鑒定分子的方法

專利名稱：鑒定分子的方法
鑒定分子的方法要求享有在先美國申請的優先權本申請要求2008年11月24日提交的美國臨時申請系列號61/117，450的權益。 該文獻以及本文提到的所有出版物、專利和專利文獻的全部內容都通過引用納入本文。
I.
背景技術：
本公開涉及生物傳感器，例如共振波導光柵(RWG)生物傳感器或表面等離振子共振(SPR)生物傳感器或電子生物傳感器，更具體涉及此類生物傳感器在鑒定分子中的應用。本公開還涉及分子指數的生成方法和藥物發現方法。IL 概沭本公開提供了采用無標記生物傳感器細胞試驗鑒定分子、和對包括配體在內的分子進行系統生物學和系統藥理學分析、以及藥物發現的方法、組合物、產品和機制。本公開還提供了為給定分子生成指數的方法、組合物、產品和機制，和采用不同分子指數的比較分析確定任何分子的作用模式的方法。III.附圖簡要說明

圖1顯示了本公開的實施方式中用于藥物發現的細胞概況藥理學方法的示意圖。圖2是本公開的實施方式中用于藥物發現的細胞概況藥理學方法的示例。圖3A和;3B顯示了本公開的實施方式中，各為ΙΟμΜ的16種不同配體作用于Α549 細胞的初級概況。圖4顯示了本公開的實施方式中32ηΜ表皮生長因子(EGF)作用于Α431靜息細胞的初級概況和“載劑”溶液作用于Α431細胞的初級概況(陰性對照)的比較。圖5顯示了本公開的實施方式中32nM EGF作用于Α431靜息細胞的初級概況(對照)和各為10 μ M的4種不同配體的二級概況。在各配體(BML465、AG1478、U0126、粗糠柴苦素(Rottlerin))預處理細胞約1小時后，通過測量Α431細胞對32nM EGF的光學應答獲得各二級概況。圖6Α、6Β和6C顯示了通過一組配體對Α431靜息細胞的32nM EGF誘導光信號的調節概況示例。分析了配體存在和缺乏時Α431細胞的EGF DMR信號的三種光學應答參數并對配體作圖。所述三種參數為Α431細胞EGF DMR信號的(A)P-DMR(正DMR)幅度、(B) N-DMR(負DMR)幅度、和(C) RP-DMR(恢復正DMR)幅度。用未經任何分子預處理的細胞的 DMR信號作為陽性對照(陽性)，而僅用載劑(即試驗緩沖溶液)處理的細胞的DMR信號作為陰性對照(緩沖液)。圖7顯示了 (A) 32nM EGF、(B) 5 μ M組胺、(C) 1 μ M煙酸、和(D) 2ηΜ腎上腺素，作用于Α431靜息細胞的初級概況。圖8 顯示了(A) 40 μ M 吡那地爾(pinacidil)、(B) 8 μ M SLIGKV-酰胺、(C) 250 μ g/ ml聚(I:C)、(D)8yM佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)、(E) ΙΟμΜ組胺、和 (F) 16 μ M毛喉素，作用于Α549細胞的初級概況。圖9顯示了本公開的實施方式中，(Α)ΗΑ-1077分子作用于Α431靜息細胞的初級概況，(B)HA-1077分子作用于A549的初級概況，和(C)HA1077的調節指數。通過比較 HA1077存在和缺乏時的細胞內標志物誘導的光學應答的特定參數來生成調節指數。正值表明HA-1077增強了細胞內標志物光學信號的特定參數，而負值表明HA-1077抑制或減弱了細胞內標志物誘導信號的特定參數。圖10顯示了本公開的實施方式中，(A)H-S分子作用于A431靜息細胞的初級概況、 (B)H-S分子作用于A549細胞的初級概況、和(C)H-S的調節指數。圖11顯示了本公開的實施方式中，(A)LY^4002分子作用于A431靜息細胞的初級概況、(B)LY^4002作用于A549細胞的初級概況、和(C)LY^4002的調節指數。圖12顯示了本公開的實施方式中，(A)槲皮素分子作用于A431靜息細胞的初級概況、(B)槲皮素作用于A549細胞的初級概況、和(C)槲皮素的調節指數。IV.發明詳沭參考附圖(如果有的話)詳細描述本發明的各種實施方式。對各種實施方式的參考不限制本發明的范圍，本發明范圍僅受所附權利要求書的范圍的限制。此外，在本說明書中列出的任何實施例都不意圖構成限制，而僅是列出要求權利的本發明的許多可能實施方式中的一些。A.定義1.材料材料是用于構成物理實體的某種東西(化學的、生物化學的、生物的、或混合的) 的有形部分。2.物質物質或類似術語是指任何物理實體。材料是物質。分子、配體、標志物、細胞、蛋白質和DNA可視為物質。機器或物品應視為由物質組成，而本身不視為物質。3.分子本文所用的術語“分子”或類似術語是指以化學分子或有確定分子量的分子的形式存在的生物或生物化學或化學實體。不論其大小，分子或類似術語是化學、生物化學或生物分子。很多分子屬于稱為有機分子(含有碳原子和其它原子，通過共價鍵連接的分子) 的類型，但一些分子不含碳(包括簡單的分子氣體例如分子氧和更復雜的分子例如一些硫基聚合物)。一般術語“分子”包括大量描述性分子類或組，例如蛋白質、核酸、碳水化合物、 類固醇、有機藥物、小分子、受體、抗體和脂質。適當的時候，由于所述方法應用于分子亞組， 本文中采用這些更具描述性的術語(其中很多，例如“蛋白質”，其本身描述了重疊的分子組)中的一個或多個，但不減損這些分子用作代表一般類別“分子”和所提亞類(例如蛋白質)的意圖。除非明確說明，“分子”一詞應包括特定的分子及其鹽，例如藥學上可接受的
Τττ . ο4.配體配體或類似術語是指能與生物分子結合并形成復合物用于生物學目的的物質或組合物或分子。在生物系統中，配體及其靶分子之間實際的不可逆共價連接是罕見的。配體與受體的結合改變了化學構象，即受體蛋白質的三維形狀。受體蛋白的構象狀態決定受體的功能狀態。結合的趨勢或強度稱為親和力。配體包括底物、阻斷劑、抑制劑、激活劑和
7神經遞質。放射性配體是帶放射性標記的配體，而熒光配體是帶熒光標記的配體；兩者都可視為配體，常用作受體生物學或生物化學研究中的示蹤劑。配體和調節劑可互換使用。5.標志物標志物(marker)或類似術語是指在生物傳感器細胞試驗中產生信號的配體。所述信號還必須是至少一種特定的細胞信號途徑和/或至少一種特定靶標介導的至少一種特定細胞過程的特征。所述信號可以是陽性、或陰性、或任何組合(例如振蕩)。6.分子混合物分子混合物或類似術語是指含有至少兩種分子的混合物。所述兩種分子可以是， 但不限于，結構不同(即對映異構體)、或組成不同(例如，蛋白質同種型、糖形、或帶有不同聚乙二醇(PEG)修飾的抗體)、或結構和組成不同(例如未純化的天然提取物、或未純化的合成化合物)。7.未知分子未知分子或類似術語是指具有未知生物/藥理/生理/病理生理活性的分子。8.已知分子已知分子或類似術語是指具有已知生物/藥理/生理/病理生理活性的分子，其精確作用模式可以是已知或未知的。9.測試分子測試分子或類似術語是指在獲得該測試分子信息的方法中使用的分子。測試分子可以是未知分子或已知分子。10.藥物候選分子藥物候選分子或類似術語是指對其用作藥物或藥效團的能力進行測試的測試分子。該分子可視為先導分子。11.調節調節，或其形式，是指提高、或降低、或維持通過細胞靶標介導的細胞活性。應當理解，在使用這些詞語中的一個時，也公開了其可以是比對照提高了，例如，l^j^UO^、 20%、50%、100%、500%、或 1000%，或可以是比對照降低了，例如，1%、5%、10%、20%、 50%、或 100%。12.調節劑調節劑或類似術語是指控制細胞靶標活性的配體。它是結合細胞靶標，例如靶蛋白的信號調節分子。13.已知調節劑已知調節劑或類似術語是指對至少一種已知靶標具有已知親和力的調節劑。例如，已知調節劑可以是PII抑制劑、PKA抑制劑、GPCR拮抗劑、GPCR激動劑、RTK抑制劑、表皮生長因子受體中和抗體、或磷酸二酯酶抑制、PKC抑制劑或激活劑等。14.細胞細胞或類似術語是指外部被半透膜限定的、小的、通常為微觀量的原生質，可包括一個或多個核和各種其它細胞器，能獨自或與其它類似物質相互作用運行生命的所有基本功能，并形成能獨立作用的活性物質的最小結構單元，包括合成細胞構建體、細胞模型系統和類似人工細胞系統。
細胞可包括不同的細胞類型，例如與特定疾病相關的細胞、來自特定來源的細胞類型、與特定靶標相關的細胞類型、或與特定生理功能相關的細胞類型。細胞還可以是天然細胞、工程細胞、轉化細胞、永生細胞、原代細胞、胚胎干細胞、成人干細胞、腫瘤干細胞、或干細胞衍生的細胞。人體由約210種已知的不同細胞類型構成。考慮到細胞的制備(例如工程改造、 轉化、永生化、或新鮮分離自人體)和獲取細胞的來源(例如不同年齡或不同疾病階段的人體等)，細胞類型幾乎是無限的。15.基體基體或類似術語是可以使其它東西按某些規則產生、成形、或發展的某些東西。所述基體可以對進行分析的方式和所得結果的質量有顯著影響。例如，在本公開的實施方式中，用于為鑒定分子選擇一組細胞的基體包括，但不限于，例如特定的疾病(例如引起過敏反應、或炎性疾病、或致病感染、或乳腺癌、或皮膚癌、或結腸癌、或肝病、或胰腺癌、或心臟病等的各種細胞)、或特定的來源(例如，各種神經元細胞、或肺細胞、或皮膚細胞、或肌肉細胞、或肝細胞等)、或特定的細胞靶標(例如，受體、或酶、或激酶、或癌基因、或結構蛋白、或DNA、或RNA)、或人生理或病理生理代表性的廣泛的細胞類型(例如，由角化上皮細胞、Wet復層屏障上皮細胞、外分泌上皮細胞、激素分泌細胞、代謝和儲存細胞、屏障功能細胞(肺、腸、外分泌腺和泌尿生殖道)、上皮細胞內層封閉的內部體腔、有推進功能的纖毛細胞、胞外基質分泌細胞、收縮細胞、血液和免疫系統細胞、感覺傳導細胞、自主神經元細胞、 感覺器官和外周神經元支持細胞、中樞神經系統神經元和膠質細胞、晶狀體細胞、色素細胞、生殖細胞、撫育細胞和間隙細胞)。在另一種實施方式中，可以用至少兩種細胞的混合群體作為細胞系統。16.細胞培養“細胞培養”是指原核或者真核細胞在受控條件下生長的過程。“細胞培養”不單指衍生自多細胞真核生物的細胞，特別是動物細胞的培養，也指復合組織和器官的培養。17.生物傳感器生物傳感器或類似術語是指用于檢測分析物的結合了生物組件和理化檢測器組件的裝置。生物傳感器通常由三部分組成生物組件或元件(例如組織、微生物、病原體、細胞、或其組合)、檢測器元件(以理化方式例如光學、壓電、電化學、熱學或磁力運作)、和與兩種組件關聯的換能器。生物組件或元件可以是，例如，活細胞、病原體或其組合。在實施方式中，光學生物傳感器可以包括將活細胞、病原體、或其組合中的分子識別或分子刺激事件轉化成可量化信號的光換能器。