殺蟲劑的篩選測定法的制作方法
                            
            
                            
            文檔序號：6087129閱讀：372來源：國知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            專利名稱：殺蟲劑的篩選測定法的制作方法
            
殺蟲劑的篩選測定法本發明涉及作為殺蟲劑靶標的優選來自黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)的具有電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Siaker樣)活性的(DmSial)鉀通道。在一個實施方案中，電壓門控性鉀通道Sial與其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)，優選地其假定的輔助蛋白CG5890，果蠅屬KChIP(鉀通道相互作用蛋白)直向同源物共表達。本發明提供具有優選來自黑腹果蠅(DmSiaI)昆蟲電壓門控性鉀通道 Shal (Shaker同族物1或Shaker樣)及其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白)，優選其假定的輔助蛋白CG5890，果蠅屬KChIP(鉀通道相互作用蛋白)直向同源物活性作為殺蟲劑靶標的多肽，提供編碼具有昆蟲電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Smker樣)及其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性多肽的新核酸序列及其上述核酸序列的功能等同物。本發明還涉及具有昆蟲電壓門控性鉀通道Shal和/或其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽，在鑒定降低昆蟲電壓門控性鉀通道SiaKShaker同族物1或 Shaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的殺蟲活性化合物的方法和測定法中的用途。此外，本發明涉及通過上述方法鑒定的殺蟲化合物和這些化合物用作殺蟲劑的用途。在另一實施方案中，本發明涉及具有優選來自黑腹果蠅Siaker鉀通道活性的作為殺蟲劑靶標的鉀通道。在一個實施方案中，Siaker通道與優選來自黑腹果蠅的 Hyperkinetic β亞基，優選Η-Ι νβ亞基A或C亞型共表達。本發明還提供在殺蟲劑篩選測定法中使用的具有優選來自黑腹果蠅昆蟲Siaker 通道和Hyperkinetic β亞基，優選H_kvi3亞基A或C亞型活性的多肽，提供編碼具有昆蟲 Shaker通道和Hyperkinetic β亞基，優選H_kvi3亞基A或C亞型活性的多肽的新核酸序列及其上述核酸序列的功能等同物。本發明此外還涉及具有昆蟲Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基， 優選H_kvi3亞基A或C亞型活性的多肽分別在鑒定分別降低昆蟲a^ker通道和 Hyperkinetic β亞基，優選H_kv β亞基A或C亞型活性的殺蟲活性化合物中的方法和測定中的用途。此外，本發明涉及通過上述方法鑒定的殺蟲化合物和這些化合物用作殺蟲劑的用途。在另一實施方案中，本發明涉及具有優選來自黑腹果蠅酚乙醇胺受體活性的作為殺蟲劑靶標的G蛋白偶聯受體(GPCR)。本發明還提供殺蟲劑的篩選測定法中使用的具有優選來自黑腹果蠅酚乙醇胺受體活性的多肽，提供編碼具有優選來自黑腹果蠅酚乙醇胺受體活性的多肽的新核酸序列及其上述核酸序列的功能等同物。本發明還涉及具有選自優選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, Oct-β和Oct-β _3R 的酚乙醇胺受體活性的多肽，在鑒定降低選自優選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, Oct_i3-2R和 Oct-β-3R的酚乙醇胺受體活性的殺蟲活性化合物的方法和測定中的用途。此外，本發明涉及通過上述方法鑒定的殺蟲化合物和這些化合物用作殺蟲劑的用途。
            
在另一實施方案中，本發明涉及作為殺蟲劑靶標的SK-通道。本發明此外提供作為殺蟲劑靶標的具有昆蟲小電導Ca2+激活鉀通道活性的多肽，提供編碼具有昆蟲小電導Ca2+激活鉀通道活性的多肽的新核酸序列及其上述核酸序列的功能等同物。本發明還涉及具有昆蟲小電導Ca2+激活鉀通道活性的多肽，在鑒定降低昆蟲小電導Ca2+激活鉀通道活性的殺蟲活性化合物的方法和測定中的用途。此外，本發明涉及通過上述方法鑒定的殺蟲化合物和這些化合物用作殺蟲劑的用途.昆蟲引起許多人和動物疾病。昆蟲還引起相當大的農業和財產損害，導致經濟損失。盡管使用和濫用了所有的昆蟲毒藥，但是昆蟲還是每年破壞超過30 %的全球糧食作物。已經開發出許多方法以限制由昆蟲引起的破壞。一種方法是使用用于昆蟲控制的化學藥品。許多殺蟲劑如DDT的問題在于它們需要高濃度應用和它們具有非特異的廣譜活性的事實。化學殺蟲劑通常影響有益和無益的物種。它們當中許多久存于環境中并且因此在食物鏈中積累。另一種方法是表達殺蟲毒素，例如來自細菌蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)蛋白質毒素的轉基因作物。昆蟲害蟲有獲得對所有殺蟲劑抗性的傾向，因為它們具有適應其環境的罕見能力，這是因為它們具有在昆蟲群體中引起快速出現抗性的機制，如短生活周期、高繁殖率和長距離行進的能力。現在，表現出殺蟲劑抗性的害蟲在日益增加。因此，仍然有尋找具有對昆蟲害蟲極其特異作用的有效且經濟的殺蟲劑的需求。 殺蟲劑越有效，其造成的環境危險越小。這可以通過鑒定和分離編碼將會控制昆蟲發育和/或存活的蛋白質的基因實現。本發明提供昆蟲電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)作為殺蟲劑的新的靶標。本發明還提供用于鑒定降低昆蟲電壓門控性鉀通道aial (Shaker同族物1或Smker樣)和/或其輔助蛋白 KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的殺蟲活性化合物的方法和測定法。在許多果蠅屬胚胎和幼體神經元中發現的外向電壓依賴性K+電流源于Siaker 家族成員 Shaw、Shab 和 Shal 產生的混合電流(Tsunoda，S.和 L. Salkoll (1995) J Neuroscience. March ；15 (3)  1741-1754)。Shal 產生這些宏觀 K+ 電流的瞬時部分(“A-型” 電流)并且通過例如某些神經元中引起延緩的電流脈沖調整這些電流(Yu，D.，i^ng，C.和 A. Guo (1999) JNeurobiology. Aug ；40 (2) :158-70)。選擇性剪接、翻譯后修飾和其他 Shal 相關的加工可能部分地負責在這些神經元中觀察到的廣泛的調整(Choi，J. C.，Park，D.和 L. C. Griffith(2004)J Neurophysiology. 91 :2353-2365)。已經證明Kv4. X(Shal)輔助蛋白KChIP可能通過促進四聚體通道組裝急劇增加 Shal向細胞膜的運輸，和引起Sial通道門控特性的不同變化(KunjiIwar, K.，Strang, C. ， DeRubeis, D.禾口 P.J.Pfaffinger(2004)JBiological Chemistry. Dec ；279 (52) 54542-54551)。不管ami在神經元傳導中的作用如何，對于該靶標的確認案例仍有待確立。我們的原位數據表明在胚胎腹神經索和內臟肌肉組織中低水平表達。位于Berkeley的果蠅屬基因組計劃顯示在胚胎/幼體內臟肌肉、縱向內臟肌肉纖維、腹中線和胚胎中樞神經系統包括腹神經索中有染色。DmaiaImRNA是在胚胎中期表達達到高峰的罕見轉錄物(內部Lynx 數據)。在哈佛醫學院果蠅保藏中心有兩個內含子轉座子插入系，但是沒有與此相關的生存力數據，并且也得不到其它的Sial突變體。在公眾領域也沒有微列陣或者northern數據。在市場上還沒有已經鑒定具有Sial鉀通道調節作為其主要作用方式的殺蟲劑， 這意味著化合物不僅僅通過殺蟲活性的“副作用”起作用，而且其活性是關鍵的致死作用。在另一實施方案中，本發明提供分別作為殺蟲劑新靶標的昆蟲Siaker通道和/或 Hyperkinetic β亞基，優選H_kvi3亞基A或C亞型。本發明還提供用于鑒定分別降低昆蟲 Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優選Η-Ι νβ亞基A或C亞型活性的殺蟲活性化合物的方法和測定法。果蠅Hyperkinetic (Hk)突變改變編碼哺乳動物K+通道P亞基同系物的基因。 Wang 等(Biophysical Journal Volume 71, December 1996,3167-3176)已經證明，Hk P 亞基調節大范圍的 Shaker(Sti)K+ 電流特性。從 CH0UINARD 等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 92，pp. 6763-6767，July 1995 Neurobiology)還可知道 Hk 與 Sh 在爪蟾卵母細胞中共表達，這證明該共表達增加電流波幅并且改變電壓依賴性和活化與失活的動力學。令人驚奇地發現，Shaker通道和Hyperkinetic β亞基，優選Η-kv β亞基A或B亞型的共表達導致產生新的殺蟲劑篩選測定法。在市場上還沒有已經鑒定具有Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優選 H-kv β亞基A或C亞型調節作為其主要作用方式的殺蟲劑，這意味著化合物不僅僅通過殺蟲活性的“副作用”起作用，而且其活性是關鍵的致死作用。在另一實施方案中，本發明提供選自優選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, Oct_i3-2R和 Oct-β -3R的昆蟲酚乙醇胺受體作為殺蟲劑的新靶標。本發明還提供用于鑒定降低選自優選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, Oct- β _2R和Oct- β _3R的昆蟲酚乙醇胺受體活性的殺蟲活性化合物的方法和測定法。酚乙醇胺是結構上與去甲腎上腺素有關的生物源單胺，其是在脊椎動物外周和中樞神經系統中介導不同生理過程的主要神經遞質、神經調質和神經激素。酚乙醇胺與酪胺一起僅是神經活性的非肽遞質，其生理作用局限于脊椎動物。酚乙醇胺的作用通過多種受體類別像oa2、Oamb, Oct-β _2R或Oct-β _3R介導。酚乙醇胺受體僅僅/主要發現于無脊椎動物中這一事實使得它們成為殺蟲劑的重要的靶標。因此，特異性調節酚乙醇胺受體的化合物將具有低的脊椎動物毒性。除了選擇性之外，酚乙醇胺受體由于其在神經元中表達而成為殺蟲劑的良好靶標。酚乙醇胺與酪胺一起僅是神經活性的非肽遞質，其生理作用局限于無脊椎動物。雖然酚乙醇胺是昆蟲中的主要神經介質，但是已經證明其受體難以克隆。目前，僅少數酚乙醇胺受體已經被克隆。本發明提供克隆章魚堿受體并將其引入優選細胞的膜中的方法。優選地，額外連接的蛋白質引入到膜中。取決于受體同種型，酚乙醇胺受體可通過環AMP產生或細胞內鈣釋放調節它們的活性。酚乙醇胺受體，優選oa2內源性地通過cAMP傳導信號。受體活性的檢測是困難的。因此，本發明提供強制偶聯至鈣的方法，這導致當其活化時鈣釋放。鈣釋放通過熒光的鈣傳感染料測量。
            
令人驚奇地發現，選自優選來自黑腹果蠅oa2、Oamb、Oct- β -2R和Oct- β _3R的酚乙醇胺受體的表達和泛宿主性G-α蛋白的表達導致產生新的殺蟲劑篩選測定法。當配體結合至GPCR細胞外部分時，GPCR介導跨細胞膜的信號轉導。GPCR的細胞內部分與G-蛋白相互作用以調整從細胞外至細胞內部的信號傳導。因此，GPCR被稱作“偶聯”至G-蛋白。G-蛋白由三個多肽亞基組成結合和水解GTP的α亞基，和二聚體的β Y 亞基。某些G-蛋白被認為是”泛宿主性”G-蛋白，因為它們的G亞基允許它們偶聯至正常情況下與其它家族G-蛋白偶聯的GPCR。在市場上還沒有已經鑒定具有選自優選來自黑腹果蠅的Oa2、0amb、0Ct-i3 -2R和 Oct-β-3R的酚乙醇胺受體調節作為其主要作用方式的殺蟲劑，這意味著化合物不僅僅通過殺蟲活性的“副作用”起作用，而且其活性是關鍵的致死作用。在另一實施方案中，本發明提供作為殺蟲劑的新靶標的小電導鈣激活鉀通道。本發明還提供用于鑒定降低昆蟲小電導Ca2+激活鉀通道活性的殺蟲活性化合物的方法和測定法。鈣激活鉀通道是由細胞內鈣增加所活化的功能多種多樣的一組離子通道。在哺乳動物中，它們主要存在于神經細胞中，在其中它們促進動作電位的形成并調節神經元興奮性。更加具體而言，它們的電流是動作電位后超極化的基礎；它們還表現出參與神經元放電頻率精度(對于綜述見=Stocker 等，Nature Reviews Neuroscience 5，2004)。該類型鉀通道基于單通道導電性存在于三大通用類型中。大、中和小電導通道分別被稱作BK、IK和SK。在果蠅中，基因分別被稱作slo、slack和SK。每一類型的鉀離子通道表現出不同的藥理學特性。鉀離子通道與大量生理過程相關，包括心跳的調節、動脈的擴張、胰島素的釋放、神經細胞的興奮和腎電解質運輸的調節。因此，鉀離子通道早已知作為治療大量疾病中的治療靶標，如WO 2005099711和US 20050239800中所公開。特別地，SK通道已經顯示具有不同的藥理學特性。如在WO 2005100349中所公開，使用膜片鉗技術發現不同化合物具有臨床相關的心理活性。所評價的化合物結構上與三環抗抑郁劑相關并且包括阿米替林、卡馬西平、氯丙嗪、賽庚啶、丙咪嗪、他克林和三氟拉嗪。發現所測試的每一化合物以微摩爾親和性封閉SK2通道電流。存在影響SK通道的大量神經肌肉抑制劑，如蜂毒明肽、阿曲庫銨、泮庫溴銨和筒箭毒堿(Siah等，Br J Pharmacol 129 :627-30(2000)) 。還描述了使用SK通道作為藥物活性化合物靶標用于治療疾病的測定法重組大鼠腦SK2通道在HEK293哺乳動物細胞中表達以通過膜片鉗技術研究中心作用性肌肉松弛劑化合物如氯唑沙宗的作用(Cao等，J. Pharmaco 1. Exp. Ther. 296  683-689，2001)。還使用轉化的HEK293細胞通過膜片鉗技術研究了金屬離子對重組人SK4 通道活化的影響(Cao 等，FEBS，446  137-141，1999)。鑒定增加或降低經鈣激活鉀SK通道的鉀離子流的化合物的方法描述于WO 98/11139 中。時至今日，典型的昆蟲中的分子靶標是乙酰膽堿酯酶、電壓依賴性鈉通道、離子型受體例如煙堿型乙酸膽堿和GABA受體。Gautier等(J. Pharm. Exp. Therapeutics, jpet. 107. 128694,2007)已經得到了鈣激活鉀通道作為間接靶標參與殺蟲劑神經毒性的證據。他們通過使用反義寡核苷酸處理蟑螂(美洲蟑螂(Periplaneta americana))DUM(背側不成對中線)神經元敲低DUM神經元BK通道，指出DMDS ( 二甲基二硫)抑制鈣激活鉀電流。抑制Ca2+激活鉀通道活性的另外的特異毒素已經從幾種生物中鑒定，最熟知的是如在US 5，607，843中所述的來自蜂毒的蜂毒明肽。然而，目前在市場上還沒有已經鑒定具有Ca2+激活鉀通道，優選SK通道調節作為其主要作用方式的殺蟲劑，這意味著化合物不僅僅通過殺蟲活性的“副作用”起作用，而且其活性是關鍵的致死作用。通常，極大地需要檢測可能組成殺蟲劑新靶標的多肽。原因是上述抗性問題和不懈的努力以鑒定新的殺蟲活性成分，其通過盡可能寬的作用譜、生態和毒理學可接受性和/ 或低應用率相區別。現在本發明提供昆蟲電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Smker樣)和/ 或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)作為殺蟲劑靶標和用于鑒定降低昆蟲電壓門控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白)活性的殺蟲活性化合物的方法和測定法。本發明還分別提供Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優選Η-Ι νβ亞基A 或C亞型作為殺蟲劑靶標和用于鑒定分別降低Siaker通道和/或Hyperkinetic β亞基， 優選H-kv β亞基A或C亞型活性的殺蟲活性化合物的方法和測定法。本發明還提供選自優選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, Oct- β _2R和Oct- β _3R的酚乙醇胺受體作為殺蟲劑靶標和用于鑒定降低選自優選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, Oct- β _2R和 Oct-β -3R的酚乙醇胺受體活性的殺蟲活性化合物的方法和測定法。本發明此外提供昆蟲小電導Ca2+激活鉀通道作為殺蟲劑靶標和用于鑒定降低昆蟲小電導Ca2+激活鉀通道活性的殺蟲活性化合物的方法和測定法。實際上，新靶標的檢測具有極大困難，因為多肽活性的抑制經常對昆蟲的存活無進一步的影響。這可歸因于昆蟲可以轉變至替代的活性這一事實，由此編碼蛋白質的基因的數量比微生物中的高至少3倍。此外，以SK-通道為例，關于在人醫學中的研究結果，例如WO 2005100349，其教導甚至對經鉀離子通道的鉀離子流的抑制在治療疾病中是有用的，令人驚奇的是本發明的SK 通道是殺蟲劑的靶標，因為它們影響其存活。本發明的目標是鑒定對于昆蟲發育或存活必需的新靶標，和提供適宜鑒定殺蟲活性化合物的方法。我們發現，該目標通過使用具有昆蟲電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或 Shaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽實現。本發明的一個實施方案涉及用于鑒定降低具有昆蟲電壓門控性鉀通道 Shal (Shaker同族物1或Smker樣)和/或其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽的殺蟲活性化合物的方法，該方法包括a)在膜中裝配最初不存在于所述膜中的、具有昆蟲電壓門控性鉀通道 Shal (Shaker同族物1或Smker樣)和/或其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽，
            
b)在一側膜上應用懷疑具有抑制最初不存在于所述膜中的所述多肽活性的能力的化合物，c)檢測所述多肽的活性，和d)鑒定在(b)中應用的降低所述多肽活性的化合物。在另一實施方案中，我們發現，該目標通過分別使用具有昆蟲Siaker通道和/或 Hyperkinetic β亞基，優選_kvi3亞基A或C亞型活性的多肽實現。本發明的一個實施方案涉及用于鑒定分別降低具有昆蟲Siaker通道和/或 Hyperkinetic β亞基，優選_kv β亞基A或C亞型活性的多肽活性的殺蟲活性化合物的方法，所述方法包括a)在膜中裝配最初不存在于所述膜中的、分別具有昆蟲Siaker通道和/或 Hyperkinetic β亞基，優選_kvi3亞基A或C亞型活性的多肽，b)在一側膜上應用懷疑具有抑制最初不存在于所述膜中的所述多肽活性的能力的化合物，c)檢測所述多肽的活性，和d)鑒定在(b)中應用的降低所述多肽活性的化合物。在另一實施方案中，我們發現，該目標通過使用具有選自優選來自黑腹果蠅oa2、 Oamb, Oct-β -2R和Oct-β -3R的昆蟲酚乙醇胺受體活性的多肽實現。本發明的一個實施方案涉及用于鑒定降低具有選自優選來自黑腹果蠅oa2、Oamb、 Oct-β -2R和Oct-β -3R的昆蟲酚乙醇胺受體活性的多肽活性的殺蟲活性化合物的方法， 所述方法包括a)在膜中裝配最初不存在于所述膜中的、具有選自優選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, Oct-β -2R和Oct-β -3R的昆蟲酚乙醇胺受體活性的多肽，b)在一側膜上應用懷疑具有抑制最初不存在于所述膜中的所述多肽活性的能力的化合物，c)檢測所述多肽的活性，和d)鑒定在(b)中應用的降低所述多肽活性的化合物。在另一實施方案中，我們發現，該目標通過使用具有昆蟲小電導Ca2+激活鉀通道活性的的多肽實現。本發明的一個實施方案涉及鑒定降低昆蟲小電導Ca2+激活鉀通道活性的殺蟲活性化合物的方法，所述方法包括a)在膜中裝配最初不存在于所述膜中的、具有昆蟲小電導Ca2+激活鉀通道活性的多肽，b)在一側膜上應用懷疑具有抑制最初不存在于所述膜中的所述多肽活性的能力的化合物，c)檢測所述多肽的活性，和d)鑒定在(b)中應用的降低所述多肽活性的化合物。根據本發明，膜是類似于半滲透板或層的結構，其充當兩相或溶液之間的屏障， 因此膜是溶劑滲透性的，優選水滲透性的。在一個實施方案中，膜是生物的膜、生物膜或者脂質層或者脂質雙層。膜優選由流體脂質雙層組成。在一個實施方案中，膜是細胞的
            
