檢測(例如， 目測或通過自動檢測系統)之后，可將捕集的微生物從培養裝置中取出以用于進一步的確認分析，或者在某些遺傳或免疫測試情況下在培養裝置中進行確認分析(即，就地確認分析)。進一步的確認分析可包括化學分析(例如，色譜法、光譜法或光譜測定法)、遺傳分析 (例如，雜交或核酸擴增)和/或免疫分析(例如，酶聯免疫吸附測定(ELISA)、免疫色譜法、 凝集反應或放射免疫測定法)。可使用培養裝置中的整個樣品，通過(例如)從粒狀濃集劑和培養基中移出或提取微生物或其組分來進行確認分析方法。或者，可分離和/或提取培養裝置的較小區域或單獨的菌落來進行確認分析方法。在一些方法中，可使用硝化纖維或尼龍膜來“提起”微生物或其組分，隨后進行遺傳、生物化學或免疫測試。具體的確認分析方法可見于“Molecular Cloning, A Laboratory Manual”(分子克隆實驗指南)，第 3 版(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，NY)，所述方法的說明以引用方式并入本文中。診斷試劑盒
可將培養裝置和粒狀濃集劑與包裝材料組合并以用于檢測存在于樣品中的大腸菌的診斷(或樣品檢測)試劑盒出售。用于實施本發明的方法的這種試劑盒包括(a)至少一個培養裝置，其包括至少一種水合或可水合的培養基；和(b)至少一種粒狀濃集劑，其在與培養裝置中的培養基(當培養基為水合的時)相接觸時為基本上光學透明的。優選地，試劑盒的培養裝置包括含有至少一種可發酵營養物質的培養基(更優選地，培養裝置為包括含有至少一種可發酵營養物質的培養基的平膜培養裝置)，和/或粒狀濃集劑包括微粒(更優選的是，無機微粒)。診斷試劑盒還優選包括一個或多個選自如下的組件檢測容器(更優選地，無菌檢測容器)、裂解試劑、緩沖液、光學檢測分析組分(例如， 一種或多種指示劑染料)、使用實施本發明方法的粒狀濃集劑和/或培養裝置的說明書、自動檢測系統(例如，手持式檢測裝置或閱讀器)，以及它們的組合。粒狀濃集劑可任選在含有防腐劑的小體積緩沖液中水合以提高儲存和運輸期間的穩定性，和/或可裝在/等分分配在撕開式密封袋中以防止污染。濃集劑可為液體中的分散體或懸浮液形式，或者可為粉末形式。優選地，診斷試劑盒包括預量出的等份的(例如， 基于樣品體積)粒狀濃集劑(更優選地，裝在一個或多個撕開式密封袋內)。試劑盒還可包括采樣和/或檢測配件，例如樣品懸浮介質(例如，水、緩沖液或生長培養基)、試劑(例如，染料、指示劑、酶、酶底物、裂解試劑或促進洗脫的試劑)、采樣裝置 (其可任選包括粒狀濃集劑和/或緩沖液)、吸管、標簽、鑷子、樣品載體和/或手套。如果需要，試劑盒中的各個組件可為滅菌的和/或可處于單獨包裹的原始包裝中。鍾下面的實例進一步說明本發明的目的和優點，但這些實例中列舉的具體材料及其量以及其他條件和細節不應被解釋為是對本發明的不當限制。除非另外指明，否則下述實例中的所有份數、百分數、比率等均按重量計。所有微生物培養物均購自美國模式培養物保藏中心(ATCC ；Manassas, VA)。除非另外指明，否則溶劑和其他試劑均來自Sigma-Aldrich Chemical 公司(Milwaukee, WI)。表面改性的硅藻土粒狀濃集劑的制備硅藻土粉(硅藻土)以白色粉末(325目；所有顆粒的尺寸小于44微米)購自Alfa Aesar (A Johnson Matthey Company, Ward Hill，ΜΑ)。此材料通過 X 射線衍射(XRD)顯示
