用于癌癥患者中診斷用途的方法和組合物的制作方法

專利名稱：用于癌癥患者中診斷用途的方法和組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于預測臨床結果和用于監測用抗-血管生成療法治療的癌癥患者的方法和組合物。
背景技術：
癌癥是對人類健康最致命的威脅之一。僅在美國，癌癥每年影響接近一百三十萬新患者，并且是位于心血管病之后的第二致死原因，4名死亡者中占約1名。實體瘤是造成那些死亡中的大部分的原因。盡管已經有某些癌癥醫學治療的顯著進步，但是全部癌癥的總的5年存活率在過去的20年內僅提高了約10%。癌癥，或惡性腫瘤，轉移并以不受控的方式快速生長，從而使及時的檢測和治療極端困難。根據癌癥類型，患者典型地具有若干種他們可以使用的治療選擇，包括化學療法、 放射和基于抗體的藥物。用于預測來自不同治療方案的臨床結果的診斷法將非常有益于這些患者的臨床管理。若干研究已經探索了基因表達與鑒定特定癌癥類型的相關性，例如通過突變特異性測定、微陣列分析、qPCR等。此類方法可用于鑒定和分類患者表現出的癌癥。 然而，關于具有臨床結果的基因表達的預測值或預后值知之甚少。因此，存在對用于預測治療結果諸如癌癥患者的無進展存活或用于監測此類治療的進展并由此選擇對各患者最佳治療方案的客觀、可重復方法的需要。發明概述本發明的方法可以用于多種設置，包括，例如，用于幫助治療癌癥患者的方法或用于藥物開發過程中的患者選擇，在用具體治療方案治療個體患者時預測成功的可能性，評估疾病進展，監測治療效果，確定個體患者的預后和評估個體受益于具體抗癌療法的傾向。本發明部分地基于下述發現，患有癌癥的患者中某些生物標志的表達水平與對單獨的抗-血管生成療法降低的臨床益處相關。因此，本發明一方面提供優化癌癥治療的治療功效的方法，包括檢測從患者獲得的樣品中胎盤生長因子(placental growth factor, (PlGF))的表達水平的步驟，其中與參照樣品相比較所述樣品中PlGF增加的表達表明所述患者可受益于不同于抗-血管生成療法的抗癌療法或除抗-血管生成療法以外的(other than or in addition to anti-angiogenic therapy)抗癌療法。在一些實施方案中，所述方法還包括向所述患者施用抗癌療法，其中所述抗癌療法不同于抗-血管生成療法的抗癌療法或是除抗-血管生成療法以外的抗癌療法。本發明另一方面提供鑒定可受益于不同于抗-血管生成療法的抗癌療法或除抗-血管生成療法以外的抗癌療法的癌癥患者的方法，包括檢測從所述患者獲得的樣品中胎盤生長因子(PlGF)表達水平的步驟，其中，與參照樣品相比較所述樣品中PlGF增加的表達表明所述患者可受益于不同于抗-血管生成療法的抗癌療法或除抗-血管生成療法以外的抗癌療法。在一個實施方案中，來自于所述患者的樣品在抗-血管生成療法開始之前或開始之時獲得。在一個實施方案中，來自于所述患者的樣品在抗-血管生成療法開始之后獲得。在一些實施方案中，所述方法還包括向所述患者施用抗癌療法，其中所述抗癌療法不同于抗-血管生成療法或是除抗-血管生成療法以外的抗癌療法。本發明另一方面提供預測癌癥患者對抗-血管生成療法的反應性的方法，包括確定從所述患者獲得的樣品中PlGF的表達水平，其中與參照樣品相比較PlGF增加的表達水平表明所述患者對單獨的抗-血管生成療法有反應的可能性更低。在一個實施方案中， 來自于所述患者的樣品在抗-血管生成療法開始之前或開始之時獲得。在一個實施方案中，來自于所述患者的樣品在抗-血管生成療法開始之后獲得。在一些實施方案中，所述方法還包括向所述患者施用抗癌療法，其中所述抗癌療法不同于抗-血管生成療法或是除抗-血管生成療法以外的抗癌療法。本發明還提供治療患有癌癥的患者的方法，包括向所述患者施用不同于抗-血管生成療法的抗癌療法或除抗-血管生成療法以外的抗癌療法，其中從所述患者獲得的樣品顯示與參照樣品相比較增加的PlGF表達水平。在一個實施方案中，來自于所述患者的樣品在抗-血管生成療法開始之前或開始之時獲得。在一個實施方案中，來自于所述患者的樣品在抗-血管生成療法開始之后獲得。所述樣品可在治療開始之前從所述患者獲得。在一個實施方案中，所述樣品具有大于或等于^pg/ml的PlGF表達水平。在一些實施方案中， 所述樣品可從現在正在用抗-血管生成療法治療的患者獲得。在一個實施方案中，來自于所述患者的樣品在抗-血管生成療法開始之后獲得。在一個實施方案中，所述樣品具有大于或等于50pg/ml的PlGF表達水平。本發明另一方面提供治療癌癥患者的方法，包括向所述患者施用抗-血管生成療法，其中從所述患者獲得的樣品顯示低或降低的PlGF表達水平，與參照樣品相比較。所述樣品可在治療開始之前從所述患者獲得。在一個實施方案中，所述樣品具有小于或等于觀 8/!111的PlGF表達水平。在一些實施方案中，所述樣品可從現在正在用抗-血管生成療法治療的患者獲得。在一個實施方案中，來自于所述患者的樣品在抗-血管生成療法開始之后獲得。在一個實施方案中，所述樣品具有小于或等于50pg/ml的PlGF表達水平。在一些實施方案中，所述抗-血管生成療法包括施用抗-VEGF抗體，例如，貝伐珠單抗 (bevacizumab)0還提供試劑盒，其包括能夠特異性檢測PlGF表達水平的化合物，其中所述試劑盒還包括使用所述試劑盒預測患有癌癥的患者對單獨的抗-血管生成療法的反應性的說明書，其中與參照樣品相比較PlGF增加的表達表明所述患者可受益于不同于抗-血管生成療法的抗癌療法或除抗-血管生成療法以外的抗癌療法。在本文描述的任何方法中，所述樣品可以是組織或細胞樣品或從血液、血漿和/ 或血清獲得。在某些實施方案中，所述樣品在癌癥治療開始之前從所述患者獲得。在某些實施方案中，所述樣品在癌癥治療開始之后從所述患者獲得。例如，所述樣品在開始癌癥治療之后的M小時內獲得，或在癌癥治療開始之后的2，3，5，10，14，20，25，28，42或56天內獲得。在本文描述的任何方法中，一種或多種基因或基因產物的表達水平可在核酸水平、蛋白水平或蛋白的分泌或表面表達水平確定。在某些實施方案中，PlGF表達水平的增加是表達水平的1. 4-1. 8倍的增加。在一些實施方案中，PlGF表達水平的增加是表達水平的至少1. 5倍的增加。在本發明方法的一些實施方案中，所述癌癥是癌瘤(carcinoma)，淋巴瘤 (lymphoma)，母細胞瘤(blastoma)，肉瘤(sarcoma)和白血病(leukemia)。所述癌癥的更具體實例包括鱗狀細胞癌(squamous cell cancer)，肺癌(lung cancer)(包括小細 Ifi月市 I (small-cell lung cancer)，__ 小細 Ife 月市· (non-small cell lung cancer), 月市腺癌(adenocarcinoma of the lung)禾口月市的麟狀癌(squamous carcinoma of the lung))，月復月莫癌(cancer of the peritoneum)，月干細胞癌(hepatocellular cancer)，胃
(gastric or stomach cancer) (1 1 IS (gastrointestinal cancer)), I^j^fg (pancreatic cancer)，成膠質細胞瘤(glioblastoma)，宮頸癌(cervical cancer)，卵巢 (ovarian cancer),H1Flg (liver cancer),MD^fg (bladder cancer),M'-JM (hepatoma), 乳腺癌(breast cancer),結腸癌(colon cancer),結腸直腸癌(colorectal cancer), 子宮內膜癌或子宮癌(endometrial or uterine carcinoma),唾液腺癌(salivary gland carcinoma), l^fg (kidney or renal cancer), H1Flg (liver cancer), Iif^lJ I/^IS (prostate cancer)，夕卜陰(vulval cancer)，(thyroid cancer) ,H1Flg (hepatic carcinoma)和多種類型的頭頸癌(head and neck cancer)，以及B細胞淋巴瘤(B_cell lymphoma)(包括低度 / 濾泡性非霍奇金淋巴瘤(low grade/follicular non-Hodgkin' s lymphoma) (NHL)；小淋巴細胞(SL)NHL(small lymphocytic (SL)NHL)；中度 / 濾泡 NHL (intermediate grade/fol licular NHL)；中度彌漫個生 NHL (intermediate grade diffuse NHL)；高度成免疫細胞性 NHL(high grade immunoblastic NHL)；高度成淋巴細胞性 NHL(high grade lymphoblastic NHL)；高度小無核裂細胞性 NHL(high grade small non-cleaved cell NHL)；巨塊型 NHL (bulky disease NHL)；套細胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma) ；AIDS相關淋巴瘤(AIDS-related lymphoma)；和瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥 (Waldenstrom' s Macroglobulinemia))；慢性淋巴細胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia) (CLL)；急性成淋巴細胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia) (ALL)；多毛細胞白血病(Hairy cell leukemia)；慢性成髓細胞白血病(chronic myeloblastic leukemia)；禾口移植后淋巴增生性障礙(post-transplant Iymphoproliferative disorder) (PTLD)，以及與瘢痣病(phakomatoses)、水腫(edema)(諸如與腦瘤有關)或梅格斯氏綜合征(Meigs' syndrome)有關的異常血管增殖。在一個實施方案中，所述癌癥是乳腺癌，包括例如轉移性乳腺癌。本發明的方法可與本文下文描述的任何抗癌劑一起實施。抗-血管生成劑可以是本文下文描述的單獨或組合的任何抗-血管發生劑。在一些實施方案中，抗-血管生成療法包括施用VEGF拮抗劑，包括例如抗-VEGF抗體。在一些實施方案中，所述抗-VEGF抗體是貝伐珠單抗(bevazicumab)。本文描述的任何實施方案或其任何組合適用于本文描述的本發明的任何和所有方法。附圖簡述

圖1是在第O天(治療開始之前)比較患有乳腺癌的患者的總存活與血漿PlGF 水平的圖。
6
圖2是顯示響應貝伐珠單抗治療的血漿PlGF水平增加的圖。圖3是在貝伐珠單抗治療第14天比較患有乳腺癌的患者的總存活與血漿PlGF水平的圖。詳細描述除非另有說明，本發明的實施將使用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學的常規技術，其是本領域的技術之內的。此類技術在文獻中有詳細解釋，所述文獻諸如"分子克隆實驗室指南(Molecular Cloning =A Laboratory Manual)"，第二版(Sambrook 等，1989)；“寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis) “ (Μ· J. Gait，編輯，1984)； 〃動物細胞培養(Animal Cell Culture) “ (R. I. Freshney，編輯，1987)；〃 酶學中的方法(Methods in Enzymology)" (Academic Press, Inc.)；“現代分子生物學方案(Current Protocols in Molecular Biology) “ (F. M.Ausubel等，編輯，1987，和定期更新)；“PCR 聚合酶鏈反應(PCR :The Polymerase Chain Reaction) “，(Mullis 等，編輯，1994)。除非另有說明，本文所用的技術和科技術語具有與本發明所屬領域技術人員通常所知相同的含義。Singleton等，微生物和分子生物學字典(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)，第 2 版，J. ffiley&Sons(紐約，N. Y. 1994)和 March，高級有機化學反應、機制禾口結構(Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Mructure)，第 4 版，John ffiley&Sons (New York, N. Y. 1992)，向技術人員提供了本申請所用的許多術語的一般指導。在本文引用的所有參考文獻，包括專利申請和出版物，其全文通過引用并入本文。定義 術語“陣列”或“微陣列”，用于本文時，指可雜交的陣列元件(優選地為多核苷酸探針(例如，寡核苷酸))在基質上的有序排列。基質可以是固體基質如玻璃載玻片，或半固體基質如硝化纖維素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其任何變換。“靶序列”、“靶核酸”或“靶蛋白”用于本文中時，是目的多核苷酸或蛋白，需要對其檢測。一般而言，“模板”用于本文中時，是含有靶核苷酸序列的多核苷酸。在一些實例中， 術語“靶序列”、“模板DNA”、“模板多核苷酸”、“靶核酸”、“靶多核苷酸”及其變體可互換使用。“擴增”用于本文中時，一般指生成所需序列的多個拷貝的過程。“多個拷貝”意指至少2個拷貝。“拷貝”不必然意指與模板序列互補性或同一性的完美序列。例如，拷貝可以包括核苷酸類似物諸如脫氧肌苷，有意的序列改變(諸如通過引物引入的序列改變，其包括可與模板雜交但不互補的序列)，和/或在擴增過程中發生的序列錯誤。