10外表面、細胞腔室、泡、脂質體(由為兩性分子的磷脂組成的泡)、聚合物囊泡或者合成體 (synthosome)0聚合物囊泡常常稱作“聚合物體”，其已經被詳細研究并且進展已經在綜述中總結 [Discher等，Science 2002,297 ；967 973]。聚合物體或聚合物囊泡由自組裝的二或三嵌段共聚物組成。合成體是功能化的納米腔室系統，其已經被開發出用于推定的生物技術應用 [Nardin等，Chem. Commun. 2000,1433 1434]。合成體是中空球體，其由具有嵌段共聚物膜的機械穩定囊泡和充當選擇性門的工程改造跨膜蛋白組成。本發明的優選昆蟲的電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Siaker樣)和/ 或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)被裝配入或嵌入、植入或整合入膜中，這些術語是同義詞并且可互換。本發明的優選昆蟲的Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優選亞基 A或C亞型被分別裝配入或嵌入、植入或整合入膜中，這些術語是同義詞并且可互換。本發明的優選昆蟲的選自優選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, Oct-β _2R和Oct-β _3R 的酚乙醇胺受體被裝配入或嵌入、植入或整合入膜中，這些術語是同義詞并且可互換。昆蟲小電導Ca2+激活鉀通道被裝配入或插入、植入或整合入膜中，這些術語是同義詞并且可互換。為了本發明的目的，通常復數旨在包括單數，反之亦然。除非另外指出，術語“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文上下文中可互換。 除非另外指出，術語“肽”、“多肽”和“蛋白質”在本文上下文中可互換。術語“序列”將涉及多核苷酸、核酸、核酸分子、肽、多肽和蛋白質，這取決于術語“序列”所使用的環境。如本文所使用的術語“一個或多個基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“一個或多個核酸分子”指任何長度的聚合形式的核苷酸，或者是核糖核苷酸或者是脫氧核糖核苷酸。 這些術語僅指分子的一級結構。因此，如本文所使用的術語“一個或多個基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“一個或多個核酸分子”包括雙鏈和單鏈DNA和RNA。它們還包括已知類型的修飾， 例如具有類似物的一個或一個以上天然存在核苷酸的甲基化作用、“加帽”、取代。優選地， DNA或RNA序列包含編碼本文所定義多肽的編碼序列。“編碼序列”是這樣的核苷酸序列，當其置于適當的調節序列控制之下時被轉錄成 RNA，例如調節RNA如miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、RNAi、核糖核酸酶等或者被轉錄成被翻譯成多肽的mRNA。編碼序列的邊界通過位于5’ -末端的翻譯起始密碼子和位于3’ -末端的翻譯終止密碼子決定。編碼序列可以包括，但不限于mRNA、cDNA、重組核苷酸序列或基因組DNA，而在某些情況下也將出現內含子。如在本文上下文中所使用，核酸分子還可以包括位于編碼基因區3’和5’端的非翻譯序列，例如編碼區5’端上游序列的至少500、優選200、特別優選100個核苷酸和編碼基因區3’端下游序列的至少100、優選50、特別優選20個核苷酸。在例如反義核酸、RNAi、 snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta_siRNA、共抑制分子、核糖核酸酶等技術的情況下，可有利地使用編碼區以及5’ -和/或3’ -區。然而，僅選擇編碼區用于克隆和表達目的常常是有利的。
            
“多肽”指氨基酸的聚合物(氨基酸序列)并且不指特定長度的分子。因此，肽和寡肽被包括在多肽的定義之內。該術語還指或者包括多肽的翻譯后修飾，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等等。定義所包含的是例如包含一個或更多個氨基酸類似物(包括例如非天然氨基酸等)的多肽、具有取代連接的多肽，以及本領域已知的天然存在或者非天然存在的其他修飾。術語“包含”、其語法變體當在本說明書中使用時用于指其所述特征、整數、步驟或構成成分或基團的存在，但不排除其一種或更多種其他特征、整數、步驟、構成成分或基團的存在或加入。術語“減少”、“阻抑”、“降低”或“抑制”涉及生物、生物部分如組織或細胞內特性
            
的相應改變。“特性的改變”應當理解為活性以相對于對照、參照或野生型相應容量或數量蛋白質的指定容量或指定數量蛋白質的改變。術語“減少”、“阻抑”、“降低”或“抑制”包括所述特性在僅本發明受試者的部分中的改變，例如修飾可以存在于細胞腔室如細胞器中或者生物的部分如組織、翼、腿、軀干等中。優選地，“減少”、“阻抑”、“降低”或“抑制”被發現于細胞內的，因此術語“活性的減少、 降低或抑制”涉及與野生型細胞或者對照細胞相比細胞內的減少、降低或抑制。因此，術語“減少”、“阻抑”、“降低”或“抑制”意思是指，基因產物蛋白質或者調節性RNA比活性以及化合物或如多肽、核酸分子代謝物、離子或編碼mRNA或DNA的量可以在比容量內被減少、降低或抑制。術語“減少”、“阻抑”、“降低”或“抑制”包括，對于所述“減少”、“阻抑”、“降低”或“抑制”的理由可以是向生物或其部分施用的化學化合物。術語“減少”、“阻抑”或“降低”是可互換的。如果不另外指出的話，術語“減少”將包括術語“阻抑”，“降低”或“抑制”。減少還理解為意思是指活性的修飾。在該上下文中，功能或活性，如“功能性活性” 或“生物學活性”與對照、參照或野生型相比減少至少10%、有利的20%、優選30%、特別優選40 %、50 %或60 %、非常特別優選70 %、80 %、85 %或90 %或更多，非常特別優選的是 95%，更優選地是99%或更高。最優選地，活性的減少、降低或缺失總計基本上100%。因此，特別有利的實施方案是失活，例如化合物如多肽或核酸分子功能的抑制。術語“野生型”、“對照”或“參照”可互換并且可以是沒有根據本文所述方法修飾或處理的生物的細胞或部分，例如細胞器或組織，或者生物，特別是昆蟲。因此，用作野生型、 對照或參照的生物的細胞或部分，例如細胞器或組織，或者生物，特別是昆蟲盡可能對應于其細胞、生物或部分并且除了本發明方法的結果，在任何其他性質中盡可能與本發明的主題相同。因此，野生型、對照或參照被同樣地處理或者盡可能相同的處理，也就是說，僅條件或特性將不同，這不影響所測試特性的性質。優選地，任何比較在相似條件下開展。術語“相似條件”意思是指所有條件例如培養或生長條件、測定條件(例如緩沖液組成、溫度、底物、病原體品種、濃度等等)在待比較的實驗之間保持相同。“參照”、“對照”或“野生型”優選沒有用本發明所述方法修飾或處理的并且具有與本發明受試者盡可能相似的任何其他特性的受試者，例如細胞器、細胞、組織、生物、特別是昆蟲。參照、對照或野生型在其基因組、轉錄物組、蛋白質組或代謝物組上盡可能與本發明受試者相似。優選地，術語“參照”、“對照”或“野生型”細胞器、細胞、組織或生物涉及遺傳上與本發明的細胞器、細胞、組織或者生物或其部分幾乎相同，優選95%、更優選98%、甚至更優選 99. 00%、特別是 99. 10%,99. 30%,99. 50%,99. 70%,99. 90%,99. 99%,99. 999% 或更高相同的細胞器、細胞、組織或者生物。最優選地，“參照”、“對照”或“野生型”是除了負責核酸分子活性賦予核酸分子或它們所編碼的基因產物根據本發明的方法被修正、操作、 交換或引入之外，與根據本發明方法使用的生物、細胞或細胞器遺傳上相同的受試者，例如細胞器、細胞、組織、生物。優選地，參照、對照或野生型與本發明的受試者僅在本發明多肽或者本發明方法中所使用多肽的活性上不同。“顯著降低”關于根據本發明的核酸序列所編碼多肽的活性，其應理解為意思是指，與對照相比，例如與沒有與測試化合物溫育的多肽活性相比，以測試化合物處理的多肽以測量誤差之外的量度降低。關于離子通道的“功能活性”應當理解為離子通道表現出或者參與的任何一個或更多個功能和/或特性。關于酚乙醇胺受體的“功能活性”應當理解為酚乙醇胺受體表現出或者參與的任何一個或更多個功能和/或特性。在一個實施方案中，術語具有昆蟲電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或 Shaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽的“功能性活性” 或“生物學活性”通過鉀離子的跨膜運輸定義。在另一實施方案中，術語分別具有昆蟲Siaker通道和/或Hyperkinetic β亞基， 優選H-kv β亞基A或C亞型活性的多肽的“功能性活性”或“生物學活性”通過鉀離子跨膜的運輸定義。在另一實施方案中，術語具有選自優選來自黑腹果蠅的oa2、Oamb, Oct_i3-2R和 Oct- β -3R的酚乙醇胺受體活性的多肽的“功能性活性”或“生物學活性”通過這樣的事實定義，即酚乙醇胺受體被α-腎上腺素能拮抗劑選擇性封閉和被α-腎上腺素能激動劑活化。在另一實施方案中，術語具有昆蟲小電導Ca2+激活鉀通道活性的多肽的“功能性活性”或“生物學活性”通過鉀離子跨膜的運輸定義。該運輸被鈣離子以選自200-1000nM、 300-900nM、300-800nM和400_800nM間隔的半最大活化或Ca2+敏感性K0. 5活化。本發明的SK通道具有選自2-20pS、3-20pS、4-15pS、5-12pS和5-lOpS間隔的單通道電導。本發明多肽的生物學活性是蜂毒明肽不敏感性的。術語化合物的“活性”指生物系統中，例如細胞、器官或者生物內化合物的功能。例如，術語化合物的“活性”指化合物的酶功能、調節功能或其作為結合配偶體、轉運體、調節物或者載體等的功能。化合物的殺蟲活性指所述化合物殺死或者麻痹昆蟲的能力，或者以昆蟲提供較少損害的方式抑制昆蟲發育或者生長的能力。具有殺蟲活性的化合物也被稱為對昆蟲具有毒性。化合物的殺蟲活性不只引起昆蟲的死亡，還包括對昆蟲的其它有害作用，例如疾病、抗飼育劑活性、生長遲緩、降低的繁殖能力和降低的生殖力。如本文所使用的具有殺蟲活性的化合物是“殺蟲劑”。術語“殺蟲劑”通常指不利影響昆蟲生存力的化學藥品、生物學試劑和其他化合物，其例如殺死、麻痹農作物保護、人和動物健康區的昆蟲物種、使其不育消滅或者致殘。在一個實施方案中，本發明方法使用包含由選自下列的核酸分子編碼的至少一種多肽的膜實現a)編碼SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示多肽的核酸分子;b)SEQ ID而1、5、9、13、17、21、25和/或四中所示核酸分子;c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡并性可以衍生自根據SEQ ID NO :2、6、10、14、 18、22、26和/或30的多肽序列；d)與包含SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25和/或四所示核酸分子的多核苷酸的
            
核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，編碼與核酸分子(a)至(c)所編碼多肽的氨基酸序列具有至少50% 同一性并且分別具有昆蟲電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Smker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽；f)在嚴格雜交條件下與(a)至(C)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對 (a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且分別具有昆蟲電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽產生；h)核酸分子，其編碼包含SEQ ID NO 33和/或34中分別所述共有序列或SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 中分別所述一個或更多個基序的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQ ID NO :3、4 ;7、8 ;11、 12 ；15,16 ；19,20 ；23,24 ；27J8和/或31、32中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到；和j)通過在嚴格雜交條件下用探針篩選適當核酸文庫得到的核酸分子，探針包含 (a)或(b)核酸分子的互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼分別具有昆蟲電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Smker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優選20nt、 30nt、50nt、100nt、200nt 或 500nt。在一個實施方案中，本發明方法使用包含由選自上面a)、b)、c) ,d)、e)、f)、g)、h)、 i)或j)項所述核酸分子所編碼多肽的至少一種功能等同物或同源物的膜實現，例如Shal_ delN突變體，其具有2-40個氨基酸編碼區的N末端缺失。在一個實施方案中，本發明方法使用包含具有SEQ ID而2、6、10、14、18和/或 22所述電壓門控性鉀通道Sial或其同源物活性的多肽的至少一種功能等同物或同源物和 /或Shal_delN突變體的膜實現，Shal_delN突變體具有連接至具有SEQ ID NO 26和/或 30中所述其輔助蛋白KChIP或其同源物活性的多肽的2-40個氨基酸編碼區的N末端缺失。在另一實施方案中，本發明方法使用包含由選自下列的核酸分子編碼的至少一種多肽的膜實現a)編碼包含SEQ ID NO :73、75、77、79、81、83、85和/或87所示多肽的多肽的核
            
14酸分子；b)包含SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86中所示核酸分子的核酸分子；c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡并性可以衍生自包含根據SEQ ID NO :73、75、 77、79、81、83、85和/或87的多肽序列的多肽；d)與包含SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86所示核酸分子的多核苷
            
酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，編碼與(a)至(c)核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少50% 同一性并且分別具有昆蟲Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優選Η-Ι νβ亞基A或 C亞型活性的多肽；f)在嚴格雜交條件下與(a)至(C)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對 (a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且分別具有昆蟲Siaker通道和/或Hyperkinetic β 亞基，優選H-kv β亞基A或C亞型活性的多肽產生；h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO :102和/或103中分別所述共有序列或者SEQ ID NO :104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、 121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128中分別所述一個或更多個基序的
            
多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQ ID NO 88,89 ；90,91 ； 92,93 ；94,95 ；96,97 ；98,99和/或100、101中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到；禾口j)通過在嚴格雜交條件下用探針篩選適當核酸文庫得到的核酸分子，所述探針包含(a)或(b)核酸分子互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼分別具有昆蟲Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優選Η-Ι νβ亞基A或 C亞型活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優選20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。在一個實施方案中，本發明方法使用包含由選自上面a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、
            
h)、i)或j)項所述核酸分子所編碼多肽的至少一種功能等同物或同源物的膜實現，由此核酸分子包含Kozak序列(例如ACCATG)。在一個實施方案中，本發明方法使用包含由選自上面a)、b)、c) ,d)、e)、f)、g)、h)、
            
i)或j)項所述核酸分子所編碼多肽的至少一種功能等同物或同源物的膜實現，由此核酸分子包含編碼Shaker通道的400bp或500bp的5，-片段的序列，優選包含Shaker ATG密碼子，優選加上適當的Kozak，和/或Siaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優選Η-kv β 亞基A或C亞型的1770bp片段。在一個實施方案中，本發明方法使用選自SEQ ID NO :73、75、77、79、81和83的至少一種多肽或其功能等同物或同源物和選自SEQ ID NO :85和87的多肽或其功能等同物或同源物的任意組合的膜實現。在另一實施方案中，本發明方法使用包含由選自下列的核酸分子編碼的至少一種多肽的膜實現
            
a)編碼 SEQ ID NO  130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174
            
中所示多肽的核酸分子；b)SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173 中所
            
示核酸分子；c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡并性可以衍生自根據SEQ ID NO  130、134、138、 142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 的多肽序列；d)與包含 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或
            
173所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，編碼與(a)至(c)核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少50% 同一性并且分別具有選自優選來自黑腹果蠅的oa2、Oamb, Oct- β -2R和Oct- β _3R的昆蟲酚乙醇胺受體活性的多肽；f)在嚴格雜交條件下與(a)至(C)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對 (a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且具有選自優選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, 0ct-^-2R 和Oct-β -3R的昆蟲酚乙醇胺受體活性的多肽產生；h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO  177、178和/或179中分別所述共有序列或者 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189和/或190、和/或191、192、193、 194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、 210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或 226 中分
            
別所述一個或更多個基序的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQ ID NO  131、132 ； 135、 136 ；139,140 ；143,144 ；147,148 ；151,152 ； 155、156、159、160 ；163,164 ；167,168 ；171,172 和/或175、176中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到；禾口j)通過在嚴格雜交條件下用探針篩選適當核酸文庫得到的核酸分子，所述探針包含(a)或(b)核酸分子互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼具有選自優選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, Oct- β _2R和Oct- β _3R的昆蟲酚乙醇胺受體活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優選20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。在一個實施方案中，本發明方法使用包含由選自上面a)、b)、c) ,d)、e)、f)、g)、h)、 i)或j)項所述核酸分子所編碼多肽的至少一種功能等同物或同源物和另外的標記蛋白質如GFP的膜實現，由此其優選地與本發明的多肽，例如由選自a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、 i)或j)項的核酸分子編碼的多肽連接。在一個實施方案中，本發明方法使用包含由SEQ ID NO :173中所述核酸分子或其同源物編碼的，SEQ ID NO :46中所示多肽的至少一種功能等同物或同源物的膜實現。在一個實施方案中，本發明方法使用包含由選自上面a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、 h)、i)或j)項所述核酸分子所編碼多肽的至少一種功能等同物或同源物和另外的”泛宿主性”G-蛋白的膜實現，其G亞基使得G-蛋白與正常情況下與其它家族G-蛋白偶聯的GPCR 偶聯，由此”泛宿主性”G-蛋白優選地與本發明的多肽，例如由選自a)、b)、c)、d)、e)、f)、 g)、h)、i)或j)項的核酸分子編碼的多肽連接。
            
