專利名稱：分析物檢測試驗的制作方法
技術領域：
本發明涉及分析物檢測的領域。更特別地，本發明涉及使用基于回音壁模式(WGM) 的試驗進行生物傳感并且快速而靈敏地檢測分析物。
背景技術：
本說明書中作者參考的出版物的書目詳細內容在描述的結尾處集中按字母順序
全A屮
口 QQ ο本說明書中對任何現有技術的參考不是并且不應當認為是該現有技術形成任何國家的公知常識的一部分的承認或任何形式的暗示。單片共振器中的環路光學模式稱為“回音壁模式”(WGM)或“形態依賴性共振”(MDR)。這樣的模式或共振是通過來自共振器邊界的全內反射支持的封閉光軌跡(直立光波)。通過球形電介質腔表面內的近-全內反射限制特定發射剖面的直立光波時，產生了 WGM(Moller 等，Applied Physics Letters 83(13) :2686-2688,2003) WGM技術詳細描述于國際專利申請No.W02005/116615中，在此將其引入作為參考。WGM技術部分是基于熒光團能夠產生與眾不同的WGM特征的現象預測的。將熒光團結合至量子點上，通過擴散使量子點進入微粒中或可以在其制備過程中摻入。熒光團的類型不受限制，并且可以是例如有機染料、基于稀土的生光團、各種形態和組成的半導體納米晶體、磷光體或照亮時發射光的其他材料。然后將這種熒光團或其混合物結合微球體顆粒。當目標分析物與固定于微球體顆粒上的結合伴侶相互作用時，WGM特征產生變化，因此能夠檢測結合事件。WGM只允許從顆粒中發射出來的特定波長的光。這種現象的結果是來自例如熒光團的常見寬發射(IO-IOOnm寬)條帶受到限制并顯示為一系列有效地對應于顆粒內光的直立模式圖型的銳鋒形。WGM特征對微球體顆粒表面的變化非常敏感，并且當微球體顆粒與其環境中的分析物或分子相互作用時，WGM特征發生變化。不同來源樣品中的稀有分析物的檢測需要靈敏、通用且實際的檢測方法。需要設計提高WGM的靈敏度、通用性和實用性的方法，用于分析物的檢測。
發明內容
本發明提供了一種基于回音壁模式(WGM)檢測試驗的靈敏方法和試劑，特別是， 用于檢測樣品中的分析物。 特別地，本發明的目的是描述一種方法，通過該方法，利用WGM對環境的敏感性， 可以常規地檢測任何介質(液體或氣體)中的未標記分析物。關于液體和氣體，包括水溶液和生物緩沖液以及空氣。本發明的方法和試劑一部分是基于意想不到的確定具有熒光團的微球體涂層本身，與使用離散的量子點相反，增強了基于WGM的檢測的靈敏度。在另一部分中，顆粒(如， 在其表面上具有功能化的化學基團的顆粒)的選擇提高了量子點或直接熒光團涂層發生時的靈敏度。在另一部分中，選擇相對于在其中進行試驗的介質而具有較高折射率的顆粒。 在一個實施方案中，微球體顆粒具有高于1. 40的折射率。因此，本發明的一個方面提供了介質中分析物檢測的方法，該方法包括將覆蓋熒光團的微球體和多個配體接受WGM檢測工具，以鑒定一個或多個配體與配體結合分析物之間的結合事件。在另一個方面中，本發明提供了介質中分析物檢測的方法，該方法包括將微球體和多個配體接受WGM檢測工具，以鑒定一個或多個配體與配體結合分析物之間的結合事件，其中微球體具有高于包含覆蓋熒光團的分析物的介質的折射率。在一個實施方案中，微球體顆粒具有高于1. 40的折射率。本發明的另一個方面提供了檢測分析物和配體之間的結合事件的方法，其包括步驟(i)將多個配體錨定一群熒光團偶聯的微球體顆粒；(ii)將微球體顆粒接觸陰性對照樣品，并測定基線光譜；(iii)在一定的時間和足以促進分析物及其各自的配體之間的結合事件的條件下，將微球體顆粒接觸推定含有分析物的樣品；和(iv)將微球體顆粒接受 WGM檢測工具，以檢測結合事件。本發明的另一個方面包括，用于檢測介質中的分析物的方法，包括步驟(i)將多個分析物的配體錨定一群熒光團偶聯的微球體顆粒，其中如果微球體顆粒是蜜胺甲醛，則其可以與熒光團偶聯或包含量子點；(ii)將微球體顆粒接觸陰性對照樣品并測定基線光譜；(ii)在一定的時間和足以促進分析物及其各自的配體之間的結合事件的條件下， 將微球體顆粒接觸推定含有分析物的樣品；和(iii)將微球體顆粒接受回音壁模式(WGM)檢測工具，以檢測結合事件。