如果第一樣品中基因、基因產物(例如蛋白質或生物標志)的表達水平/量大于第二樣品中基因、基因產物(例如蛋白質或生物標志)的表達水平/量，則與第二樣品中的表達/量相比較，第一樣品中基因、蛋白或生物標志的表達/量高或增加。在一個實施方案中，第一樣品中基因、基因產物(例如蛋白質或生物標志)的表達水平/量的增加是至少大約 1. 5X, 1. 75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X 或 100X 的第二樣品中各個基因、基因產物(例如蛋白質或生物標志)的表達水平/量。如果第一樣品中基因、基因產物(例如蛋白質或生物標志)的表達水平/量小于第二樣品中基因、基因產物(例如蛋白質或生物標志)的表達水平/量，則與第二樣品中的表達/量相比較，第一樣品中基因、蛋白或生物標志的表達/量是低的或降低。在一個實施方案中，第一樣品中基因、基因產物(例如蛋白質或生物標志)的表達水平/量比第二樣品中各個基因、基因產物(例如蛋白質或生物標志)的表達水平/量低至少大約1.5X，1.75X， 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X 或 IOOX0表達水平/量可以基于本領域已知的任何適合的標準確定，包括但不限于mRNA， cDNA，蛋白質，蛋白質片段和/或基因拷貝數。表達水平/量可以定性和/或定量地確定。 在一個實施方案中，樣品針對測定的RNA或蛋白量的不同和所用RNA或蛋白樣品質量差異性進行標準化。此類標準化可以通過測量和引入某些標準化基因，包括公知的持家基因，諸如GAPDH的表達來完成。備選地，標準化可以基于全部測定的基因或其大子集的平均值或中值信號(全面標準化方法)。基于每種基因，患者腫瘤mRNA或蛋白的測量的標準化的量與參照組中存在的量比較。每個患者每個測試的腫瘤的各mRNA或蛋白的標準化的表達水平可以表示為參照組中測量的表達水平的百分比。待分析的具體患者樣品中測量的表達水平應該是該范圍內的一些百分點，其可以通過本領域中公知的方法來確定。“檢測”包括任何檢測方式，包括直接和間接檢測。術語“樣品”或“測試樣品”用于本文中時，指從目標受試者獲得或得到的組合物， 其包含意欲例如基于物理、生化、化學和/或生理特征表征和/或鑒定的細胞和/或其它分子實體。在一個實施方案中，該定義包括血液和生物來源的其它液體樣品，和組織樣品如活組織檢查樣本或組織培養物或來自其中的細胞。組織樣品的來源可以是來自新鮮、冷凍和/或保存的器官或組織樣品或活組織檢查樣品或抽吸物的實體組織；血液或任何血液成分；體液；和來自受試者妊娠或發育的任何時候的細胞，或血漿。樣品可在治療(例如癌癥治療)開始之前或治療(例如癌癥治療)開始之后從受試者獲得。樣品可在治療(例如癌癥治療)開始之后M小時、7天、10天、14天、觀天、42天或56天內獲得。術語“樣品”或“測試樣品”包括在獲得它們后已經以任何方式進行處理的生物學樣品，所述方式如通過用試劑處理，溶解，或富集某些成分，如蛋白或多核苷酸，或包埋在半固體或固體基質中用于切片目的。為了本文中的目的，組織樣品的“切片”意為組織樣品的單一部分或塊，例如自組織樣品切下的組織或細胞的薄切片。樣品包括，但不限于，原代或培養的細胞或細胞系，細胞上清液，細胞裂解物，血小板，血清，血漿，玻璃體液(vitreous fluid)，淋巴液，滑液，濾泡液，精液，羊膜液，乳，全血， 血液來源的細胞，尿液，腦脊液，唾液(saliva)，痰(sputum)，淚液，汗液，粘液，腫瘤裂解物，和組織培養基，組織提取物如勻化的組織，腫瘤組織，細胞提取物，及其組合。在一個實施方案中，所述樣品是臨床樣品。在另一個實施方案中，所述樣品用在診斷測定中。在一些實施方案中，所述樣品獲自原發或轉移腫瘤。組織活組織檢查通常用于獲得腫瘤組織的代表塊。備選地，腫瘤細胞可以以已知或被認為包含目的腫瘤細胞的組織或流體形式間接獲得。例如，肺癌病灶的樣品可以通過切除術、支氣管鏡檢、細針抽吸活檢 (fine needle aspiration)、支氣管刷檢(bronchial brushings)獲得,或來自痰、胸膜液或血液。在一個實施方案中，樣品在抗血管生成療法之前從受試者或患者獲得。在另一個實施方案中，樣品在VEGF拮抗劑療法之前從受試者或患者獲得。在另一個實施方案中，樣品在抗-VEGF抗體療法之前從受試者或患者獲得。在又一個實施方案中，樣品從進行至少一種VEGF拮抗劑療法治療的受試者或患者獲得。在一個實施方案中，樣品從至少一種抗-血管生成療法治療之后的受試者或患者獲得。在另一個實施方案中，樣品從進行至少一種抗-VEGF抗體治療的受試者或患者獲得。 在一些實施方案中，樣品在癌癥轉移之前從患者獲得。在某些實施方案中，樣品在癌癥已經轉移之后從患者獲得。“參照樣品”用于本文時，指用于比較目的的任何樣品、標準或水平。在一個實施方案中，參照樣品從相同受試者或患者的身體的健康和/或非患病部分(例如，組織或細胞) 獲得。在另一個實施方案中，參照樣品從相同受試者或患者的身體的未處理的組織和/或細胞獲得。在另一個實施方案中，參照樣品從不是受試者或患者的個體的身體的健康和/ 或未患病部分(例如組織或細胞)獲得。在又一個實施方案中，參照樣品從不是受試者或患者的個體的身體的未處理的組織和/或細胞部分獲得。在某些實施方案中，參照樣品是在與獲得測試樣品的時間不同的一個或多個時間點獲得的來自相同受試者或患者的單一樣品或組合的多個樣品。例如，參照樣品在比獲得測試樣品時更早的時間點從相同的受試者或患者獲得。如果參照樣品在癌癥的最初診斷過程中獲得，并且測試樣品隨后在癌癥變得有轉移性時獲得，此類參照樣品可以是有用的。在某些實施方案中，參照樣品包括從非-受試者或患者的一個或多個個體獲得的、在上述術語“樣品”下定義的所有類型的生物學樣品。在某些實施方案中，參照樣品從非-受試者或患者的患有血管生成病癥(例如，癌癥)的一個或多個個體獲得。在某些實施方案中，參照樣品是來自非-受試者或患者的一個或多個健康個體的合并的多個樣品。在某些實施方案中，參照樣品是來自非-受試者或患者的一個或多個患有疾病或病癥(例如，血管生成病癥如例如癌癥)的個體的合并的多個樣品。在某些實施方案中，參照樣品是來自非-受試者或患者的一個或多個個體的正常組織或合并的血漿或血清樣品的合并的RNA樣品。在某些實施方案中，參照樣品是來自非-受試者或患者的一個或多個患有疾病或病癥(例如，血管生成病癥，如例如癌癥)的個體的腫瘤組織或合并的血漿或血清樣品的合并的RNA樣品。“多核苷酸”或“核酸”，在本文交互使用，指任何長度的核苷酸的聚合物，并包括 DNA和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修飾的核苷酸或堿基和/或它們的類似物，或可以通過DNA或RNA聚合酶結合到聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包含修飾的核苷酸，如甲基化的核苷酸和它們的類似物。如果存在，可以在所述聚合物的裝配之前或之后，對核苷酸結構進行修飾。核苷酸序列可以被非核苷酸成分中斷。多核苷酸可在聚合后進一步修飾，如通過與標記成分綴合。其它類型的修飾包括，例如“帽”，用類似物取代一個或多個天然存在的核苷酸，核苷酸之間的修飾如例如具有不帶電荷的連接的那些 (例如膦酸甲酯，磷酸三酯，亞磷酰胺(phosphoamidates)，氨基甲酸酯等)，和具有帶電連接的那些(例如，硫代磷酸酯，二硫代硫酸酯等)，包含側結構部分(pendant moieties)的那些，如例如蛋白(例如，核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚L-賴氨酸等)，具有嵌入劑(例如， 吖啶、補骨脂素等)的那些，包含螯合劑(例如，金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等)的那些，包含烷化劑的那些，具有修飾的連接(例如，α異頭核酸等)的那些，以及多核苷酸的未修飾形式。此外，任何通常存在于糖中的羥基基團可以被例如膦酸酯基團(phosphonategroups)、磷酸酯基團(phosphate group)取代，被標準的保護基保護，或被激活以制備與另外的核苷酸的另外的連接物，或可以綴合于固體支持物。5’和3’末端OH可以被磷酸化，或被胺類或1-20個碳原子的有機加帽基團結構部分取代。還可以將其他的羥基衍生為標準的保護基。多核苷酸還可以包含核糖或脫氧核糖的類似形式，其通常是本領域中已知的，包括例如2’ -0-甲基-2’ -0-烯丙基_，2’ -氟-或2’ -疊氮基-核糖，碳環糖類似物，α -異頭糖，差向異構的糖如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、無環類似物， 和無堿基核苷酸類似物如甲基核苷。一個或多個磷酸二酯連接可以被備選的連接基團取代。這些備選的連接基團包括，但不限于其中磷酸酯被P (O)S ( “硫酯(thi0ate)”)，P(S) S ( “二硫酯(dithioate)，，)，(O)NR 2 ( “酰胺化物(amidate) ”)，P (0) R，P (0) OR，，CO 或 CH 2( "formacetal")取代的實施方案，其中每個R或R’獨立地是H或是任選包含醚(一0-) 連接的取代或未取代的烷基(1-20C)、芳基、烯基、環烷基、環烯基或araldyl。在多核苷酸中不是所有的連接都需要是相同的。前面的描述可應用于本文提及的所有的多核苷酸，包括 RNA 禾口 DNA。“寡核苷酸”用于本文時，一般指短的、一般為單鏈的，一般為合成的多核苷酸，其一般，但不是必需地少于約200個核苷酸的長度。術語“寡核苷酸”和“多核苷酸”不相互排斥。上面關于多核苷酸的描述等同地并且充分地可應用于寡核苷酸。“引物”通常為短的單鏈多核苷酸，一般具有游離的3' -OH基團，其通過與靶序列雜交與可能存在于目的樣品中的靶標結合，并且隨后促進與該靶標互補的多核苷酸的聚術語“生物標志”用于本文時一般指，這樣的分子，其包括，基因、蛋白、碳水化合物結構或糖脂，所述分子在哺乳動物組織或細胞中或在其上的表達可以通過標準方法(或本文公開的方法)檢測，并且是對哺乳動物細胞或組織對基于抑制血管發生的治療方案的敏感性的預測、診斷和/或預后，所述基于抑制血管發生的治療方案，例如抗-血管生成劑如 VEGF-特異性抑制劑。任選地，確定所述生物標志的表達高于針對對照/參照組織或細胞樣品觀察到的。此類生物標志的表達可以利用高通量多種免疫測定法諸如可商購自Rules Based Medicine, Inc.或Meso Scale Discovery的那些來確定。生物標志的表達還可以利用例如PCR或FACS測定，免疫組織化學測定或基于基因芯片的測定來確定。所述“組織或細胞樣品”意指從受試者或患者的組織獲得的細胞集合。組織或細胞樣品的來源可以是來自新鮮、冷凍和/或保存的器官或組織樣品或活組織檢查樣品或抽吸物的實體組織；血液或任何血液成分；體液諸如腦脊液、羊水、腹水或間質液；來自于受試者懷孕或發育的任何時間的細胞或血漿。組織樣品還可以是原代或培養的細胞或細胞系。 任選地，組織或細胞樣品從癌性組織/器官獲得。組織樣品可含有本質上與組織不天然混合的化合物如防腐劑、抗凝劑、緩沖劑、固定劑、營養素、抗生素等等。為本文的目的，組織樣品的“切片”意指組織樣品的單個部分或片，例如從組織樣品切下的組織或細胞的薄片。所述“相關(correlate) ”或“相關的(correlating) ”意味著以任何方式比較第一分析或流程的性能和/或結果與第二分析或流程的性能和/或結果。例如，可以使用第一分析或流程的結果進行第二流程和/或可以使用第一分析或流程的結果來確定是否應該進行第二分析或流程。關于基因表達分析或流程的實施方案，可以使用基因表達分析或流程的結果來確定是否應該進行具體的治療方案。
詞語“標記”當用于本文時，指直接或間接與試劑如核酸探針或抗體綴合或融合并且有利于檢測與其綴合或融合的試劑的化合物或組合物。所述標記本身可以是可檢測的 (例如放射性同位素標記或熒光標記)，或在酶促標記的情形中，可以催化可檢測的底物化合物或組合物的化學變化。“天然序列”多肽包含與來自自然的多肽具有相同的氨基酸序列的多肽。因此，天然序列多肽可以具有來自任何哺乳動物的天然存在的多肽的氨基酸序列。所述天然序列多肽可以從自然分離或可以通過重組或合成方式產生。術語“天然序列”多肽具體地包括多肽的天然存在的截短或分泌形式(例如，細胞外結構域序列)，天然存在的變體形式(例如， 可變剪接形式)和多肽的天然存在的等位基因變體。多肽“變體”指與天然序列多肽具有至少約80%氨基酸序列同一性的生物學活性多肽。此類變體包括例如其中在多肽的N末端或C末端添加或刪除一個或多個氨基酸殘基的多肽。通常，變體將會與天然序列多肽具有至少約80%氨基酸序列同一性，更優選至少約 90%氨基酸序列同一性，和甚至更優選至少約95%氨基酸序列同一性。術語“VEGF”或“VEGF-A”用于指165個氨基酸的人血管內皮細胞生長因子及相關的121個、189個和206個氨基酸的人血管內皮細胞生長因子，如Leung等，科學(kience)， 246 :1306(1989)；和 Houck 等，分子內分泌學(Mol. Endocrin.)，5 1806 (1991)所記載的， 及其天然存在等位基因形式和加工形式。VEGF-A是包括VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、 VEGF-F和PlGF的基因家族的一部分。VEGF-A主要結合兩種高親合力受體酪氨酸激酶，即 VEGFR-I (Flt-I)和VEGFR-2 (Flk-1/KDR)，后者是VEGF-A血管內皮細胞有絲分裂信號的主要遞質。另外，已經鑒定出神經氈蛋白-Kneuropilin-l)作為肝素-結合VEGF-A同種型受體，并可能在血管發育中發揮作用。術語“VEGF”或“VEGF-A”還指來自非人物種諸如小鼠、大鼠或靈長類動物的VEGF。有時，來自特定物種的VEGF用如下術語表示，諸如hVEGF表示人VEGF或mVEGF表示鼠VEGF。術語“VEGF”還用于指包含165個氨基酸的人血管內皮細胞生長因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的多肽截短形式或片段。任何所述VEGF 形式的參考符號在本申請中，例如，通過“VEGF(8-109)，，，"VEGF(1-109) ”或"VEGF165”來識別。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示的編號。例如，截短的天然 VEGF中的第17位氨基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF具有與天然VEGF相當的對KDR和Flt-I受體的結合親合力。術語“VEGF”或“VEGF-A”用于本文中時，指165個氨基酸的人血管內皮細胞生長因子及相關的121個、189個和206個氨基酸的人血管內皮細胞生長因子，如Leung等(1989) 科學(Science)，246 :1306 ；和 Houck 等(1991)分子內分泌學(Mol. Endocrin. ),5 :1806 所記載的，及其天然存在等位基因形式和加工形式。術語“VEGF”還指來自非人物種諸如小鼠、 大鼠或靈長類動物的VEGF。有時，來自特定物種的VEGF用如下術語表示，諸如hVEGF表示人VEGF，mVEGF表示鼠VEGF，等。術語“VEGF”還用于指包含165個氨基酸的人血管內皮細胞生長因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的多肽截短形式。任何所述VEGF形式的參考符號在本申請中，例如，通過“VEGF(8-109)，，，"VEGF(1-109) ”或"VEGF165”來識別。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示的編號。例如，截短的天然VEGF中的第17位氨基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF 具有與天然VEGF相當的對KDR和Flt-I受體的結合親合力。