在一個實施方案中，本發明方法使用包含由選自上面a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、
            
h)、i)或j)項所述核酸分子所編碼多肽的至少一種功能等同物或同源物和另外的標記蛋白質如GFPjP /或另外的“泛宿主性”G-蛋白的膜實現，由此標記蛋白質和/或“泛宿主性”G-蛋白優選地與本發明的多肽，例如由選自a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)或j)項的核酸分子編碼的多肽連接。在一個實施方案中，本發明方法使用包含由SEQ ID NO :173中所述核酸分子或其同源物編碼的，SEQ ID NO :46中所示多肽至少一種功能等同物或同源物和另外的“泛宿主性”G-蛋白的膜實現，由此蛋白質優選地與其連接。在一個實施方案中，“泛宿主性”G-蛋白是泛宿主性G- α -16-蛋白質或其同源物。在另一實施方案中，本發明方法使用包含由選自下列的核酸分子編碼的至少一種多肽的膜實現a)編碼SEQ ID NO :228,230,232中所示多肽的核酸分子；b)SEQ ID NO  227、229、231 中所示核酸分子；c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡并性可以衍生自根據SEQ ID NO :228,230,232 的多肽序列；d)與包含SEQ ID NO :227、2四、231所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，編碼與(a)至(c)核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少50% 同一性并且具有小電導Ca2+激活鉀通道活性的多肽；f)在嚴格雜交條件下與(a)至(C)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對 (a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且具有小電導Ca2+激活鉀通道活性的多肽產生；h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO :239中所述共有序列或選自SEQ ID NO 240, 241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個或更多個基序的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQ ID NO :233、234、235、 236 ；和237、238中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到；和j)通過在嚴格雜交條件下用探針篩選適當核酸文庫得到的核酸分子，所述探針包含(a)或(b)核酸分子互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼具有小電導Ca2+激活鉀通道活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優選20nt、 30nt、50nt、100nt、200nt 或 500nt。在一個實施方案中，本發明方法使用包含由選自上面a)、b)、c) ,d)、e)、f)、g)、h)、
            
i)或j)項所述核酸分子所編碼多肽的至少一種功能等同物或同源物的膜實現。術語如上所述多肽的“功能等同物”是基本上賦予如SEQ ID NO :2、6、10、14、18、 22,26和/或30中所述多肽活性的多肽，至于shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為 SEQ ID NO :73、75、77、79、81、83、85和/或87，至于G蛋白偶聯受體為 SEQ ID NO :130,134, 138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 并且至于 SK-通道為 SEQ ID NO :228、 230、232。
            
術語如上所述核酸分子的“功能等同物”是基本上賦予如SEQ ID N0:l、5、 9、13、17、21、25和/或四中所述核酸分子活性的多核苷酸，至于shaker通道和/或 Hyperkinetic β 亞基為 SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84 和 / 或 86，至于 G 蛋白偶聯受體為 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173 并且至于 SK-通道為 SEQ ID NO :227、229、231。根據本發明，蛋白質或多肽具有如SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26和/或30中所述多肽的活性，至于shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為SEQ ID NO :73、75、77、79、 81、83、85 和 / 或 87，至于 G 蛋白偶聯受體為 SEQ ID NO  130、134、138、142、146、150、154、 158、162、166、170和/或174并且至于SK-通道為SEQ ID NO :228、230、232，如果其活性的減少、阻抑、降低或抑制介導經膜的鉀流降低的話。根據本發明，核酸分子或多核苷酸具有如SEQ ID而1、5、9、13、17、21、25和/或四中所述核酸分子的活性，至于shaker通道和/或Hyperkinetic^亞基為SEQ ID NO :72、 74、76、78、80、82、84 和 / 或 86，至于 G 蛋白偶聯受體為 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、 149、153、157、161、165、169 和 / 或 173 并且至于 SK-通道為 SEQ ID NO :227、229、231 如果其表達的減少、阻抑、降低或抑制介導經膜的鉀流降低的話。本發明多肽的同源物(=同源物)，特別是由如SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25 和/或四中所示核酸分子編碼或者包含其的多肽，或者包含含有SEQ ID NO 33和/或34 中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50、51、52、53、54 和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、 70和/或71的一個或更多個基序的多肽的多肽的同源物，可以衍生自任何生物，只要同源物賦予本文所述活性即可，即其是所述分子的功能等同物。至于shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，本發明多肽的同源物(=同源物)， 特別是由如SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86中所示核酸分子編碼或者包含其的多肽，或者包含含有SEQ ID NO :102和/或103中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO  104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、 122、123、124和/或125和/或126、127和/或128的一個或更多個基序的多肽的多肽的同源物，可以衍生自任何生物，只要同源物賦予本文所述活性即可，即其是所述分子的功能等同物。至于G蛋白偶聯受體，本發明多肽的同源物(=同源物)，特別是由如SEQ ID NO 129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173 中所示核酸分子編碼或者包含其的多肽，或者包含含有SEQ ID而177、178和/或179中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、192、 193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或 226 的一個或更多個基序的多肽的多肽的同源物，可以衍生自任何生物，只要同源物賦予本文所述活性即可，即其是所述分子的功能等同物。至于SK-通道，本發明多肽的同源物(=同源物)，特別是由如SEQ ID NO :227、 229、231中所示核酸分子編碼或者包含其的多肽，或者包含含有SEQ ID NO :239中所示共有序列或選自 SEQ ID NO :240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和
            
18253的一個或更多個基序的多肽的多肽的同源物，可以衍生自任何生物，只要同源物賦予本文所述活性即可，即其是所述分子的功能等同物。此外，根據本發明，術語“同源物”涉及生物的、與所述生物的所有表達序列的本文所述或所列序列具有優選最高或者基本最高序列同源性的序列。本領域技術人員已知如何發現、鑒定和證實假定的同源物具有本文所述的相同活性。如果知道的話，生物中的生物學功能或活性基本上涉及或對應于如對于SEQ ID NO 1、5、9、13、17、21、25和/或四中所述基因所述的活性或功能，至于shaker通道和/或 Hyperkinetic β 亞基為 SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84 和 / 或 86，至于 G 蛋白偶聯受體為 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173，并且至于 SK-通道為 SEQ ID NO :227、229、231。因此，在一個實施方案中，同源物或功能等同物包含由含有SEQ ID N0:l、5、9、13、 17、21、25和/或四中所指出序列的核酸分子編碼的多肽的序列或者在SEQ ID NO :2、6、10、 14、18、22、26和/或30中所述的多肽序列、如分別在SEQ ID NO 33和/或34中所示的共有序列或分別選自 SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、 52、53、54 和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一個或更多個基序，或者其是包含SEQ ID Ν0:2、6、10、14、18、22、26和/或30中所指出多核苷酸的核酸分子的表達產物。至于shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，因此，在一個實施方案中，同源物或功能等同物包含由含有SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86所指出序列的核酸分子編碼的多肽序列或者在SEQ ID而73、75、77、79、81、83、85和/或87中所述的多肽序列、如分別在SEQ ID NO :102和/或103中所示的共有序列或分別選自SEQ ID N0:104、 105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、 124和/或125和/或1沈、127和/或1 的一個或更多個基序，或者其是包含SEQ ID NO  73、75、77、79、81、83、85和/或87中所指出多核苷酸的核酸分子的表達產物。至于G蛋白偶聯受體，因此，在一個實施方案中，同源物或功能等同物包含由含有 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173 所指出序列的核酸分子編碼的多肽序列或者在 SEQ ID NO  130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、 170和/或174中所述的多肽序列、如分別在SEQ ID NO  177、178和/或179中所示的共有序列或分別選自 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、 和 / 或 191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、 225和/或2 的一個或更多個基序，或者其是包含SEQ ID NO :130、134、138、142、146、150、 154、158、162、166、170和/或174中所指出多核苷酸的核酸分子的表達產物。至于SK-通道，因此，在一個實施方案中，同源物或功能等同物包含由含有SEQ ID NO :227,229,231所指出序列的核酸分子編碼的多肽序列或者在SEQ ID NO :228,230,232 中所述的多肽序列、如在SEQ ID NO :239中所示的共有序列或選自SEQ ID NO :240、241、 242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個或更多個基序，或者其是包含SEQ ID N0:2^、230、232中所指出多核苷酸的核酸分子的表達產物。本文所公開的關于序列、活性、共有序列、多肽基序和測試的信息將本領域技術人員引向生物中的各個同源或功能等效表達產物。在一個實施方案中，任何一個本發明多肽的同源物衍生自昆蟲并且具有至少50 % 的序列同一性并且優選與昆蟲電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Smker樣)和 /或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)分別具有基本相同或者相似的活性。在另一實施方案中，任何一個本發明多肽的同源物衍生自昆蟲并且具有至少50% 的序列同一性并且優選與Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優選Η-Ι νβ亞基A或 C亞型分別具有基本相同或者相似的活性。在另一實施方案中，任何一個本發明多肽的同源物衍生自昆蟲并且具有至少50% 的序列同一性并且優選與選自優選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, Oct- β _2R和Oct- β _3R的酚乙醇胺受體具有基本相同或者相似的活性。在進一步的實施方案中，任何一個本發明多肽的同源物衍生自昆蟲并且具有至少50%的序列同一性并且優選與昆蟲小電導Ca2+激活鉀通道具有基本相同或者相似的活性。在一個實施方案中，任何一個本發明多肽的同源物衍生自昆蟲，優選來自選自有翅亞綱、新翅目、半翅目、鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、同翅目、擬步行蟲總科、擬步行蟲科、擬步行蟲屬、Sternorrhyncha、Aphidina、Brachycera、果蟲黽禾斗、Drosophilinae 禾口果蟲黽屬的昆蟲并且具有至少50%的序列同一性并且優選與i)昆蟲電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白)，或ii) Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優選Η_1 νβ亞基A或C亞型，或iii)選自優選來自黑腹果蠅oa2、Oamb、Oct- β 和Oct- β _3R的酚乙醇胺受體， 或iv)昆蟲小電導Ca2+激活鉀通道分別具有基本相同或者相似的活性。在一個實施方案中，任何一個本發明多肽的同源物衍生自i)黑腹果蠅、亞熱帶粘蟲、擬谷盜屬、褐稻飛虱，或者ii)黑腹果蠅、亞熱帶粘蟲、擬谷盜屬、桃蚜、棉蚜和/或苜蓿蚜，或者iii)黑腹果蠅、亞熱帶粘蟲(Spodoptera eridania)、赤擬谷盜(Tribolium castaneum)、桃蟲牙(Myzus persicae)禾口銀葉粉風(Bemisia argentifolii),或者iv)昆蟲，優選來自選自有翅亞綱、新翅目、半翅目、鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、同翅目、擬步行蟲總科、擬步行蟲科、擬步行蟲屬、Sternorrhyncha、Aphidina、Brachycera、果蠅科、Drosophilinae and果蠅屬的昆蟲并且具有至少50%的序列同一性并且優選與昆蟲小電導Ca2+激活鉀通道具有基本相同或者相似的活性。本發明多肽的功能等同物或者同源物分別具有i)昆蟲電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白)，或ii)昆蟲Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優選Η_1 νβ亞基A或C亞型， 或iii)選自優選來自黑腹果蠅oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的昆蟲酚乙醇胺受體，或 iv)昆蟲小電導Ca2+激活鉀通道的活性和與選自SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26和/或30的序列所示多肽具有至少 55%、56%、57%、58%、59%、60%、61 %、62% 或 63%、優選至少 64 %、65 %、66 %、67 %、 68%或 69%、更優選至少 70%、71%、72%、73%、74%，75%、76%、77%、78%、79%、80%、 81%、82%、83%、84%或 85%、最優選 86%、87%、88%、89%或 90%、特別優選至少 91 %、 92%、93%，94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，至于shaker通道和/ 或 Hyperkinetic β 亞基為 SEQ ID NO :73、75、77、79、81、83、85 和 / 或 87，至于 G 蛋白偶聯受體為 SEQ ID NO :130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174，并且至于 SK-通道為 SEQ ID NO :228、230、232。“功能等同物”在本文上下文中描述在標準條件下與編碼具有下列生物學活性的多肽的核酸序列雜交的核酸序列i)昆蟲電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白)，或ii)昆蟲Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優選Η_1 νβ亞基A或C亞型， 或iii)選自優選來自黑腹果蠅oa2、Oamb、Oct- β 和Oct- β -3R的酚乙醇胺受體， 或iv)昆蟲小電導Ca2+激活鉀通道或上述核酸序列的部分，其能夠在細胞或生物內引起具有下列生物學活性的多肽的表達i)昆蟲電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白)，或ii)昆蟲Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優選Η_1 νβ亞基A或C亞型， 或iii)選自優選來自黑腹果蠅oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的昆蟲酚乙醇胺受體，或iv)昆蟲小電導Ca2+激活鉀通道。為了開展雜交，有利的是使用如保守區或其它區域長度約10_50bp、優選15_40bp 的短寡核苷酸，其可以以技術人員熟悉的方式通過與其它相關基因的比較確定。然而，本發明核酸的長度100-500bp的較長片段或完整序列也可用于雜交。取決于所使用的核酸/寡核苷酸、片段或完整序列的長度或取決于什么類型核酸用于雜交，即DNA或RNA，這些標準條件可變化。因此，例如，對于DNA  DNA雜合體的解鏈溫度比相同長度DNA  RNA雜合體的解鏈溫度低大約10°C。標準雜交條件應理解為意思是指，取決于核酸，例如42和58°C之間的溫度，在水性緩沖溶液中具有0. 1至切之間的SSC濃度(1XSSC = 0. 15M NaCl, 15mM檸檬酸鈉，pH 7.2)或者另外在50%甲酰胺存在下，例如42°C，5xSSC，50%甲酰胺。對于DNA  DNA雜合體的雜交條件有利的是0. IxSSC和約20°C和65°C之間的溫度，優選約30°C和45°C之間的
            
21溫度。以DNA  RNA雜合體為例，雜交條件有利的是0. IxSSC和約30 V和65°C之間的溫度， 優選約45°C和55°C之間的溫度。已經描述的這些雜交溫度是解鏈溫度值，其已經通過實例如在甲酰胺缺乏下長度約100個核苷酸和50%的G+C含量的核酸計算出。對于DNA雜交的實驗條件描述于遺傳學的專業教科書中，例如在Sambrook等，‘‘Molecular Cloning"， Cold Spring Harbor Laboratory，1989中，并且可以使用技術人員熟悉的公式，例如作為核酸長度、雜合體類型或G+C含量的函數計算。技術人員將在下列教科書中找到關于雜交的進一步的信息Ausubel 等(eds)，1985，Current 方案 s in Molecular Biology, John Wiley&Sons, New York ；Hames and Higgins(eds),1985, Nucleic Acids Hyb ridization  APractical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford ；Brown(ed), 1991, Essential Molecular Biology :A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford。此外，功能等同物還理解為意思是指，尤其是由根據本發明的核酸序列所編碼蛋白質的各個核酸序列的天然或人工突變和來自其他生物的它們的同源物。因此，本發明還包括，例如，通過修飾SEQ ID NO  1、5、9、13、17、21、25和/或29的核酸序列得到的那些核苷酸序列，至于shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84 和 / 或 86，至于 G 蛋白偶聯受體為 SEQ ID NO :129、133、137、 141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173，并且至于 SK-通道為 SEQ ID NO :227、229、 231。例如，此類修飾可以通過技術人員熟悉的技術，例如“定點誘變”、“易錯PCR”、“DNA改組” (Nature 370，1994，pp. 389-391)或者“交錯延伸方法” (Nature Biotechnol. 16，1998， pp. 258-261)產生。此種修飾的目的可以是，例如插入用于限制酶的更多的酶切位點、去除 DNA以便將序列截短、替代核苷酸以優化密碼子或加入更多的序列。由所修飾核酸序列編碼的蛋白質必須保留預期的功能，盡管是有偏差的核酸序列，其是下列的生物學活性i)昆蟲電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白)，或ii)昆蟲Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優選Η_1 νβ亞基A或C亞型， 或iii)選自優選來自黑腹果蠅oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的昆蟲酚乙醇胺受體，或iv)昆蟲小電導Ca2+激活鉀通道。因此功能等同物包括本文所述序列的天然存在變體和人工核酸序列，例如已經通過化學合成得到的那些和適應密碼子選擇以及從它們衍生的氨基酸序列的那些。對應于包含SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26 和 / 或 30，至于 shaker 通道和 / 或 Hyperkinetic β 亞基為 SEQ ID NO :73、75、77、79、81、83、85 和 / 或 87，至于 G 蛋白偶聯受體為 SEQ ID NO :130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174，并且至于 SK-通道為SEQ ID Ν0:2^、230、232中所示多核苷酸的核酸分子的天然變體同源物的核酸分子，例如本發明的核酸分子和還可以是cDNA的核酸分子，可以基于它們與本文所公開核酸分子的同源性，使用SEQ ID而1、5、9、13、17、21、25和/或四，至于81^1 ^通道和/或 Hyperkinetic β 亞基為 SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84 和 / 或 86，至于 G 蛋白偶聯受體為 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173，并且至于
            