18.試驗試驗或類似術語是指用以確定物質如分子或細胞特征的分析，例如細胞受一種或多種外源刺激如配體或標志物刺激時光學或生物阻抗應答的存在、缺乏、量、程度、動力學、 動態學或類型。細胞對刺激的應答產生生物傳感器信號可以是試驗。19.長期試驗“長期試驗”或類似術語用于研究給定分子對活細胞的長期影響。一種具體的長期試驗是“長期生物傳感器細胞試驗”。”在一種實施方式中，每個類型的細胞僅暴露于分子中一段校長時間(例如，8小時、16小時、24小時、32小時、48小時、72小時)。這一長期試驗用于確定分子對細胞健康狀態(例如，活力、凋亡、細胞周期調節、細胞粘附調節、增殖)的影響。這一長期試驗還包含可直接用于分子誘導細胞信號事件或途徑研究的早期細胞信號應答(例如，分子刺激后30分鐘、60分鐘、120分鐘、180分鐘)。在另一種實施方式中，標志物存在下的長期生物傳感器細胞試驗被用于交叉調節分子和標志物對細胞生物學和生理學的長期影響。所述標志物的添加可以在所述分子之前、同時、和之后。例如，當標志物(例如,H2O2)引發細胞組中至少一種細胞的凋亡時，可以采用這種長期試驗確定分子是否是保護性的。反之，這種長期試驗也可用于確定標志物對分子誘導的細胞事件(例如，凋亡、或壞死)的保護或協同作用。20.短期試驗“短期試驗”或類似術語用于研究給定分子對活細胞的短期影響。一種具體的短期試驗是“短期生物傳感器細胞試驗”。在一種實施方式中，每個類型的細胞僅暴露于所述分子中一段較短時間(例如，5分鐘、10分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘、180分鐘、 240分鐘)。這一短期試驗常用于檢測早期細胞信號應答，其可直接用于研究分子誘導細胞信號事件或途徑或研究分子對標志物誘導的細胞應答的調節能力。21.兩步試驗“兩步試驗”或類似術語是指，細胞組中的每種細胞先暴露于分子以研究分子誘導的生物傳感器信號，然后通過特定的標志物或一組標志物研究分子調節標志物誘導的生物傳感器信號的能力。這一試驗可稱為雙模式試驗如初始的激動模式和后續的拮抗模式，分子的作用模式(例如，靶標、激動和拮抗、和效能或功效)。22.激動和拮抗模式激動模式或類似術語是指細胞暴露于分子以確定所述分子引起生物傳感器信號如DMR信號的能力的試驗，而拮抗模式是指在分子存在時細胞暴露于標志物以確定所述分子對細胞應答所述標志物的生物傳感器信號的調節能力的試驗。23.脈沖刺激試驗“脈沖刺激試驗”或類似術語可用于細胞僅暴露于分子中極短時間(例如，數秒、或數分鐘)的情況。這種脈沖刺激試驗可用于研究分子作用于細胞/靶標的動力學，及其對標志物誘導的生物傳感器信號的影響。可以通過在添加分子后的給定時間用液體操作裝置簡單地將分子溶液替換成細胞試驗緩沖液來進行脈沖刺激試驗。24.處理處理或類似術語可至少以兩種方式使用。首先，處理或類似術語可以指施用或作用于對象。其次，處理或類似術語可以指將任何兩種物品，例如任何兩種或多種物質如分子和細胞，混合到一起。這種混合把至少兩種物質匯集到一起使它們之間發生接觸。當處理或類似術語用于有疾病的對象時，并不意味治愈或甚至例如癥狀的減輕。 當治療或類似術語與處理或類似術語一起使用時，是指潛在疾病的癥狀被減輕，和/或一種或多種潛在的細胞、生理、或生化原因或引起癥狀的機理被減輕。應當理解，本文使用的減輕是指相對疾病的狀態而言，包括疾病的分子狀態，而不僅指疾病的生理狀態。25.接觸接觸或類似術語是指，若至少兩種物品，例如分子、細胞、標志物、至少一種化合物或組合物、或至少兩種組合物、或這些中的任意一種和產品或機器間的分子可能相互作用，使相互靠近從而能發生分子相互作用。例如，接觸是指將至少兩種組合物、分子、物品、或東西接觸，使其接近以混合或碰觸。例如，有組合物溶液A和培養的細胞B并將組合物溶液A 傾倒到培養的細胞B上，使組合物溶液A與細胞培養B接觸。用配體接觸細胞將把配體帶到細胞確保細胞能得到配體。應當理解本文公開的任何物品可與任何其它物品接觸。例如，可以使細胞接觸標志物或分子、生物傳感器等。26.引發引發或類似術語是指引起或啟動事件如應答的行為。27.檢測檢測或類似術語是指本公開中的設備和方法發現或感應分子或標志物誘導的細胞應答和區分對不同分子感應到的應答的能力。28.應答應答或類似術語是指對任何刺激的任何反應。29.細胞應答“細胞應答”或類似術語是指細胞對刺激的任何反應。30.生物傳感器應答“生物傳感器應答”、“生物傳感器輸出信號”、“生物傳感器信號”或類似術語是指具有細胞的傳感器系統對細胞應答的任何反應。生物傳感器將細胞應答轉化成可量化的傳感器應答。生物傳感器應答是由光生物傳感器例如RWG或SPR測得的對刺激的光學應答或者是由電生物傳感器測得的細胞對刺激的生物阻抗應答。因為生物傳感器應答與細胞對刺激的應答直接相關，在公開的實施方式中，生物傳感器應答和細胞應答可以互換使用。31. DMR 應答"DMR應答”或類似術語是指采用光生物傳感器的生物傳感器應答。DMR是指動態物質再分布或動態細胞物質再分布。P-DMR是表明感應區內物質增加的正DMR應答，N-DMR 是表明感應區內物質減少的負DMR應答，RP-DMR是表明刺激事件后物質再分布回復基礎水平的回復P-DMR。32.應答試驗“應答試驗”或類似術語是指采用方法來鑒定應答。例如，若使分子與細胞接觸，可以采用生物傳感器測試細胞對暴露于所述分子的應答。33.概況概況或類似術語是指對組合物，例如細胞采集到的數據。如本文所述，概況可以從無標記的生物傳感器采集。34.初級概況“初級概況”或類似術語是指當分子接觸細胞時產生的生物傳感器應答或生物傳感器輸出信號或概況。通常，在將初始細胞應答對凈零生物傳感器信號(即基線)標準化以后獲得初級概況。35. 二級概況“二級概況”或類似術語是指細胞在分子存在時對標志物應答的生物傳感器應答或生物傳感器輸出信號。二級概況可以用作分子對標志物誘導的細胞應答或生物傳感器應答的調節能力的指示劑。36.調節概況“調節概況”或類似術語是指標志物在分子存在時的二級概況和標志物在不存在任何分子時的初級概況之間的比較。例如，所述比較可以通過從二級概況中減去初級概況或從初級概況中減去二級概況或將二級概況對初級概況進行標準化。37.庫庫或類似術語是指集合。庫可以是本文公開的任何物品的集合。例如，它可以是指數的集合，指數庫；它可以是概況的集合，概況庫；或者它可以是DMR指數的集合，DMR指數庫；同樣，它可以是分子的集合，分子庫；它可以是細胞的集合，細胞庫；它可以是標志物的集合，標志物庫；例如，庫可以是隨機或非隨機的，確定或不確定的。例如，公開了已知調節劑的DMR指數庫或生物傳感器指數庫。38.組組或類似術語是指預先確定的整套樣本(例如，標志物、或細胞、或途徑)。可以從庫中選取樣本產生組。39.標志物組“標志物組”或類似術語是指包括至少兩種標志物的組。所述標志物可以針對不同的途徑、相同的途徑、不同的靶標、或甚至相同的靶標。40.細胞組“細胞組”或類似術語是指包括至少兩種細胞的組。所述細胞可以是本文公開的任何種類的細胞或組合。41.在分子存在下“在分子存在下”或類似術語是指將培養的細胞接觸或暴露于分子。所述接觸或暴露可以在細胞接觸刺激之前、或同時發生。42.生物傳感器信號“生物傳感器信號”或類似術語是指生物傳感器測得的由細胞受刺激下的應答產生的細胞信號。43. DMR 信號“DMR信號”或類似術語是指光生物傳感器測得的由細胞受刺激下的應答產生的細胞信號。44.標準化標準化或類似術語是指，調整數據、或概況、或應答以消除至少一個共變量。例如， 若產生了兩種應答，一種針對作用于細胞的標志物且一種針對作用于細胞的標志物與分子，標準化是指比較沒有分子時標志物誘導的應答和存在分子時的應答，并消除后僅由標志物引起的應答，使得標準化的應答代表由于分子對標志物的調節造成的應答。通過在分子存在下標準化標志物的初級概況和標志物的二級概況(調節概況)得到調節比較。45.對照術語對照或“對照水平”或對照細胞“或類似術語定義為測量變化的標準，例如對照不進行實驗，而是進行整套確定的參數，或對照是基于處理前或處理后的水平。它們或者與測試平行進行，或者在之前或之后進行，或者它們可以是預先確定的標準。例如，對照可以指對象或客體在除了略去受測過程或試劑以外按平行實驗處理的實驗所得結果，該結果用作比較實驗效果的標準。因此，對照可以用來確定與過程或試劑或變量等相關的效果。例如，若所研究的是測試分子對細胞的影響，可以a)簡單地記錄細胞在分子存在下的特征， b)添加具有已知活性或無活性的對照分子、或對照組合物(例如，試驗緩沖溶液(載劑)) 并記錄影響，然后將測試分子的影響與對照進行比較。在某些情況中，一旦進行了對照，所述對照就可用作標準，不再進行對照實驗，而在另一些情況中每當要作出比較時都應平行進行對照實驗。46.陽性對照“陽性對照”或類似術語是一種對照，其顯示能產生數據采集的數據采集條件。47.調節比較“調節比較”或類似術語是初級概況和二級概況標準化的結果。48.指數指數或類似術語是指數據的集合。例如，指數可以是含有一種或多種調節概況的列表、表格、文件、或編目。應當理解，可以由任何數據組合生成指數。例如，DMR概況可以有P-DMR、N-DMR和RP-DMR。可以采用完整的概況數據、P-DMR數據、N-DMR數據、RP-DMR數據、或其中的任意點、或這些數據的組合或其它數據生成指數。指數是任何此類信息的集合。通常，在比較指數時，所述指數是類似數據，即P-DMR對P-DMR數據。49.生物傳感器指數“生物傳感器指數”或類似術語是由生物傳感器數據的集合構成的指數。生物傳感器指數可以是生物傳感器概況，例如初級概況、或二級概況的集合。所述指數可以包含任何種類的數據。例如，概況的指數可以只包括N-DMR數據點，它可以是P-DMR數據點、或者兩種都有或者它可以是阻抗數據點。它可以是與概況曲線相關的所有數據點。50. DMR 指數"DMR指數”或類似術語是由DMR數據的集合構成的指數。51.分子生物傳感器指數“分子生物傳感器指數”或類似術語是由對分子采集的數據生成的生物傳感器指數。例如，分子生物傳感器指數可以由分子作用于細胞組的概況、和分子針對標志物組的調節概況構成，每組標志物針對細胞組中的一種細胞。52.分子DMR指數“分子DMR指數”或類似術語是通過對分子采集的數據生成的DMR指數。例如，分子生物傳感器指數可以由分子作用于細胞組的概況、和分子針對標志物組的調節概況構成， 每組標志物針對細胞組中的一種細胞。53.分子指數“分子指數”或類似術語是涉及分子的指數。54.調節劑生物傳感器指數“調節劑生物傳感器指數”或類似術語是由對調節劑采集的數據生成的生物傳感器指數。例如，調節劑生物傳感器指數可以由調節劑作用于細胞組的概況、和調節劑針對標志物組的調節概況構成，每組標志物針對細胞組中的一種細胞。55.調節劑DMR指數