包含無定形二氧化硅以及結晶α-方石英和石英。通過以下述方式表面處理硅藻土來制備包含兩種不同表面改性劑(即，二氧化鈦和氧化鐵)的粒狀濃集劑二氧化鈦的沉積通過在攪拌下將20. 0 克 TiO(SO4) ‘ 2H20 (Noah Technologies Corporation, San Antonio, TX)溶于80. 0克去離子水中來制備20重量％的硫酸氧鈦(IV)脫水溶液。將50. 0 克該溶液與175mL去離子水混合以形成二氧化鈦前體化合物溶液。通過在快速攪拌下將 50. 0克硅藻土分散于較大燒杯中的500mL去離子水中來制備硅藻土的分散體。將硅藻土分散體加熱至約80°C之后，經約1小時的時間段逐滴加入二氧化鈦前體化合物溶液，同時快速攪拌。添加之后，將燒杯用表面皿蓋住并將其內容物加熱至沸騰20分鐘。將氫氧化銨溶液添加至燒杯中直至內容物的PH為約9。通過沉降/潷析來洗滌所得產物直至洗滌水的PH為中性。通過過濾分離產物并將其在100°C下干燥過夜。將干燥產物的一部分置于瓷坩堝內并通過下述方式進行煅燒，即以約3°C /分鐘的加熱速率從室溫加熱至350°C并隨后在350°C下保持1小時。氧化鐵的沉積基本上使用上述二氧化鈦沉積方法來將氧化鐵沉積到硅藻土上，不同的是用20. 0 ^Fe (NO3)3 '9H20(J. Τ. Baker, Inc. , Phillipsburg, N. J.)溶于 175mL 去離子水中的溶液來替代硫酸氧鈦溶液。將所得氧化鐵改性的硅藻土的一部分按相似方法煅燒至350°C以用于進一步的檢測。MM18 兆歐的水通過使用得自 Millipore 公司(Bedford, MA)的 Milli-Q Gradient 去離子系統獲得的18兆歐的無菌去離子水。3M Petrifilm 大腸桿菌/大腸菌計數平板(包括至少一種可發酵營養物質的平膜培養裝置)得自3M公司(St. Paul, MN)。尺寸范圍為30-50微米的胺-官能化玻璃珠得自Polykiences公司 (Warrington, PA)。CaCO3 直徑范圍為2. 5_ 10微米的碳酸鈣粒子得自Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)。CM-Ill :無定形的球化硅酸鎂；成形為固體球的微球，且粒子密度為2. 3g/cc ；表面積為3. 3m2/g ；粒度90%小于約11微米、50%小于約5微米、10%小于約2微米；以3M Cosmetic Microspheres CM-111 得自 3M 公司(St. Paul，MN)。Fe-DE 基本上如上文所述沉積到硅藻土的氧化鐵。羥基磷灰石粒度為2-8微米的以目錄號H0252得自Sigma-Aldrich( . Louis, MO)的1型羥基磷灰石粒子。mHPA 平均粒度為約2微米的得自Chemicell，GmbH (Berlin，Germany)的經羥基磷灰石涂布的磁珠。PCTE-I 平均孔尺寸為約0. 4微米的得自Merlitech (Kent，PA)的聚碳酸酯徑跡蝕刻膜過濾器。PCTE-2 平均孔尺寸為約0. 2微米的聚碳酸酯徑跡蝕刻膜過濾器(由Whatman制造；得自 VWR(West Chester, PA))。二氧化硅微球平均直徑為約2. 5微米的二氧化硅微球；得自Polykiences公司 (Warrington, PA)。Ti-DE 基本上如上文所述沉積到硅藻土上的二氧化鈦。濃集劑的預篩檢將IOOmg各種粒狀濃集劑(CM-111、CaCO3> Ti_DE、羥基磷灰石、Fe-DE和胺-官能化玻璃珠)進行稱重、添加至5mL聚丙烯試管中，并懸浮于ImL 18兆歐的無菌去離子水中。 將50mg和IOmg的i^e-DE樣品以相同方式進行處理。