22SK-通道為SEQ ID N0:227、2^K231中所示核酸分子，如本發明的核酸分子或其片段作為雜交探針，根據嚴格雜交條件下的標準雜交技術分離。有利地用于本發明方法的核酸分子可以基于它們與本文所公開核酸分子的同源性，使用序列或其部分作為雜交探針并在嚴格雜交條件下按照標準雜交技術分離。術語“同源性”意思是指，各個核酸分子或所編碼的蛋白質是功能和/或結構等效的。與上述核酸分子同源和為所述核酸分子衍生物的核酸分子是，例如，核酸分子的變體， 所述變體呈現出具有相同的生物學功能，特別是編碼具有相同或者基本相同生物學功能的蛋白質的修飾。它們可以是天然存在的變體，例如來自其他植物品種或物種或突變的序列。 這些突變可天然發生或者可通過誘變技術得到。等位基因變體可以是天然存在的等位基因變體以及合成產生的或遺傳工程產生的變體。結構等同物可以通過例如測試所述多肽與抗體的結合或者基于計算機的預測鑒定。結構等同物具有相似的免疫學特性，例如包含相似的表位。“雜交”意思是指，核酸分子在常規雜交條件，優選在嚴格雜交條件下，例如 Sambrook(Molecular Cloning ；A Laboratory Manual, 第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1989)) 5 Current Protocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons, N. Y. (1989) ,6. 3. 1-6. 3. 6 中所述的條件下雜交。根據本發明，本發明核酸的DNA以及RNA分子可以用作探針。此外，作為用于鑒定功能同源物的模板，可以開展Northern印跡分析以及Southern印跡分析。Northern印跡分析有利地提供關于所表達基因產物的更多的信息例如表達模式、加工步驟的出現，像剪接和加帽等。Southern印跡分析提供關于編碼本發明核酸分子的基因的染色體定位和組織的附加信息。嚴格Southern印跡雜交條件的優選、非限定實例是，在6x氯化鈉/檸檬酸鈉 (=SSC)中于大約45 °C下雜交，接著是在0. 2xSSC,0. 1% SDS中于50至65°C，例如在 50°C、55°C或60°C下開展一次或更多次的洗滌步驟。技術人員已知，這些雜交條件因核酸類型的不同而不同，并且例如當存在有機溶劑時，關于溫度和緩沖液的濃度的雜交條件因核酸類型的不同而不同。“標準雜交條件”下的溫度因核酸類型的不同而不同，例如在具有0. Ix,0. 5x、lx、2x、3x、4x或5xSSC(pH 7. 2)濃度的水性緩沖液中在42°C和58°C之間， 優選在45°C和50°C之間。如果在上述緩沖液中存在一種或多種有機溶劑，例如50%甲酰胺，標準條件下的溫度約40°C、42°C或45°C。對于DNA  DNA雜合體的雜交條件優選的為例如 0. IxSSC 和 20°〇、251、301、351、401或451，優選在 30°C禾口 45°C之間。對于DNA  RNA雜合體的雜交條件優選的為例如0. 1乂55(和301、；351、401、451、501或 55°C，優選在45°C和55°C之間。對于例如在甲酰胺缺乏下長度約100bp(=堿基對)和 50%的G+C含量的核酸確定了上述雜交溫度。技術人員知道借助于教科書確定所需要的雜交條件，例如上面提到的教科書或者下列教科書=Sambrook等，‘‘Molecular Cloning"， Cold Spring Harbor Laboratory,1989 ;Hames 禾口 Higgins(Ed.) 1985, " Nucleic Acids Hybridization :A Practical Approach " , IRL Press at Oxford University Press, Oxford ；Brown (Ed. )1991, " Essential Molecular Biology :A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford。一個此類嚴格雜交條件的其他實例是在4XSSC中于65°C下雜交，接著在0. IXSSC中于65 °C下洗滌一小時。備選地，示例性的嚴格雜交條件是在50 %甲酰胺，4XSSC中于42 °C 下雜交。此外，洗滌步驟過程中的條件可以選自由低嚴格條件(約2X SSC中于50°C下)和高嚴格條件(約0. 2XSSC中于50°C下，優選于65°C下)(20XSSC :0. 3M檸檬酸鈉，3M NaCl, PH 7.0)所界定的條件范圍。此外，洗滌步驟過程中的溫度可以從室溫約22°C的低嚴格條件升高約65°C的較高嚴格條件。鹽濃度和溫度參數兩者可同時變化，或者兩個參數之一可以保持恒定而僅另一個變化。在雜交過程中還可以使用變性劑，例如甲酰胺或SDS。在50%甲酰胺存在下，雜交優選地在42°C下實現。相關因素如i)處理長度、ii)鹽濃度、iii)去污劑條件、iv)競爭DNA、 ν)溫度和vi)探針選擇可以依情況組合以致于并非所有的可能性均在此提到。對于DNA雜交(Southern印跡分析)和洗滌步驟的條件的一些實例示于下面(1)可以從下列條件中選擇雜交條件a)4XSSC，65°C，b)6XSSC，45°C，c) 6XSSC，100mg/ml 變性的片段化的魚精 DNA，68°C，d)6XSSC，0. 5% SDS, 100mg/ml 變性的鮭精 DNA，68°C，e)6XSSC,0. 5% SDS, 100mg/ml 變性的片段化鮭精 DNA，50% 甲酰胺，42°C，050%甲酰胺，4父55(，421，g)50% (vol/vol)甲酰胺，0. 牛血清白蛋白，0. 1 % Ficoll，0. 1 %聚乙烯吡咯烷酮，50mM磷酸鈉緩沖液pH 6. 5,750mM NaCl，75mM檸檬酸鈉，42°C，h) 2X 或 4XSSC，50°C (低嚴格條件)，或i)30至40%甲酰胺，2X或4XSSC，42°C (低嚴格條件)。(2)洗滌步驟可以從例如下列條件中選擇a) 0. 015M NaCl/0. 0015M 檸檬酸鈉 /0. 1 % SDS, 50°C。b)0. 1XSSC，65°C。c)0. 1XSSC，0. 5% SDS，68°C。d)0. 1XSSC,0. 5% SDS，50% 甲酰胺，42°C。e) 0. 2XSSC, 0. 1 % SDS, 42°C。f) 2XSSC,65°C (低嚴格條件)·g)0, 2XSSC,0, 1% SDS,60°C (中高嚴格條件)，或h)0, 1XSSC,0, 1% SDS,60°C (中高嚴格條件)，或i)0, 2XSSC,0, 1% SDS,65°C (高嚴格條件)，或h) 0，1XSSC, 0，1 % SDS, 65°C (高嚴格條件)。在一個實施方案中，術語“嚴格條件下的雜交”旨在描述對于這樣的雜交和洗滌的條件，在該條件下彼此至少30^^40^^50%或65%同一性的核苷酸序列通常仍然彼此雜交。優選地，條件是這樣的，以致于彼此至少約70 %、更優選至少約75 %或80 %并且甚至更優選至少約85%、90%或95%或更高同一性的序列通常仍然保持彼此雜交。在一個實施方案中，本發明的核酸分子在嚴格條件下與SEQ ID NO :1、5、9、13、17、 21、25和/或29中所示序列，在shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基情況下SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84 和 / 或 86，在 G 蛋白偶聯受體情況下 SEQ ID NO  129、133、137、
            
24141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173，并且在 SK-通道情況下 SEQ ID NO :227、 229,231中所示序列雜交，并且對應于天然存在的核酸分子。如本文所使用，“天然存在”核酸分子指具有自然出現的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如編碼天然蛋白質)。除了在種群中存在的核酸或蛋白質序列的天然存在變體之外，技術人員將進一步地認識到，可通過向編碼多肽的核酸分子的核苷酸序列中引入突變而引入改變，由此導致所編碼多肽氨基酸序列中的改變并且由此改變多肽的功能能力，這意味著優選減少、降低或缺失所述活性。例如，導致“必需”氨基酸殘基位置上氨基酸替代的核苷酸替代可以在本發明方法中待減少的核酸分子序列中進行，所述序列例如包含如SEQ ID N0:l、5、9、13、17、 21、25和/或四中所示對應核酸分子，在shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基情況下 SEQ ID N0:72、74、76、78、80、82、84和/或86，在G蛋白偶聯受體情況下SEQ ID Ν0:129、 133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173，并且在 SK-通道情況下 SEQ ID Ν0:227、2^、231。“必需”氨基酸殘基是這樣的殘基，即如果來自一個多肽野生型序列的殘基改變導致所述多肽活性改變，而“非必需”氨基酸殘基對于蛋白質活性，例如對于作為酶或通道的活性而言是不需要的。“必需”殘基的改變常常導致多肽活性減少、降低或缺失。優選地，多肽氨基酸以如此方式改變以致于活性被減少、降低或缺失，這意味著優選地必需氨基酸殘基和/或更多非必需殘基被改變并且由此在降低多肽的表達或活性之后活性減少。 然而，其它氨基酸殘基(例如在具有所述活性的結構域中不保守的或僅半保守的那些)對于活性而言不是必需的，并且因此可以被改變而不改變所述活性，這是較不優選的。優選地，由核酸分子編碼的蛋白質與SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26和/或30 中所示序列或者與包含SEQ ID NO :33和/或34中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一個或更多個基序的序列至少約60%、70%或80%相同，更優選與SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26和/或30所示序列之一或者與包含SEQ ID NO :33和/或34中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一個或更多個基序的序列至少約85%同一，甚至更優選與SEQ ID而2、6、10、14、18、22、沈和/或30中所示序列或者與包含SEQ ID NO 33和/或34中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO :35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70和/或71的一個或更多個基序的序列至少約90%, 91%、92%、93%、94%、95% 同源，并且最優選與 SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、洸和/或30 中所示序列或者與包含SEQ ID NO :33和/或34中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一個或更多個基序的序列至少約 96%、97%、98%或 99% 同一。在shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基的情況下，優選地，由核酸分子編碼的蛋白質與SEQ ID NO :73、75、77、79、81、83、85和/或87中所示序列或者與包含SEQ ID NO: 102和/或103中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO :104、105、106、107、108、109、 110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124 和 / 或 125 和 / 或126,127和/或128的一個或更多個基序的序列至少約60%、70%或80%同一，更優選與 SEQ ID NO :73、75、77、79、81、83、85 和 / 或 87 中所示序列或者與包含 SEQ ID NO :102 禾口 / 或103中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO :104、105、106、107、108、109、110、111、 112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124 和 / 或 125 和 / 或 126、127 和 /或1 的一個或更多個基序的序列至少約85%同一，甚至更優選與SEQ ID NO :73,75,77, 79、81、83、85和/或87中所示序列或者與包含SEQ ID NO :102和/或103中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、 117、118、119、120、121、122、123、124 和 / 或 125 和 / 或 126、127 和 / 或 128 的一個或更多個基序的序列至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%同源，并且最優選與SEQ ID NO :73、 75、77、79、81、83、85和/或87中所示序列或者與包含SEQ ID NO  102和/或103中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、 115、116、117、118、119、120、121、122、123、124 和 / 或 125 和 / 或 126、127 和 / 或 128 的一個或更多個基序的序列至少約96%、97%、98%或99%同一。在G蛋白偶聯受體的情況下，優選地，由核酸分子編碼的蛋白質與SEQ ID NO 130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 中所示序列或者與包含 SEQ ID NO :177、178和/或179中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO  180、181、182、183、 184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、192、193、194、195、196、197、198、199、 200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、 216、217、218、219、220、221、222、223、224、225和/或226的一個或更多個基序的序列至少約 60%、70%或 80% 同一，更優選與 SEQ ID NO :130、134、138、142、146、150、154、158、162、 166、170和/或174中所示序列或者與包含SEQ ID NO  177、178和/或179中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、 和 / 或 191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、 225和/或226的一個或更多個基序的序列至少約85%同一，甚至更優選與SEQ ID NO 130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 中所示序列或者與包含 SEQ ID NO :177、178和/或179中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO  180、181、182、183、 184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、192、193、194、195、196、197、198、199、 200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、 216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或 226 的一個或更多個基序的序列至少約 90%、91%、92%、93%、94%、95% 同源，并且最優選與 SEQ ID NO  130、134、138、142、 146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 中所示序列或者與包含 SEQ ID NO :177,178 和 /或179中分別所示共有序列或者分別選自SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、 187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、 203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、 219、220、221、222、223、224、225和/或226的一個或更多個基序的序列至少約96%、97%、 98%或 99% 同一。在SK-通道的情況下，優選地，由核酸分子編碼的蛋白質與SEQ ID NO =228,230, 232中所示序列或者與包含SEQ ID NO :239所示共有序列或者選自SEQ ID NO :240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個或更多個基序的序列至少約60%、70%或80%同一，更優選與SEQ ID NO :2觀、230、232中所示序列或者與包含SEQ ID NO :239 所示共有序列或者選自 SEQ ID NO :240、241、242、243、244、245、246、247、248、 249、250、251、252和253的一個或更多個基序的序列至少約85%同一，甚至更優選與SEQ ID NO :2觀、230、232中所示序列或者與包含SEQ ID NO :239所示共有序列或者選自SEQ ID NO :240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個或更多個基序的序列至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%同源，并且最優選與SEQ ID NO :228、 230、232所示序列或者與包含SEQ ID NO :239所示共有序列或者選自SEQ ID NO :240、241、 242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個或更多個基序的序列至少約 96%、97%、98%或 99% 同一。為了確定兩個氨基酸序列或者兩個核酸分子的同源性(=同一性)百分數，將一個序列寫在另一個序列的下方以便優化比較。可以向蛋白質或核酸分子序列中插入空位以便產生與另一蛋白質或者另一核酸的最佳比對。然后在兩個聚合物之間比較對應氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或者核苷酸。如果在一個序列中的一個位置被與另一序列對應位置上的相同的氨基酸殘基或相同的核苷酸占據，則在該位置上分子是相同的。氨基酸或者核苷酸“同一性”，如在本文上下文中所使用，對應于氨基酸或者核酸“同源性”。通常，兩個序列之間的同源性百分數是序列共享的相同位置數量的函數(即％同源性=相同位置數量/總位置數量xlOO)。因此，術語“同源性”和“同一性”被認為對于本說明書是同義詞。為了確定兩個或更多個氨基酸序列或者兩個或更多個核苷酸序列之間的同源性 (=同一性)百分數，已經開發出數個計算機軟件程序。兩個或更多個序列的同源性可用軟件fasta計算，其目前已經有版本fasta 3在使用(W. R. Pearson和D. J. Lipman (1988)， Improved Tools for Biological Sequence Comparison.PNAS 85 2444-2448 ； W. R. Pearson(1990)Rapid and Sensitive Seq uence Comparison with FASTP and FASTA, Methods in Enzymology 183 :63-98 R. Pearson 禾口 D. J. Lipman(1988)Improved Tools for Biological Sequence Comparison. PNAS 85 :2444-2448 ；W. R. Pearson(1990) ；Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA Methods in Enzymology 183 :63-98)。用于計算不同序列同源性的另一有用的程序是標準的blast程序，其包含在 Biomax pedant軟件之中(Biomax，Munich，德意志聯邦共和國)。不幸的是，這有時產生亞最佳的結果，因為blast不是經常把目標和查詢序列的全部包括在內。雖然該序列極其有效，其可以用于比較極大數量的序列。對于此類序列比較有代表性地使用下列設置-p 程序名稱[字符串]；-d數據庫[字符串]；默認=nr;-i查詢文件[文件輸入]；默認= stdin ；-e期望值(E) [Real]；默認=10. O ；-m比對觀察選項0 =配對；1 =查詢錨定的顯示同一性；2 =查詢錨定的無同一性；3 =平面查詢錨定的，顯示同一性；4 =平面查詢錨定的，無同一性；5 =查詢錨定的無同一性和平端；6 =平面查詢錨定的，無同一性和平端；7 =XML Blast輸出；8 =列表；9帶有注解行的列表[整數]；默認=O ；-o BLAST報告輸出文件[文件輸出]可選；默認=stdout ；-F過濾查詢序列(DUST具有blastn，SEG具有其他)[字符串]；默認=T ；-G空位打開代價(零調用默認行為)[整數]；默認=O ；-E空位延長代價(零調用默認行為)[整數]；默認=O ；-X對于有空位比對的X減少(in bits)
            
27(零調用默認行為)；blastn 30，megablast 20，tblastx 0，所有其他15[整數]；默認=
            
0；-I Show GI' s in deflines[T/F]；默認=F ；-q核苷酸錯配罰分(僅blastn)[整數]； 默認=-3 ；_r核苷酸匹配獎勵(僅blastn)[整數]；默認=1 ；_v對于(V)顯示一行描述的數據庫序列數量[整數]；默認=500 ；-b顯示對于(B)比對的數據庫序列數量[整數]； 默認=250 ；_f對于延長命中的閾值，如果是零為默認；blastp 11，blastn 0，blastx 12， tblastn 13 ；tblastx 13，megablast 0 [整數]；默認=0 ；-g 執行有缺口的比對(對于 tblastx不可用)[T/F]；默認=T ；-Q使用的查詢遺傳密碼子[整數]；默認=1 ；-D DB遺傳密碼子(僅對于tbiastfcx])[整數]；默認=1 ；-a使用的處理器數量[整數]；默認=
            