“ VEGF生物學活性”包括與任何VEGF受體的結合或任何VEGF信號傳導活性如調節正常和異常血管生成和血管發生(Ferrara和Davis-Smyth (1997)內分泌綜述(Endocrine Rev.) 18 4-25 ；Ferrara(1999)分子醫學雜志(J. Mol. Med.) 77 :527-543)；促進胚胎血管發生和血管生成(Carmeliet 等，(1996)自然(Nature) 380 :435-439 ;Ferrara 等，(1996) 自然(Nature) 380 :439-442)；和調節雌性生殖道的周期性血管增殖，以及骨生長和軟骨形成(Ferrara 等，(1998)自然醫學(Nature Med.) 4 :336-340 ;Gerber 等，(1999)自然醫學 (Nature Med.) 5 =623-628) 0除了作為血管生成和血管發生中的血管生成因子之外，VEGF 還作為多效生長因子在其它生理過程中顯示了多種生物學效應，如內皮細胞存活，血管通透性和血管舒張，單核細胞趨化作用和鈣流入Perrara和Davis-Smyth (1997)，見上文，和 Cebe-Suarez 等，細胞分子生命科學(Cell. Mol. Life. Sci). 63 :601-615(2006)。而且，最近的研究已經報道了 VEGF對于數種非內皮細胞類型，如視網膜色素上皮細胞、胰管細胞和許旺細胞的促有絲分裂作用。Guerrin等，(1995)細胞生理學雜志(J. Cell Physiol.) 164 385-394 ；Oberg-Welsh 等(1997).分子細胞內分泌學(Mol. Cell. Endocrinol). 126 125-132 ；Sondell 等，神經科學雜志(J. Neurosci.) 19 :5731-5740 (1999)。"VEGF拮抗劑”或“VEGF特異性拮抗劑”指這樣的分子，其能夠結合VEGF，降低VEGF 表達水平，或中和、阻斷、抑制、消除、降低或干擾VEGF生物學活性，包括但不僅限于VEGF與一種或多種VEGF受體的結合，和VEGF介導的血管發生和內皮細胞存活或增殖。本發明的方法中包括的有用的VEGF-特異性拮抗劑是特異性結合VEGF的多肽，抗VEGF抗體及其抗原結合片段、特異性結合VEGF由此使其隔絕與一種或多種受體結合的受體分子及衍生物、 融合蛋白(例如，VEGF-iTrap(Regeneron))和 VEGFm-gelonin (Peregrine)。VEGF-特異性拮抗劑也包括VEGF多肽的拮抗劑變體，至少與編碼VEGF多肽的核酸分子的片段互補的反義核堿基(nucleobase)寡聚物；至少與編碼VEGF多肽的核酸分子的片段互補的小RNA ； 靶向VEGF的核酶；針對VEGF的肽體(ρ印tibody)；及VEGF適配體。VEGF-特異性拮抗劑也包括結合VEGF并能夠阻斷、抑制、消除、降低或干擾VEGF生物學活性的非肽小分子。因此，術語“VEGF活性”特別包括VEGF介導的VEGF生物學活性。在某些實施方案中，VEGF拮抗劑將VEGF的表達水平或生物學活性降低或抑制至少10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、 70^^80^^90%或更多。在一些實施方案中，通過VEGF-特異性拮抗劑抑制的VEGF是 VEGF (8-109)，VEGF (1-109)，或 VEGF165。“抗VEGF抗體”是以足夠親合力和特異性結合VEGF的抗體。在某些實施方案中，所選擇的抗體通常具有針對VEGF的足夠的結合親合力，例如所述抗體可以以介于IOOnM-IpM 之間的Kd值結合hVEGF。抗體親合力可以通過例如基于表面等離振子共振的測定法(諸如BIAcore測定法，如PCT申請公開號W02005/012359所記載的)；酶聯免疫吸附測定法 (ELISA)；和競爭測定法(例如RIA)來測定。在某些實施方案中，抗VEGF抗體可以用作靶向和干擾其中涉及VEGF活性的疾病或病癥的治療劑。而且，所述抗體可以進行其它生物學活性測定法，例如為了評估其作為治療劑的效力。此類測定法是本領域已知的，而且依賴于所述抗體的靶抗原和預期用途。實例包括HUVEC抑制測定法；腫瘤細胞生長抑制測定法(如例如W089/06692所記載的)；抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)和補體介導的細胞毒性(CDC)測定法(美國專利5，500, 362)； 及激動性活性或造血測定法(參見W095/2706》。抗VEGF抗體通常不會結合其它VEGF同系物，諸如VEGF-B或VEGF-C，也不結合其它生長因子，諸如P1GF、PDGF或bFGF。在一個實施方案中，抗VEGF抗體是與雜交瘤ATCC HB 10709所生成的單克隆抗VEGF抗體A4. 6. 1結合相同表位的單克隆抗體。在另一個實施方案中，抗VEGF抗體是根據I^esta等(1997)癌癥研究(Cancer Res.) 57 :4593-4599產生的重組人源化抗-VEGF單克隆抗體，包括但不限于稱為“貝伐珠單抗(BV ；AVASTIN )，，的抗體。抗-VEGF抗體“貝伐珠單抗(BV) ”，也稱為“rhuMAb VEGF"或“AVASTIN ”，是根據 I^esta等(1997)癌癥研究(Cancer Res. )57 :4593-4599產生的重組人源化抗-VEGF單克隆抗體。其包含突變的人IgGl構架區和來自鼠抗hVEGF單克隆抗體A. 4. 6. 1 (其阻斷人VEGF結合其受體)的抗原結合互補性決定區。貝伐珠單抗大約93%的氨基酸序列(包括大部分構架區)來自人IgGl，而大約7%的序列來自鼠抗體A4. 6.1。貝伐珠單抗具有約 149，000道爾頓的分子量，而且是糖基化的。貝伐珠單抗和其它人源化抗VEGF抗體進一步記載于2005年2月沈日授權的美國專利號6，884，879，將其全部內容通過引用明確并入本文。另外優選的抗體包括G6或B20系列抗體(例如G6-31、B20-4. 1)，如PCT申請公開號W02005/012359所描述的。另外優選的抗體參見美國專利號7，060，269，6，582，959， 6，703，020 ；6，054，297 ；W098/45332 ；W096/30046 ；W094/10202 ；EP0666868B1 ；美國專利申請公開號 2006009360,20050186208,20030206899,20030190317,20030203409 和 20050112126 ；及 Popkov 等，免疫學方法雜志(Journal of Immunological Methods) 288 149-164 (2004)。其它優選的抗體包括結合人VEGF上的功能表位的那些，該表位包含殘基 F17, M18, D19, Y21, Y25, Q89, 191，K101, E103 禾口 C104，或備選地包含殘基 F17，Y21, Q22, Y25, D63, 183 和 Q89。術語“抗體”以最廣義使用，具體地涵蓋單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、及抗體片段，只要它們展現出期望的生物學活性。“阻斷性”抗體或抗體“拮抗劑”指抑制或降低其所結合的抗原的生物學活性的抗體。例如，VEGF特異性拮抗性抗體結合VEGF并抑制VEGF誘導血管內皮細胞增殖的能力。 優選的阻斷性抗體或拮抗性抗體完全地抑制抗原的生物學活性。除非另有說明，本說明書全文中使用的表述“多價抗體”表示包含三個或更多抗原結合位點的抗體。多價抗體優選地被改造成具有三個或更多抗原結合位點，而且一般不是天然序列IgM或IgA抗體。“Fv”片段是包含完整抗原識別和結合位點的抗體片段。該區由處于緊密結合的一個重鏈和一個輕鏈可變結構域的二聚體組成，所述結合可以本質上是共價的，例如在scFv 中。在該構型中，各可變結構域的三個CDR相互作用以定義二聚體表面上的抗原結合位點。總體上，6個CDR或其亞組將抗原結合特異性賦予抗體。然而，甚至單可變結構域 (或僅包括3個特異于抗原的CDR的Fv的一半)具有識別和結合抗原的能力，盡管通常處于低于完整結合位點的親合力。術語“單克隆抗體”在用于本文時指從一群基本上同質的抗體獲得的抗體，所述同質的抗體即構成群體的各個抗體是相同的，除了可以以極小量存在的可能的天然存在突變外。單克隆抗體是高度特異性的，針對單個抗原位點。此外，與典型地包含針對不同決定簇 (表位)的不同抗體的常規(多克隆)抗體制備物不同，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。修飾語“單克隆”表明抗體從基本上同質的抗體群獲得的特征，不應解釋為要求通過任何特定方法來生產抗體。例如，依照本發明使用的單克隆抗體可通過由Kohler等，自然(Nature) 256 :495(197 首先描述的雜交瘤法制造，或可通過重組DNA法(參見例如美國專利號4，816，567)制造。“單克隆抗體”也可使用例如Clackson等，自然(Nature) 352 624-628(1991)和 Marks 等，分子生物學雜志(J. Mol. Biol.) 222 :581-597 (1991)中描述的技術從噬菌體抗體文庫中分離。單克隆抗體在本文中特別地包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與來自特定物種或屬于特定抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源， 而鏈的剩余部分與來自另一物種或屬于另一抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現出期望的生物學活性(美國專利No. 4，816，567 和 Morrison 等，美國國家科學院學報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855 (1984))。非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式指最低限度包含來自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在大多數情況下，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體的高變區殘基用具有期望特異性、親合力和能力的非人物種(供體抗體)(諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動物)的高變區的殘基替換。在有些情況中，將人免疫球蛋白的Fv 構架區(FR)殘基用相應的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體中或在供體抗體中沒有發現的殘基。進行這些修飾來進一步改進抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含基本上全部的至少一個、典型地兩個可變結構域，其中所有或基本上所有高變環對應于非人免疫球蛋白的高變環，且所有或基本上所有FR區是人免疫球蛋白序列的FR區。人源化抗體任選還將包含至少部分的免疫球蛋白恒定區(Fe)，典型地是人免疫球蛋白的。更多細節參見 Jones 等，自然(Nature) 321 :522-525(1986) ；Riechmann 等， 自然(Nature) 332 :323-329(1988)；及 Presta，現代結構生物學觀點(Curr. Op. Struct. Biol.) 2 :593-596(1992)。“人抗體”指這樣的抗體，其具有與由人生成的抗體的氨基酸序列對應的氨基酸序列和/或使用本文所公開的用于生成人抗體的任何技術產生。人抗體的這種定義明確排除包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。人抗體可使用本領域已知的多種技術來產生。在一個實施方案中，人抗體選自噬菌體文庫，其中該噬菌體文庫表達人抗體(Vaughan等，自然生物技術(Nature Biotechnology) 14 :309-314(1996) ；Sheets 等，國家科學院學報(Proc. Natl. Acad. Sci. )95 :6157-6162(1998) ；Hoogenboom 和 Winter，分子生物學雜志(J. Mol. Biol.) 227 381 (1991) ；Marks 等，分子生物學雜志(J. Mol. Biol.) 222 :581 (1991))。人抗體還可通過將人免疫球蛋白基因座引入轉基因動物來產生，所述轉基因動物例如是其中內源免疫球蛋白基因已經部分或完全滅活的小鼠。在受到激發時，觀察到人抗體產生，它在所有方面與在人中看到的極其相似，包括基因重排、裝配和抗體所有組成成分。這種方法記載于例如美國專利號5，545，807 ；5，545，806 ；5，569，825 ；5，625，126 ；5，633，425 ；5，661，016，及以下科學出版物中:Marks 等，生物 / 技術(Bio/Technology) 10 :779-783(1992) ；Lonberg 等，自然(Nature)368 :856-859(1994) ；Morrison,自然(Nature)368 :812-13(1994)； Fishwild 等，自然生物技術(Nature Biotechnology) 14 :845-51 (1996) ；Neuberger,自然生物技術(Nature Biotechnology) 14 826 (1996) ；Lonberg 和 Huszar，國際免疫學綜述 (Intern. Rev. Immunol.) 13 :65-93 (1995)。備選地，人抗體可通過產生針對靶抗原的抗體的