在特定的實施方案中，通過化學部分，如使用疊氮化物、炔、胺、醛、硫酸鹽或硫醇、 羧基、羧酸鹽和/或羥基，將微球體顆粒官能化。在一個方面中，微球體顆粒是胺-醛顆粒， 如但不限于，蜜胺顆粒或蜜胺甲醛顆粒。因此，本發明的另一個方面提供了用于檢測分析物和配體之間的結合事件的方法，包括步驟(i)將多個配體錨定一群熒光團偶聯的官能化微球體顆粒；(ii)將官能化的微球體顆粒接觸陰性對照樣品，并測定基線光譜；(iii)在一定的時間和足以促進分析物及其各自的配體之間的結合事件的條件下，將官能化的微球體顆粒接觸推定含有分析物的樣品；和(iv)將微球體顆粒接受WGM檢測工具，以檢測結合事件。在特定的實施方案中，本發明提供了用于檢測分析物和配體之間的結合事件的方法，包括步驟(i)將多個配體錨定一群熒光團偶聯的胺-醛微球體顆粒；(ii)將胺-醛微球體顆粒接觸陰性對照樣品，并測定基線光譜；(iii)在一定的時間和足以促進分析物及其各自的配體之間的結合事件的條件下，將胺-醛微球體顆粒接觸推定含有分析物的樣品；和(iv)將胺-醛微球體顆粒接受WGM檢測工具，以檢測結合事件。在最特別的實施方案中，胺-醛顆粒是蜜胺甲醛顆粒。
因此，本發明提供了用于檢測分析物和配體之間的結合事件的方法，包括步驟 (i)將多個配體錨定一群熒光團偶聯的蜜胺甲醛微球體顆粒；(ii)將蜜胺甲醛微球體顆粒接觸陰性對照樣品，并測定基線光譜；(iii)在一定的時間和足以促進分析物及其各自的配體之間的結合事件的條件下，將蜜胺甲醛微球體顆粒接觸推定含有分析物的樣品；和 (iv)將蜜胺甲醛微球體顆粒接受WGM檢測工具，以檢測結合事件。當顆粒是蜜胺甲醛時，顆粒還可以包含量子點。因此，本發明的另一個方面是提供用于檢測分析物和配體之間的結合事件的方法，包括步驟(i)將多個配體錨定一群包含熒光團覆蓋的量子點的蜜胺甲醛微球體顆粒；(ii)將微球體顆粒接觸陰性對照樣品，并測定基線光譜；(iii)在一定的時間和足以促進分析物及其各自的配體之間的結合事件的條件下，將微球體顆粒接觸推定含有分析物的樣品；和(iv)將微球體顆粒接受WGM檢測工具， 以檢測結合事件。本發明的另一個方面提供了用于檢測分析物和配體之間的結合事件的方法，包括步驟(i)將多個配體錨定一群具有高于包含分析物的介質的折射率的微球體顆粒，微球體顆粒編碼熒光團；(ii)將微球體顆粒接觸陰性對照樣品，并測定基線光譜；(iii)在一定的時間和足以促進分析物及其各自的配體之間的結合事件的條件下，將微球體顆粒接觸推定含有分析物的樣品；和(iv)將微球體顆粒接受WGM檢測工具，以檢測結合事件。本發明的再另一個方面提供了檢測分析物的方法，該方法包括將至少一群微球體顆粒接觸推定包含分析物的樣品，其中微球體顆粒群內的每個顆粒包含應答紅外線激勵發射可見光輻射的熒光團和分析物的固定化推定結合伴侶，其中每個顆粒群具有限定的WGM 特征，其中分析物與固定化結合伴侶的結合導致至少一群微球體顆粒的WGM特征發生變化，這表示了分析物的存在。在一個實施方案中，分析物或其各自的配體包含選自核酸；蛋白；肽；抗體；脂質； 碳水化合物；和任何小分子或化學個體的分子，包括細胞(例如，癌細胞)、細菌和病毒。在特定的實施方案中，與微球體顆粒錨定的配體是核酸分子，待檢測的分析物是互補核酸分子。在另一個實施方案中，核酸配體或分析物是包含單鏈DNA序列的DNA分子。本發明的另一個方面提供了一種方法的用途，該方法包括步驟(i)將多個配體錨定一群熒光團偶聯的微球體顆粒；(ii)將微球體顆粒接觸陰性對照樣品，并測定基線光譜；(iii)在一定的時間和足以促進分析物及其各自的配體之間的結合事件的條件下，將微球體顆粒接觸推定含有分析物的樣品；和(iv)將微球體顆粒接受試驗制備中的WGM檢測工具，以檢測分析物和配體之間的結合事件。在進一步的實施方案中，微球體可以是循環利用的。此外，試驗可以在任何介質中進行，如空氣或其他氣體，或在液相中，如水溶液、生物緩沖液或復合的生物流體。在另一個方面中，本發明提供了一種試劑盒，其包含熒光團偶聯的微球體顆粒和多個用于與其錨定的配體，用于通過WGM檢測工具來檢測配體和分析物之間的結合事件。在特定的實施方案中，試劑盒包含熒光團偶聯的微球體顆粒，多個配體已經與其結合。當顆粒是蜜胺甲醛時，熒光團可以覆蓋在有機染料或量子點上。在進一步的方面中，本發明提供了包含WGM檢測工具的生物傳感器，其中生物傳感器是包含粉末來源、光源、樣品操縱室和分光光度計的自給裝置。