1；-0 SeqAlign文件[文件輸出]可選；-J相信查詢def line [T/F]；默認=F;_M矩陣[字符串]；默認=BL0SUM62 ；-W字大小，如果是零為默認(blastn 11，megablast 28，所有其他3)[整數]；默認=0;-z數據庫的有效長度(對應真實大小使用零)[真]；默認=0;-K 來自待保留區域的最佳命中數(默認為關，如果使用則數值100是推薦的)[整數]；默認 =0 ；-P對于多次命中為0，對于一次命中為1 [整數]；默認=0 ；-Y搜索空間的有效長度 (對于真實大小使用零)[真]；默認=0;_s針對數據庫搜索的查詢鏈(對于blast[nx]， 和tblastx) ；3是兩者，1是上面的，2是下面的[整數]；默認=3 ；-T產生HTML輸出[T/ F]；默認=F ;-1對數據庫搜索限制于GI' s列表[字符串]可選；-U使用小寫過濾FASTA 序列[T/F]可選；默認=F ；-y在命中中對于非空位延伸的X減少值(0.0調用默認行為)； blastn20, megablast 10，所有其他7 [真]；默認=0. 0 ；-Z在命中中對于最終缺口比對的 X減少值(0.0調用默認行為)；blastn/megablast 50, tblastx 0，所有其他25 [整數]；默認=0 ；-R PSI-TBLASTN檢查點文件[文件輸入]可選；_n MegaBlast搜索[T/F]；默認= F ；-L查詢序列上的位置[字符串]可選；-A多重命中窗口大小，如果是零為默認(blastn/ megablast 0，所有其他40 [整數]；默認=0;_w移碼罰分(對blastx為OOF算法)[整數]；默認=0 ；-t用于連接HSR的tblastn中允許的最大內含子長度(0不能連接)[整數]；默認=0。通過使用Needleman和Wunsch或者Smith和Waterman算法達到高質量的結果。因此基于所述算法的程序是優選的。有利的，序列比較可以用程序PileUp(J.Mol. Evolution.，25，351-360，1987，Higgins 等，CABI0S，51989  151-153)或優選用程序 Gap 和 BestFit 進行，它們分別基于 Needleman 和 Wunsch [J. Mol. Biol. 48 ；443-453 (1970)]以及 Smith 和 Waterman [Adv. App 1. Math. 2 ；482-489 (1981)]的算法。兩個程序是 GCG 軟件包的一部分[Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991) ；Altschul 等(1997)Nucleic Acids Res. 25 :3389 以及下列等等]。因此，優選地使用Gap程序在序列的整個范圍上開展計算以確定序列同源性百分數。對于核酸序列比較使用下列標準調整空位加權:50，長度加權:3，平均匹配10. 000，平均錯配0. 000。例如在核酸水平與SEQ ID N0.  1所示序列具有80%同源性的序列理解為意思是指，當通過上述Gap程序算法應用上述參數設置與SEQ ID NO  1的序列比較時序列具有 80%同源性。兩個多肽之間的同源性理解為意思是指，通過借助于程序算法Gap (Wisconsin Package Version 10. 0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA)，設置以下參數空位加權8 ；長度加權2 ；平均匹配2. 912 ；平均錯配-2. 003經比較計算的，每一情況下整個序列長度上的氨基酸序列的同一性。例如在蛋白質水平與SEQ ID NO :2的序列具有80%同源性的序列理解為意思是指，當通過上述Gap程序算法應用上述參數設置與SEQ ID NO 2的序列比較時序列具有 80%同源性。根據本發明通過取代、插入或者缺失，從SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26和/或 30所示多肽之一或者包含SEQ ID NO 33和/或34中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一個或更多個基序的序列之一衍生的功能等同物，與SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26和/或30所示多肽之一或者包含SEQ ID NO :33和/或34中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO :35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70和/或71的一個或更多個基序的多肽之一具有至少 30%、35%、40%、45%或50%，優選至少55%、60%、65%或70%，優選至少80%，特別優選至少85%或90%、91%、92%、93%或94%，非常特別優選至少95%、97%、98%或99%同源性，并且通過與SEQ ID而2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示多肽具有基本相同的特性相區別。根據本發明通過取代、插入或者缺失，從SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25和/或29 所示核酸序列衍生的功能等同物與SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25和/或四中所示的根據本發明的核酸具有至少30%、；35%、40%、45%或50%，優選至少55%、60%、65%或70%優選至少80 %，特別優選至少85 %或90 %、91 %、92 %、93 %或94 %，非常特別優選至少95 %、 97%、98%或99%同源性，并且編碼與SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示多肽具有基本相同特性的多肽。以shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為例，根據本發明通過取代、插入或者缺失,從SEQ ID N0:73、75、77、79、81、83、85和/或87所示多肽之一或者包含SEQ ID NO: 102和/或103中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO  104、105、106、107、108、109、 110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124 和 / 或 125 和 / 或 1沈、127和/或1 的一個或更多個基序的多肽之一衍生的功能等同物，與SEQ ID NO :73、 75、77、79、81、83、85和/或87中所示多肽之一或者包含SEQ ID NO  102和/或103中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、 115、116、117、118、119、120、121、122、123、124 和 / 或 125 和 / 或 126、127 和 / 或 128 的一個或更多個基序的多肽之一具有至少30 %、35 %、40 %、45 %或50 %，優選至少55 %、60 %、 65 %或70 %，優選至少80 %，特別優選至少85 %或90 %、91 %、92 %、93 %或94 %，非常特別優選至少 95%、97%、98% 或 99% 同源性，并且通過與 SEQ ID NO :73、75、77、79、81、83、85 和/或87所示多肽具有基本相同的特性相區別。以shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為例，根據本發明通過取代、插入或者缺失，從SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86中所示核酸序列衍生的功能等同物， 與根據本發明的SEQ ID而72、74、76、78、80、82、84和/或86中所示核酸之一具有至少 30%、35%、40%、45%或50%，優選至少55%、60%、65%或70%，優選至少80%，特別優選至少85%或90%、91%、92%、93%或94%，非常特別優選至少95%、97%、98%或99%同源性，并且編碼與SEQ ID NO :73、75、77、79、81、83、85和/或87中所示多肽具有基本相同特性的多肽。以G蛋白偶聯受體為例，根據本發明通過取代、插入或者缺失，從SEQ ID NO 130, 134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 中所示多肽之一或者包含 SEQ ID NO  177、178和/或179中分別所示共有序列或者分別選自SEQ ID NO  180、181、182、183、 184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、192、193、194、195、196、197、198、199、 200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、 216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或 226 的一個或更多個基序的多肽之一衍生的功能等同物，與 SEQ ID NO  130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 /或174中所示多肽之一或者包含SEQ ID而177、178和/或179中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207和/或208、 和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 /或226的一個或更多個基序的多肽之一具有至少30%、35%、40%、45%或50%，優選至少55%、60%、65%或70%，優選至少80%，特別優選至少85%或90%、91 %、92%、93%或 94%，非常特別優選至少95%、97%、98%或99%同源性，并且通過與SEQ ID NO :130,134, 138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174所示多肽具有基本相同的特性相區別。以G蛋白偶聯受體為例，根據本發明通過取代、插入或者缺失，從SEQ ID NO 129, 133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173中所示核酸序列衍生的功能等同物，與根據本發明的 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173中所示核酸之一具有至少30%、；35%、40%、45%或50%，優選至少55%、60%、65%或 70 %，優選至少80 %，特別優選至少85 %或90 %、91 %、92 %、93 %或94 %，非常特別優選至少 95%、97%、98% 或 99% 同源性，并且編碼與 SEQ ID NO :130、134、138、142、146、150、 154、158、162、166、170和/或174中所示多肽具有基本相同特性的多肽。以SK-通道為例，根據本發明通過取代、插入或者缺失，從SEQ ID NO =228,230, 232所示多肽之一或者包含SEQ ID NO :239中所示共有序列或選自SEQ ID NO :240、241、 242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個或更多個基序的多Jft之一衍生的功能等同物，與SEQ ID NO :2觀、230、232中所示多肽之一或者包含SEQ ID NO :239 所示共有序列或選自 SEQ ID NO :240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,250,251, 252和253的一個或更多個基序的多肽之一具有至少30 %、35 %、40 %、45 %或50 %，優選至少55%、60%、65%或70%，優選至少80%，特別優選至少85%或90%、91 %、92%、93%或 94%，非常特別優選至少95%、97%、98%或99%同源性，并且通過與SEQ ID NO :228,230, 232所示多肽具有基本相同的特性相區別。以SK-通道為例，根據本發明通過取代、插入或者缺失，從SEQ ID NO =227,229, 231中所示核酸序列衍生的功能等同物，與根據本發明的SEQ ID N0:227、2^、231中所示核酸之一具有至少30 %、；35 %、40 %、45 %或50 %，優選至少55 %、60 %、65 %或70 %，優選至少80 %，特別優選至少85 %或90 %、91 %、92 %、93 %或94%，非常特別優選至少95 %、 97%、98%或99%同源性，并且編碼與SEQ ID NO :2觀、230、232中所示多肽具有基本相同特性的多肽。
            
30
            
在一個實施方案中，兩個核酸序列或多肽序列之間的“同源性”或“同一性”通過每一情況中核酸序列/多肽序列整個序列長度上的同一性定義，同一性通過借助于設置如下參數空位加權8 ；長度加權2 ；平均匹配2，912 ；平均錯配-2，003以程序算法 GAP(Wisconsin Package VersionlO.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG)，Madison, USA)進行的比對計算。在下文中，術語同一性也代替術語“同源的”或“同源性”同義地使用。“突變”包括取代、添加、缺失、倒位或插入一個或更多個核苷酸殘基，這也可通過取代、插入或者缺失一個或更多個氨基酸帶來靶標蛋白質對應氨基酸序列的改變。在一個實施方案中，本發明涉及選自下列的分離的核酸分子a)編碼SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示多肽的核酸分子;b)SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25 和 / 或四中所示核酸分子;c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡并性可以衍生自根據SEQ ID NO :2、6、10、14、 18、22、26和/或30的多肽序列；d)與包含SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25和/或四所示核酸分子的多核苷酸的
            
核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，編碼與(a)至(C)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且分別具有電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽；f)在嚴格雜交條件下與(a)至(C)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對 (a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且分別具有電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1 或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽產生；h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO 33和/或34中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一個或更多個基序的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQ ID NO :7、8 ；9,10 ；IU 12中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到；禾口j)通過在嚴格雜交條件下用探針篩選適當核酸文庫得到的核酸分子，所述探針包含(a)或(b)核酸分子互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼分別具有電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Smker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優選20nt、30nt、 50nt、100nt、200nt 或 500nt。以shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為例，在一個實施方案中，本發明涉及選自下列的分離的核酸分子a)編碼包含SEQ ID NO :73、75、77、79、81、83、85和/或87所示多肽的多肽的核
            
酸分子；b)包含SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86中所示核酸分子的核酸分子；c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡并性可以衍生自包含根據SEQ ID NO :73、75、 77、79、81、83、85和/或87的多肽序列的多肽；d)與包含SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86所示核酸分子的多核苷
            
酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，編碼與(a)至(C)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且分別具有Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優選Η-Ι νβ亞基A或 C亞型活性的多肽；f)在嚴格雜交條件下與(a)至(C)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對 (a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且分別具有Siaker通道和/或Hyperkinetic β亞基， 優選H-kv β亞基A或C亞型活性的多肽產生；h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO :102和/或103中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、 120、121、122、123、IM和/或125和/或126、127和/或128的一個或更多個基序的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQ ID NO :88,89 ；90,91 ； 92,93 ；94,95 ；96,97 ；98,99和/或100、101中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到和j)通過在嚴格雜交條件下用探針篩選適當核酸文庫得到的核酸分子，所述探針包含(a)或(b)核酸分子互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼分別具有Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優選Η-Ι νβ亞基A或C亞型活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優選20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。以G蛋白偶聯受體為例，在一個實施方案中，本發明涉及選自下列的分離的核酸分子a)編碼 SEQ ID NO  130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174
            
中所示多肽的核酸分子；b)SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173 中所
            
示核酸分子；c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡并性可以衍生自包含根據SEQ ID NO :130,134, 138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 的多肽序列的多肽；d)與包含 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，編碼與(a)至(C)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且具有選自優選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, Oct- β -2R和Oct- β _3R的酚乙醇胺受體活性的多肽；f)在嚴格雜交條件下與(a)至(C)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對 (a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且具有選自優選來自黑腹果蠅的0&2、0&1^、0(^-3-21 和Oct-β -3R的酚乙醇胺受體活性的多肽產生；h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO  177、178和/或179中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、 192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或
            
226的一個或更多個基序的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQ ID NO  131、132 ； 135、 136 ；139,140 ；143,144 ；147,148 ；151,152 ； 155、156、159、160 ；163,164 ；167,168 ；171,172 和/或175、176中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到和j)通過在嚴格雜交條件下用探針篩選適當核酸文庫得到的核酸分子，所述探針包含(a)或(b)核酸分子互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼具有選自優選來自黑腹果蠅的oa2、Oamb, Oct- β _2R和Oct- β _3R的酚乙醇胺受體活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優選20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。以SK-通道為例，在一個實施方案中，本發明涉及選自下列的分離的核酸分子a)編碼SEQ ID NO =230,232中所示多肽的核酸分子；b)SEQ ID NO =229,231 中所示核酸分子；c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡并性可以衍生自根據SEQ ID NO =230,232的多肽序列；d)與包含SEQ ID NO :2四、231所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，編碼與(a)至(C)核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少50% 同一性并且具有小電導Ca2+激活鉀通道活性的多肽；f)在嚴格雜交條件下與(a)至(C)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對 (a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且具有小電導Ca2+激活鉀通道活性的多肽產生；h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO :239中所述共有序列或選自SEQ ID NO 240, 241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個或更多個基序的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQ ID NO :233、234、235、 236 ；和237、238中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到和j)通過在嚴格雜交條件下用探針篩選適當核酸文庫得到的核酸分子，所述探針包含(a)或(b)核酸分子互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼具有小電導Ca2+激活鉀通道活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優選20nt、 30nt、50nt、100nt、200nt 或 500nt。在一個實施方案中，本發明涉及包含本發明分離的核酸分子的核酸構建體。在一個實施方案中，本發明涉及包含本發明核酸構建體或者分離的核酸分子的載體。
            
33
            
在一個實施方案中，本發明涉及通過轉染/轉化方式包含本發明的載體、核酸構建體或者分離的核酸分子的轉基因宿主細胞。“分離的”多核苷酸或者核酸分子與存在于該核酸分子天然來源的其它多核苷酸或者核酸分子分離。分離的核酸分子可以是數kb的染色體片段，或者優選地僅包含基因編碼區的分子。因此，分離的核酸分子可包含臨近5’和3’的染色體區或者進一步臨近染色體區，但是優選地不包含如此的序列，即其天然位于在核酸分子所來源生物基因組或染色體背景中核酸分子的側翼(例如臨近編碼核酸分子5’ -和3’ -UTR區的序列)。在多種實施方案中，在根據本發明的方法中使用的分離的核酸分子可以例如包含小于約5kb、4kb、3kb、 2kb、lkb、0. 5kb或0. Ikb的核苷酸序列，這些核苷酸序列天然位于核酸分子所來源細胞基因組DNA中核酸分子的側翼。在方法中使用的核酸分子或其部分可以使用分子生物學標準技術和本文提供的序列信息分離。同樣，例如在DNA或者氨基酸水平同源的序列或者同源、保守序列區可以借助于比較算法鑒定。前者可以用作標準雜交技術(例如Sambrook等，Molecular Cloning  A Laboratory Manual. 2ndEd. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，NY，1989中描述的那些)下的雜交探針用于分離在該方法中有用的更多的核酸序列。包含其活性待在本發明方法中降低的分子的整個序列或其部分的核酸分子，可額外地通過聚合酶鏈式反應、基于被使用的該序列或其部分的寡核苷酸引物分離。例如，包含完整序列或其部分的核酸分子可以通過聚合酶鏈式反應使用已經基于該每一序列產生的寡核苷酸引物分離。例如，mRNA可以通過例如Chirgwin等(1979)Biochemistry 18: 5294-5299的硫氰酸胍提取法從細胞分離，并且cDNA可通過逆轉錄酶(例如Moloney MLV 逆轉錄酶，可從Gibco/BRL，Bethesda, MD得到，或AMV逆轉錄酶，可從Seikagaku America, Inc.，St. Petersburg, FL 得到)產生。用于通過聚合酶鏈式反應擴增的合成的寡核苷酸引物可以基于本文所示序列產生。此類引物可以用于從cDNA文庫或者從基因組文庫擴增核酸序列和鑒定在本發明方法中有用的核酸分子。此外，通過與根據本發明方法待減少的核酸分子所編碼蛋白質，特別是SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25 和 / 或 29 中所示核酸分子，在 shaker 通道和 / 或 Hyperkinetic β 亞基情況下，SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86，在G蛋白偶聯受體情況下，SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和/ 或 173，并且在 SK-通道情況下，SEQ ID Ν0:227、229、231所編碼的序列開展蛋白質序列比對，可以鑒定來自不同生物的保守區，并且反過來從這些保守區可以衍生簡并引物。保守區是在來自不同來源的數個同源物的一個特定位置中的氨基酸極少變異的那些區。本文所示的共有序列和多肽基序衍生自所述比對。此外，通過與根據本發明方法待減少的核酸分子所編碼蛋白質，特別是由SEQ ID而2、6、10、14、18、22、26和/或30所示多肽分子編碼的序列，至于shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為SEQ ID NO :73、 75、77、79、81、83、85和/或87，至于6蛋白偶聯受體為 SEQ ID NO  130、134、138、142、146、 150、154、158、162、166、170 和 / 或 174，并且至于 SK-通道為 SEQ ID NO :228、230、232 開展蛋白質序列比對，可以鑒定來自多種生物的保守區，并且反過來從這些保守區可以衍生簡并引物。保守區是在來自不同來源的數個同源物的一個特定位置中的氨基酸極少變異的那些區。本文所示的共有序列和多肽基序衍生自所述比對。在一個有利的實施方案中，在本發明方法中，包含SEQ ID NO :33和/或34，至于shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為SEQ ID NO :102和/或103，至于G蛋白偶聯受體為SEQ ID NO  177、178和/或179， 并且至于SK-通道為SEQ ID NO :239所示共有序列或者選自SEQ ID NO :35、36、37、38、39、 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和 / 或55、和 / 或56、57、58、59、60、61、 62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71，至于 shaker 通道和 / 或 Hyperkinetic β 亞基為 SEQ ID NO :104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、 120、121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128，至于G蛋白偶聯受體為SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189和/或190、和/或191、192、193、194、 195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209,210, 211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或 226，并且至于 SK-通道為 SEQ ID NO :240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個或更多個基序的多肽或者由它們組成的多肽的活性被降低，并且在另一個實施方案中，本發明涉及包含SEQ ID NO :33和/或34，至于shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為SEQ ID NO :102和/或103，至于G蛋白偶聯受體為SEQ ID NO :177、178和/或179， 并且至于SK-通道為SEQ ID NO :239所示共有序列或者選自SEQ ID NO :35、36、37、38、39、 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、 62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71，至于 shaker 通道和 / 或 Hyperkinetic β 亞基為 SEQ ID NO:104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、 120、121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128，至于G蛋白偶聯受體為SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189和/或190、和/或191、192、193、194、 195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209,210, 211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或 226，并且至于 SK-通道為 SEQ ID NO :240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個或更多個基序的多肽或者由它們組成的多肽，由此所指定的20或更少、優選15或 10、優選9、8、7或6、更優選5或4、甚至更優選3、甚至更優選2、甚至更優選1、最優選0個氨基酸位置被任意氨基酸代替。在一個實施方案中，由字母指定的不大于15%、優選10%、 甚至更優選5%、4%、3%或2%、最優選1 %或0 %的氨基酸位置被另一氨基酸代替。在一個實施方案中，20或更少、優選15或10、優選9、8、7或6、更優選5或4、甚至更優選3、甚至更優選2、甚至更優選1、最優選0個氨基酸被插入至共有序列或蛋白質基序中。共有序列衍生自如SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26和/或30，至于shaker通道和 / 或Hyperkinetic^ 亞基為 SEQ ID NO 73、75、77、79、81、83、85 和 / 或 87，至于 G 蛋白偶聯受體為 SEQ ID NO 130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174，并且至于SK-通道為SEQ ID NO 228、230、232所示序列的多重比對。字母表示單字母氨基酸密碼子并且表明氨基酸在所有比對的蛋白質中是保守的。字母X代表在所有序列中不保守的氨基酸。保守結構域從所有序列鑒定并且使用亞類標準Prosite標記法描述，例如模式
            