將200微升體積的二氧化硅微球和100 微升、50微升和10微升體積的經羥基磷灰石涂布的磁珠(mHPA)也按相同方式進行處理。通過在 VWR Analog Vortex Mixer (VWR，West Chester, PA)上以最高速度(設置為 10 3200 轉/分(rpm))渦旋10秒來混合試管內容物。將懸浮的粒狀濃集劑按照制造商的說明鋪板到3MTMPetrifilmTM大腸桿菌/大腸菌計數平板上并進行密封。將47mm的PCTE過濾器通過洗瓶用無菌去離子水潤濕約2分鐘并添加至3M Petrifilm 大腸桿菌/大腸菌計數平板， 然后進行水合(通過圍繞過濾器的邊緣以及頂部添加約ImL的水進行)并根據制造商的說明進行密封。通過使用3M Petrifilm Plate Reader (PPR，3M公司(St. Paul)；包括至少一個掃描儀的自動光學檢測系統)的數字光學成像來分析計數平板(包括含有無菌水樣品而不含濃集劑的對照平板)以獲得圖像。針對PI3R的藍色、綠色和紅色通道中的信號，通過使用 Media Cybernetics 公司(Bethesda，MD)的 Image Pro Plus 6· 3· 0· 512 版軟件來進一步分析圖像。PPR綠色通道中的信號(其具有525nm的波長)經計算為從計數平板的頂部反射的(綠)光和從計數平板的背部透射的(綠)光的總和。PI3R綠色通道中的光/信號透射數據示于下表1中。表權利要求
1.一種方法，所述方法包括(a)提供至少一個疑似包含至少一個大腸菌菌株的樣品；(b)提供至少一個培養裝置，所述培養裝置包括至少一種水合的或可水合的培養基；(c)提供至少一種粒狀濃集劑，所述粒狀濃集劑在所述培養基為水合的情況下與所述培養裝置中的所述培養基相接觸時為基本上光學透明的；(d)設置所述粒狀濃集劑與所述樣品相接觸，使得所述大腸菌菌株的至少一部分結合至所述粒狀濃集劑或被所述粒狀濃集劑捕集，以形成結合大腸菌的粒狀濃集劑；(e)設置所述結合大腸菌的粒狀濃集劑與所述培養裝置的所述培養基相接觸；(f)孵育包括與所述培養基相接觸的所述結合大腸菌的粒狀濃集劑的所述培養裝置， 所述培養基為水合的；和(g)在不將所述大腸菌菌株與所述粒狀濃集劑分離的情況下，光學檢測所述大腸菌菌株的存在。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述樣品為流體的形式。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述樣品為水樣品。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述大腸菌菌株為產生氣體的大腸菌菌株。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述大腸菌菌株為大腸桿菌。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述培養基包含至少一種可發酵營養物質。
7.根據權利要求1所述的方法，其中所述培養裝置為包括含有至少一種可發酵營養物質的培養基的平膜培養裝置。
8.根據權利要求1所述的方法，其中相對于不含所述粒狀濃集劑的相應對照樣品，所述粒狀濃集劑捕集或結合存在于所述樣品中的微生物的至少約60%。