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“調節劑DMR指數”或類似術語是通過對調節劑采集的數據生成的DMR指數。例如， 調節劑DMR指數可以由調節劑作用于細胞組的概況、和調節劑針對標志物組的調節概況構成，每組標志物針對細胞組中的一種細胞。56.分子調節指數“分子調節指數”或類似術語是指顯示分子對標志物組作用于細胞組的生物傳感器輸出信號的調節能力的指數。通過把分子存在下受標志物刺激的細胞應答的特定生物傳感器輸出信號參數對沒有任何分子時的情況進行標準化而生成調節指數。57.已知調節劑生物傳感器指數“已知調節劑生物傳感器指數”或類似術語是由對已知調節劑采集的數據生成的調節劑生物傳感器指數。例如，已知調節劑生物傳感器指數可以由已知調節劑作用于細胞組的概況、和已知調節劑針對標志物組的調節概況構成，每組標志物針對細胞組中的一種細胞。58.已知調節劑DMR指數“已知調節劑DMR指數”或類似術語是由對已知調節劑采集的數據生成的調節劑 DMR指數。例如，已知調節劑DMR指數可以由已知調節劑作用于細胞組的概況、和已知調節劑針對標志物組的調節概況構成，每組標志物針對細胞組中的一種細胞。59.標志物生物傳感器指數“標志物生物傳感器指數”或類似術語是由對標志物采集的數據生成的生物傳感器指數。例如，標志物生物傳感器指數可以由標志物作用于細胞組的概況、和標志物針對標志物組的調節概況構成，每組標志物針對細胞組中的一種細胞。60.標志物DMR指數“標志物DMR指數”或類似術語是由對標志物采集的數據生成的生物傳感器DMR指數。例如，標志物DMR指數可以由標志物作用于細胞組的概況、和標志物針對標志物組的調節概況構成，每組標志物針對細胞組中的一種細胞。61.指數相似性“指數相似性”或類似術語是表達針對分子的兩種指數之間、或至少三種指數之間基于指數的模式、和/或分數矩陣的相似性的術語。分數矩陣與其對應物密切相關，例如在相應細胞中不同分子的初級概況的特征，和不同分子對各標志物的調節概況的本質和百分比。例如，給予更相似的特征更高的分數，給予不相似的特征較低或負的分數。因為分子調節指數只有三種調節類型，正、負和中性，相似性矩陣相對簡單。例如，簡單的矩陣可以給相同的調節(例如正調節)評分為+1，給不同的調節評分為-1。或者，可以給具有不同水平的一種調節類型不同的分數。例如，10%、20%、30%、 40%、50%、60%、100%、200% 等的正調節可以相應評分為 +1、+2、+3、+4、+5、+6、+10、+20。 相反，對于負調節，可以給出相似但相反的評分。根據這一方法，圖9C顯示了 HA-1077針對標志物組的調節指數，表明PKA/PKG抑制劑HA1077差異性地調節不同標志物誘導的生物傳感器應答在A549細胞中吡那地爾(pinacidil) (-86%)、聚(I:C) (+18% ) ,PMA(+36% ), SLIGKV-酰胺(+22% )、毛喉素(+18% )、組胺(早期 P-DMR，+26% )、組胺(后期 P-DMR， +55% )；和在 A431 靜息細胞中，腎上腺素(-38% )、煙酸(+8 % )、EGF (P-DMR，+19% EGF(N-DMR,-20% )、和組胺(-50% )。因此，HA1077調節指數的協同評分可以定為(-8. 6，1.8,3.6,2.2,1.8,2.6,5.5, -3.8,0.8,1.9, -2，-5)。另一方面，對于 H8，其協同評分為 (-7. 2，1. 8,2. 2,3. 2,2,3. 8,6. 5，-1. 6,1,0. 3，-2，1. 6)。HA1077和H8指數的比較可以基于(1)簡單評分矩陣，其中它們在A549和A431 中的初級指數是相似的(評分為+1，+1)，和調節指數相似(評分為+1，+1，+1，+1，+1，+1， +1,+1,+1,+1,+1, -1) ； (2)基于比例的分數矩陣，其中兩者的協同評分相似但不相同，可能是由于它們作用于細胞靶標的效力不同。值得注意的是，兩項指數都采用相同劑量(10 μ M) 產生；C3)采用顯著的調節概況(例如吡那地爾應答)分選，其中兩種分子產生相似的調節。綜合考慮，可以總結出在檢測的兩種細胞系中ΗΑ1077和Η8都顯示相似的初級作用模式。類似的，在檢測的兩種細胞系中LY^4002和槲皮素也都顯示相似的初級作用模式。但是，HA1077/H8和LY^4002/槲皮素顯示不同的作用模式。62.鑒定鑒定或類似術語是指收集關于物質，例如配體、分子、標志物或細胞的任何性質的信息，例如獲得配體、分子、標志物或細胞的概況。63.增強增強、被增強或類似術語是指由分子導致的細胞內標志物的生物傳感器應答的特定參數的提高。通過比較標志物的初級概況和分子存在下相同標志物在相同細胞內的二級概況，可以計算出分子對細胞的標志物誘導生物傳感器應答的調節。正調節是指分子導致標志物誘導的生物傳感器信號的提高。64.更高和抑制和類似詞語術語更高、提高、提升或升高或類似術語或這些術語的變形是指提高到基礎水平以上，例如與對照相比。術語低、更低、減少、降低或縮減或類似術語或這些術語的變形是指降低到基礎水平以下，例如與對照相比。例如，在向細胞內添加分子例如激動劑或拮抗劑之前或不存在添加時基礎水平是正常體內水平。抑制或抑制形式或類似術語是指降低或遏制。65.分子藥理學分子藥理學或類似術語是指分子作用于細胞的系統細胞生物學或系統細胞藥理學或作用模式。通常通過，但不限于，毒性、影響特定細胞過程(例如，增殖、分化、活性氧物質信號傳導)的能力、或調節特定細胞靶標(例如，PI3K, PKA, PKC, PKG, JAK2，MAPK, MEK2， 或肌動蛋白)的能力鑒定分子藥理學。66.受體受體或類似術語是指包埋在細胞的質膜或胞質內的，可以結合移動的信號傳導 (或“信號”)分子的蛋白分子。與受體結合的分子稱為“配體”，并可以是肽(例如神經遞質)、激素、藥物、或毒素，當發生這種結合時，受體發生的構象變化通常啟動細胞應答。但是，一些配體只是阻斷受體而不引起任何應答(例如拮抗劑)。配體誘導的受體變化導致生理變化，這構成配體的生物活性。67.細胞靶標“細胞靶標”或類似術語是指能通過外部刺激改變活性的生物聚合物例如蛋白質或核酸。細胞靶標最常見的是蛋白質例如酶、激酶、離子通道和受體。68.信號傳導途徑
“確定的途徑”或類似術語是指從接收信號(例如外源配體)到細胞應答(例如細胞靶標表達的提高)的細胞途徑。在一些情況中，配體與受體結合導致的受體激活與細胞對配體的應答直接偶聯。例如，神經遞質GABA能激活作為離子通道的一部分的細胞表面受體。GABA與神經元上GABA A受體的結合打開了是受體的一部分的氯選擇性離子通道。GABA A受體激活使帶負電的氯離子能移動進入神經元從而抑制神經元產生動作電位的能力。但是，對于很多細胞表面受體，配體受體相互作用不直接與細胞應答關聯。在配體產生對細胞行為的最終生理效應之前，激活的受體必須首先與細胞內的其它蛋白質相互作用。通常，一系列相互作用的細胞蛋白質的行為在受體激活后被改變。由受體激活誘導的整套細胞變化稱為信號傳導機理或途徑。信號傳導途徑可以是比較簡單或相當復雜的。69.經分子處理的細胞經分子處理的細胞或類似術語是已暴露于分子的細胞。70.細胞過程細胞過程或類似術語是指在細胞內或通過細胞發生的過程。細胞過程的例子包括，但不限于，增殖、凋亡、壞死、分化、細胞信號傳導、極性變化、遷移或轉化。71. “時間段”“時間段”是指代表時間推移的任何期間。例如，1秒、1分鐘、1小時、1天和1年都是時間段。72. “短的時間段”“短的時間段”或類似術語是指在1分鐘到300分鐘之間的時間段。73. “另一時間段”“另一時間段”或類似術語是指在一個時間段后相繼發生的時間段。74. “整個細胞組和針對標志物組”短語“整個細胞組和針對標志物組”是指檢測分子作用于細胞組內各細胞的初級概況以及分子調節標志物組的調節概況的系統過程。對于標志物/細胞對，所述過程首先從檢測分子獨立作用于每個類型細胞的初級概況開始，然后檢測相同細胞內標志物在分子存在下的二級概況。術語“針對”具體用于表示分子調節標志物誘導的生物傳感器應答的能力。75.分子作用模式的指示劑“指示劑”或類似術語是進行指示的東西。具體地，“分子作用模式的指示劑”是指能被理解為分子和熟知調節劑具有相似作用模式的事物，例如分子的生物傳感器指數與公知調節劑指數相比較的相似性。76. “特定人生理或病理生理的代表”“代表”或類似術語是某種類型或種類東西的示例或典型。例如，認為人肺癌細胞系A549的細胞特征代表人肺癌的生理；因此，A549用作研究人肺癌的細胞生物學和生理學的模型細胞系。77. “長期生物傳感器信號”“長期生物傳感器信號”是長期試驗產生的生物傳感器信號。78. “長期 DMR 信號”長期DMR信號或類似術語是指長期光生物傳感器細胞試驗產生的光生物傳感器信號。79.淘選淘選或類似術語是指篩選存在一種或多種受體或細胞靶標的細胞。80. “強生物傳感器信號”“強生物傳感器信號”是指生物傳感器信號幅度顯著超過噪音水平或陰性對照應答(例如3x，10x, 20x, IOOx,或ΙΟΟΟχ)。陰性對照應答通常是添加試驗緩沖溶液(即載劑) 后細胞的生物傳感器應答。噪音水平是不另外添加任何溶液時細胞的生物傳感器信號。值得注意的是，在添加任何溶液前，細胞總是被溶液覆蓋。80. “強 DMR 信號”“強DMR信號”或類似術語是指“強生物傳感器信號”的DMR形式。82.效能效能或類似術語是用產生給定強度效應所需的量表述的分子活性的度量。例如， 高效能藥物在低濃度引起較高的應答。效能和親和力與功效成比例。親和力是藥物分子與受體結合的能力。83.功效功效或類似術語是指在理想或最優條件下產生所需規模的效應的能力。這些條件區分了功效和相關的有效性概念，后者涉及在現實條件下的改變。功效是受體占用和啟動分子、細胞、組織或系統水平應答的能力之間的關系。84.確定的途徑“確定的途徑”或類似術語是指特定的途徑，例如Gq途徑、Gs途徑、Gi途徑、EGFR 途徑或PKC途徑。85.網狀相互作用“網狀相互作用”或類似術語是指至少兩種特定信號傳導級聯反應或途徑間的相互作用。例如，A431細胞內緩激肽B2受體的激活影響至少兩種信號傳導途徑Gq和(is途徑，其中這兩種途徑能相互交叉調節。這種交叉調節就是一種網狀相互作用。另一個例子是A431細胞內的EGFR信號傳導，它涉及復雜的多組成信號傳導途徑。這些途徑提供了反饋、信號擴增、和細胞內多種信號和信號傳導途徑之間相互作用的機會，主要通過網狀相互作用。86.化學生物學方法“化學生物學方法”或類似術語是指涉及應用化學技術和工具，通常是合成化學生成的化合物，進行生物系統的研究和操控的科學方法。一些形式的化學生物學嘗試通過在化學水平直接探測活的系統來回答生物學問題。與采用生物化學、遺傳學或分子生物學這些能突變產生新的感興趣生物體或細胞的研究相反，化學生物學研究有時采用為特定目的設計或在基于生化或細胞篩選的基礎上鑒定的小分子在體內或體外探測系統。87.細胞生物學方法“細胞生物學方法”或類似術語是指涉及研究細胞-其生理學特性、結構、所含細胞器、與環境的相互作用、生命周期、分裂和死亡的科學方法。這在顯微和分子水平上完成。 知曉細胞的組成和細胞如何工作是所有生物科學的基礎。88.生物傳感器細胞試驗為核心的細胞概況藥理學