35Y-x (21，23) - [FW]意思是指，保守酪氨酸被來自苯丙氨酸或色氨酸的最小21和最大23個氨基酸殘基分隔開。保守模式使用軟件工具MEME版本3. 5. 1或者手工鑒定。MEME由Timothy L. Bailey 禾口 Charles Elkan, Dept. of Computer Science and Engeneering, University of California, San Diego, USA 開發并且由 Timothy L. Bailey 禾口 Charles Elkan [Fitting a mixture model by expectation maximization to discover motifs in biopolymers, Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology,pp. 28-36,AAAI Press,Menlo Park,California, 1994]描述。獨立程序的源代碼可以從San Diego Supercomputer center (http//meme. sdsc. edu)公開獲得。為了用軟件工具MEME鑒定所有序列中的共同基序，使用下列設置-maxsize 500000, -nmotifs 15, -evt 0. 001，-maxw 60, _  巨畠 le-3, -minsites Μ   白勺 歹(J·。 對于MEME的輸入序列是Fasta格式的非對齊的序列。其它參數在該軟件版本中使用默認設置。對于保守結構域的Prosite模式使用軟件工具Pratt版本2. 1或手工產生。 Pratt 由 Inge Jonassen, Dept. of Informatics, University of Bergen, Norway 開發并 由 Jonassen 等.[I. Jonassen, J. F. Collins and D. G. Higgins, Finding flexible patterns in unaligned protein sequences, Protein Science 4(1995), pp.1587-1595 ； I. Jonassen, Efficient discovery of conserved patterns using a pattern graph, Submitted to CABIOS Febr. 1997]描述。對于獨立程序的源代碼(ANSI C)在例如建立的生物信息中心像 EBI (European Bioinformatics Institute)中公開得到。為了使用軟件工具Pratt產生模式，使用下列設置PL(max Pattern Length) 100,PN(max Nr of Pattern Symbols) : 100,PX(max Nr of consecutive x' s) 30,FN(max Nr of flexible spacers) :5, FL(max Flexibility) :30, FP(max Flex. Product)  10, ON (max number patterns) :50。對于Pratt的輸入序列是如從軟件工具MEME所鑒定的表現出高相似性的蛋白質序列的不同區。不得不匹配所產生模式的序列的最低數量(CM，min Nr of Seqs to Match)被設置成是所提供序列的至少80%。本文未提到的參數使用它們的默認設置。保守結構域的Prosite模式可以用于搜尋匹配該模式的蛋白質序列。多個建立的生物信息中心提供公開的英特網入口用于在數據庫搜索中使用那些模式(例如PIR[蛋白質信息資源，位于 Georgetown University Medical Center]或 ExPASy [Expert Protein Analysis System])。備選地，可利用獨立軟件，像程序Fuzzpro，它是EMBOSS軟件包的部分。例如，程序Fuzzpro不但允許搜索精確的模式-蛋白質匹配，而且還允許在開展的搜索中設置不同的模糊。比對使用軟件ClustalK版本1. 83)開展并描述于Thompson等· [Thompson, J. D. , Higgins, D.G.and Gibson, T. J. (1994)CLUSTALff improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22 :4673_4680]。對立程序的源代碼從 European Molecular Biology Laboratory ；Heidelberg, Germany 公開獲得。分析使用 Clustalff vl. 83 默認參數(空位開口罰分10.0 ；空位延長罰分0.2 ；蛋白質矩陣Gonnet ；pprotein/DNA endgap -1 ；蛋白質 /DNA gapdist 4)開展。然后，如上述設計的簡并引物可被PCR采用用于擴增編碼具有上述活性的蛋白質的新編碼區片段。然后，這些片段可用作雜交探針用于分離完整的基因序列。備選地，缺失的5’和 3’序列可以通過RACE-PCR手段分離。根據本發明的核酸分子可以使用cDNA，備選地使用基因組DNA作為模板和適宜寡核苷酸引物，按照標準PCR擴增技術擴增。因此，擴增的核酸分子可以被克隆入適宜的載體中并通過DNA序列分析的方式表征。對應于用于本發明方法的核酸分子之一的寡核苷酸可以通過標準合成方法，例如使用自動DNA合成儀產生。有利地用于根據本發明方法的核酸分子可以基于它們與本文所公開核酸分子的同源性，使用序列或其部分作為雜交探針并且按照嚴格雜交條件下的標準雜交技術分離。在一個實施方案中，本發明涉及由選自下列的核酸分子編碼的多肽a)編碼SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示多肽的核酸分子;b)SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25 和 / 或 29 中所示核酸分子;c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡并性可以衍生自根據SEQ ID NO :2、6、10、14、 18、22、26和/或30的多肽序列；d)與包含SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25和/或29所示核酸分子的多核苷酸的
            
核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，編碼與(a)至(C)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且分別具有電壓門控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽；f)在嚴格雜交條件下與(a)至(C)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對 (a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且分別具有電壓門控性鉀通道Shal (Shaker同族物1 或Shaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽產生；h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO 33和/或34中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一個或更多個基序的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQ ID NO :7、8 ；9,10 ；IU 12中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到和j)通過在嚴格雜交條件下用探針篩選適當核酸文庫得到的核酸分子，所述探針包含(a)或(b)核酸分子互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼分別具有電壓門控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優選20nt、30nt、 50nt、100nt、200nt 或 500nt。以shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為例，在一個實施方案中，本發明涉及由選自下列的核酸分子編碼的多肽
            
a)編碼SEQ ID NO :73、75、77、79、81、83、85和/或87中所示多肽的核酸分子；b) SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84 和 / 或 86 所示核酸分子；c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡并性可以衍生自根據SEQ IDN0:73、75、77、79、 81、83、85和/或87的多肽序列；d)與包含SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86所示核酸分子的多核苷
            
酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，編碼與(a)至(C)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且分別具有Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優選Η-Ι νβ亞基A或 C亞型活性的多肽；f)在嚴格雜交條件下與(a)至(C)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對 (a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且分別具有Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基， 優選H-kv β亞基A或C亞型活性的多肽產生；h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO 102和/或103中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、 120、121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128的一個或更多個基序的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQ ID NO :88、89 ；90,91 ； 92,93 ；94,95 ；96,97 ；98,99和/或100、101中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到禾口j)通過在嚴格雜交條件下用探針篩選適當核酸文庫得到的核酸分子，所述探針包含(a)或(b)核酸分子的互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼分別具有Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優選Η-Ι νβ亞基A或C 亞型活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優選20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。以G蛋白偶聯受體為例，在一個實施方案中，本發明涉及由選自下列的核酸分子編碼的多肽a)編碼 SEQ ID NO  130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174
            
中所示多肽的核酸分子；b)SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173 中所
            
示核酸分子；c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡并性可以衍生自根據SEQ ID NO  130、134、138、 142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 的多肽序列；d)與包含 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或
            
173所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，編碼與核酸分子(a)至(c)所編碼多肽的氨基酸序列具有至少50% 同一性并且具有選自優選來自黑腹果蠅的oa2、Oamb, Oct- β _2R和Oct- β _3R的酚乙醇胺受體活性的多肽；f)在嚴格雜交條件下與(a)至(C)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對
            
38(a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且具有選自優選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, 0ct-^-2R 和Oct-β -3R的酚乙醇胺受體活性的多肽產生；h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO  177、178和/或179中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、 192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或
            
226的一個或更多個基序的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQ ID NO  131、132 ； 135、 136 ；139,140 ；143,144 ；147,148 ；151,152 ； 155、156、159、160 ；163,164 ；167,168 ；171,172 和/或175、176中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到和j)通過在嚴格雜交條件下用探針篩選適當核酸文庫得到的核酸分子，所述探針包含(a)或(b)核酸分子互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼具有選自優選來自黑腹果蠅的oa2、Oamb, Oct- β _2R和Oct- β _3R的酚乙醇胺受體活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優選20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。以SK-通道為例，在一個實施方案中，本發明涉及由選自下列的核酸分子編碼的多肽a)編碼SEQ ID NO =230,232中所示多肽的核酸分子；b)SEQ ID NO :229、231 中所示核酸分子；c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡并性可以衍生自根據SEQ ID NO :230、232的多肽序列；d)與包含SEQ ID NO :229、231所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，編碼與(a)至(C)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且具有小電導Ca2+激活鉀通道活性的多肽；f)在嚴格雜交條件下與(a)至(C)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對 (a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且具有小電導Ca2+激活鉀通道活性的多肽產生；h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO :239中所述共有序列或選自SEQ ID NO 240、 241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個或更多個基序的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQ ID N0:233、234、235、 236 ；和237、238中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到禾口j)通過在嚴格雜交條件下用探針篩選適當核酸文庫得到的核酸分子，所述探針包含(a)或(b)核酸分子互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼具有小電導Ca2+激活鉀通道活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優選20nt、 30nt、50nt、100nt、200nt 或 500nt。在一個實施方案中，本發明涉及包含本發明多肽的膜，由此膜不具有本發明多肽的內源活性。在一個實施方案中，本發明涉及包含本發明多肽的宿主細胞，由此宿主的膜不顯示本發明多肽的內源活性。措辭“膜不具有本發明多肽的最初活性”意思是指，本發明的多肽不是天然存在膜的部分，但是其被裝配入根據本發明方法的膜中。在一個實施方案中，本發明方法包括編碼分別具有下列活性的多肽的基因的表達i)在宿主膜中的昆蟲電壓門控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣)和 /或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)，或ii)在宿主膜中的昆蟲Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優選Η-Ι νβ亞基A或C亞型，或iii)在宿主膜中的選自優選來自黑腹果蠅的0￡12、0_13、0(^-0-21 和0(^-0-31  的昆蟲酚乙醇胺受體，或iv)在宿主膜中的昆蟲小電導Ca2+激活鉀通道。在一個實施方案中，宿主細胞是哺乳動物細胞。在一個實施方案中，宿主細胞是在其天然狀態下具有低或者無興趣的電活性的細胞。與此相比，表達本發明多肽的宿主細胞顯示選自2-20pS、3-20pS、4-15pS、5-12pS和 5-10pS間隔的電導。在一個實施方案中，宿主細胞選自CHO細胞、HEK293、COS、HeLa, NIH3T3、BAK21、 Jurkat, CV-1、H印C-2-、爪蟾卵母細胞；Sf9, S2、Sf21、Hi5、Pcl2、U20S。為了產生包含具有下列活性的本發明多肽的本發明宿主細胞i)離子通道和/或其輔助蛋白，編碼多肽的核苷酸序列，或ii)離子通道和/或Hyperkinetic β亞基，優選Η-Ι νβ亞基A或C亞型，編碼多肽的核苷酸序列，或iii)酚乙醇胺受體和優選額外的標記蛋白質，如GFP，和/或額外的“泛宿主性” G-蛋白，編碼多肽的至少一個核苷酸序列，或iv)離子通道，編碼多肽的核苷酸序列被引入其被重組產生的宿主細胞中。在一個實施方案中，宿主細胞是微生物，其中編碼具有下列活性的多肽的核苷酸序列被根據描述于例如 T. Maniatis, E. F. Fritsch和 J. Sambrook, “ Molecular Cloning :A Laboratory Manual" , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,NY (1989) 的一般克隆技術引入以增殖所述核苷酸序列i)本發明的鉀離子通道和/或其輔助蛋白，或ii)本發明的鉀離子通道和/或Hyperkinetic β亞基，優選Η-Ι νβ亞基A或C亞型，或iii)本發明的酚乙醇胺受體和優選額外標記蛋白質，如GFP，和/或額外的“泛宿主性” G-蛋白，或iv)本發明的通道。上述核酸分子可以與更多的基因一起被克隆入根據本發明的核酸構建體或者載體中，或者不同的基因通過將數個核酸構建體或載體(包括質粒)轉化入宿主細胞中而引入。
            
因此，本發明還涉及包含功能性連接至一個或更多個調節元件或信號的用于本發明方法中的一個或多個核酸分子或其片段的核酸構建體，優選表達構建體。此外，本發明還涉及用于產生同源重組事件的包含用于本發明方法的核酸分子或其部分的核酸構建體。核酸構建體還可以包含待引入宿主細胞內的更多的基因。如本文所述，調節序列或因子可對優選引入的構建體的表達具有正作用，因此增加構建體的表達。因此，通過使用強轉錄信號例如啟動子和/或增強子可有利地在轉錄水平發生調節元件的增強。此外，然而，轉錄的增強也可通過例如增加RNA穩定性實現。因此，本發明的核酸構建體可以用作表達盒并且因此可以用于直接引入至宿主細胞中，或者它們可以被引入至載體中。因此，在一個實施方案中，核酸構建體是包含微生物啟動子或微生物終止子或者兩者的表達盒。在另一實施方案中，表達盒包含真核啟動子或者真核終止子或者兩者。如果預期以數個構建體或者載體轉化宿主細胞，則上述轉化的標記必須去除或者在后續轉化中采用另外的標記。可以通過本領域技術人員的方法如現有技術中所述將標記從宿主細胞中去除。在一個實施方案中，用于根據本發明方法的核酸序列可有利的有效連接至一個或更多個調節信號以便增加基因表達。這些調節序列旨在使核酸分子，例如用于本發明方法的基因或基因片段或基因產物或核酸的特異表達成為可能。取決于宿主生物，例如真核細胞或微生物，這將意味著例如基因或基因構建體僅在誘導后表達和/或過表達，或其組成型表達和/或過表達。這些調節序列為例如誘導子或阻抑物結合并因此調節核酸表達的序列。此外，基因構建體還可有利的包含一個或更多個與啟動子有效連接的稱作增強子序列的序列，并且它們使核酸序列增強表達。同樣，可以在DNA序列3’端插入另外有利的序列，例如其他的調節元件或終止子。術語“增加的表達”或“過表達”，如本文所使用，意思是指原始野生型表達水平之外的任何形式的表達。用于增加基因或基因產物表達的方法在本領域中廣泛記錄并且包括例如由適當啟動子驅動的過表達、轉錄增強子或翻譯增強子的使用。充當啟動子或增強子元件的分離的核酸可以引入至非異源形式多核苷酸的適當位置中(通常是上游)，以致于上調編碼目的多肽的核酸的表達。以shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為例，在本發明的一個實施方案中使用Kozak序列。編碼根據本發明蛋白質的核酸分子和編碼另外的多肽的核酸分子可以存在于一個核酸構建體或載體中或者存在于數個核酸構建體或載體中。在一個實施方案中，僅用于本發明方法的核酸分子或其編碼基因的一個拷貝存在于核酸構建體或載體中。數個載體或核酸構建體或載體可以在宿主生物中一起表達。根據本發明的核酸分子或核酸構建體可以插入在載體中并以自由形式存在于細胞中。如果優選穩定轉化，則使用超過數個世代穩定復制或者它們或它們的部分被插入至基因組中的載體。以哺乳動物細胞為例，可以發生向細胞核基因組中的整合。為了向宿主基因組中插入一個以上的構建體，待表達的構建體將一起存在于一個載體中，例如在攜帶多個構建體的上述載體中。
            
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通常，用于構建體表達率的調節序列位于與待調節核酸分子序列相對而言的上游 (5’)、當中和/或下游(3’)。它們特別是控制轉錄和/或翻譯和/或轉錄穩定性。表達水平依賴于更多細胞調節系統，例如細胞的蛋白質生物合成和降解系統的結合。調節序列包括轉錄和翻譯調節序列或信號，例如尤其與轉錄或翻譯起始調節有關的位于上游(5’ )的序列，如啟動子或起始密碼子，和尤其與轉錄或翻譯終止和轉錄物穩定性有關的位于下游(3’ )的序列，如多腺苷化信號或終止密碼子。特別有利的啟動子是組成型啟動子、組織或區室特異啟動子和可誘導啟動子。通常，“啟動子”在本文上下文中被理解為意思是指核酸分子中的介導核酸分子的編碼序列片段表達的調節序列。原則上，可以使用天然啟動子和它們的調節序列。用于哺乳動物細胞的一些啟動子是例如CMV、SV40、ΤΚ、β -肌動蛋白。核酸構建體有利地如此構建，以致于啟動子之后是用于插入待表達核酸的適宜切割位點，有利地在多接頭中，如果合適，之后是位于多接頭后面的終止子。如果合適，該次序被重復數次以致于數個基因被組合在一個構建體中，并且因此可以被引入至轉基因植物中以便被表達。序列被重復如直至三次。為了表達，核酸序列通過適宜的切割位點插入在例如啟動子后面的多接頭中。對于每一核酸序列，有利的是具有其自身的啟動子，并且，如果合適，具有其自身的終止子，如上面所提到。然而，還可以在啟動子后面并且如果合適在終止子之前插入數個核酸序列，特別是當在宿主或靶細胞中多順反子轉錄可能時。在該上下文中，插入位點或者插入至核酸構建體中的核酸分子序列不是決定性的，也就是說核酸分子可以插入至盒的第一個或最后一個位置而對表達沒有實質性的影響。然而，還可以在構建體中僅使用一個啟動子類型。本發明的一個實施方案還涉及產生載體的方法，包括將本文表征的核酸分子、根據本發明的核酸分子或根據本發明的表達盒插入至載體中。載體可以例如引入至細胞，如微生物或哺乳動物細胞中，如本文對于核酸構建體或下面轉化或轉染所述或實施例所示。 宿主或靶細胞可以瞬時或穩定轉化，然而，優選穩定轉化。根據本發明的載體優選是適宜在細胞中、優選哺乳動物細胞中表達根據本發明多肽的載體。因此，方法還包括用于將調節信號，特別是介導在生物如微生物或哺乳動物細胞中表達的信號整合入載體的一個或更多個步驟。因此，本發明還涉及包含本文所表征核酸分子作為適于根據本發明核酸分子的植物表達的核酸構建體部分的載體。用于本發明方法的有利的載體，如本發明的載體包含編碼用于本發明方法的核酸分子的核酸分子，或適用于在細胞中表達的包含如上所述適用于本發明方法的核酸分子的核酸構建體，或者單獨或者與更多的基因如標記或者選擇基因一起。因此，有利的用于本發明方法的重組表達載體包含用于本發明方法的核酸分子或者根據本發明的核酸構建體，其為這樣的形式，即適于在宿主細胞中表達包含SEQ ID NO 2、6、10、14、18、22、26和/或30，至于81^1 ^通道和/或！^ 6『1^1^^化0 亞基為 SEQ ID NO 73、75、77、79、81、83、85 和 / 或 87，至于 G 蛋白偶聯受體為 SEQ ID NO 130、134、138、 142、146、150、154、158、162、166、170 和/ 或 174，并且至于 SK-通道為 SEQ ID NO 228、230、 232中所示多核苷酸的核酸分子或其同源物和/或同時表達與根據本發明的核酸分子伴隨的或本文所述的另外的基因。因此，重組表達載體包含與待表達核酸序列有效連接的、基于待用于表達的宿主細胞選擇的一個或更多個調節信號。根據本發明，術語“載體”指能夠運輸與其連接的另一核酸的核酸分子。一種類型的載體是“質粒”，其意思是指可以向其中連接另外的DNA片段的環形雙鏈DNA環。更多類型的載體是病毒載體，其可以將額外的DNA片段連接入病毒基因組中。某些載體能夠在它們所導入的宿主細胞中自主復制(例如具有細菌復制起始點的細菌載體)。其它優選的載體當它們被引入至宿主細胞中時有利地全部或部分整合入宿主細胞的基因組中，并因此與宿主基因組一起復制。此外，某些載體能夠控制與它們有效連接的基因的表達。在本文上下文中，這些載體被稱為“表達載體”。如上面所提到，它們能夠自主復制或者可以部分或全部整合入宿主基因組中。適用于DNA重組技術的表達載體通常采用質粒形式。在本說明書中，“質粒”和“載體”可互換使用，因為質粒是最頻繁使用形式的載體。然而，本發明還旨在包括發揮相似功能的其它形式的表達載體，例如病毒載體。此外，術語載體還包括技術人員已知的其他載體，例如噬菌體、病毒例如SV40、CMV、TMV、轉座子、IS元件、噬粒、噬菌粒、粘粒和線性或環狀DNA。在重組表達載體中，“有效連接”意思是指目的核酸分子以基因表達成為可能的方式連接至調節信號它們彼此如此連接以致于兩個序列實現對于序列所指定的預期功能 (例如在體外轉錄/翻譯系統中，或在宿主細胞中，如果載體被引入宿主細胞中的話)。術語“調節序列”旨在包括啟動子、增強子和其他表達控制元件(例如多腺苷化信號)。這些調節序列描述于例如 Goeddel :Gene Expression Technology =Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990),或參見Gruber 禾口 Crosby, in  Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton, Florida,Ed. :Glick和Thompson，第7章，89-108中，包括它們當中所引用的文獻。調節序列包括控制核苷酸序列在許多類型宿主細胞中組成型表達的那些，和控制核苷酸序列僅在特定細胞中和在特定條件下直接表達的那些。技術人員知道，表達載體的設計將取決于多種因素如待轉化宿主細胞的選擇、蛋白質量減少的程度等等。對調節序列的優選選擇描述于上面，例如啟動子、終止子、增強子等等。術語調節序列被認為包含在術語調節信號之內。 數個有利的調節序列，尤其是啟動子和終止子在上面描述。通常，作為適宜表達的有利核酸構建體描述的調節序列也適用于載體。備選地，核酸序列可以使用桿狀病毒表達載體在昆蟲細胞中表達。可用于在所培養的昆蟲細胞(例如Sf9細胞)中表達蛋白質的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith等 (1983)Mol. Cell Biol. 3 :2156_2165)和 ρVL 系列(Lucklow 和 Summers(1989)Virology 170:31-39)。上面提到的載體僅是可能的適宜載體的小的概述。更多的質粒是技術人員己知的并且描述于例如 Cloning Vectors (Ed. Pouwels, P. H.等，Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0444904018)。用于原核細胞和真核細胞的更多的適宜表達系統見 Sambrook, J. , Fritsch, E. F.禾口 Maniatis, Τ. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual,2ndEdition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 中的第 16 禾Π 17 章。因此，本發明的一個實施方案涉及包含用于根據本發明方法中的核酸分子或用于本發明方法中的核酸構建體，例如本發明的核酸分子或核酸構建體的載體。所述載體可用于轉染或轉化宿主細胞以便提供根據本發明多肽的表達。有利地，所述核酸分子與用于在
            