14人B淋巴細胞的永生化來制備(此類B淋巴細胞可從個體回收，或者可在體外免疫)。參見例如 Cole 等，單克隆抗體和癌癥治療(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy), Alan R. Liss，p. 77(1985) ；Boerner 等，免疫學雜志(J. Immunol.) 147(1) :86-95(1991)；及美國專利號5，750，373。“分離的”多肽或“分離的”抗體指已經鑒定且與其天然環境的成分分離和/或從其回收的多肽或抗體。其天然環境的污染性成分指將會干擾該多肽或抗體診斷或治療用途的物質，可包括酶、激素、和其它蛋白質性質或非蛋白質性質的溶質。在優選實施方案中，將多肽或抗體純化至(1)根據Lowry法的測定，多肽或抗體以重量計超過95%，和最優選地以重量計超過99%，(2)足以通過使用轉杯式測序儀獲得至少15個殘基的N-末端或內部氨基酸序列的程度，或C3)根據使用考馬斯藍或優選地銀染色的還原性或非還原性條件下的 SDS-PAGE，達到同質。既然多肽的天然環境的至少一種成分不會存在，那么分離的多肽或抗體包括重組細胞內的原位多肽或抗體。然而，分離的多肽或抗體通常通過至少一個純化步驟來制備。用于本文時，“治療(treatment)”指在嘗試改變待治療的個體或細胞的天然進程中的臨床介入，并且可以為了預防或在臨床病理學的進程中進行。治療的理想效果包括防止疾病發生或復發，緩和癥狀，消除疾病的任何直接或間接病理學后果，減少疾病進展速率，改善或減輕疾病狀態，和癥狀緩解或改善的預后。在一些實施方案中，在試圖延緩疾病或病癥的發展中本發明的方法和組合物是有用的。“有效量”指在需要的劑量和時間階段，有效獲得需要的治療或預防效果的量。治療劑的“治療有效量”可以根據因素諸如疾病階段，個體年齡、性別、和體重，和抗體在個體內引起所需反應的能力而變化。治療有效量也是這樣的量，其中治療劑的任何毒性或有害作用小于其治療有益效果。“預防有效量”是指在需要的劑量和時間階段，有效獲得需要的預防效果的量。典型地，但不是必需地，由于預防劑量在疾病發生之前或疾病的早期階段用于受試者，因此預防有效量將小于治療有效量。在癌前、良性腫瘤、早期或晚期腫瘤的情形中，血管生成抑制劑的治療有效量可以減少癌細胞的數量；減少原發腫瘤大小；抑制(即， 在一定程度上減緩并且優選地阻止)癌細胞浸潤到周圍器官中；抑制(即，在一定程度上減緩并且優選地阻止)腫瘤轉移；在一定程度上，抑制腫瘤生長；和/或在一定程度上減輕與病癥相關的一種或多種癥狀。根據藥物可阻止現有癌細胞生長和/或殺死現有癌細胞的程度，它可以是細胞抑制性的和/或細胞毒性的。對于癌癥療法，體內功效可以通過例如評估存活持續時間、距疾病進展的時間(TTP)、反應率(RR)、反應持續時間、和/或生活質量來測量。“短暫無進展存活”是指第一次腫瘤評估的時間的進展。取決于癌癥或腫瘤的類型，第一次腫瘤評估的時間發生在治療起始之后的大約4，3，2或1個月。第一次腫瘤評估的時機取決于具體疾病進展有多快。在一個實施方案中，腎癌(renal cancer)的第一次腫瘤評估的時間是抗癌療法開始之后的56天。術語“癌癥”和“癌性”指或描述哺乳動物中特征典型地為細胞生長不受調節的生理病況。包括在這種定義中的是良性和惡性癌癥。癌癥的實例包括但不限于癌瘤(carcinoma)、淋巴瘤(lymphoma)、母細胞瘤(blastoma)、肉瘤(sarcoma)、禾口白血病(leukemia)。此類癌癥的更具體實例包括鱗狀細胞癌(squamous cell cancer)、肺癌(lung cancer)(包括小細胞肺癌(small-cell lung cancer)、非小細胞肺癌 (non-small cell lung cancer)、月市的腺癌(adenocarcinoma of the lung)禾口月市的售舞癌(squamous carcinoma of the lung)) > 月復月莫癌(cancer of the peritoneum) > M M M ^ (hepatocellular cancer)> 胃 (gastric or stomach cancer)(^ll f舌胃腸癌(gastrointestinal cancer))、胰腺癌(pancreatic cancer)、成膠質細胞瘤 (glioblastoma)、宮頸癌(cervical cancer)、卵巢癌(ovarian cancer)、月干癌(liver cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、肝瘤(h 印 atoma)、乳腺癌(breast cancer)、結腸癌 (colon cancer)、結腸直腸癌(colorectal cancer)、子宮內膜癌或子宮癌(endometrial or uterine carcinoma)、唾液腺癌(salivary gland carcinoma)、腎癌(kidney or renal cancer)、月干· (liver cancer)、|1]"歹(prostate cancer)、夕卜陰· (vulval cancer) > 甲狀腺癌(thyroid cancer)、月干癌(hepatic carcinoma)禾口多種類型的頭頸癌(head and neck cancer)，以及B細胞淋巴瘤(B-cell lymphoma)(包括低度/濾泡性非霍奇金淋巴瘤(low grade/follicular non-Hodgkin‘ s lymphoma) (NHL)；小淋巴細胞性(SL) NHL (small Iymphocytic(SL)NHL)；中度 / 濾泡 f生 NHL (intermediate grade/fol licular NHL)；中度彌漫性 NHL (intermediate grade diffuse NHL)、高度成免疫細胞性 NHL (high grade immunoblastic NHL)；高度成淋巴細胞個生 NHL (high grade lymphoblastic NHL)； 高度小無核裂細胞性 NHL(high grade small non-cleaved cell NHL);巨塊型(bulky disease)NHL ；套細胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma) ；AIDS 相關淋巴瘤(AIDS-related lymphoma)；和瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥(Waldenstrom' s Macroglobulinemia))； 慢性淋巴細胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia) (CLL)；急性成淋巴細胞個生白 IfiI _ (acute lymphoblastic leukemia) (ALL) ； € _ Ifi 個生白 in _ (Hairy cell leukemia)；慢性成髓細胞性白血病(chronic myeloblastic leukemia)；和移植后淋巴 ±曾殖個生病癥(post-transplant lymphoproliferative disorder) (PTLD)；以及與疲疲病 (phakomatoses)、水腫(edema)(諸如與腦瘤有關)和梅格斯氏綜合征(Meigs' syndrome) 相關的異常血管增殖。“受試者”或“患者”的意思是哺乳動物，包括，但不限于人或非人哺乳動物，如牛、 馬、犬、羊或貓。優選地，所述受試者或患者是人。術語“抗癌療法”指用于治療癌癥的療法。抗癌治療劑的實例包括，但不僅限于，例如，化療劑、生長抑制劑、細胞毒性試劑、放射療法中使用的試劑、抗血管生成劑、細胞凋亡試劑、抗微管蛋白試劑、和其他用于治療癌癥的試劑，諸如抗-HER-2抗體、抗-CD20抗體、表皮生長因子受體(EGFR)拮抗劑(例如，酪氨酸激酶抑制劑)、HER1/EGFR抑制劑(例如，厄洛替尼(erlotinib) (Tarceva )、血小板衍生的生長因子抑制劑(例如，GleeveC (甲磺酸伊馬替尼(Imatinib Mesylate)))、C0X_2抑制劑(例如，塞來考昔(celecoxib))、干擾素、 細胞因子、與下列靶標 VEGF、ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR- β、BlyS、APRIL、BCMA 或 VEGF 受體中的一種或多種結合的拮抗劑(例如，中和抗體)、TRAIL/Apo2、及其它生物活性和有機化學劑等。本發明還包括它們的組合。“血管生成因子或試劑”指參與刺激血管發育，例如促進血管發生、內皮細胞生長、血管穩定性和/或血管發生等的生長因子或其受體。例如，血管生成因子包括但不限于例如 VEGF 和 VEGF 家族的成員和其受體(VEGF-B，VEGF-C, VEGF-D, VEGFRl, VEGFR2和VEGFR3)、P1GF、PDGF家族、成纖維細胞生長因子家族(FGF)、TIE配體(血管生成素 (angiopoietins)、ANGPT 1、ANGPT2)、！ Ε1、ΤΙΕ2、肝配蛋白、Βν8、δ 樣配體 4(DLL4)、Del_l、 成纖維細胞生長因子酸性(aFGF)和堿性(bFGF)、FGF4、FGF9、BMP9、BMP10、Follistatin、 粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、GM-CSF、肝細胞生長因子(HGF)/散射因子(SF)、白介素-8(IL-8)、CXCL12、來普汀(L 印 tin)、中期因子(Midkine)、神經氈蛋白(neuropilins)、 NRPU NRP2、胎盤生長因子、血小板衍生的內皮細胞生長因子(PD-ECGF)、血小板衍生的生長因子、特別是 PDGF-BB、PDGFR- α、或 PDGFR-β、多營養因子(PTN)、Progranulin、增殖蛋白Troliferin)、轉化生長因子-a (TGF-α )、轉化生長因子-β (TGF-β )、腫瘤壞死因子- a (TNF- α ), Alkl, CXCR4, NotchU Notch4, Sema3A, Sema3C, Sema3F, Robo4 等。其還包括促進血管發生的因子，諸如ESMl和基底膜蛋白聚糖(Perlecan)。它還包括加速傷口愈合的因子，諸如生長激素、胰島素樣生長因子-I (IGF-I)、VIGF、表皮生長因子(EGF)、EGF-樣結構域 7(EGF-like domain, multiple 7 (EGFL7)) (EGFL7)、CTGF 及其家族成員、及 TGF-α 和 TGF- β。參見例如 Klagsbrun 和 D，Amore (1991)，生理學年評(Annu. Rev. Physiol.) 53 217-39 ;Streit 禾口 Detmar (2003)，致癌基因(Oncogene) 22 :3172-3179 ;Ferrara 禾口 Alitalo (1999)，自然醫學(Nature Medicine) 5 (12 :1359-1364 ；Tonini 等(200 ，致癌基因(Oncogene) 22 :6549-6556 (例如列舉已知血管生成因子的表1)；和&ito Q003)，國際臨床腫瘤學雜志(Int. J. Clin. Oncol. )8 :200_206。 “抗血管生成劑”、“血管生成抑制劑”、“抗-血管發生劑”或“血管發生抑制劑”指直接或是間接抑制血管發生、血管生成、或不想要的血管通透性的小分子量物質、多核苷酸 (包括，例如，抑制性RNA(RNAi或siRNA))、多肽、分離的蛋白質、重組蛋白、抗體、或其綴合物或融合蛋白。應該理解抗血管生成劑包括結合和阻斷血管生成因子或其受體的血管生成活性的那些試劑。例如，抗血管生成劑是上文定義的血管生成劑的抗體或其它拮抗劑， 例如VEGF-A的抗體或VEGF-A受體(例如，KDR受體或Flt-I受體)的抗體、抗PDGFR抑制劑(例如，Gleevec 甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate))、阻斷VEGF受體信號傳導的小分子(例如 PTK787/3(2284、SU6668、SUTENT /SUl 1248 (蘋果酸舒尼替尼(sunitinib malate))、AMG706、或例如國際專利申請WO 2004/113304中所述的那些)。