“生物傳感器細胞試驗為核心的細胞概況藥理學”或類似術語是采用無標記生物傳感器細胞試驗確定分子的藥理學的方法。89.系統生物學“系統生物學”或類似術語是指在生物學過程發揮作用的復雜生理環境中對這些過程的‘系統化’調查。90.系統藥理學“系統藥理學”或類似術語是指用系統生物學探索藥理學目標。91.調節標志物的生物傳感器信號“調節生物傳感器信號”或類似術語是指使細胞應答標志物刺激的生物傳感器信號或概況發生改變。92.調節DMR信號“調節DMR信號”或類似術語是指使細胞應答標志物刺激的DMR信號或概況發生改變。93.(藥物候選分子的)直接作用“直接作用”或類似術語是指(藥物候選分子)獨立作用于細胞的結果。94.細胞概況藥理學“細胞概況藥理學”或類似術語采用無標記生物傳感器，特別是光生物傳感器，產生細胞對單獨刺激或與刺激與分子一起的應答的初級概況，和細胞在沒有分子時對單獨刺激或與標志物分子組一起的應答的二級概況。初級概況和二級概況的集合、及其所得調節概況被獨立或集中用于確定分子的藥理學。95.細胞/標志物在沒有和存在分子時的動力學應答“細胞/標志物在沒有和存在分子時的動力學應答”或類似短語是指在沒有和存在分子時標志物誘導的細胞應答的整個試驗或部分試驗的時間系列，采用例如模式識別分析，其可直接用于檢測分子的藥理學或作用模式。96.結合“結合”、“附著”、“粘附”、“粘著”、“貼壁”、“固定化”、或類似術語一般指例如，表面
修飾物質、相容劑、細胞、配體候選分子、和本公開的類似實體通過物理吸附、化學結合、和類似過程或其組合固定化或固著在表面上。具體而言，“細胞附著”、“細胞粘著”或類似術語是指細胞與表面的相互作用或結合，例如通過培養、或與細胞錨定材料、相容劑(例如纖連蛋白、膠原蛋白、核纖層蛋白、明膠、聚賴氨酸等)相互作用、或兩者一起。“貼壁細胞”、“固定化細胞”、或類似術語是指保持與基底外表面結合、固定或某種接觸的細胞、細胞系或細胞系統，例如原核或真核細胞。這類細胞在培養后能承受或經受清洗和介質交換過程而保持附著，這些過程是很多基于細胞的試驗的先決條件。97.弱貼壁細胞“弱貼壁細胞”是指在細胞培養中與基底表面相互作用、結合、或接觸較弱的細胞、 細胞系或細胞系統，例如原核或真核細胞。但是，這些類型的細胞，例如人胚胎腎(HEK)細胞通過清洗或培養基交換的物理擾動方式從基底表面脫離。98.懸浮細胞“懸浮細胞”是指優選在培養基中培養，其中細胞在培養過程中不附著或粘著在基底表面的細胞或細胞系。但是，懸浮細胞通常可以通過化學(例如共價結合、或抗體-細胞表面受體相互作用)、或物理方式(例如，由于重力作用沉降到包埋了生物傳感器的孔底部)與生物傳感器表面接觸。因此，懸浮細胞也可用于生物傳感器細胞試驗。99.對象全文中使用的對象或類似術語是指個體。因此，“對象“可以包括，例如馴養的動物如貓、狗等，牲畜(例如，牛、馬、豬、綿羊、山羊等)、實驗動物(例如，小鼠、兔子、大鼠、豚鼠等)和哺乳動物、人以外的哺乳動物、靈長動物、人以外的靈長動物、嚙齒動物、鳥、爬行動物、兩棲動物、魚和任何其它動物。在一個方面，對象是哺乳動物，例如靈長動物或人。對象可以不是人。100.可選的“可選的”或“可選地”或類似術語表示隨后描述的事件或情形可以發生或不發生， 而且該描述包括事件或情形發生的實例和事件或情形不發生的實例。例如，短語“可選地， 組合物可以包含組合”是指組合物可以包含不同分子的組合或不包含組合，從而說明書包括了組合和不存在組合(例如組合中單獨的成員)。101.—除非上下文中有明確的另外說明，在本說明書和權利要求書中所用的單數形式 “一個”，“一種”和“該”或類似術語包括復數指示物。因此，例如“一種藥學載體”包括兩種或更多載體的混合物等。102.縮寫可采用本領域普通技術人員熟知的縮寫(例如，表示小時的“h”或“hr”、表示克的 “g”或“gm”、表示毫升的“mL”、表示室溫的“rt”、表示納米的“nm”、表示摩爾的“M”以及類似縮寫)。103.范圍在本文中，范圍可以表述為自“約” 一具體值始和/或至“約”另一具體值止。表述這樣的范圍時，另一種實施方式包括自一具體值始和/或至另一具體值止。類似地，用先行詞“約”將數值表達為近似值時，應該理解，該具體值構成另一實施方式。應該進一步理解，范圍的各端點不論與另一端點相關還是獨立于該另一端點，都是有意義的。還應理解， 在此公開了許多數值，每個數值也都公開為“約”具體值，還包括數值本身。例如，如果公開數值“10”，則也公開“約10”。還應理解，當數值公開為“小于或等于”該值，“大于或等于” 該值時，也公開如由技術人員適當理解的數值之間可能的范圍。例如，如果公開數值“10”， 則也公開了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。還應理解，在通篇申請中，提供了許多不同格式的數據，這些數據代表終點和起點以及由這些數據點的任意組合的范圍。例如，如果公開具體數據點“10”和具體數據點“15”，應理解，可以認為公開了大于、大于或等于、小于、大于或等于、以及等于“10”和“15”、以及在10-15之間。還應理解，還公開了兩個具體單元之間的每個單元。例如，如果公開10和15，則也公開了 11，12，13和14。104.包含在本說明書的描述和權利要求中，詞語“包含”和該詞語的其它形式，如“含有”和 “包括”，意味著“包括但不限于”并且不意圖排除例如其它添加劑、組分、整數、或步驟。105.主要由……組成
實施方式中的“主要由……組成”指例如表面組合物、在本公開的生物傳感器、制品、裝置、或設備表面上制作或使用表面組合物、制劑或組合物的方法，還可包括權利要求中列出的組分或步驟，以及實質上不影響組合物、制品、設備和制造使用本公開的方法中任何一項的基本新性質的其它組分或步驟，如所選的特定反應物、特定添加劑或成分、特定試劑、特定細胞或細胞系、特定表面調節劑或表面條件、特定候選配體、或類似結構、材料或過程變量。可對本發明的組分或步驟的基本性質產生實質影響或可賦予本發明不希望出現的特征的項目包括例如，細胞對生物傳感器表面的親和力降低、刺激對細胞表面受體或胞內受體的異常親和力、對候選配體或類似刺激的應答的不規則或相反細胞活性、和類似特征。106.穩定在用于藥物組合物時，術語“穩定”或類似術語一般在本領域理解為表示在特定保存條件下經過給定的期間活性成分的損失低于一定量，通常為10%。組合物被認定為穩定所需要的時間和各產品的用途有關，并由生產所述產品、保持以進行品質控制和檢查、運輸到批發商或直接到消費者在其最終使用前被再次保存的商業化實踐所確定。包括數月時間的安全因子，藥物的最短產品壽命一般是一年，優選超過18個月。本文所用術語“穩定”參考了這些市場現實和在容易實現的環境條件例如2V _8°C冷藏下保存與運輸產品的能力。107.組分公開了本文所述方法中使用的用于制備所公開組合物的組分和組合物本身。本文公開了這些和其它的材料，應當理解，當公開這些材料的組合、子集、相互關系、組等等而未明確地具體提及這些分子的每個不同的單獨的和集合的組合以及這些分子的排列組合時， 在本文中具體設想和描述了它們中的每一種情況。因此，如果公開了一類分子A、B、和C且公開了一類分子D、EjP F和分子組合的實施例A-D，則即使沒有分別列舉每個單獨地和集合地視為有意義的組合，也應當認為公開了 A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、CUP C-F。同樣， 還公開這些組合的任意子集或組合。因此，舉例來說，應認為已公開亞組A-E、B-F和C-E。 此觀念可適用于本申請的所有方面，包括但不限于制造和使用所公開的組合物的方法。因此，如果存在可進行的多個附加步驟，應當理解可通過所公開方法的任一特定實施方式或實施方式的組合來進行這些附加步驟中的每一個。108.模擬本文所用的“模擬”或類似術語是指執行參考對象的一種或多種功能。例如，分子模擬物執行分子的一種或多種功能。109.或本文所用的詞語“或”或類似術語表示特定列表中的任意成員且還包括該列表中成員的任意組合。110.出版物整篇申請中，引用了多個出版物。這些出版物公開的全部內容通過引用納入本申請中以更完整地描述本申請所屬領域的狀態。所公開的參考文獻基于其討論中所包含的物質也被單獨地和具體地通過引用納入本文。111.樣品樣品或類似術語是指按本文所述進行試驗的動物、植物、真菌等；天然產物、天然產物提取物等；動物的組織或器官；細胞(在對象內的、或直接取自對象、或在培養物中維