43原核或真核宿主中或者在原核和真核宿主中表達的調節序列有效連接。此外，適宜同源重組的載體也處于本發明范圍之內。因此，本發明的一個實施方案涉及已經用適宜本發明方法的載體，特別是用根據本發明的載體或根據本發明的核酸分子或根據本發明的核酸構建體穩定或瞬時轉化的宿主細胞，由此宿主的膜不內源顯示本發明多肽的活性。本發明的更多實施方案還涉及產生轉基因宿主細胞，例如真核或原核宿主或宿主細胞，優選轉基因哺乳動物細胞的方法，包括向宿主細胞中引入根據本發明的核酸構建體、 根據本發明的載體或根據本發明的核酸分子，由此宿主的膜不內源顯示本發明多肽的活性。載體DNA可以通過常規轉化或轉染技術引入至原核或真核細胞中。術語“轉化” 和“轉染”包括接合和轉導，并且如在本文上下文中所使用，旨在包括用于將外來核酸分子 (例如DNA)引入宿主細胞內的多種多樣的現有技術方法，包括磷酸鈣共沉淀或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖-介導的轉染、PEG-介導的轉染、脂轉染、天然感受態、化學介導的轉移、電穿孔或粒子轟擊。用于宿主細胞包括植物細胞轉化或轉染的適宜方法可以在Sambrook等 (Molecular Cloning :A Laboratory Manual.，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)禾口其它實驗室手冊如 Methods in Molecular Biology，1995，Vol. 44, Agrobacterium protocols，Ed. Gartland and Davey, Humana Press，Totowa, New Jersey 中找到。為了選擇核酸分子、載體或核酸構建體向宿主生物內的成功轉移，有利的是使用已經在上面詳細描述的標記基因。對于核酸向植物細胞內的穩定或瞬時整合，已知僅少數細胞攝入外來DNA并且如果預期的話，將其整合入其基因組中，這取決于所使用的表達載體和所使用的轉染技術。為了鑒定和選擇這些整合體，通常將編碼可選擇標記的基因(如上所述，例如對抗生素的抗性)與目的基因一起引入到宿主細胞內。優選的可選擇標記是例如編碼參與抗性的基因的標記，優選抗生素抗性基因或者如糖或氨基酸生物合成途徑中的基因，例如半乳糖苷酶、ura3或ilv2。編碼基因如螢光素酶、gfp或其他熒光基因的標記同樣適用。這些標記和上述標記可以用于突變體中，在所述突變體中這些基因不具有功能，因為它們已經通過常規方法被缺失。此外，編碼可選擇標記的核酸分子可以與編碼本方法所用核苷酸分子在同一載體上引入至宿主細胞中，或者在分開的載體上引入至宿主細胞中。已經以所引入核酸分子穩定轉染的細胞可以通過例如選擇來鑒定(例如，已經整合入可選擇標記的細胞存活而其它細胞死亡)。“報告基因”編碼容易定量的蛋白質，如上述標記基因一樣。轉化效率或表達位點或時限可通過這些基因經生長測定、熒光測定、化學發光測定、生物發光測定或抗性測定或光度測量(內在顏色)或酶活性評價。在該上下文中，極其特別優選的是報告蛋白質(Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999 ；13(1) :29_44)例如“綠色熒光蛋白”(GFP) (Gerdes HH 和 Kaether C, FEBS Lett. 1996 ；389(1) 44-47 ；Chui WL 等，Curr Biol 1996,6 325-330 ；Leffel SM 等，Biotechniques. 23 (5) :912_8，1997)、氯霉素乙酰轉移酶、螢光素酶(Giacomin，Plant Sci 1996,116 59-72 ；Scikantha, J Bact 1996,178  121 ；Millar 等，Plant Mol Biol Rep 199210:324-414)和一般的螢光素酶基因、β _ 半乳糖苷酶或β-葡糖醛酸糖苷酶(Jefferson等，EMBO J. 1987，6，3901-3907)或Ura3基因。
            
“選擇標記”賦予對抗生素或其他毒性化合物的抗性在該上下文中可以提到的實例是新霉素磷酸轉移酶基因，其賦予對氨基葡糖苷抗生素新霉素(G 418)、卡那霉素、巴龍霉素的抗性(Deshayes A等，EMBO J. 4 (1985) 2731-2737)，編碼突變的二氫蝶酸合酶的sul 基因(Guerineau F 等，Plant Mol Biol. 1990 ；15(1)  127-136)，潮霉素 B 磷酸轉移酶基因(Gen Bank登錄號K 01193)和she ble抗性基因，其賦予對博來霉素抗生素如zeocin 的抗性。選擇標記基因的更多實例是賦予對2-脫氧葡萄糖-6-磷酸(W0 98/45456)或膦絲菌素等等抗性的基因，或賦予對抗代謝物抗性的那些基因，例如dhfr基因(Reiss， Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994) 142-149)。其他適宜的基因實例是 trpB 或 hisD (Hartman SC and Mulligan RC, Proc Natl Acad Sci USA. 85 (1988) 8047-8051)。 另一適宜基因是甘露糖磷酸異構酶基因(W0 94/20627)，ODC(鳥氨酸脫羧酶)基因(McConlogue,1987 in :Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed.)或土曲霉脫氨酶(Tamura K 等，Biosci Biotechnol Biochem. 59(1995)2336-2338)。在一個實施方案中，本發明的載體或核酸構建體包括編碼親和標記的核酸序列。 “親和標記”指肽或多肽，其編碼核酸序列可使用慣常克隆技術直接或通過連接體方式與編碼本發明多肽的核酸序列融合。親和標記用于通過親和層析從總細胞提取物中分離、濃縮和/或特異純化重組靶蛋白質。上述連接體可有利的包含蛋白酶切割位點(例如凝血酶或因子Xa的切割位點)，由此當需要時可從靶蛋白質上將親和標記切割下來。常用的親和標記的實例為來自Quiagen的“His標記”、Hilden、“Str印標記”、“Myc標記”(Invitrogen， Carlsberg)、來自New England Biolabs的由殼多糖-結合結構域和內含肽組成的標記、來自New England Biolabs的麥芽糖結合蛋白質(pMal)和來自Novagen的稱作CBD的標記。 在該上下文中，親和標記可以連接至編碼靶蛋白質的編碼核酸序列的5’或3’端。本發明的核酸分子可以用于產生雜交探針，通過雜交探針可以分離根據本發明的核酸序列的功能等同物。這些探針的產生和實驗步驟是已知的。例如，這涉及通過PCR特異性產生放射性或非放射性探針和適宜標記的寡核苷酸的使用和之后的雜交實驗。對于此目的所需要的技術在例如 T. Maniatis, E. F. Fritsch 和 J. Sambrook, Molecular Cloning  ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1989) 中提到。此外，所討論的探針可以通過標準技術(Lit. SDM或隨機誘變)以如此方式修飾， 以致于它們能夠用于更多目的，例如用作與mRNA和相應編碼序列特異性雜交的探針以便分析其它生物中的相應序列。探針可以用于例如篩選所述昆蟲的基因組文庫或cDNA文庫或者在電子數據庫中計算機搜索類似序列。“遺傳控制序列，，術語“遺傳控制序列，，被認為與術語“調節序列”等同，并且描述對根據本發明的核酸在原核或真核生物中的轉錄并且如果合適對翻譯具有影響的序列。實例是啟動子、終止子或稱作“增強子”的序列。除了這些控制序列外或者代替這些序列，這些序列的天然調節可仍存在于實際結構基因之前，并且如果合適，會以如此方式進行遺傳修飾以致于關閉天然調節并且靶標基因的表達已經被修飾，也就是說增加了或者減少了。控制序列的選擇取決于宿主生物或起始生物。此外，遺傳控制序列還包括基因的5’ -非翻譯區、內含子或非編碼3’區。此外，控制序列理解為意思是指允許向宿主生物基因組中進行同源重組或插入的那些或者允許從基因組去除的那些。
            
“敲除轉化體”指在其中特定基因已經通過轉化手段以定向方式被分別失活，特定基因的活性已經被降低、下調、減少或缺失的個體轉基因生物。“天然遺傳環境”指原來生物中的天然染色體基因座。以基因組文庫為例，核酸序列的天然遺傳環境優選地至少部分保留。該環境至少在核酸序列5’或3’側面，并且具有至少50bp、優選至少IOObp、特別優選至少500bp、非常特別優選至少IOOObp和最優選至少 5000bp的序列長度。“反應時間”指開展活性測定直至得到關于活性的重要發現所需要的時間；它取決于在測定法中所采用蛋白質的比活性和所使用方法以及所用設備的靈敏度。技術人員熟悉反應時間的確定。以基于光度鑒定殺真菌活性化合物的方法為例，反應時間通常在> 0和 360分鐘之間。“重組DNA”描述可通過重組DNA技術產生的DNA序列的組合。“重組DNA技術”是用于融合DNA序列的通常已知的技術(例如描述于Sambrook 等，1989, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press 中)。“復制起點”保證了根據本發明的表達盒或載體在微生物和酵母中的繁殖，例如大腸桿菌(E. coli)中的 pBR322 ori、ColEl 或 P15A ori (Sambrook 等.=Molecular Cloning. A Laboratory Manual,2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)和酵母中的 ARSl ori (Nucleic Acids Research, 2000, 28 (10) 2060-2068)。“靶標/靶標蛋白質”具有下列活性的本發明的多肽、蛋白質i)鉀離子通道和/或其輔助蛋白，或ii)鉀離子通道和/或Hyperkinetic β亞基，優選Η_1 νβ亞基A或C亞型，或iii)具有酚乙醇胺受體活性的蛋白質，或iv)鉀離子通道。所有的靶標或作用位點共有特征，即靶標蛋白質功能的存在是昆蟲存活所必須的。“轉化”描述向原核或真核細胞內引入異源性DNA的過程。所轉化細胞不僅描述了轉化過程本身的產物，還描述了通過轉過過程所產生轉基因生物的所有轉基因后代。“轉基因的”指包含根據本發明的核酸序列的核酸序列、表達盒或載體或者以根據本發明的核酸序列、表達盒或載體轉化的生物，術語轉基因描述已經通過遺傳工程方法產生的所有那些構建體，其中靶標蛋白質的核酸序列，或者有效連接至靶標蛋白質的核酸序列的遺傳控制序列，或者上述可能性的組合不在它們的天然遺傳環境中或者已經通過重組方法修飾。在該上下文中，修飾可以通過例如將所述核酸序列的一個或更多個核苷酸殘基突變實現。在一個實施方案中，本發明涉及本發明的多肽、膜或宿主細胞用作殺蟲靶標的用途。編碼黑腹果蠅昆蟲電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Siaker樣) 和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)的基因的缺失，或電壓門控性鉀通道 Shal (Shaker同族物1或Smker樣)和/或其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白)活性的抑制對黑腹果蠅而言是致死性的。
            
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因此，在一個實施方案中，本發明涉及由選自下列的核酸分子編碼的多肽a)編碼SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示多肽的核酸分子;b)SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25 和 / 或四中所示核酸分子；c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡并性可以衍生自根據SEQ ID NO :2、6、10、14、 18、22、26和/或30的多肽序列；d)與包含SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26和/或30所示核酸分子的多核苷酸
            
的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，編碼與(a)至(C)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且分別具有電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽；f)在嚴格雜交條件下與(a)至(C)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對 (a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且分別具有電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1 或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽產生；h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO 33和/或34中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一個或更多個基序的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQ ID NO :7、8 ；9,10 ；IU 12中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到；和j)通過在嚴格雜交條件下用探針篩選適當核酸文庫得到的核酸分子，探針包含 (a)或(b)的核酸分子互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼分別具有電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Smker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優選20nt、30nt、 50nt、100nt、200nt 或 500nt,或其同源物用作殺蟲靶標的用途。以shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為例，黑腹果蠅中編碼昆蟲Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優選Η-Ι νβ亞基A或C亞型的基因的缺失，或Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優選H_kvi3亞基A或C亞型活性的抑制對黑腹果蠅而言是致命性的。因此，在一個實施方案中，本發明涉及由選自下列的核酸分子編碼的多肽a)編碼包含SEQ ID NO :73、75、77、79、81、83、85和/或87所示多肽的多肽的核酸分子；b)包含SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86中所示核酸分子的核酸分子；c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡并性可以衍生自包含根據SEQ ID NO :73、75、 77、79、81、83、85和/或87的多肽序列的多肽；d)與包含SEQ ID NO :73、75、77、79、81、83、85和/或87所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，編碼與(a)至(C)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且分別具有Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優選Η-Ι νβ亞基A或 C亞型活性的多肽；f)在嚴格雜交條件下與(a)至(c)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對 (a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且分別具有Siaker通道和/或Hyperkinetic β亞基， 優選H-kv β亞基A或C亞型活性的多肽產生；h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO :102和/或103中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、 120、121、122、123、IM和/或125和/或126、127和/或128的一個或更多個基序的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQ ID NO :88,89 ；90,91 ； 92,93 ；94,95 ；96,97 ；98,99和/或100、101中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到；和j)通過在嚴格雜交條件下用探針篩選適當核酸文庫得到的核酸分子，探針包含 (a)或(b)核酸分子互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼分別具有Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優選Η-Ι νβ亞基A或C亞型活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優選20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt，或其同源物用作殺蟲靶標的用途。以G蛋白偶聯受體為例，黑腹果蠅或其他昆蟲中編碼選自優選來自黑腹果蠅的 Oa2、0amb、0Ct-i3 -2R和Oct-β -3R的昆蟲酚乙醇胺受體的基因的缺失，或選自優選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, Oct- β _2R和Oct- β _3R的酚乙醇胺受體活性的抑制對黑腹果蠅或其它昆蟲而言是致命性的。因此，在一個實施方案中，本發明涉及由選自下列的核酸分子編碼的多肽a)編碼 SEQ ID NO  130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174
            
中所示多肽的核酸分子；b)SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173 中所
            
示核酸分子；c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡并性可以衍生自包含根據SEQ ID NO :130,134, 138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 的多肽序列的多肽；d)與包含 SEQ ID NO  130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，編碼與(a)至(C)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且具有選自優選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, Oct- β -2R和Oct- β _3R的酚乙醇胺受體活性的多肽；f)在嚴格雜交條件下與(a)至(C)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對 (a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且具有選自優選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, 0c和Oct-β -3R的酚乙醇胺受體活性的多肽產生；h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO  177、178和/或179中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、 192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或
            
226的一個或更多個基序的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQ ID NO  131、132 ； 135、 136 ；139,140 ；143,144 ；147,148 ；151,152 ； 155、156、159、160 ；163,164 ；167,168 ；171,172 和/或175、176中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到；禾口j)通過在嚴格雜交條件下用探針篩選適當核酸文庫得到的核酸分子，所述探針包含(a)或(b)核酸分子互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼具有選自優選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, Oct- β _2R和Oct- β _3R的酚乙醇胺受體活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優選20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt，或其同源物用作殺蟲靶標的用途。以SK-通道為例，黑腹果蠅中編碼昆蟲小電導Ca2+激活鉀通道基因的缺失，或昆蟲小電導Ca2+激活鉀通道活性的抑制對黑腹果蠅而言是致命性的。因此，在一個實施方案中，本發明涉及由選自下列的核酸分子編碼的多肽a)編碼SEQ ID NO :228,230,232中所示多肽的核酸分子；b)SEQ ID NO :227、229、231 中所示核酸分子；c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡并性可以衍生自根據SEQ ID NO :228,230,232 的多肽序列；d)與包含SEQ ID NO :2觀、230、232所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，其編碼與(a)至(C)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且具有小電導Ca2+激活鉀通道活性的多肽；f)在嚴格雜交條件下與(a)至(C)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，其編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對(a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且具有小電導Ca2+激活鉀通道活性的多肽產生；h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO :239中所述共有序列或選自SEQ ID NO :240、 241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個或更多個基序的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQ ID NO :233、234、235、 236 ；和237、238中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到；和j)通過在嚴格雜交條件下用探針篩選適當核酸文庫得到的核酸分子，所述探針包含(a)或(b)核酸分子的互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼具有小電導Ca2+激活鉀通道活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優選20nt、 30nt、50nt、100nt、200nt 或 500nt,
            