抗-血管生成劑還包括但不限于下述試劑VEGF抑制劑如VEGF-特異性拮抗劑，EGF抑制劑，EGFR Φ ^Ll Erbitux (西妥昔單抗(cetuximab), ImClone Systems, Inc.，Branchburg, N. J.), Vectibix (中白尼單抗(panitumumab)，Amgen, Thousand Oaks, CA)， TIE2 抑制劑，IGFlR抑制劑，COX-II (環加氧酶II)抑制劑，MMP-2 (基質-金屬蛋白酶2)抑制劑， 和MMP-9 (基質-金屬蛋白酶9)抑制劑，CP-547, 632 (Pfizer Inc.(輝瑞公司)，NY, USA)， 阿昔替尼(Axitinib) (Pfizer Inc.(輝瑞公司)；AG-013736)，ZD-6474(AstraZeneca), AEE788 (Novartis)， AZD-2171)， VEGF Trap (Regeneron/Aventis)，^ftkiiM (Vatalanib) (也稱為 PTK-787, ZK-222584 :Novartis&Schering A G)，Macugen (培加他尼八鈉 (pegaptanib octasodium),NX-1838,EYE-OOl,Pfzer Inc.(輝瑞公司)/Gilead/Eyetech)， IM862 (Cytran Inc. of Kirkland, Wash.,美國)；禾口 angiozyme,來自 Ribozyme (Boulder, Colo.)的合成的核酶和Chiron (Emeryville，Calif.)及其組合。其他血管生成抑制劑包括血小板反應蛋白1，血小板反應蛋白2，膠原蛋白IV和膠原蛋白XVIII。VEGF抑制劑公開在美國專利號6，534，524和6，235，764中，為所有目的將二者全文并入本文。抗-血管生成劑還包括天然血管發生抑制劑，例如制管張素(angiostatin)、內皮生長抑素(endostatin) 等。參見例如 Klagsbrun 和 D，Amore (1991)生理學年評(Annu. Rev. Physiol.) 53 :217-39 ； Streit和Detmar (2003)致癌基因(Oncogene) 22 :3172-3179 (例如列舉惡性黑素瘤中抗血管生成療法的表 3) ；Ferrara 和 Alitalo (1999)自然藥物(Nature Medicine) 5 (12) 1359-1364 Jonini等(2003)致癌基因(Oncogene) 22 :6549-6556 (例如列舉已知抗血管生成因子的表2)；及Sato (2003)，國際臨床腫瘤學雜志(Int. J. Clin. Oncol. )8 :200-206(例如列舉臨床試驗中所使用的抗血管生成劑的表1)。術語“抗-血管生成療法”指有效用于抑制血管生成的療法，所述療法包括施用抗血管生成劑。本文所用的術語“細胞毒性試劑”指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞破壞的物質。該術語意圖包括放射性同位素(例如，Im>I125>Y90和Re186)、化療劑和毒素，如細菌、 真菌、植物或動物來源的酶活性毒素或其片段。“化療劑”是用于治療癌癥的化合物。化療劑的實例包括用于治療癌癥的化合物。化療劑的實例包括烷基化試劑，如塞替哌(thiot印a)和CYTOXAN 環磷酰胺(cyclophosphamide)；烷基磺酸酯(alkyl sulfonates)如白消安(busulfan)， 英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；吖丙啶類(aziridines)如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和烏瑞替哌(uredopa)；乙撐亞胺類(ethylenimines)和甲基蜜胺類(methylamelamines)， 包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三亞乙基磷酰胺 (triethylenephosphoramide)、三乙烯硫代憐酸胺(triethylenethiophosphoramide) 和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine)；聚乙酸類(acetogenins)(特別是布拉他辛 (bullatacin)禾口布拉他辛麗(bullatacinone))；喜積 喊(camptothecin)(包括合成的類似物托泊替康(topotecan))；苔蘚抑素(bryostatin) ；callystatin ；CC_1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；隱藻素類(cryptophycinsM特別是隱藻素1和隱藻素8)；多拉司他汀 (dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成的類似物、KW-2189 和 CB1-TM1)； jt 1f S (eleutherobin) ；pancratistatin ； ftl fe it 王古月 Il (sarcodictyin) ； · til i (spongistatin)；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷酉先胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環磷酉先胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法倉(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽留醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亞硝基脲類(nitrosureas)如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(Iomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素如烯二炔類(enediyne)抗生素(例如加利車霉素(calicheamicin)，尤其是加利車霉素Y II和加利車霉素 0 11(參見例如々81^^，Chem. Intl. Ed. Engl. 33 :183-186(1994))；烯二炔蒽環類抗生素 (dynemicin)，包括烯二炔蒽環類抗生素A; 二膦酸鹽類(bisphosphonates)，諸如氯膦酸鹽(clodronate) ;±矣其j 波霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)生色團和相關色素蛋白烯二炔類抗生素生色團)、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放線菌素(actinomycin)、蒽霉素(authramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素 (bleomycins) > 放線菌素 C (cactinomycin)、carabicin、洋紅霉素(carminomycin)、 嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放線菌素 D(dactinomycin)、 柔紅霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸 (6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、ADRIAMYCIN 多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉代多柔比星(morpho 1 ino-doxorubicin)、氛基嗎琳代多柔比星(cyanomorpho 1 ino-doxorubicin)、 2-吡咯啉-多柔比星 Q-pyrrolino-doxorubicin)和脫氧多柔比星(deoxydoxorubicin))、 表柔比星(印irubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、馬塞羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素類(mitomycins)如絲裂霉素C、麥考酚酸(mycophenolic acid)、諾拉霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycins)、培洛霉素(ρ印lomycin)、 紫菜霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑霉素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結核菌素 (tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物如甲氨喋呤(methotrexate)和5_氟尿嘧啶(5_f luorouracil) (5-FU)；葉酸類似物如二甲葉酸(denopterin)、甲氨喋呤、喋羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)； 嘌呤類似物如氟達拉濱(fludarabine)、6_巰嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤 (thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物如安西他濱(ancitabine)、 阿扎胞苷(azacitidine)、6_ 氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(f loxuridine)；雄激素類(androgens)，諸如卡魯睪酮 (calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄酉享(epitiostanol)、 美雄燒(mepitiostane)、辜內酉旨(testolactone)；抗腎上腺藥(anti-adrenals)如氨魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補償劑如亞葉酸(frolinic acid)；醋葡醛內酯(aceglatone)；羥醛磷酰胺配糖(aldophosphamide glycoside) ；5_ 氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿啼唆(eniluracil)；安口丫唆(amsacrine) ；bestrabucil ；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate) ；defofamine ；秋水仙胺(demecolcine)；地口丫酉昆(diaziquone)； elfornithine ；依利醋銨(elliptinium acetate) ；epothilone ；依托格魯(etoglucid)； 硝酸鎵(gallium nitrate)；羥基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(Ientinan)；氯尼達明 (Ionidainine)；美登木素生物堿類(maytansinoids)如美登素(maytansine)和安絲 MM (ansamitocins)；米托月瓜月宗(mitoguazone)；米托惠酉昆(mitoxantrone)；莫口jS達酉享 (mopidanmol)；尼曲吖唆(nitraerine)；噴司他丁(pentostatin)；異丙嗪(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽酉昆(Iosoxantrone)；鬼酸(podophyllinic acid) ；2-乙基酰胼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴胼(procarbazine) ；PSK 多糖復合物(JHS Natural ProductsCJHS 天然產品)，Eugene, OR)；雷佐生(razoxane)；利索新(rhizoxin)；西佐喃 (sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone) ；2，2，，2” -三氯三乙胺(2，2，，2”-trichlorotriethylamine)；單端孢霉烯族化合物(trichothecenes)(特別是T-2毒素、verracurin Α、桿孢菌素A(roridinA)和蛇形菌素(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪 (dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine) ；二溴甘露酉享(mitobronitol) ；二溴衛矛酉享 (mitolactol)；喊泊漠燒(pipobroman) ；gacytosine ；阿糖胞昔(arabinoside) (“Ara-C")； 環磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替哌(thiotepa)；紫杉烷類化合物(taxoids)，例如 TAXOL ^^Il (paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N. J.),^ 克列莫佛(Cremophor)的ABRAXANE 、紫杉醇的白蛋白改造的納米顆粒制劑(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)、禾口 TAXOTERE ⑧多西他塞(doxetaxel) (Rhone -Poulenc Rorer, Antony, France)；苯丁酸氮芥(chloranbucil) ；GEMZAR吉西他濱(gemcitabine) ；6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine)；巰嘌呤(mercaptopurine)；甲氨喋呤；鉬類似物如順鉬(cisplatin)和卡鉬(carboplatin)；長春堿(vinblastine)；鉬；依托泊苷(etoposide) (VP-16)；異環磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新堿(vincristine) ；NAVELBINE ；長春瑞濱(vinorelbine)；諾安托(novantrone)； 替尼泊苷(teniposide)；依達曲沙(edatrexate)；道諾霉素(daunomycin)；氨基蝶呤 (aminopterin)；希羅達(xeloda)；伊本膦酸鹽(ibandronate)；伊立替康(irinotecan) (Camptosar, CPT-11)(包括伊立替康(irinotecan)與 5_FU 和亞葉酸(Ieucovorin)的治療方案)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000;二氟甲基鳥氨酸(difluoromethylornithine) (DMFO)；類視黃酸類(retinoids)如視黃酸(retinoic acid)；卡培他濱(capecitabine)； 考布他汀(combretastatin)；亞葉酸(Ieucovorin) (LV)；奧沙利鉬(oxaliplatin)，包括奧沙利鉬(oxaliplatin)治療方案(FOLFOX) ；PKC- α的抑制劑，Raf的抑制劑，H-Ras的抑制劑，EGFR的抑制劑(例如，厄洛替尼(erlotinib) (Tarceva ))和VEGF-A的抑制劑，它們降低細胞增殖，和上述任一種的藥用鹽、酸或衍生物。 抗-激素劑也包含在本定義中，它們起作用從而調控或抑制對腫瘤的激素作用， 諸如抗雌激素和選擇性雌激素受體調節劑(SERMs)，包括例如，他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX 他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)，4-羥基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen),曲沃昔芬(trioxifene)、keoxifene、LY117018、奧那司酮(onapristone)和 FAREST0N ·托瑞米芬(toremifene)；和芳香酶抑制劑(aromatase inhibitors)，其抑制芳香酶，該酶調節腎上腺中的雌激素產生，諸如，例如，4(5)-咪唑類 G (5) -imidazoles)、氨魯米特(aminoglutethimide)、MEGASE 醋酸甲地孕酮 (megestrol acetate)、AROMASIN 益西美坦(exemestane)、福美坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR 伏氯唑(vorozole)、FEMARA φ 來曲唑(Ietrozole)和 ARIMIDEX 阿那曲唑(anastrozole)；和抗-雄激素類(anti-androgens)諸如氟他胺 (flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙立德(Ieuprolide) 和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他濱(troxacitabine) (1，3_ 二氧戊環核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是抑制在涉及異常細胞增殖的信號傳導途徑中基因的表達的那些，所述基因諸如例如，PKC-α、Raf和H-Ras ；核酶(ribozymes)諸如VEGF表達抑制劑(例如，ANGIOZYME 核酶)和HER2表達抑制劑；疫苗諸如基因治療疫苗，例如，ALLOVECTIN 疫苗、LEUVECTIN 疫苗和 VAXID 疫苗；PROLEUKIN rIL_2 ；LURTOTECAN 拓撲異構酶 1 抑制劑；ABARELIX rmRH ；長春瑞濱(Vinorelbine)和埃斯波霉素(Esperamicins)(參見美國專利號4，675，187)，和上述任意物質的藥用鹽、酸或衍生物。
所述“放射性療法”意指定向Y射線或β射線對細胞誘導足以限制其起正常功能的能力的破壞或使細胞完全破壞的用途。應該理解本領域中已知許多用于確定治療的劑量和持續時間的方式。典型的治療作為一次施用和典型劑量范圍10-200單位(Grays)/日來提供。“降低或抑制”是與參照比較減少或降低活性、功能和/或量。所述“降低或抑制” 意為導致總的減少優選20 %或更多，更優選50 %或更多，和最優選75 %，85 %，90 %，95 % 或更多的能力。降低或抑制可涉及被治療的病癥的癥狀，轉移瘤的存在或大小，原發腫瘤的大小，或在血管生成病癥中的血管的大小或數目。術語“診斷”在本文中用于意指確定分子的或病理學的狀態、疾病或病癥，諸如確定癌癥或用于確定可受益于具體治療方案的癌癥患者。術語"預后"用于本文時指預測從抗癌療法得到臨床益處的可能性。術語"預測"用于本文時，指患者對特定抗癌療法反應良好或不良的可能性。在一個實施方案中，預測涉及那些反應的程度。在一個實施方案中，預測涉及患者在治療(例如用特定治療劑治療)后是否在一定階段不伴隨疾病復發的存活或改善和/或這樣存活或改善的可能性。本發明的預測方法可以在臨床上通過選擇對于任何特定患者的最適合的治療方式來做出治療決定。如果患者可能對治療方案(如給定的治療方案，包括例如施用給定的治療劑或組合，外科手術干預，類固醇治療等)的反應良好，或在治療方案后患者的長期存活是可能的，那么本發明的預測方法是預測的有價值的工具。“患者反應”可以使用任何指示患者益處的終點來評估，所述終點包括，但不限于 (1)在一定程度上抑制疾病進展，包括延緩和徹底停滯；( 減少病灶大小；C3)抑制(即， 減少、減緩或徹底阻止)疾病細胞浸潤到鄰近的周圍器官和/或組織中；(4)抑制(即，減少、延緩或完全阻止)疾病傳播；( 在一定程度上，減輕與病癥相關的一種或多種癥狀； (6)增加治療后沒有表現疾病的長度；和/或(8)治療后在給定時間點減少的死亡率。術語“長期存活”用于本文意指在治療性處理后存活至少1年、5年、8年或10年。術語“益處”廣義使用，并且指任何理想的效果，具體地包括如本文定義的臨床益處。臨床益處可以通過評估各種終點來測量，例如在一定程度上抑制疾病進展，包括延緩和完全阻滯；減少疾病事件和/或癥狀的數量；減少病灶大小；抑制(即，減少、減緩或徹底阻止)疾病細胞浸潤到鄰近的周圍器官和/或組織中；抑制(即，減少、延緩或完全阻止)疾病傳播；減少自體免疫應答，其可以，但不必需導致疾病病灶的退化或消除；在一定程度上減輕與病癥相關的一種或多種癥狀；增加治療后沒有疾病表現的長度，例如無進展存活期；增加的總存活時間；更高的反應速率；和/或在治療后的給定時間點減少的死亡率。II.本發明的方法本發明部分基于鑒定與治療癌癥的抗-血管生成療法降低的臨床益處相關的特異性生物標志。因此，公開的方法和測定提供方便、有效且可能有成本效益的獲得用于評估治療癌癥患者的適當或有效療法的數據和信息的方式。例如，癌癥患者可進行活組織檢查以獲得組織或細胞樣品，或可從患者獲得血漿樣品，所述樣品可通過多種體外測定進行檢查以確定PlGF的表達與對照或參照樣品相比較是否增加。如果檢測到表達的增加，則所述
21患者將可能受益于不同于抗-血管生成療法的抗癌療法或除抗-血管生成療法以外的抗癌療法。因此，本發明提供鑒定可受益于不同于抗-血管生成療法的抗癌療法或除抗-血管生成療法以外的抗癌療法的癌癥患者的方法，包括檢測從所述患者獲得的樣品中胎盤生長因子(PlGF)表達水平的步驟，其中，與參照樣品相比較所述樣品中PlGF增加的表達表明所述患者可受益于不同于抗-血管生成療法的抗癌療法或除抗-血管生成療法以外的抗癌療法。在一些實施方案中，所述樣品在癌癥治療開始之前從所述患者獲得，其中所述樣品具有大于^pg/ml的PlGF表達水平。在一些實施方案中，所述樣品從現在正在進行抗-血管生成療法的患者獲得，其中所述樣品具有大于50pg/ml的PlGF表達水平。在一些實施方案中， 所述樣品是血漿樣品。本發明還提供預測癌癥患者對抗-血管生成療法的反應性的方法，包括確定從所述患者獲得的樣品中PlGF的表達水平，其中與參照樣品相比較PlGF增加的表達水平表明所述患者對單獨的抗-血管生成療法有反應的可能性更低。在一些實施方案中，所述樣品在癌癥治療開始之前從所述患者獲得，其中所述樣品具有大于^pg/ml的PlGF表達水平。 在一些實施方案中，所述樣品從現在正在進行抗-血管生成療法的患者獲得，其中所述樣品具有大于50pg/ml的PlGF表達水平。在一些實施方案中，所述樣品是血漿樣品。還提供治療患有癌癥的患者的方法，包括向所述患者施用不同于抗-血管生成療法的抗癌療法或除抗-血管生成療法以外的抗癌療法，其中從所述患者獲得的樣品顯示與參照樣品相比較增加的PlGF表達水平。本發明另一方面提供優化癌癥治療的治療功效的方法，包括確定從患者獲得的樣品中PlGF的表達水平，其中，與參照樣品相比較PlGF增加的表達水平表明所述患者對單獨的抗-血管生成療法有反應的可能性更低。所述樣品可在治療開始之前從所述患者獲得。 所述樣品可在治療開始之后從所述患者獲得。在一個實施方案中，所述樣品具有小于或等于觀 8/!111的PlGF表達水平。在一些實施方案中，所述樣品可以從現在正在進行抗-血管生成療法治療的患者獲得。在一個實施方案中，所述樣品具有小于或等于50pg/ml的 PlGF表達水平。在一些實施方案中，所述抗-血管生成療法包括施用VEGF拮抗劑，如例如抗-VEGF抗體，例如貝伐珠單抗。本發明另一方面提供治療癌癥患者的方法，包括向所述患者施用抗-血管生成療法，其中從所述患者獲得的樣品顯示與參照樣品相比較的低的PlGF表達水平。所述樣品可在治療開始之前從所述患者獲得。在一個實施方案中，所述樣品具有小于或等于^Pg/ml 的PlGF表達水平。在一些實施方案中，所述樣品可以從現在正在進行抗-血管生成療法治療的患者獲得。在一個實施方案中，所述樣品具有小于或等于50pg/ml的PlGF表達水平。 在一些實施方案中，所述抗-血管生成療法包括施用VEGF拮抗劑，如例如抗-VEGF抗體，例如貝伐珠單抗。本發明的方法涉及患有癌癥的患者。所述癌癥可以是，例如癌瘤(carcinoma)，淋巴瘤(lymphoma)，母細胞瘤(blastoma)，肉瘤(sarcoma)禾口 /或白血病(leukemia)。所述癌癥的更具體實例包括鱗狀細胞癌(squamous cell cancer)，肺癌(lung cancer)(包括小細Ifi月市· (small-cell lung cancer)，#/J、細Ifi月市· (non-small cell lung cancer), 月市腺癌(adenocarcinoma of the lung)禾口月市的麟狀癌(squamous carcinoma of the lung))，月復月莫癌(cancer of the peritoneum)，月干細胞癌(hepatocellular cancer)，胃(gastric or stomach cancer) (1 1 IS (gastrointestinal cancer)), I^j^fg (pancreatic cancer)，成膠質細胞瘤(glioblastoma)，宮頸癌(cervical cancer)，卵巢 (ovarian cancer),H1Flg (liver cancer),MD^fg (bladder cancer),M'-JM (hepatoma), 乳腺癌(breast cancer),結腸癌(colon cancer),結腸直腸癌(colorectal cancer),子宮內膜癌或子宮癌(endometrial or uterine carcinoma),唾液腺癌(salivary gland carcinoma)，腎癌或腎癌(kidney or renal cancer)，月干癌(liver cancer)，前列腺癌 (prostate cancer)，夕卜陰癌(vulval cancer)，甲#1/ 癌(thyroid cancer)，月干癌(hepatic carcinoma)和多種類型的頭頸癌(head and neck cancer)，以及B細胞淋巴瘤(B_cell lymphoma)(包括低度 / 濾泡性非霍奇金淋巴瘤(low grade/follicular non-Hodgkin' s lymphoma) (NHL)；小淋巴細胞(SL)NHL(small lymphocytic(SL)NHL)；中度 / 濾泡性 NHL (intermediate grade/fol licular NHL)；中度彌漫NHL (intermediate grade diffuse NHL)；高度成免疫細胞性 NHL(high grade immunoblastic NHL)；高度成淋巴細胞性 NHL(high grade lymphoblastic NHL)；高度小無核裂細胞性 NHL(high grade small non-cleaved cell NHL)；巨塊型 NHL (bulky disease NHL)；套細胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma) ；AIDS相關淋巴瘤(AIDS-related lymphoma)；和瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥 (Waldenstrom' s Macroglobulinemia))；慢性淋巴細胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia) (CLL)；急性成淋巴細胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia) (ALL)；多毛細胞白血病(Hairy cell leukemia)；慢性成髓細胞白血病(chronic myeloblastic leukemia)；禾口移植后淋巴增生性障礙(post-transplant Iymphoproliferative disorder) (PTLD)，以及與瘢痣病(phakomatoses)、水腫(edema)(諸如與腦瘤有關)或梅格斯氏綜合征(Meigs' syndrome)有關的異常血管增殖。