20持的細胞或來自培養細胞系的細胞)；細胞裂解物(或裂解物的部分)或細胞提取物；或含有一種或多種來自細胞或細胞材料的分子(例如多肽或核酸)的溶液。樣品還可以是含有細胞或細胞組分的體液或分泌物(例如，但不限于血液、尿液、糞便、唾液、淚液、膽汁)。112.約本公開的實施方式中采用對例如，組合物中成分的量、濃度、體積、過程溫度、過程時間、產率、流速、壓力、和類似數值，及其范圍進行修飾的約是指可能發生的數值量的改變，例如，由于制備化合物、組合物、濃縮物或使用制劑所用的常規測量和操作過程；由于這些過程中的偶然性誤差；由于用來進行所述方法的起始材料或成分的生產、來源或純度的差異；和類似因素。術語“約”還包括由于具有特定初始濃度或混合物的組合物或制劑的陳化而不同的量，以及由于混合或加工具有特定初始濃度或混合物的組合物或制劑而不同的量。無論是否受術語“約”修飾，所附權利要求書均包括這些量的等同形式。113.數值組分、成分、添加劑、細胞類型、標志物和類似方面的公開的具體和優選數值及其范圍僅用于說明，它們不排除其它定義數值或定義范圍內的其它數值。本發明的組分、設備和方法包括具有本文所述的任何數值或數值的任何組合、具體數值、更具體數值和優選數值的組分、設備和方法。因此，本文公開的方法、組合物、制品、和機器可以以包含或由其組成、或基本由其組成的方式組合本文討論的不同組分、步驟、分子和組合物等。例如，它們可用于本文定義的分子包括配體的鑒定方法；本文定義的產生指數的方法；或本文定義的藥物發現的方法。114.復合物和組合物復合物和組合物在本領域中具有標準含義。應當理解，在任何情況下，具體名稱， 例如分子、物質、標志物、細胞、或試劑，都公開了包含這些名稱、由其組成、和基本由其組成的組合物。因此，當使用具體名稱標志物時，應當理解還公開了包含該標志物，由該標志物組成、或基本由該標志物組成的組合物。在適當之處，當給出具體的名稱時，應當理解也公開了該名稱的復合物。例如，當公開具體的生物材料，例如EGF時，EGF的復合物形式也被公開。B.組合物、方法、產品、和機器醫藥和生物技術受到看似相反目標的挑戰⑴達到更低的新藥損耗率和(2)縮短新藥進入市場的引入時間。藥物發現要求從近乎無限量的化學實體中選出具有所需藥理和生理品質的隱蔽分子。不幸的是，藥物的選擇可以是成本極高且本質上低效的過程。 盡管在先進技術上有大量投入，近年中新藥批準的數量仍很低。目前的研發生產能力的缺口 -醫藥研發花費相對于每年引入的候選新藥數量的增加-已經引起廣泛關注，對于該問題及其可能的解決方法有不同意見。基因組和蛋白質組的最新發展顯著增加了新藥的潛在靶標數量，這加劇了上述形勢。盡管此前針對已知靶標有過成功，但靶標取向的藥物發現技術往往不能針對新的靶標 (即不是以前藥物靶標的分子)提供藥物。重要的是，過去十年中全行業平均每年只有兩到三個針對這些“創新型”靶標的小分子藥物。因此，很多公司重新檢查用于藥物發現和開發的工具、技術和操作。這種反省突出了對基于系統生物學和系統藥理學的藥物作用的評估和驗證的需求，和對更多生理相關技術的需求，特別是在藥物發現中。1.鑒定分子的方法本文公開了采用無標記生物傳感器細胞試驗進行藥物發現的方法。具體而言，本文公開了用于藥物發現的涉及以無標記生物傳感器細胞試驗為核心的細胞概況藥理學的方法。本方法涉及使用無標記生物傳感器，通過直接監控候選藥物分子對代表人生理學和人病理生理學的不同種類細胞組的作用，確定候選藥物分子的系統細胞藥理學，以及確定候選藥物分子獨立地或者與標志物組分子一起調節各細胞應答刺激生物傳感器信號的能力。分子對細胞的直接作用產生其初級概況，而分子對標志物誘導的生物傳感器信號的調節產生二級概況。兩種概況通常都記錄為實時動力學細胞應答。在標志物組作用的多種細胞之間結合不存在分子時的初級概況和分子存在時的二級概況，獲得分子針對這些標志物的多組調節概況。例如，全部或部分組的調節概況可結合產生調節指數，例如生物傳感器指數，例如DMR指數。比較分子指數和藥理學已知調節劑組既定指數，能確定分子干預的細胞受體或靶標或途徑。細胞概況藥理學方法不僅提供了任意分子的作用模式(例如靶標、途徑、激動或拮抗、或毒性)的信息，還能確定其效能、選擇性、和系統細胞藥理學。本藥物發現方式和方法可使用本文公開的任何實體組分，包括但不限于材料、物質、分子、配體、標志物、分子、組合物、未知分子、已知分子、測試分子、候選藥物分子、分子混合物、調節劑、已知調節劑、細胞、激動劑、拮抗劑、庫、組、標志物組、細胞組、受體、細胞靶標、確定的途徑、經分子處理的細胞、信號途徑、附著細胞、弱貼壁細胞、懸浮細胞、生物傳感器、和甚至對象。本藥物發現的方式和方法可使用本文公開的任何實體/抽象或信息上相關的組分，包括但不限于應答、細胞應答、生物傳感器應答、DMR應答、概況、初級概況、二級概況、調節概況、生物傳感器信號、DMR信號、對照、陽性對照、陰性對照、調節劑比較、指數、生物傳感器指數、DMR指數、分子生物傳感器指數、分子DMR指數、分子指數、調節劑生物傳感器指數、 調節劑DMR指數、分子調節劑指數、已知調節劑生物傳感器指數、已知調節劑DMR指數、標志物生物傳感器指數、標志物DMR指數、標志物生物傳感器指數、標志物指數、指數相似性、基體、分子藥理學、細胞過程、時間段、短的時間段、另一時間段、指示劑、人生理學、人病理生理學、長期生物傳感器信號、長期DMR信號、強生物傳感器信號、強DMR信號、效能、功效、網狀相互作用、化學生物學、細胞試驗為核心的細胞概況藥理學、系統細胞藥理學和細胞概況藥理學。本藥物發現的方式和方法可以使用本文公開的任何方法組成，包括但不限于調節、細胞培養、試驗、長期試驗、短期試驗、兩步試驗、脈沖刺激試驗、處理、接觸、引發、檢查、 應答的試驗、標準化、鑒定、增強、淘選、調節生物傳感器信號、調節DMR信號、和附著。應當理解，本文中任何組分都可以任意組合使用，本文中至少對上述組分清單中弓丨用的組分具體列舉了各種變換。公開了確定不同種類細胞組的基體，用于基于細胞概況藥理學的藥物發現。在某些實施方式中，采用人細胞確定分子，例如候選藥物分子的藥理學。實踐中幾乎不可能使用所有的人細胞來確定候選藥物的藥理學。為了綜合候選藥物分子的潛力和成藥性，可以選擇不同的細胞組用于特定的目的。例如，廣譜細胞組可用于評估分子的潛在副作用，而特定疾病相關的細胞組可用于確定分子治療特定疾病的效能和功效。另一方面，來自特定器官的細胞組可用于研究分子的特異性，而特定靶標的細胞組可用于確定分子通過相同靶標發揮作用的廣泛應用。已知由于各細胞的特定細胞背景，特定細胞靶標的活性調節可能導致不同的細胞應答(常稱為細胞環境依賴性“表型”應答)。藥物候選分子可以表現出對相同細胞靶標活性調節的功能選擇性，從而在表達相同靶標的細胞間產生不同的細胞應答。a)信號傳導途徑和細胞靶標公開了標志物/細胞靶標/途徑組對每種細胞的應用。標志物/細胞靶標/途徑的選擇首先是預先確定配體組在各種細胞類型中引發生物傳感器信號如DMR的能力，然后通過化學生物學調節概況確定系統細胞生物學(例如，配體誘導的靶標調節下游的途徑和網狀相互作用)和各配體的系統細胞藥理學(例如，靶標特異性和效能和功效)。當(1)配體在采用生物傳感器細胞試驗的細胞中產生強生物傳感器信號，( 配體的生物傳感器信號具有由至少一種特定靶標介導的至少一種特定細胞信號傳導途徑和/或至少一種細胞過程的特征時，配體可定性為標志物。細胞組中的各種細胞的標志物可以是不同的。例如，細胞1可使用標志物A和B 和C，而細胞2可使用標志物D和E和F。在另一種實施方式中，組內的至少兩種細胞有至少一種共同標志物。例如，組胺可用作組內A549和A431細胞的標志物。在其它實施方式中，組內各細胞的標志物數量可以不同(例如，細胞1有1種標志物，細胞2有2種標志物， 細胞3有2種標志物，細胞4有4種標志物)。在其它實施方式中，組內各細胞的標志物數量可以相同(例如，各細胞有1種標志物，各細胞有2種標志物，或各細胞有3種標志物)。在實施方式中，標志物組可以選擇為完全覆蓋主要細胞傳導途徑(例如一種Gtl的標志物、Gi的標志物、一種Gs的標志物、一種EGFR的標志物、一種Toll樣受體途徑的標志物等等)。在某些實施方式中，根據感興趣的特定疾病(例如炎性疾病、感染疾病、癌癥、糖尿病、肥胖癥、神經疾病、自體免疫疾病、哮喘的氣道發炎、COPD的氣道病理、阿耳茨海默病、 自體免疫導致白癜風、結直腸癌、胰腺癌、或病毒引發氣道發炎等)，標志物組選擇為覆蓋特定信號傳導途徑群(例如，PI3K途徑、Akt途徑、PKA途徑、MAPK途徑、JNK途徑、toll樣受體途徑、Gq途徑、Gs途徑、Gi途徑、G12713途徑、EGFR途徑、mTOR途徑、或IKK途徑等)。主要的細胞信號傳導途徑包括，但不限于，14-3-3誘導胞內信號傳導(例如細胞周期調節、凋亡)、通過Mio家族GTP酶基于肌動蛋白的運動、cAMP-PKA途徑、通過GPCR介導的(is途徑、通過GPCR介導的Gq途徑、通過GPCR介導的Gi途徑、通過GPCR介導的G12/13 途徑、AIF途徑、Akt信號傳導、上皮細胞中的醛固酮信號傳導、AMPK酶復合物途徑、MHC的抗原加工和呈遞、通過死亡受體或HIVl的凋亡、苦味信號傳導、cAMP途徑、T-輔助細胞中的CD^信號傳導、細胞凋亡途徑、神經酰胺途徑、趨化因子信號傳導、CREB途徑、細胞周期蛋白和細胞周期調節、eNOS信號傳導、ERK信號傳導、雌激素調節、FAK信號傳導、FGF途徑、 G-β Y信號傳導、GPCR途徑、生長激素信號傳導、GSK3信號傳導、白介素(例如，IL_1、IL_2、 IL-22、IL-3、IL-23、IL-9)途徑、NOS信號傳導、胰島素受體途徑、整聯蛋白途徑、干擾素途徑、胞內鈣信號傳導、IP3途徑、JAK-STAT途徑、JNK途徑、MAPK信號傳導、線粒體凋亡、mTOR 途徑、NF- κ B途徑、NGF途徑、Notch信號傳導、p38信號傳導、p53介導的凋亡、PDGF途徑、 磷脂酶C途徑、PI3K信號傳導、PKA信號傳導、PKC途徑、PTEN途徑、Racl途徑、RANK途徑、 Rapl途徑、Ras途徑、RhoA途徑、RNAi途徑、siRNA途徑、SMAD信號傳導、STAT3途徑、SUMO途徑、T細胞受體信號傳導、TGF-β途徑、凝血酶信號傳導、TNF信號傳導、Toll樣受體途徑、 VEGF途徑、和WNT信號傳導。由于許多這些途徑和信號傳導事件中共有很多匯聚點(稱為整合點或接點)并相互作用，本文公開的生物傳感器細胞試驗可以提供關于信號傳導和網狀相互作用的信息。不必要把所有這些途徑包括在本文所述的細胞概況藥理學藥物發現的標志物/靶標/途徑組中。公開了多種試驗用于基于生物傳感器細胞概況藥理學的發現。在一種實施方式中，采用長期生物傳感器細胞試驗研究分子對細胞組的長期影響。此處每個類型的細胞僅暴露于分子較長時間(例如，8小時、16小時、24小時、32小時、48小時、72小時)。這一長期試驗用于確定分子對健康細胞狀態(例如，活力、凋亡、細胞周期調節、細胞粘附程度、增殖)的影響。