 或其同源物用作殺蟲靶標的用途。 本發明此外涉及包含下列的核酸構建體或表達盒a)與包含下列的核酸序列有效連接的遺傳控制序列i)具有 SEQ ID NO 1、5、9、13、17、21、25 和 / 或 29，至于 shaker 通道和 / 或 Hyperkinetic β 亞基為 SEQ ID NO 72，74，76，78，80，82，84 和 / 或 86，至于 G 蛋白偶聯受體為 SEQ ID NO 129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173，并且至于 SK-通道為SEQ ID NO 227,229,231中所示核酸序列的核酸序列；或ii)基于遺傳密碼子簡并性，可以通過回譯從SEQ ID NO 2、6、10、14、18、22、26和 / 或 30，至于 shaker 通道和 / 或 Hyperkinetic β 亞基為 SEQ ID NO 73、75、77、79、81、83、 85 和 / 或 87，至于 G 蛋白偶聯受體為 SEQ ID NO 130、134、138、142、146、150、154、158、162、 166、170和/或174，并且至于SK-通道為SEQ ID NO 2觀、230、232所示氨基酸序列衍生的核酸序列；或iii)核酸序列 SEQ ID NO 1、5、9、13、17、21、25 和 / 或 29，至于 shaker 通道和 / 或 Hyperkinetic β 亞基為 SEQ ID NO 72，74，76，78，80，82，84 和 / 或 86，至于 G 蛋白偶聯受體為 SEQ ID NO 129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173，并且至于 SK-通道為SEQ ID NO 227、229、231的功能等同物；禾口b)額外的功能元件；或c) a)和b)的組合并且涉及包含下列的核酸構建體或表達盒a)與根據本發明的核酸序列有效連接的遺傳控制序列；b)額外的功能元件；或c) a)和b)的組合在“體外”或“體內”測定系統中的用途。本發明此外涉及核酸構建體或表達盒的上述實施方案用于在體外或體內測定系統中表達本發明多肽的用途。在一個實施方案中，本發明涉及本發明的多肽、膜或宿主細胞用于鑒定具有殺蟲活性的化合物的用途。本發明此外涉及本發明的多肽在用于鑒定殺蟲化合物的方法中的用途。根據本發明方法的優選實施方案包括下列步驟i.將本發明的多肽在允許一種或更多種測試化合物與本發明多肽結合的條件下與一種或更多種測試化合物接觸，ii.檢測測試化合物是否結合在i)中所述本發明的多肽；或iii.檢測測試化合物是否減少或抑制或封閉在i)中所述本發明多肽的活性；或iv.檢測測試化合物是否減少或抑制或封閉具有下列活性的多肽的轉錄、翻譯或表達1.在i)中所述電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)，或2.在i)中所述Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優選Η_1 νβ亞基A或C亞型，或3.在i)中所述選自優選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, Oct- β _2R和Oct- β _3R的酚乙醇胺受體，或4.在i)中所述昆蟲小電導Ca2+激活鉀通道。按照上述方法步驟ii或iii對本發明多肽活性的檢測，可以使用多種體外和體內測定法評價，例如測量電流、測量膜電位、測量離子流如鉀或銣、測量鉀濃度、測量第二信使和轉錄水平、使用鉀依賴性酵母生長測定法和使用如電壓敏感染料、放射性示蹤劑和膜片鉗電生理學。以G蛋白偶聯受體為例，按照上述方法步驟ii或iii對本發明多肽活性的檢測， 可以使用多種體外和體內測定法評價，例如測量電流、測量膜電位、測量離子流如鈣、優選測量鈣濃度、測量第二信使和轉錄水平、使用鉀依賴性酵母生長測定法和使用如鈣濃度敏感染料或放射性示蹤劑。按照上述方法步驟ii或iii的檢測可使用鑒定蛋白質和配體之間相互作用的技術實現。在該上下文中，測試化合物或者多肽可包含可檢測標記例如熒光標記、放射性同位素、化學發光標記或膜或電位標記。標記的實例選自來自Molecular Devices的藍色膜電位染料、ANEP (氨基萘基乙烯基吡啶錯)染料像di-4-ANEPPS、di-8-ANEPPS、di-2-ANEPEQ+、 di-8-ANEPPQ、di-12-ANEPPQ ；RH 染料(最初由 Rina Hildesheim 合成)，包括來自 Molecular ftx)bes的一系列的二烷基氨基苯基多烯基吡啶鎮染料像RH 414(T_1111)、 RH 795 (R-649)和 RH 237(S_1109)。RH 421(S_1108)或來自 Molecular Probes 的基于羰花青和氧雜菁的其它染料，如在1999年出版的第七版Molecular Probes' Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 中所述。以shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為例，在本發明的一個實施方案中， 檢測測試化合物是否減少、抑制或封閉本發明多肽活性的方法包括以優選選自SEQ ID Ν0 72，74，76，78，80，82，84 和 / 或 86 的昆蟲 Shaker 通道和 / 或 Hyperkinetic β 亞基，優選H-kv β亞基A或C亞型穩定轉染的CHO細胞經受加載至少一種上述染料，優選來自 Molecular Devices的藍色膜電位染料，達0. 1-3小時、優選0. 5-1小時、優選0. 45小時，通過以l-120mM、優選10_60mM、更優選50mM KCl的EC50值濃度增加KCl的細胞外水平活化^iaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優選Η_1 νβ亞基A或C亞型，優選以1μΜ-100πιΜ、10-10000μΜ、優選100-1000 μ M的濃度加入懷疑具有抑制通道活性能力的化合物，測量發光、熒光，與對照比較染料的發光/熒光數據和確定所測試化合物是否具有抑制通道活性的能力。以G蛋白偶聯受體為例，按照上述方法步驟ii或iii的檢測可使用鑒定蛋白質和配體之間相互作用的技術實現。在該上下文中，測試化合物或者多肽可包含可檢測標記例如熒光標記、放射性同位素、化學發光標記或膜或電位標記。標記的實例可以選自鈣濃度敏感性染料，例如 Fluo-4Calcium Crimson 、Calcium Green 、Calcium Orange 、Calcium Yellow 、Fura Red >Oregon Green  ν Rhod-3>X-rhod-5F>Fura-2>bis-fura-2>f luo-5F> fluo_5N、fura dextran、fura_4F、fura_5F、fura_6F、fura—FF、fura—FF、quin—2、rhod
            
51dextran、rhod-2、rhod_5N 或 rhod-FF 或來自 Molecular Probes 的基于羰花青禾口氧雜菁的其它染料，如在1999年出版的第七版Molecular Probes' Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 中所述。以SK-通道為例，在本發明的一個實施方案中檢測測試化合物是否減少、抑制或封閉本發明多肽活性的方法包括以優選選自SEQ ID NO :227,229,231的昆蟲小電導Ca2+ 激活鉀通道穩定轉染的CHO細胞經受加載至少一種上述染料，優選來自Molecular Devices的藍色膜電位染料，達2_6 小時、優選-5小時、優選4小時，以100-500nM、更優選200nM的EC50值濃度的離子載體，優選離子霉素活化小電導 Ca2+激活鉀通道，意思是指以1-5 μ M的濃度溫育細胞，以5-50 μ Μ、5-20 μ Μ、優選10 μ M的濃度加入懷疑具有抑制通道活性能力的化合物測量發光、熒光與對照比較染料的發光/熒光數據和確定所測試化合物是否具有抑制通道活性的能力。在本發明的一個實施方案中檢測測試化合物是否減少、抑制或封閉本發明多肽活性的方法包括以優選選自SEQ ID NO  1、5、9、13、17、21、25和/或四的昆蟲電壓門控性鉀通道Sml (Shaker同族物1或Smker樣)和/或其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白) 穩定轉染的CHO細胞經受，加載至少一種上述染料，優選來自Molecular Devices的藍色膜電位染料，達 0. 5-3小時、優選1. 5小時、優選2-2. 5小時，通過以10-120mM、優選10_60mM、更優選30mM EC50值的KCl濃度增加KCl的細胞外水平活化電壓門控性鉀通道^ial (Shaker同族物1或Smker樣)和/或其輔助蛋白 KChIP(鉀通道相互作用蛋白)，以1-200 μ Μ、5-100 μ Μ、優選25-30 μ M的濃度加入懷疑具有抑制通道活性能力的化合物，測量發光、熒光與對照比較染料的發光/熒光數據和確定所測試化合物是否具有抑制通道活性的能力。懷疑具有抑制本發明多肽活性的化合物直接加入至槽溶液中。備選地，按照上述方法步驟ii或iii的檢測可使用膜片鉗技術實現。可使用基本技術的一些變型選自內部-外、外部-外、細胞連接的、雙切割膜片、全細胞膜片和穿孔膜片技術。隨后的測定取決于標記并且是技術人員已知的。在本發明的一個實施方案中，檢測測試化合物是否減少、抑制或封閉本發明多肽活性的方法包括以優選選自SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、沈和/或30的昆蟲電壓門控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白)穩定轉染的CHO細胞在室溫Q2-25°C )下經受全細胞結構的膜片鉗技術，使用當充滿吸管溶液時具有2-3M0hm電阻的硼硅玻璃毛細管并且在槽溶液中測量，優選補償槽和吸管溶液之間的液體接頭電位，在全細胞鉗下測量膜電流，以2kHz取樣并以IkHz過濾，將細胞保持在_70mV下并以每2秒IOmV的增量應用從-100至+130mV的一系列400ms測試電壓脈沖，測量波幅，如測量電流-電壓相互關系一樣，并且定義為在給定去極化電位下的最大外向電流。以shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為例，在本發明的一個實施方案中， 檢測測試化合物是否減少、抑制或封閉本發明多肽活性的方法包括以優選選自SEQ ID NO 73、75、77、79、81、83、85 和 / 或 87 的昆蟲 Shaker 通道和 / 或 Hyperkinetic β 亞基，優選 H-kv^亞基A或C亞型穩定轉染的CHO細胞在室溫02-25°C)下經受全細胞結構的膜片鉗技術。本發明的全細胞電壓鉗方法包括使用EPClO數字控制的放大器與PATCHMASTER軟件 (HEKA Electronics，Lambrect，Germany)組合進行數據采集和進一步的分析。EPClO通過前脈沖手段提供電容和泄漏電流的自動扣除。數據以66. 7KHz過濾(-3dB，8-pole Bessel 低通濾波器)并以每個點5μ s數字化。膜片吸管的輸入電阻是2.0-4. 0ΜΩ并且細胞的電容是15. 3士2. IpFOi = 45)；殘留系列電阻(在直到80%補償之后)是4. 2士0. 4ΜΩ。常規應用對液體接頭電位的修正。膜電位固定在-IOOmV并且電流通過從_60mV至+IOOmV(或 +60mV)的50ms去極化脈沖(0. IHz)引出。懷疑具有抑制本發明多肽活性的化合物直接加入至槽溶液中。在一個實施方案中，剩余電容和泄漏電流的扣除使用pClamp的在線P/4方案開展。以G蛋白偶聯受體為例，在本發明的一個實施方案中，檢測測試化合物是否減少、 抑制或封閉本發明多肽活性的方法包括使穩定表達G-α-16泛宿主性G蛋白質和穩定或瞬時表達優選選自 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173 的選自優選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, Oct- β -2R和Oct- β -3R的酚乙醇胺受體的CHO細胞進行加載至少一種上述染料，優選Fluo-4，達0. 1-3小時、優選0. 5-2小時、優選1小時，置于FLIPR中并使用兩次添加方案運行，由此測試化合物，懷疑具有封閉或活化酚乙醇胺受體能力的化合物在第一次添加中加入并溫育3分鐘，然后激活劑酚乙醇胺在第二次添加中以EC80濃度引入并且讀取熒光2分鐘。對于兩次添加均運行對照。在第一次添加中高于基線的熒光增加將表明是可能的激活劑并且在第二次添加中反應降低或者沒有增加可表明是可能的抑制劑。隨后的檢測依賴于標記并且是技術人員已知的。以SK-通道為例，在本發明的一個實施方案中，檢測測試化合物是否減少、抑制或封閉本發明多肽活性的方法包括以優選選自SEQ ID N0:2^、230、232的昆蟲小電導Ca2+ 激活鉀通道穩定轉染的CHO細胞在室溫Q2-25°C )下經受全細胞結構的膜片鉗技術，使用當充滿電極溶液時具有2-3M0hm抗性的硼硅玻璃毛細管并且在槽溶液中測量，優選補償槽和電極溶液之間的液體接頭電位，在全細胞鉗下測量膜電流，以2kHz取樣并以IkHz過濾， 將細胞保持在_70mV下并以每2秒IOmV的增量應用從-100至+130mV的一系列400ms測試電壓脈沖，測量波幅，如測量電流-電壓相互關系，并且定義為在給定去極化電位下的最大外向電流。
            
在根據本發明的方法中，還可以采用多個測試化合物。如果一組測試化合物影響靶標，則可直接分離各個測試化合物或者可以將測試化合物組分成許多亞組，例如當其由數個不同成分組成時，以便減少根據本發明的方法中的不同測試化合物的數量。然后，根據本發明的方法以各個測試化合物重復或者相關亞組的測試化合物重復。取決于樣品的復雜性，上述步驟可以重復開展，優選地直到依照根據本發明方法鑒定的亞組僅包含小數量的測試化合物或者實際上僅一種測試化合物。根據本發明的方法可有利的作為HTS步驟開展。HTS使得同時測試大量不同化合物成為可能。高通量篩選的質量由兩種因素確定，即測定窗口的相對大小和該測定窗口在從對照實驗到對照實驗間的穩定性(即 20個測定篩選板對照中的測定信號穩定性)。這表示為篩選的ζ’因子并且等式為V = 1-((30 max+3 O fflin) / (I μ max_ μ minI))。以SK-通道外例，高通量篩選的質量由兩種因素確定，即測定窗口的相對大小，在該例中來自完全活化通道的信號減去來自非活化通道的信號(通常表示成任意單位)。第二個因素是該測定窗口在從對照實驗到對照實驗間的穩定性(即 20個測定篩選板對照中的測定信號穩定性)。這表示為篩選的ζ’因子并且等式為Z，= 1-[3 * (σ max+ σ min) /Abs (Ave (MAX) -Ave (MIN))]。所計算的Ζ’ > 0. 5被認為是極佳的測定。以shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為例，備選地為了計算Ζ，因子使用下
            
列公式
            
權利要求
            
1.鑒定分別降低昆蟲電壓門控性鉀通道Sial(Shaker同族物1或Smker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的殺蟲活性化合物的方法，所述方法包括a)在膜中裝配最初不存在于所述膜中的、具有昆蟲電壓門控性鉀通道SiaKShaker同族物1或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽，b)在膜的一側上應用懷疑具有抑制最初不存在于所述膜中的所述多肽活性的能力的化合物，c)檢測所述多肽的活性，和d)鑒定在(b)中應用的降低所述多肽活性的化合物。
            
2.根據權利要求1的方法，其中編碼分別具有昆蟲電壓門控性鉀通道Sial(Shaker同族物1或Srnker樣)和/或其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽的基因表達于宿主細胞的膜中。
            
3.權利要求1或2任意一項的方法，其中所述膜包含由選自下列的核酸分子編碼的至少一種多肽a)編碼SEQID NO :1、5、9、13、17、21、25和/或四中所示多肽的核酸分子;b)SEQID NO :1、5、9、13、17、21、25和/或四中所示核酸分子;c)核酸分子，其因遺傳密碼的簡并性可以衍生自根據SEQID N0:2、6、10、14、18、22、26 和/或30的多肽序列；d)與包含SEQID而1、5、9、13、17、21、25和/或四所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，其編碼與(a)至(c)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少50% 同一性并且分別具有電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Smker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽；f)在嚴格雜交條件下與(a)至(c)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，其編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對 (a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且分別具有電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1 或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽產生；h)核酸分子，其編碼包含SEQID NO :33和/或34中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一個或更多個基序的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQID N0:3、4;7、8;ll、12;15、 16,19,20 ；23,24 ；27,28和/或31、32中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到；禾口j)通過在嚴格雜交條件下用探針篩選適當核酸文庫得到的核酸分子，所述探針包含 (a)或(b)核酸分子的互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼分別具有電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Smker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優選20nt、30nt、 50nt、100nt、200nt 或 500nt。
            
4.權利要求1的方法，其中具有昆蟲電壓門控性鉀通道SiaKShaker同族物1或 Shaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的所述多肽的活性通過電生理學方法測定，優選通過膜片鉗或者在HTS測定中測定。
            
5.權利要求2的方法，其中編碼分別具有昆蟲電壓門控性鉀通道Sial(Shaker同族物 1或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽的基因在哺乳動物細胞中表達，優選在選自CHO細胞和HEK293的哺乳動物細胞中表達。
            
6.權利要求1的方法，其包括e)向昆蟲、昆蟲群體或在其中將控制所述昆蟲的場所應用昆蟲控制量的根據權利要求 Id)鑒定的化合物，和f)測定所處理昆蟲或昆蟲群體或所述場所上的昆蟲或昆蟲群體和未處理的昆蟲、昆蟲群體或場所的生長或生存力，和g)選擇在步驟e)的應用化合物后降低所處理昆蟲或昆蟲群體或所述場作上的昆蟲或昆蟲群體的生長或生存力的化合物。
            
7.測定系統，其用于鑒定分別降低昆蟲電壓門控性鉀通道SiaKShaker同族物1或 Shaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的殺蟲活性化合物，所述測定系統包含宿主生物、組織、細胞或其細胞消化物或膜，其已經包埋、裝配入、插入或整合入選自如權利要求3a)至3 j)中所述核酸分子的核酸分子，并且基于該核酸分子的表達， 分別具有昆蟲電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Smker樣)和/或其輔助蛋白 KChIP(鉀通道相互作用蛋白)的生物學活性的多肽。
            
8.權利要求7的測定系統，其中宿主生物是穩定轉染的哺乳動物細胞，優選選自CHO 細胞、HEK293, COS、HeLa, NIH3T3、BAK21、Jurkat, CV-U H印C_2_、爪蟾卵母細胞、Sf9, S2、 Sf21、Hi5、Pcl2和U20S，所述宿主生物表達選自權利要求3a)至3j)中所述核酸分子的核酸分子。
            
9.殺死昆蟲或者抑制昆蟲生長或生存力的方法，其包括向昆蟲應用根據權利要求1的方法鑒定的化合物。
            
10.核酸分子，其選自a)編碼在SEQID而2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示多肽的核酸分子；b)SEQID NO :1、5、9、13、17、21、25和/或四中所示核酸分子;c)核酸分子，其因遺傳密碼的簡并性可以衍生自根據SEQID N0:2、6、10、14、18、22、26 和/或30的多肽序列；d)與包含SEQID而1、5、9、13、17、21、25和/或四所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，其編碼與(a)至(c)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少50% 同一性并且分別具有電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Smker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽；f)在嚴格雜交條件下與(a)至(c)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，其編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對 (a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且分別具有電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1 或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽產生；h)核酸分子，其編碼包含SEQID NO :33和/或34中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一個或更多個結構域的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQID N0:3、4;7、8;ll、12;15、 16 ；19,20 ；23,24 ；27J8和/或31、32中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到；禾口j)通過在嚴格雜交條件下用探針篩選適當核酸文庫得到的核酸分子，所述探針包含 (a)或(b)的核酸分子的互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼分別具有鉀通道Sial (Shaker同族物1或Smker樣)和/或其輔助蛋白 KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優選20nt、30nt、50nt、 100nt、200nt 或 500nt。
            
11.核酸構建體，其包含根據權利要求10的核酸分子。
            
12.載體，其包含根據權利要求11的核酸構建體或根據權利要求10的核酸分子。
            
13.轉基因細胞，其包含根據權利要求12的載體、根據權利要求11的核酸構建體或根據權利要求10的核酸分子。
            
14.由根據權利要求10的核酸分子編碼的多肽。
            
15.分別具有昆蟲電壓門控性鉀通道Sial(Shaker同族物1或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽用作殺蟲靶標的用途，優選地多肽由選自如權利要求3a)至3j)中所述核酸分子的核酸分子編碼。
            
16.控制殺蟲害蟲的方法，包括應用含有至少一種如表I所示化合物或其衍生物作為殺蟲活性成分的組合物。
            
全文摘要
            
本發明涉及多肽，優選來自黑腹果蠅的多肽(DmShal)作為殺蟲劑的靶標。
            
文檔編號G01N33/68GK102272603SQ200980153714 
            
公開日2011年12月7日 申請日期2009年11月5日 優先權日2008年11月6日
            
發明者A·霍夫海因, B·韋德爾, D·倫敦, D·豪茨, F·馬隆, F-J·布勞恩, G·魯, J·多施, J·迪克豪特, J·青克, L·斯塔姆, M·格里斯沃爾德, N·B·蘭克爾, P·貝爾納斯科尼, R·D·柯克敦, R·坎德薩米, S·格羅斯, S·齊特科, T·M·格加納斯 申請人:巴斯夫歐洲公司
            


                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
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