核苷酸和氨基酸序列通過序列識別號(SEQ ID NO)來表示。SEQ ID NO用數字對應于序列識別號<400>1(SEQ ID NO :1)、<400>2(SEQ ID NO :2)等。表1中提供了序列識別號的概括。在權利要求之后提供了序列表。表1中提供了貫穿本說明書中所用的序列識別號的概括。表 1序列識別號的概括
權利要求
1.一種用于檢測介質中的分析物的方法，包括步驟(i)將多個分析物的配體錨定一群熒光團偶聯的微球體顆粒，其中如果微球體顆粒是蜜胺甲醛，則其可以與熒光團偶聯或包含量子點；( )將微球體顆粒接觸陰性對照樣品并測定基線光譜；( )在一定的時間和足以促進分析物及其各自的配體之間的結合事件的條件下，將微球體顆粒接觸推定含有分析物的樣品；和(iii)將微球體顆粒接受回音壁模式(WGM)檢測工具，以檢測結合事件。
2.如權利要求1的方法，其中微球體顆粒包含選自以下的材料蜜胺或其衍生物；硅石；乳膠；氧化鈦；二氧化錫；氧化釔；氧化鋁；其他二價金屬氧化物；鈣鈦礦和其他壓電金屬氧化物；PLGA ；蔗糖和瓊脂糖。
3.如權利要求2的方法，其中微球體顆粒包含蜜胺甲醛。
4.如權利要求1的方法，其中選擇相對于其中進行檢測的介質具有更高折射率的微球體顆粒。
5.如權利要求4的方法，其中微球體顆粒具有高于1.40的折射率。
6.如權利要求1至5任一項的方法，其中介質是液相或氣相。
7.如權利要求1至6任一項的方法，其中液相是水溶液、緩沖液或生物流體，氣相是空氣。
8.如權利要求1的方法，其中分析物或其各自的配體包含選自以下的分子核酸；蛋白；肽；抗體；脂質；碳水化合物；細菌；病毒；細胞和任何小分子或化學實體。
9.如權利要求8的方法，其中分析物或其各自的配體包含核酸。
10.如權利要求8的方法，其中核酸包含單鏈DNA。
11.如權利要求10的方法，其中通過用限制性核酸內切酶和/或核酸外切酶消化雙鏈 DNA來制備單鏈DNA。
12.如權利要求11的方法，其中限制性核酸內切酶是1型限制性核酸內切酶。
13.如權利要求11的方法，其中核酸外切酶是λ核酸外切酶。
14.如權利要求10的方法，其中從RNA:DNA雜交分子制備單鏈DNA。
15.如權利要求14的方法，其中RNA:DNA雜交分子包含與通過逆轉錄制備的信使RNA 雜交的DNA。
16.如權利要求14的方法，其中RNA是病毒RNA。
17.如權利要求1的方法，其中分析物或配體源自獲自生物、工業、實驗室或環境來源的分離樣品。
18.如權利要求17的方法，其中樣品包含礦物、合成的、真核生物的、原核生物的或病毒來源的材料。
19.一種方法在制造檢測分析物和配體之間的結合事件的試驗中的用途，該方法包括步驟(i)將多個配體錨定一群熒光團偶聯的微球體顆粒，其中如果微球體顆粒是蜜胺甲醛，則其可以與熒光團偶聯或包含量子點；(ii)將微球體顆粒接觸陰性對照樣品并測定基線光譜；(iii)在一定的時間和足以促進分析物及其各自的配體之間的結合事件的條件下，將微球體顆粒接觸推定含有分析物的樣品；和(iv)將微球體顆粒接受WGM檢測工具。
20.一種用于檢測分析物和配體之間的結合事件的方法，包括步驟(i)將多個配體錨定一群熒光團偶聯的或量子點標記的蜜胺甲醛微球體顆粒；(ii)將蜜胺甲醛微球體顆粒接觸陰性對照樣品并測定基線光譜；(iii)在一定的時間和足以促進分析物及其各自的配體之間的結合事件的條件下，將蜜胺甲醛微球體顆粒接觸推定含有分析物的樣品；和(iv) 將蜜胺甲醛微球體顆粒接受WGM檢測工具，以檢測結合事件。
全文摘要
快速且靈敏的分析物檢測試驗是基于熒光標記的微球體顆粒的回音壁模式。將分析物(如核酸)的配體錨定顆粒。熒光標記可以包含熒光團或量子點。在后一種情況中，顆粒可以包含蜜胺甲醛。試驗可以用于檢測含水樣品中的分析物。
文檔編號G01N33/551GK102272597SQ200980153782
公開日2011年12月7日 申請日期2009年11月20日 優先權日2008年11月21日
發明者E·努希杰, K·F·伯特, P·馬爾瓦尼 申請人:墨爾本大學, 惠研生物系統公司