這一長期試驗還包含可直接用于分子誘導細胞信號事件或途徑研究的早期細胞信號應答(例如，分子刺激后10分鐘、30分鐘、60分鐘、120分鐘、180分鐘)。在另一種實施方式中，標志物存在下的長期生物傳感器細胞試驗被用于研究分子和標志物對細胞生物學和生理學的長期影響之間的交叉調節。標志物的添加可以在分子之前、同時、和之后。例如，當標志物(例如,H2O2)引發細胞組中至少一種細胞的凋亡時，可以采用這種長期試驗確定分子是否是保護性的。在另一種實施方式中，至少采用兩步試驗，細胞組中每種細胞首先暴露于分子以研究分子誘導的生物傳感器信號如DMR信號，然后單獨用特定標志物或標志物組處理。該試驗常稱為雙模試驗初始的激動模式和后續的拮抗模式。激動模式設定為確定分子引發生物傳感器信號例如DMR信號的能力，而拮抗模式設定為確定分子調節標志物組的生物傳感器信號例如DMR信號的能力，每個標志物組用于細胞組中一種細胞。在另一種實施方式中，可采用脈沖刺激試驗，其中細胞僅暴露于分子中極短時間 (例如，數秒、或數分鐘)。這種脈沖刺激試驗可用于研究分子作用于細胞/靶標的動力學， 及其對標志物誘導的DMR信號的影響。可以通過在添加分子后的給定時間用液體操作裝置簡單地將分子溶液替換成細胞試驗緩沖液來進行脈沖刺激試驗。2.生成指數的方法公開了研究分子例如藥物候選分子的系統細胞藥理學的方法。所述方法包括產生生物傳感器信號信號指數例如DMR指數用于直接分析分子的系統細胞藥理學，或者基于分子和熟知調節劑(例如PII抑制劑、PKA抑制劑、GPCR拮抗劑、RTK抑制劑、EGFR中和抗體、 或磷酸二酯酶抑制、PKC抑制劑或激活劑等)誘導的生物傳感器信號信號指數例如DMR指數之間模式識別的間接分析。在一種實施方式中，所述方法包括(1)在激動模式下采集對分子的生物傳感器信號應答例如DMR應答；( 在存在和沒有分子時采集細胞組中對標志物組的生物傳感器信號應答例如DMR應答；(3)從各生物傳感器信號信號例如DMR信號中消除特定的生物傳感器信號應答參數例如DMR參數群；(4)將各參數對陽性對照(即在沒有任何分子的情況下經標志物處理的細胞)進行標準化以產生調節百分數(其可表明增強、抑制、或沒有調節)； 將各參數的調節百分數對標志物/細胞作圖產生所述分子的生物傳感器信號指數；和(6)針對所述細胞/標志物組，將所述分子誘導的生物傳感器信號指數與已知調節劑生物傳感器信號指數庫，或任何分子誘導的生物傳感器信號指數庫作比較。在一種實施方式中，所述方法包括⑴在激動模式下采集對分子的DMR應答；⑵在存在和沒有分子時采集細胞組中對標志物組的DMR應答；(3)從各DMR信號中消除特定的DMR參數群；(4)將各DMR參數對陽性對照(即在沒有任何分子的情況下經標志物處理的細胞)進行標準化以產生調節百分數(其可表明增強、抑制、或沒有調節)；( 將各DMR 參數的調節百分數對標志物/細胞作圖產生所述分子的DMR信號指數；和(6)針對所述細胞/標志物組，將所述分子誘導的DMR信號指數與已知調節劑DMR指數庫，或任何分子誘導的DMR指數庫作比較。分子生物傳感器信號指數例如DMR指數和調節劑生物傳感器信號指數例如DMR指數之間的相似性可用作分子作用模式的指示劑。分子生物傳感器信號指數例如DMR指數越接近調節劑生物傳感器信號指數例如DMR指數，分子調節調節劑作用的相同靶標的可能性就越大。生物傳感器信號指數例如DMR指數中還可包括激動模式下的分子生物傳感器信號例如DMR信號。在某些實施方式中，鑒定出某一指數和另一指數之間，例如分子指數和已知標志物指數之間的相似性至少為 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 98%的分子。可以從概況中例如P-DMR數據產生的任意指數點確定所述相似性。在該示例中，可以用兩種方式之一確定相似性1)各指數的全部P-DMR數據點中至少例如80%相似； 或2)各指數的每個數據點相似性至少為80%。在某些實施方式中，采用傳統的模式識別分析將分子指數和標志物指數、調節劑指數、或任何分子指數的庫作比較鑒定分子的作用模式。在某些實施方式中，采用分數矩陣鑒定分子的作用模式。所述分數矩陣與其對應物密切相關，例如在相應細胞中不同分子的初級概況的特征，和不同分子對各標志物的調節概況的本質和百分比。例如，給予更相似的特征更高的分數，給予不相識的特征較低或負的分數。因為調節指數中只有三種調節，正、負和中性，相似性矩陣比較簡單。例如，簡單的矩陣可以給相同的調節(例如正調節)評分為+1，給不同的調節評分為-1。在另一些實施方式中，可以給具有不同水平的一種調節類型不同的分數。例如，10 %、20 %、30 %、40 %、 50%、60%、100%、200%等的正調節可以相應評分為 +1、+2、+3、+4、+5、+6、+10、+20。相反，對于負調節，可以給出相似但相反的評分。根據這一方法，圖9C顯示了 HA-1077針對標志物組的調節指數，表明PKA/PKG抑制劑HA1077差異性地調節不同標志物誘導的生物傳感器應答在A549細胞中，吡那地爾(-95%)、聚(I:C) (+18% )、PMA(+36% )、SLIGKV-酰胺 (+22%)、毛喉素(+18%)、組胺(+26%)；和在A431靜息細胞中，腎上腺素(_38%)、煙酸 (+8% ), EGF(P-DMR, +19% ), EGF(N-DMR, -20% )、和組胺(-50% )。因此，HA1077 調節指數的協同評分可以定為(-9. 5，1. 8,3. 6,2. 2，1. 8,2. 6,-3. 8,0. 8，1. 9，-2，-5)。類似地，對于 H8，其協同評分為(-7. 2,1. 8,2. 2,3. 2,2,3. 8,6. 5,-1. 6,1,0. 3,-2,1. 6)。通過比較HA1077 和H8的分數，可以推斷在兩種檢測的細胞系中兩種分子都顯示相似的作用模式。3.藥物發現方法公開了任何分子包括藥物候選分子的系統藥理學或系統細胞藥理學評估方法。所述方法依賴于細胞/標志物/靶標/途徑的選擇以產生分子的生物傳感器指數，例如DMR 指數。分子引發生物傳感器信號如DMR信號，和調節標志物誘導生物傳感器信號如DMR信號的能力，可結合不同類型試驗，系統評估分子的整合藥理學。參考圖1，該示意圖顯示了所公開的用于藥物發現的細胞概況藥理學方法。該示例中，采用了兩種細胞，細胞1和細胞2。這兩種細胞可以是相關、或不相關的。對每種細胞， 進行兩種試驗僅用分子的長期試驗，和短期的例如兩步(或雙模)試驗。所述長期試驗用于確定分子對健康細胞狀態(例如，增殖率、細胞周期調節、毒性、或細胞粘附的改變等)的影響。雙模試驗包括用以確定兩種細胞內分子誘導的生物傳感器信號如DMR信號的初始激動模式，和隨后用以確定每種細胞中所述分子調節標志物組誘導的生物傳感器信號如DMR 信號的拮抗模式。在此，每種細胞有自己的標志物組，例如細胞1有標志物A、B和C，或細胞2有標志物D、E和F。各標志物可以通過不同途徑產生信號傳導，例如在細胞1中對應途徑a、b和C、或細胞2中對應途徑d、e和f。或者，這些途徑可以相互作用，或至少其中兩種可以相似或相同。調節概況的組合可用來生成調節指數。和分子的初級概況一起，可以生成分子針對2種細胞和6種標志物的生物傳感器指數，例如DMR指數。生物傳感器指數如 DMR指數，進一步用于確定分子藥理學，通過針對生物傳感器指數庫如已知調節劑庫的DMR 指數進行模式識別。參考圖2，該示意圖顯示了基于生物傳感器細胞概況藥理學的方法如何用于確定分子藥理學。該方法由細胞開始，針對能通過特定途徑(例如Gq偶聯組胺1受體介導的信號傳導)引發細胞信號傳導的標志物組測試分子，最后通過與已知調節劑誘導的生物傳感器信號指數庫如DMR指數庫的比較進行模式識別(或特定數據點)，從而確定分子得以作用的特定靶標。因此可以確定分子的整合藥理學。公開的細胞概況藥理學采用無標記生物傳感器，特別是光生物傳感器，產生細胞應答單獨刺激或與標志物分子組一起刺激的初級概況。各標志物分子激活受體或細胞靶標，產生細胞內的生物傳感器信號。公開了確定和篩選分子藥理學的方法，采用以生物傳感器為核心的測量，該方法包括1).選擇細胞組，其中基于基體選擇所述細胞；2).確定各種細胞中的細胞靶標組和標志物組，其中標志物分子對細胞靶標的調節不僅通過確定的途徑產生信號傳導，還引起可被無標記生物傳感器檢測的生物傳感器信號；3).用分子處理各細胞；3a)用標志物組處理各細胞以生成組中各標志物的初級概況；4).監控短時間段的細胞應答以生成分子的初級概況；5).將標志物組分別添加到經分子處理的細胞以生成分子影響各標志物信號的二級概況，其中各標志物為特定的劑量(例如，EC5(1、EC8(1、EC9(1、EC95或EC1J ；6).監控另一時間段的細胞應答；6a)比較標志物組中各標志物在所述分子存在下的二級概況和各標志物的相應初級概況；7).生成所述分子在全組細胞中針對標志物組的生物傳感器指數。8).比較所述分子的生物傳感器指數與具有已知藥理學的調節劑的生物傳感器指數，其中所述分子生物傳感器指數與所述調節劑生物傳感器指數的相似性是所述分子作用模式的指示劑。9)可選地，生成所述分子在細胞內沒有和存在標志物下的長期生物傳感器信號。公開的細胞概況藥理學采用無標記光生物傳感器以產生細胞應答單獨刺激或與標志物分子一起刺激的初級概況。各標志物分子激活受體或細胞靶標，引起細胞內的DMR 信號。公開了確定和篩選分子藥理學的方法，采用以生物傳感器為核心的測量，該方法包括1).選擇細胞組，其中所述細胞基于基體選擇。2).確定各種細胞中的細胞靶標組和標志物組，其中標志物分子對細胞靶標的調節不僅通過確定的途徑引起信號傳導，還引起可被無標記生物傳感器檢測的DMR信號；3).用分子處理各細胞；4).監控短時間段的細胞DMR應答產生分子的初級DMR概況；5).將標志物組分別添加到經分子處理的細胞以生成分子影響各標志物信號的二級DMR概況，其中各標志物為特定的劑量(例如，EC50, EC80, EC90, EC95或ECltJ ；6).監控另一時間段的細胞DMR應答；7).生成所述分子在全組細胞中針對標志物組的DMR指數。8).比較所述分子的DMR指數與具有已知藥理學的調節劑的DMR指數，其中所述分子DMR指數與所述調節劑DMR指數的相似性是所述分子作用模式的指示劑。9)可選地，生成所述分子在細胞內沒有和存在標志物下的長期DMR信號。