在一個實施方案中，癌癥是腎細胞癌(renal cell carcinoma)。包含靶生物標志的樣品可以通過本領域公知的并且適合于目的癌癥的特定類型和定位的方法獲得。組織的活組織檢查常常用于獲得癌性組織的代表性塊。備選地，細胞可以已知或認為含有目的癌細胞的組織/液體的形式間接地獲得。例如，癌性病灶的樣品可以通過切除術、支氣管鏡檢查法、細針抽吸、支氣管刷檢獲得，或來自痰、胸膜液或血液。可以從癌癥或腫瘤組織或從其它身體樣品如尿液、痰液、血清或血漿中檢測基因或基因產物。 可以將上述關于檢測癌性樣品中的靶基因或基因產物所討論的相同技術用于其它身體樣品。癌細胞可以從癌癥病灶脫落，并且出現在所述身體樣品中。通過篩選此類身體樣品，對于這些癌癥可以實現簡單的早期診斷。此外，療法的進程也可以通過測試所述身體樣品的靶基因或基因產物更容易地監測。富集癌細胞的組織制備物的方式是本領域已知的。例如，組織可以從石蠟或恒溫箱切片分離。癌細胞也可以通過流式細胞術或激光捕獲顯微切割與正常細胞分離。這些技術，以及用于分離癌細胞和正常細胞的其它技術是本領域公知的。如果癌組織被正常細胞高度污染，那么檢測標志性的基因或蛋白表達圖譜可能會較困難，盡管已知使污染和/或假陽性/假陰性結果降到最低程度的技術(其中一些在下面進行討論)。例如，還可以對樣品進行生物標志存在的評估，所述生物標志已知與目的癌細胞相關，但是與相應的正常細胞不相關，或反之亦然。在本發明的方法中，獲得并檢查哺乳動物組織或細胞樣品的一種或多種生物標志(例如，P1GF)的表達。多種生物標志在樣品中的表達可以通過許多方法分析，其中多數方法是本領域已知的并且為技術人員所了解，包括，但不限于免疫組化分析和/或蛋白質印跡分析、免疫沉淀、分子結合測定法、ELISA、ELIFA、熒光激活的細胞分選(FACQ等、定量的基于血液的測定法(例如血清ELISA)(用于例如檢查蛋白表達的水平)、生化酶促活性測定法、原位雜交、RNA印跡分析和/或mRNA的PCR分析，以及可以通過基因和/或組織陣列分析進行的多種測定法中的任一種。評價基因和基因產物狀態的典型方法見于例如Ausubel 等，編輯，1995，現代分子生物學方案(Current Protocols In Molecular Biology)，單元 2(RNA 印跡(Northern Blotting))，4 (DNA 印跡(Southern Blotting))，15 (免疫印跡 (Immunoblotting)和18(PCR分析)。也可以使用多種免疫測定法如可獲自Rules Based Medicine 或 Meso Scale Discovery (MSD)的那些免疫測定法。在本發明的一些實施方案中，使用免疫組織化學和染色方法來檢查樣品中靶蛋白的表達。組織切片的免疫組織化學染色顯示是評估或檢測樣品中蛋白存在的可靠方法。免疫組織化學(“IHC”)技術，通常通過生色法或熒光法，使用抗體原位探測和顯現細胞抗原。對于樣品制備，可以使用來自于哺乳動物(典型地人患者)的組織或細胞樣品。樣品的實例包括但不限于組織的活組織檢查、血液、肺抽吸物、痰、淋巴液、血漿等。樣品可通過本領域已知的多種程序獲得，包括但不限于外科切除、抽吸或活組織檢查。組織可以是新鮮的或冷凍的。在一個實施方案中，樣品在石蠟等中固定和包埋。可以通過常規技術(見例如，“武裝部隊病理學研究所的組織學染色方法手冊(Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology)，”第 3 版(1960)Lee G. Luna, HT(ASCP)編輯，McGraw-Hill Book 公司 Blakston分公司，紐約；武裝部隊病理學研究所組織學和病理學的先進實驗室方法(The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Method in Histology and Pathology), (1994)Ulreka V. Mikel，編輯，武裝部隊病理學研究所(Armed Forces Institute of Pathology)，美國病理學登 i己處(American Registry of Pathology), Washington, D. C.)對組織樣品進行固定(即，保存)。技術人員將理解固定劑選擇是根據樣品進行組織學染色還是其它分析的目的來確定的。技術人員還將理解固定的長短取決于所用的組織樣品的大小和固定劑。例如，可以將中性緩沖的福爾馬林，布安溶液或低聚甲醛用于固定樣品。一般而言，將樣品首先固定，接著通過系列升高的醇進行脫水，浸潤并用石蠟或其它可以使組織樣品被切片的切片介質進行包埋。備選地，可以切割組織并且固定獲得的切片。例如，可以將組織樣品通過常規方法，在石蠟中包埋和處理(見例如，“武裝部隊病理學研究所的組織學染色方法手冊(Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology)，上文)。可以使用的石蠟的實例包括，但不限于 Paraplast, Broloid和Tissuemay。一旦組織樣品被包埋，可以通過切片機等對樣品進行切片(見，例如“武裝部隊病理學研究所的組織學染色方法手冊(Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology),上文)。作為這禾中方法的實例，切片的范圍可以在約3微米到約5微米的厚度。一旦被切片，這些切片可以通過一些標準方法附于載玻片。載玻片膠黏劑的實例包括，但不限于硅烷、明膠、聚-L-賴氨酸等。例如，可以將石蠟包埋的切片附于帶正電荷的載玻片和/或用聚-L-賴氨酸包被的載玻片。如果將石蠟用作包埋物質，那么通常對組織切片進行去石蠟(cbparaffinize)并與水進行再水合。通過一些常規標準方法對組織切片進行去石蠟。例如，可以使用二甲苯和逐漸減少系列的醇(見，例如“武裝部隊病理學研究所的組織學染色方法手冊(Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology),上文)。備選地，可以使用商購的去石蠟非有機試劑如Hemo_De7(CMS，Houston, Texas)。任選地，樣品制備后，可以使用IHC來分析組織切片。可以與其它的技術如形態學染色和/或熒光原位雜交結合進行IHC。可獲得兩種IHC通用方法；直接和間接測定法。根據第一種測定法，直接確定抗體與靶抗原的結合。這種直接測定法使用標記的試劑，如熒光標記或酶標記的初級抗體，其可以在沒有進一步抗體相互作用的情況下顯色。在典型的間接測定法中，未綴合的初級抗體結合于抗原并且接著，標記的次級抗體結合于初級抗體。如果所述次級抗體綴合于酶促標記，加入生色或熒光底物以提供抗原的顯色。出現了信號放大，因為一些次級抗體可以與初級抗體上的不同表位反應。用于免疫組織化學的初級抗體和/或次級抗體典型地用可檢測的結構部分進行標記。可以獲得許多標記，其通常被歸為下面的類別中(a)放射性同位素，如％，14(，1251，3!1和1311。抗體可以使用例如在當前的免疫學方法(Current Protocols in Immunology)，第 1 卷和第 2 卷，Coligen 等，編輯。 Wiley-hterscience，紐約，New York, Pubs. (1991)中所述的技術利用放射性同位素進行標記，并且可以使用閃爍計數法測量放射性。(b)膠體金顆粒。(c)熒光標記，包括，但不限于稀土螯合物(銪螯合物)、德克薩斯紅、羅丹明、熒光素、丹酰、麗絲胺、傘形酮、藻紅蛋白、藻藍蛋白或商購的熒光團如SPECTRUM 0RANGE7和 SPECTRUM GREEN7和/或上述任意一種或多種的衍生物。可以例如使用在當前免疫學方法 (Current Protocols in Immunology)，見上文中公開的技術將熒光標記綴合于抗體。熒光可以使用熒光計來量化。(d)可獲得各種酶-底物標記并且美國專利號4，275，149提供其中一些的綜述。 酶通常催化可以使用各種技術測量的生色底物的化學變化。例如，酶可以催化底物的顏色變化，這可以通過分光光度計測量。備選地，酶可以改變底物的熒光或化學發光。用于量化熒光變化的技術如上所述。化學發光的底物通過化學反應被電激發，接著可以發射可測量 (例如使用化學發光計)的光，或給熒光受體提供能量。酶促標記的實例包括螢光素酶(例如螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶，美國專利號4，737，456)、螢光素、2，3- 二氫酞嗪二酮、 蘋果酸脫氫酶、脲酶、過氧化物酶如辣根過氧化物酶(HRPO)、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、 葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環氧化酶(如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化物酶、微過氧化物酶等。用于將酶綴合于抗體的技術在0' Sullivan等，制備用于酶免疫測定法中的酶_抗體綴合物的方法(Mehods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay),酶學方法(Method in Enzym)中·(J. Langone&H. Van Vunakis 編輯)，學術出版社，紐約，73 :147-166(1981)記載。酶-底物組合的實例包括，例如
(i)辣根過氧化物酶(HRPO)，以過氧化氫酶作為底物，其中過氧化氫酶氧化染料前體(例如，鄰苯二胺(orthophenylene diamine) (OPD)或3，3‘ ,5,5'-四甲基聯苯胺鹽酸鹽(Tiffi))；(ii)堿性磷酸酶(AP)，以對-硝基苯基磷酸作為生色底物；和(iii) β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)與生色底物(例如，對-硝基苯基-β _D_半乳糖苷酶)或熒光底物(例如，4-甲基umbelIiferyl-β-D-半乳糖苷酶)。許多其它的酶-底物組合是本領域技術人員可獲得的。關于這些的一般綜述見美國專利號4，275，149和4，318，980。有時，所述標記可以間接與抗體綴合。技術人員知道實現所述綴合的各種技術。例如，抗體可以與生物素綴合并且上述四種廣泛種類的標記的任一種可以與抗生物素蛋白綴合，或反之亦然。生物素選擇性地結合抗生物素蛋白，并且因此，所述標記可以以這種間接的方式與抗體綴合。備選地，為了獲得標記與抗體的間接綴合，所述抗體與小的半抗原綴合，并且上述不同類型的標記之一與抗-半抗原抗體綴合。由此，可以實現標記與抗體的間接綴合。除了上述討論的樣品制備方法外，在IHC之前、過程中或之后進行組織切片的進一步處理可能也是需要的。例如，可以進行表位挽回方法(印itope retrieval method), 如在檸檬酸鹽緩沖液中加熱組織樣品(見，例如，Leong等，應用免疫組織化學(Appl. Immunohistochem.)4(3) :201 (1996))。在任選的封閉步驟后，在充足的時間階段內和適合的條件下，將組織切片暴露于初級抗體，從而使初級抗體結合于組織樣品中的靶蛋白抗原。用于實現所述結合的適合的條件可以通過常規實驗確定。通過使用上述討論的任一種可檢測標記來確定抗體與樣品結合的程度。優選地，標記是催化生色底物如3，3’ - 二氨基聯苯胺色素原的化學變化的酶促標記(例如HRP0)。優選地，酶促標記綴合于特異性結合于初級抗體的抗體(例如，初級抗體是兔多克隆抗體并且次級抗體是山羊抗-兔抗體)。由此制備的樣本可以被封固并且用載玻片蓋上。接著，例如使用顯微鏡確定載玻片評估，并且可以使用常規用于本領域的染色強度標準。在備選方法中，樣品可以在足以形成抗體-生物標志復合物的條件下與特異于所述生物標志的抗體接觸，接著檢測所述復合物。可以以多種方式，如通過測定多種組織和樣品，包括血漿或血清的蛋白質印跡法和ELISA方法檢測生物標志的存在。使用這樣的測定形式的多種免疫測定技術是可獲得的，見，例如，美國專利號4，016，043,4, 424，279和 4，018，653。這些包括非競爭類型的單點和兩點或“夾心式”測定法，以及傳統的競爭結合測定法。這些測定法還包括將標記的抗體直接結合于靶生物標志。夾心式測定法是最有效和常用的測定法之一。存在夾心式測定法技術的許多變化，并且所有的變化都意欲涵蓋在本發明中。簡言之，在典型的正向測定法中，將未標記的抗體固定在固體基底上，并且使待測試的樣品與結合的分子接觸。在適合的溫育階段(足以形成抗體-抗原復合物的時間段)后，接著加入特異于抗原、并且用能夠產生可檢測信號的報道分子標記的第二抗體并進行溫育，溫育時間足以形成另一種抗體-抗原標記的抗體的復合物。任何未反應的物質被洗去，并且通過觀察由報道分子產生的信號來確定抗原的存在。該結果可以是定性的，通過簡單觀察可視的信號進行，或可以是定量的，通過與包含已知量的生物標志的對照樣品比較進行。