9.根據權利要求1所述的方法，其中所述粒狀濃集劑包括微粒。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述微粒為無機微粒。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述無機微粒選自金屬硅酸鹽；二氧化硅；金屬碳酸鹽；金屬磷酸鹽；金屬氧化物、金或鉬改性的硅藻土 ；以及它們的組合。
12.根據權利要求11所述的方法，其中所述無機微粒選自金屬碳酸鹽；二氧化鈦、金或鉬改性的硅藻土 ；無定形金屬硅酸鹽；二氧化硅；金屬磷酸鹽；以及它們的組合。
13.根據權利要求1所述的方法，其中所述粒狀濃集劑為無定形的球化硅酸鎂。
14.根據權利要求1所述的方法，其中所述設置與所述樣品相接觸是通過將所述粒狀濃集劑與所述樣品混合來實現的。
15.根據權利要求1所述的方法，其中所述方法還包括離析所述結合大腸菌的粒狀濃集劑和/或從所述樣品中分離所得的離析過的粒狀濃集劑。
16.根據權利要求1所述的方法，其中所述方法還包括鑒定和/或計數所述大腸菌菌株。
17.根據權利要求1所述的方法，其中所述光學檢測包括檢測至少一種顏色變化。
18.根據權利要求1所述的方法，其中所述光學檢測通過自動光學檢測系統進行。
19.一種方法，所述方法包括(a)提供至少一個疑似包含大腸桿菌的水樣品；(b)提供至少一個平膜培養裝置，所述平膜培養裝置包括至少一種培養基，所述培養基為水合的或可水合的并且包含至少一種可發酵營養物質；(C)提供至少一種粒狀濃集劑，所述粒狀濃集劑在所述培養基為水合的情況下與所述平膜培養裝置中的所述培養基相接觸時為基本上光學透明的，所述粒狀濃集劑包括無機微粒，所述無機微粒選自無定形的球化硅酸鎂；碳酸鈣；二氧化硅；羥基磷灰石；二氧化鈦改性的硅藻土 ；以及它們的組合；(d)設置所述粒狀濃集劑與所述水樣品相接觸，使得所述大腸桿菌的至少一部分結合至所述粒狀濃集劑或被所述粒狀濃集劑捕集，以形成結合大腸桿菌的粒狀濃集劑；(e)設置所述結合大腸桿菌的粒狀濃集劑與所述平膜培養裝置的所述培養基相接觸；(f)孵育包括與所述培養基相接觸的所述結合大腸桿菌的粒狀濃集劑的所述平膜培養裝置，所述培養基為水合的；以及(g)在不將所述大腸桿菌與所述粒狀濃集劑分離的情況下光學檢測所述大腸桿菌的存在，所述光學檢測包括通過使用包含至少一個掃描儀的自動光學檢測系統的數字光學成像來檢測至少一種顏色變化以及鄰近至少一個大腸桿菌菌落的至少一個氣泡的存在。
20. 一種用于實施根據權利要求1所述的方法的診斷試劑盒，所述診斷試劑盒包括(a)至少一個培養裝置，所述培養裝置包括至少一種水合的或可水合的培養基；和(b)至少一種粒狀濃集劑，所述粒狀濃集劑在所述培養基為水合的情況下與所述培養裝置中的所述培養基相接觸時為基本上光學透明的。
全文摘要
本發明公開了一種方法，所述方法包括(a)提供(1)至少一個疑似包含至少一個大腸菌菌株的樣品、(2)至少一個包括至少一種水合的或可水合的培養基的培養裝置、(3)至少一種在所述培養基為水合的情況下與所述培養裝置中的所述培養基相接觸時為基本上光學透明的粒狀濃集劑；(b)設置所述粒狀濃集劑與所述樣品相接觸，使得所述大腸菌菌株的至少一部分結合至所述粒狀濃集劑以形成結合大腸菌的粒狀濃集劑；(c)設置所述結合大腸菌的粒狀濃集劑與所述培養基相接觸；(d)孵育包括與所述培養基相接觸的所述結合大腸菌的粒狀濃集劑的所述培養裝置，所述培養基為水合的；以及(e)在不將所述大腸菌菌株與所述粒狀濃集劑分離的情況下，光學檢測所述大腸菌菌株的存在。
文檔編號G01N1/40GK102325894SQ200980157395
公開日2012年1月18日 申請日期2009年12月29日 優先權日2008年12月31日
發明者曼基里·T·克希爾薩加爾 申請人:3M創新有限公司