不同于高度依賴使用細胞系統和接觸點測量(例如細胞生長速率、或特定細胞因子的釋放)的基于傳統系統生物學和系統藥理學的藥物發現，本公開的方法使用不同種類天然細胞或工程細胞組，與基于無標記生物傳感器的動力學測量相結合，用于研究分子藥理學和病理藥理學。傳統系統生物學方法常使用大規模分析工具進行鑒定，例如蛋白微陣列、DNA微陣列、或質譜。還公開了采用天然或工程細胞系統用于細胞概況藥理學的方法。可通過將不同細胞類型組合在一起把疾病相關復雜性改造進細胞系統，并通過同時激活多種途徑探明網狀調節和突顯特性。例如，用于炎性疾病的細胞系統方法可包括上皮細胞與血單核細胞，和復雜細胞因子或免疫刺激環境的組合。系統生物學，特別是信號傳導途徑的闡明和動態分析，為藥物發現提供了新的框架。通過在迭代方法中整合實驗、數學和計算科學，得以洞察這些大量、差異、相互作用組分的組合行為。通過這一對疾病分子機理的相關了解，系統方法進一步推進調節和代謝網絡的治療性調節的鑒定和確認，從而有助于鑒定候選藥物的靶標和生物標志物，以及‘脫靶’ 效應和副作用。例如，本文公開的方法能使用系統生物學方法研究分子或物質。本文公開的方法還具有基于傳統系統生物學方法的優點。例如，在各系統中細胞、 刺激物和讀出信息的組合，一起試驗的系統組合可用于以最少的測量檢測和區分盡可能多的疾病調節劑。本文公開的藥物發現方法再次將生物學擺在首位，并在整個發現過程中應用生物學知識該方法根據在復雜細胞系統或模擬感興趣疾病狀態中的不同活性細胞、途徑和網絡的細胞組中闡明的生物學來鑒定成功品并優化先導物。該方法中，采用候選藥物本身進行確認，而不是靶基因或靶蛋白。4.生物傳感器和生物傳感器試驗無標記細胞試驗常使用生物傳感器監控活細胞中分子誘導的應答。分子可以是天然產生或是合成的，可以是純化的或未純化的混合物。生物傳感器常利用傳感器，例如光、 電、熱量、聲、磁、或類似傳感器將與生物傳感器接觸的細胞內的分子識別事件或分子誘發
27的變化轉化成可定量的信號。這些無標記生物傳感器可用于涉及鑒定分子復合物如何隨時間形成和解離的分子相互作用分析，或用于涉及鑒定細胞如何對刺激應答的細胞應答分析。可用于本方法的生物傳感器包括，例如，光生物傳感器系統如表面等離振子共振(SPR) 和共振波導光柵(RWG)生物傳感器、共振鏡、橢圓計，和電生物傳感器系統如生物阻抗系統。a) SPR生物傳感器和系統SPR依靠棱鏡把覆蓋入射角范圍的一角偏振光導入裝有導電金屬膜(例如金)的平面玻璃基材上以激發表面等離子體。所產生的漸消波與金層中的游離電子云相互作用并被吸收，產生電荷密度波(即表面等離子體)并導致反射光強度的減弱。產生最新強度的共振角隨傳感器表面的反面上接近金層溶液的折射率而變化。 b) RffG生物傳感器和系統RffG生物傳感器可包括，例如基材(例如玻璃)、包埋了光柵或周期性結構的波導薄膜、和細胞層。RWG生物傳感器利用通過衍射光柵的方式將光共振偶聯進入波導，導致在溶液-表面界面的全內反射，進而在界面產生電磁場。這一電磁場本質是漸消的，表示它從傳感器表面指數衰減；它衰減到初始值的Ι/e的距離稱為貫穿深度，它隨具體的RWG生物傳感器的設計而變化，但通常在約200納米左右。這類生物傳感器利用這種漸消波鑒定傳感器表面上或靠近該表面的細胞層由配體誘導的變化。RWG儀器可以根據角度變化或波長變化測量細分為不同系統。在波長變化測量中， 采用具有恒定角度的覆蓋入射波長范圍的偏振光照射波導，特定波長的光被偶聯進入并沿波導放大。或者，在角度變化儀器中，用單色光照射傳感器并測量光的共振偶聯角度。共振條件受與生物傳感器表面直接接觸的細胞層影響(例如細胞融合、粘附和狀態)。當配體或分析物與活細胞內的細胞靶標(例如，GPCR、激酶)相互作用時，細胞層內局部折射率的任何變化可以通過共振角(或波長)的變化檢測出。Corning Epic 系統采用RWG生物傳感器進行無標記生化或細胞試驗(康寧公司，紐約州康寧)。所述Epic 系統由RWG讀板儀和SBS(生物分子篩選學會)標準微量滴定板組成。讀板儀的檢測器系統利用集成光纖測量入射光的波長變化，該變化是細胞內配體誘導變化的結果。一系列照射-檢測頭以線性方式排列，從而能從384孔微孔板的列中各孔同時采集反射光譜。掃描整塊板使得每個傳感器被多次訪問，每列被依序訪問。采集入射光的波長用于分析。所述儀器可包括溫控單元以盡可能減少因溫度波動導致的入射光偽變化。測得的應答代表細胞群的平均應答。系統的不同部分例如樣品加載可以自動化， 也可以多通路化，例如用96孔或384孔微量滴定板。可以用機載的液體處理器或外接的液體處理附件進行液體操作。具體地，在各孔底部培養了細胞的細胞試驗板的孔內直接添加或吸入分子溶液。細胞試驗板包含一定體積試驗緩沖液覆蓋細胞。在分子添加步驟中還可以加入通過吸上放下數次完成的簡單混合步驟。c)電生物傳感器和系統電生物傳感器由基材(例如，塑料)、電極、和細胞層組成。在這種電檢測方法中， 在陣列于基材上的小金電極上培養細胞，并按時跟蹤系統的電阻抗。阻抗是對細胞層電導率變化的測量。通常，在電極或電極陣列上施加固定頻率或變頻的微小恒定電壓，隨時間監控流經電路的電流。配體誘導的電流變化提供了細胞應答的測量。用于全細胞感測的阻抗測量最初于1984年實現。從那時起，基于阻抗的測量被應用于研究廣泛的細胞事件， 包括細胞粘著和伸展、細胞微動、細胞形態變化、和細胞死亡。經典阻抗系統的缺陷在于因使用小檢測電極和大參比電極導致的高試驗變化。為克服這一變化，最新一代的系統，例如 CellKey系統(MDS賽科斯(MDS Sciex)，加利福尼亞州南舊金山)和RT-CES (ACEA生物科學公司(ACEA Biosciences he.)，加利福尼亞州圣地亞哥)采用具有微電極陣列的集成電路。d)高空間分辨率生物傳感器成像系統光生物傳感器成像系統，包括SI3R成像系統、橢圓計成像系統、和RWG成像系統，提供了高空間分辨率，可用于本公開的實施方式中。例如，SPRimager· II (GWC技術公司)采用棱鏡偶聯SPR，在固定的入射角進行SI3R測量，并用CCD相機采集反射光。記錄表面的變化作為反射性的變化。因此，sra成像同時采集陣列中所有元件的測量。基于RWG生物傳感器的掃頻波長光解調系統可用于以成像為基礎的應用。該系統中，采用快速可調激光源照射傳感器或在微孔板形式中的RWG生物傳感器陣列。可以通過檢測激光波長掃描時傳感器上反射的光能隨時間的變化構建傳感器光譜，用計算機化共振波長解調模型分析所測數據得到固定有受體或細胞層的生物傳感器的空間解析圖像。使用圖像傳感器自然生成基于成像的解調方案。可以無需移動部件獲得二維無標記圖像。或者，可以采用具有橫向磁力或ρ-偏振光TMtl模式的角度調查系統。該系統由發射系統和接收系統組成，發射系統產生光束陣列使其中每個以約200 μπιΧ3000μπι或 200 μ mx2000 μ m的維度照射RWG傳感器，基于CXD相機的接收系統用于記錄從這些傳感器反射光束的角度變化。通過分光器和衍射光學鏡片的組合獲得陣列的光束。該系統能每3 秒對最多49個傳感器(在7x7孔傳感器陣列中)同時測樣，或每10秒對最多整個384孔微孔板進行同時測樣。或者，還可使用掃描波長解調系統。該系統中，采用覆蓋恒定角度入射波長范圍的偏振光照射并掃描整個波導光柵生物傳感器，可同時記錄各位置的反射光。通過掃描，也可以獲得整個生物傳感器的高分辨率圖像。5.活細胞內的動態質量再分布(DMR)信號通過細胞靶標對刺激的細胞應答可以由下游信號網絡的空間和時間動態編碼。因此，實時監控細胞信號傳導的整合能提供用于細胞生物學和生理學理解的生理學相關信肩、ο光生物傳感器包括共振波導光柵(RWG)生物傳感器，能檢測動態細胞物質再分布相關的集成細胞應答，從而提供研究細胞信號傳導的非侵入性手段。所有光生物傳感器的共同點在于它們能測量傳感器表面或極接近該表面的局部折射率的變化。原則上，幾乎所有光生物傳感器都可用于細胞感測，因為它們能使用漸消波鑒定細胞內配體誘導的變化。 漸消波是電磁場，由光在溶液-表面界面的全內反射產生，它通常延伸到溶液內很短的距離(約數百納米)，其特征深度稱為貫穿深度或感測容積。近來，開發出理論和數學模型描述在活細胞應答配體刺激中測得光學信號的參數和特性。這些模型基于3層波導系統與已知細胞生物物理的結合，將配體誘導的光信號與通過受體介導的特定細胞過程聯系起來。因為生物傳感器測量受入射光照射區域細胞的平均應答，可以采用細胞高度融合層以獲得最佳試驗結果。由于與生物傳感器的短貫穿深度相比細胞尺寸較大，傳感器配置考慮用非傳統的三層系統基材、具有光柵結構的波導膜和細胞層。因此，配體誘導的有效折射率(即，測得的信號)變化可以是，以一級形式，直接與細胞層底部折射率變化成比例Δ N = S (C) Δ nc其中S (C)為對細胞層的靈敏度，Δη。為生物傳感器感測的配體誘導的細胞層局部折射率變化。因為細胞內給定體積的折射率主要由生物分子如蛋白質的濃度決定，Δη。可以假定為與配體誘導的局部細胞靶標濃度或感測體積內的分子組件濃度的變化直接成比例。考慮到漸消波從傳感器表面延伸的指數衰減性質，配體誘導的光信號受下式支配
權利要求
1.一種鑒定分子的方法，該方法包括a.可選地，采集分子的生物傳感器應答生成初級概況；b.在所述分子存在下，采集細胞組中標志組的生物傳感器應答生成二級概況；c.從各生物傳感器信號中提取特定生物傳感器參數群；d.將各生物傳感器參數對陽性對照標準化以產生調節比較；e.將至少一個生物傳感器參數的調節比較對所述標志物組或所述細胞組作圖以產生分子調節指數；f.可選地，聯用所述分子的初級概況和所述分子調節指數以產生分子生物傳感器指數；以及g.比較所述分子生物傳感器指數與調節劑生物傳感器指數庫。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物傳感器檢測DMR。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，還包括識別與所述分子生物傳感器指數中一種或多種分子調節概況相似的所述調節劑生物傳感器指數中一種或多種標志物調節概況。
4.如權利要求2所述的方法，其特征在于，當所述分子生物傳感器指數與所述調節劑生物傳感器指數相似時，所述分子與所述調節劑共享相似的作用模式。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a)在激動劑模式下進行。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟d)中所述陽性對照包括當細胞樣品僅用標志物處理時標志物產生的初級概況。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述調節比較包括增強。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述調節比較包括抑制。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述調節比較包括無調節。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述調節劑生物傳感器指數庫包括分子調節指數。
11.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述調節劑生物傳感器指數庫包括分子生物傳感器指數。
12.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述調節劑生物傳感器指數庫包括不同分子，但在相同細胞組中針對相同標志物組。
13.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述分子生物傳感器指數與調節劑生物傳感器指數之間的所述相似性被用作作用模式的指示劑。
14.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述相似性基于所述分子生物傳感器指數之間的模式識別分析。
15.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述相似性基于所述分子調節指數之間的模式識別分析。
16.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述相似性基于對所述分子調節指數的分數矩陣。
17.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述標志物組從配體庫中選擇，其中每個在細胞中產生指示特定細胞信號傳導途徑的生物傳感器信號。
18.如權利要求1所述的方法，其特征在于，還包括生成所述分子在細胞內沒有和存在標志物下的長期生物傳感器信號。
19.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述標志物在向細胞添加所述分子之前、 同時、或之后添加。
20.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述細胞組包括與特定疾病相關的一類細胞、來自特定來源的一類細胞、與特定靶標相關的一類細胞、或與特定生理功能相關的一類細胞。
21.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述細胞包括天然細胞、工程細胞、轉化細胞、永生細胞、原代細胞、胚胎干細胞、成人干細胞、腫瘤干細胞、或干細胞衍生的細胞。
22.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(a)包括將所述細胞與特定劑量的所述分子接觸。
23.如權利要求22所述的方法，其特征在于，所述特定劑量是某個選自1μΜ、5μΜ、 10 μ Μ、或50 μ M的所述分子濃度。
24.如權利要求22所述的方法，其特征在于，所述特定劑量是某個選自lng/ml、10ng/ ml、100ng/ml、ly g/ml、10y g/ml、或 100μ g/ml 的所述分子濃度。
25.如權利要求22所述的方法，其特征在于，所述特定劑量是標志物在所述細胞內引發其生物傳感器信號的EC5Q、EC80, EC90, EC95、或ECiqq。
26.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(a)包括將所述細胞與特定劑量的所述標志物組的標志物接觸。
27.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(a)包括將所述細胞與所述配體接觸一段時間然后將所述細胞與所述標志物接觸。
28.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(b)包括將所述細胞與所述標志物接觸一段時間然后將所述細胞與所述分子接觸。
29.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(b)包括將所述細胞與所述標志物和所述分子同時接觸。
30.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(d)包括比較(1)標志物的初級概況的P-DMR幅度和所述分子針對所述標志物的二級概況的P-DMR幅度、( 標志物的初級概況的N-DMR幅度和所述分子針對所述標志物的二級概況的N-DMR幅度、( 標志物的初級概況的RP-DMR幅度和所述分子針對所述標志物的二級概況的RP-DMR幅度、或其組合。
31.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述調節比較包括調節差異、調節百分數、 或其組合。
32.—種生成指數的方法，該方法包括a.采集分子針對多于一個標志物的調節概況；以及b.在指數中列出所述分子的調節比較
33.如權利要求32所述的方法，其特征在于，在一種細胞類型中獲得多個標志物的調節指數。
34.如權利要求32所述的方法，其特征在于，在多種細胞類型中獲得單個標志物的調節指數。
35.如權利要求32所述的方法，其特征在于，在多種細胞類型中獲得多個標志物的調節指數。
36.如權利要求32所述的方法，其特征在于，獲得多個標志物的調節指數。
37.一種藥物發現的方法，該方法包括a.比較未知分子的指數與已知調節劑的指數，b.確定未知分子配體指數是否與已知調節劑指數相似。
38.一種鑒定分子的方法，該方法包括a.將細胞與標志物接觸；b.測試所述細胞對所述標志物的應答以得到初級概況；c.將細胞與標志物和所述分子接觸；以及d.測試所述細胞對所述標志物和所述分子的應答以得到調節概況。
39.一種鑒定分子的方法，該方法包括a.將細胞與標志物和分子接觸；b.測試所述細胞對所述標志物和所述分子的應答。
40.如權利要求39所述的方法，其特征在于，還包括在之前的步驟后合成所述分子的步驟。
41.如權利要求40所述的方法，其特征在于，還包括制備所述分子的衍生物庫的步驟。
42.如權利要求41所述的方法，其特征在于，其中一個或多個步驟在機器上進行。
43.如權利要求42所述的方法，其特征在于，所述機器是一般計算機。
44.如權利要求43所述的方法，其特征在于，所述機器是生物傳感器。
45.一種制備組合物的方法，該方法包括合成分子，其中所述分子表征為分子，其中所述分子指數與調節劑指數有相似性，并能采用權利要求1所述的方法識別。
46.一種產品，通過權利要求45所述的過程制備。
47.一種采用生物傳感器細胞試驗篩選分子的方法，該方法包括a.選擇細胞組；b.選擇標志物組，各組標志物用于細胞組中的一種細胞；c.用分子處理組內的每種細胞產生經分子處理的細胞組；d.監控生物傳感器應答以產生所述分子的初級概況組，每種細胞一個概況；e.將標志物組中各標志物單獨添加到經分子處理的細胞組中的每種細胞中，其中各標志物為特定劑量；f.監控生物傳感器應答以產生分子影響標志物生物傳感器信號的二級概況組，每個標志物一個概況；g.對全組細胞并針對標志物組生成分子生物傳感器指數；h.比較所述分子生物傳感器指數與已知調節劑的生物傳感器指數，其中分子生物傳感器指數和調節劑生物傳感器指數之間的相似性是分子作用模式的指示劑。
48.如權利要求47所述的方法，其特征在于，所述細胞組與特定疾病、特定細胞靶標、 特定起源相關，或者代表特定的人生理和病理生理。
49.如權利要求48所述的方法，其特征在于，所述細胞組中包括至少一種細胞系統。
50.如權利要求49所述的方法，其特征在于，所述細胞系統包括兩類細胞。
51.如權利要求47所述的方法，其特征在于，步驟e)中所述的標志物特定劑量包括其在細胞中引發生物傳感器信號的EC5(1、EC8(1、EC9(1、EC95或EC1(1(1中的至少一個濃度。
52.一種鑒定分子的方法，該方法包括a.用一組已知配體淘選細胞組以確定已知配體是否能在給定細胞類型中引發強生物傳感器信號，b.選擇能引發強生物傳感器信號的已知配體作為標志物以產生給定細胞類型的標志物庫，c.確定各標志物在特定細胞類型中引發生物傳感器信號能力的效能和功效，d.確定各標志物在特定細胞類型中引發的信號傳導途徑和網狀相互作用，e.減選各細胞類型的標志物組，f.進行試驗檢測分子在細胞組中引發生物傳感器信號的能力以生成所述分子的初級概況組，并檢測所述分子在所述細胞組中調節標志物誘導的生物傳感器信號的能力以生成二級概況組或所述分子針對標志物組的調節概況，g.生成分子生物傳感器指數，以及h.比較所述分子的生物傳感器指數與已知調節劑生物傳感器指數庫。
53.一種鑒定分子的方法，該方法包括a.采集分子的DMR應答產生初級概況；b.在所述分子存在下，采集細胞組中標志物組的DMR應答產生二級概況；c.從各生物傳感器信號中提取特定DMR參數群；d.將各DMR參數對陽性對照標準化以產生調節比較；e.將至少一個生物傳感器參數的調節比較對所述標志物組或所述細胞組作圖以產生分子調節指數；f.可選地，聯用所述分子的初級概況和所述分子調節指數以產生分子DMR指數；以及g.比較所述分子DMR指數與調節劑DMR指數庫。
全文摘要
藥物發現是面臨著許多挑戰的復雜任務，尤其是高消耗率，由于對疾病、進而對其生物系統、它們的靶標知之甚少，很多有希望的候選物在臨床上被證明是無效或毒性的。因此，已形成廣泛共識提高藥物發現的產率需要大大加深對于疾病的分子機理的理解，要超越單個基因和蛋白而考慮到藥物靶標的全部生物環境。本方法依靠無標記細胞試驗，特別是DMR指數的使用，系統化顯示任何分子的作用模式、毒性、和靶標與途徑。
文檔編號G01N33/566GK102292636SQ200980155483
公開日2011年12月21日 申請日期2009年11月23日 優先權日2008年11月24日
發明者A·M·菲里, E·特蘭, J·拉稀瑞, 方曄 申請人:康寧股份有限公司