正向測定法的變化包括同時測定法，其中將樣品和標記的抗體同時加入至結合的抗體。這些技術是本領域技術人員公知的，包括任何顯而易見的微小變化。在典型的正向夾心式測定法中，特異于生物標志的第一抗體共價地或被動地結合于固體表面。固體表面典型地是玻璃的或聚合物的，最常用的聚合物是纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚乙烯氯或聚丙烯。固體支持物可以以試管、珠、微型板的盤形式存在，或可以是適合于進行免疫測定法的任何其它表面。結合方法是本領域公知的并且通常由交聯共價結合或物理吸附組成，聚合物-抗體復合物在測試樣品的制備中進行洗滌。接著，將待測試的樣品的等分試樣加入固相復合物并以充足的時間階段(例如2-40分鐘或過夜，如果更方便的話)和在適合的條件(例如從室溫至40°C，如25°C-32°C，包括端點)下溫育從而允許抗體中存在的任何亞基的結合。在溫育階段后，洗滌抗體亞基固相并且干燥，與特異于生物標志的一部分的第二抗體一起溫育。所述第二抗體連接于報道分子，所述報道分子用于指示第二抗體與分子標志的結合。備選方法包括將靶生物標志固定在樣品中，并且接著將固定的靶標暴露于可以用報道分子標記的或可以不用報道分子標記的特異性抗體。根據靶標的量和報道分子信號的強度，結合的靶標可以通過用抗體直接標記進行檢測。備選地，將特異于第一抗體的第二標記抗體暴露于靶標-第一抗體復合物以形成靶標-第一抗體-第二抗體的三級復合物。復合物通過由報道分子發射的信號檢測。所述“報道分子”，在本發明中使用時，意為通過其化學性質提供在分析上可鑒定的信號的分子，所述信號允許檢測抗原結合的抗體。在這種類型的測定法中的最常用的報道分子是酶、熒光團或包含放射性核素的分子(即，放射性同位素)和化學發光分子。在酶免疫測定法的情形中，酶通常通過戊二醛或高碘酸的方式綴合于第二抗體。 然而，如容易意識到的，存在多種技術人員容易得到的不同的綴合技術。常用的酶特別包括辣根過氧化物酶、葡糖氧化酶、β -半乳糖苷酶和堿性磷酸酶。通常對特定的酶所用的底物進行選擇，從而在由相應的酶水解后，用于產生可檢測的顏色變化。適合的酶的實例包括堿性磷酸酶和過氧化物酶。也可以使用熒光底物，其產生熒光產物而不是上述生色底物。在所有的情形中，將酶-標記的抗體加入第一抗體-分子標志復合物，進行結合，接著洗去過量的試劑。隨后，將包含適合的底物的溶液加入抗體-抗原-抗體的復合物中。底物將與連接第二抗體的酶反應，提供定性的視覺信號，這還可以進一步量化(通常通過分光光度測定法)，從而提供關于樣品中存在的生物標志的量的指示。或者，可以將熒光化合物，如熒光素和羅丹明化學偶聯于抗體而不改變它們的結合能力。當通過用特定波長的光照明來激活時，熒光染料標記的抗體吸收光能量，誘導分子中的激發狀態，隨后發射特征色的光，所述特征色可以用光學顯微鏡視覺檢測。當在EIA中時，允許熒光標記的抗體結合于第一抗體-分子標志復合物。在洗去未結合的試劑后，接著使剩余的三級復合物暴露于適當波長的光，觀察到的熒光指示目的分子標志的存在。免疫熒光和EIA技術都是本領域中充分建立的。然而，也可以使用其它的報道分子，如放射性同位素、化學發光或生物發光分子。預期上述技術也可以用于檢測PlGF的表達。本發明的方法還包括檢查組織、細胞或血漿樣品中PlGF mRNA水平的存在和/或表達的方案。用于評價細胞中的mRNA的方法是公知的，并且包括，例如使用互補DNA探針的雜交測定法(如使用特異于PlGF的標記的核糖核酸探針的原位雜交，RNA印跡和相關技
27術)和各種核酸擴增測定法(如使用特異于PlGF的互補引物的RT-PCR和其它擴增類型的檢測方法，如，例如分支DNA、SISBA、TMA等)。可以使用RNA印跡法、斑點雜交或PCR分析方便地測定哺乳動物的組織、細胞或血漿樣品的mRNA。例如，RT-PCR測定法，如定量PCR測定法是本領域中公知的。在本發明的舉例說明的實施方案中，用于檢測生物樣品中的靶mRNA的方法包括通過使用至少一種引物的反轉錄從樣品中產生cDNA ；使用靶多核苷酸作為有義和反義引物擴增這樣產生的cDNA 以擴增其中的靶cDNA ；和檢測擴增的靶cDNA的存在。此外，所述方法可以包括使技術人員確定靶mRNA在生物樣品中的水平的一個或多個步驟(例如，通過同時檢查“持家”基因如肌動蛋白家族成員的比較對照mRNA序列的水平)。任選地，可以確定擴增的靶cDNA的序列。本發明的任選方法包括通過微陣列技術檢查或檢測組織、細胞或血漿樣品中的 mRNA,如靶mRNA的方法。使用核酸微陣列，對來自測試和對照樣品的測試和對照mRNA樣品進行反轉錄和標記以產生cDNA探針。所述探針接著與固定在固體支持物上的核酸陣列雜交。對所述陣列進行構造從而使陣列的每個成員的序列和定位是已知的。例如，可以將其表達與抗血管生成治療的增大或減小的臨床效果相關的基因選擇物排列在固體支持物上。標記的探針與特定的陣列成員的雜交指示探針來自其中的樣品表達該基因。疾病組織的差別基因表達分析可以提供有價值的信息。微陣列技術使用核酸雜交技術和計算機技術來在單一實驗中評價數千基因的mRNA表達圖譜(見，例如，在2001年10月11日公開的 WO 01/75166)；(見例如，U. S. 5，700，637，美國專利 5，445，934 和美國專利 5，807，522， Lockart,自然生物技術(Nature Biotechnology)，14 1675-1680 (1996) ；Cheung, V. G.等， 自然遺傳學(Nature Genetics) 21 (增刊)15-19 (1999)，關于陣列制作的討論)。DNA微陣列是包含基因片段的微型陣列，所述基因片段直接合成在或點樣到玻璃或其它基底上。 數千基因通常在單一陣列中展示。典型的微陣列實驗包括下列步驟1)制備從樣品分離的 RNA的熒光標記的靶標，幻將標記的靶標與微陣列雜交，幻洗滌、染色和掃描陣列，4)分析掃描的圖像和5)產生基因表達圖譜。目前使用兩種主要類型的DNA微陣列寡核苷酸(通常是25-70mers)陣列和包含從cDNAs制備的PCR產物的基因表達陣列。在形成陣列時，寡核苷酸可以是預制的并且點樣到表面上或直接合成到所述表面上(原位)。Affymetrix GeneChip 系統是商購的微陣列系統，其包括通過直接在玻璃表面上合成寡核苷酸而制備的陣列。探針/基因陣列通常為25mers的寡核苷酸通過基于半導體的照相平版印刷術和固相化學合成技術的組合直接合成到玻璃晶片(glass wafer) 上。每個陣列包含多到400，000個不同的低聚物，并且每種低聚物以百萬個拷貝存在。 由于寡核苷酸探針在陣列上的已知位置合成，雜交模式和信號強度可以由Affymetrix Microarray Suite軟件，根據基因特性和相對表達水平進行解釋。每個基因通過一系列不同的寡核苷酸探針展示在陣列上。每個探針對由完全匹配的寡核苷酸和錯配的寡核苷酸組成。完全匹配的探針具有完全互補于特定基因并由此測量該基因表達的序列。錯配的探針與完全匹配的探針不同之處在于中心堿基位置的單一堿基置換，所述堿基置換干擾了靶基因轉錄物的結合。這有助于確定背景雜交和非特異性雜交，其有助于關于完全匹配的低聚物所測量的信號。Microarray Suite軟件將錯配探針的雜交強度從完全匹配的探針的雜交強度中扣除從而確定關于每個探針組的絕對或特定強度值。基于目前來自Genbank和其它核苷酸所有組成成分(repositories)的信息選擇探針。認為所述序列識別基因的3’端的獨特區域。將基因芯片雜交爐(“rotisserie”烘箱)用于同時進行多到64個陣列的雜交。流控站進行探針陣列的洗滌和染色。所述流控站是完全自動化的并且包含四個組件，其中每個組件控制一個探針陣列。每個組件通過使用預先編程流控流程的Microarray Suite軟件獨立控制。掃描器是共焦激光熒光掃描器，其測量由結合于探針陣列的標記的 cRNA發射的熒光強度。具有Microarray Suite軟件的計算機工作站控制流控站和掃描器。 Microarray Suite軟件可以控制多到8個流控站，所述流控站使用預先編程的關于探針陣列的雜交、洗滌和染色流程。軟件還獲得雜交強度數據，并使用適合的算法將所述雜交強度數據轉化為每個基因的存在/不存在。最終，軟件通過比較分析檢測實驗之間基因表達的變化并將輸出格式化為.txt文件，這可以用于其它的軟件程序進行進一步的數據分析。選定的生物標志在組織或細胞樣品中的表達也可以通過功能性測定法或基于活性的測定法進行檢查。例如，如果生物標志是酶，那么可以進行本領域已知的測定法來確定或檢測給定的酶促活性在組織或細胞樣品中的存在。本發明的試劑盒具有許多實施方案。典型的實施方案是這樣的試劑盒，其含有容器、在所述容器上的標簽和包含于所述容器內的組合物；其中所述組合物包括結合PlGF的初級抗體，所述容器上的標簽顯示所述組合物可以用于評估至少一種類型的哺乳動物細胞中PlGF的存在，和關于使用抗體來評估至少一種類型的哺乳動物細胞中PlGF的存在的說明。所述試劑盒還可以包括用于制備組織、細胞或血漿樣品和將抗體和探針應用于組織、細胞或血漿樣品的相同部分的一組說明書和材料。所述試劑盒可以包括初級抗體和次級抗體，其中所述次級抗體與標記物，例如酶標記物綴合。另一個實施方案是這樣的試劑盒，其包括容器、所述容器上的標簽、和容納在所述容器中的組合物；其中所述組合物包括一種或多種在嚴格條件下與PlGF雜交的多核苷酸， 所述容器上的標簽顯示所述組合物可以用于評估至少一種類型的哺乳動物細胞或血漿中 PlGF的存在，和關于使用多核苷酸來評估至少一種類型的哺乳動物細胞或血漿中PlGF RNA 或DNA存在的說明。試劑盒中的其他任選成分包括一種或多種緩沖劑(例如，封閉緩沖液、洗滌緩沖液、底物緩沖液等)、其他試劑諸如由酶標記物化學改變的底物(例如，發色團)，表位挽回溶液(印itope retrieval solution)、對照樣品(陽性和/或陰性對照)、對照切片等。對于本發明的方法，根據已知方法將抗癌治療劑、抗-血管發生劑和/或化療劑施用于人患者，所述方法如作為推注(bolus)的靜脈內施用或在一定時間階段內通過持續輸注施用，通過肌內、腹膜內、腦脊髓內(intracerobrospinal)、皮下、關節內、滑液內、鞘內、 口服、局部或吸入途徑進行施用。抗體的靜脈內或皮下施用是優選的。本發明的治療可涉及組合施用抗-VEGF抗體和一種或多種化療劑。本發明涵蓋施用不同化療劑的混合物。組合施用包括使用分開的制劑或單一藥物制劑的共施用，和任一次序的順次施用，其中優選地有一段時間兩種(或所有)活性劑同時發揮其生物學活性。 該化療劑的準備和給藥方案可依照制造商的說明使用或由熟練的技術人員憑經驗確定。化學療法的準備和給藥方案也在化學療法服務(Chemotherapy Service)，編輯，Μ. C. Perry, ffilliams&ffilkins, Baltimore, MD(1992)中描述。化療劑可以在施用抗體之前或之后，或可以與其同時給予。對于疾病的預防或治療，抗癌治療劑或抗-血管發生劑的適宜劑量取決于上文定義的待治療疾病的類型、疾病的嚴重程度和病程、施用藥劑是用于預防還是治療目的、先前的療法、患者的臨床史和對藥劑的反應、及主治醫師的判斷。將藥劑一次性或者在一系列治療中適當的施用于患者。在組合治療方案中，本發明的組合物以治療有效量或協同量施用。 在一些實施方案中，抗-血管發生劑是VEGF拮抗劑，例如抗-VEGF抗體，如貝伐珠單抗。根據疾病的類型和嚴重程度，大約1 μ g/kg到50mg/kg(例如0. l-20mg/kg)的抗體是施用于患者的初始候選劑量，無論是例如通過一次或多次分開施用，或者是通過連續輸注。典型每日劑量的范圍可以為大約1 μ g/kg到大約100mg/kg或者更多，取決于上述因素。對于持續數天或更長時間的重復給藥，根據疾患，治療維持到直至發生期望的疾病癥狀抑制。然而， 其它劑量方案可能也是有用的。在優選的方面，本發明的抗體每兩至三周以劑量范圍大約 5mg/kg至大約15mg/kg施用。更優選地，此類給藥方案與化療方案組合作為治療轉移性結腸直腸癌的一線療法。在一些方面，化療方案涉及傳統高劑量間歇性施用(intermittent administration)。在一些其它方面，化療劑使用更小和更頻繁的劑量施用，沒有預定的間歇(節律化學療法(“metronomic chemotherapy”))。本發明的療法的進展通過常規技術和測定容易地監測。在一些實施方案中，本發明的方法中使用的抗-VEGF抗體是貝伐珠單抗。在某些實施方案中，例如，當組合使用時，貝伐珠單抗以從大約0. 05mg/kg至大約15mg/kg的范圍施用。在一個實施方案中，可向受試者施用大約0. 5mg/kg, 1. 0mg/kg,2. 0mg/kg, 3. Omg/ kg,4. Omg/kg,5. Omg/kg,6. Omg/kg,7. Omg/kg,7. 5mg/kg,8. Omg/kg,9. Omg/kg,lOmg/kg 或 15mg/kg(或其任何組合)的一種或多種劑量。此類劑量可間歇性施用，例如每天、每三天、 每周或每兩至三周。在另一個實施方案中，例如，當組合使用時，貝伐珠單抗以每隔一周 10mg/kg或每三周15mg/kg靜脈內施用給受試者。下述實施例僅為示例性目的提供，不應根據本文教導作限制性解釋。 實施例實施例1癌癥患者中更高基線PlGF水平與更短存活相關研究受試者和治療樣品收集自AVF-0776，其是至少一種用于轉移性疾病的常規化療方案后已經復發的患有轉移性乳腺癌患者的貝伐珠單抗單一療法(monotherapy)的研究。所有受試者每2 周接受3mg/kg、1 Omg/kg或20mg/kg的貝伐珠單抗，共六次輸注。在第70天腫瘤評估時，無疾病進展證據的受試者可繼續接受每2周的貝伐珠單抗直到第1M天(六次以上輸注)，然后進行腫瘤評估。在第巧4天無疾病進展證據的受試者在第168天接受貝伐珠單抗的最終輸注。經歷疾病進展的受試者從該研究中停止。在完成研究或退出研究后，在第0天后對受試者進行1年存活狀態的追蹤。樣品和方法來自于受試者的外周靜脈血直接抽入帶有淡紫色常規蓋子的BD Vacutainer塑料EDTA管中。收集后，輕輕混合樣品并允許其靜置30分鐘。通過在室溫3，OOOxg離心20 分鐘獲得血漿。選擇來自全部67個患者的樣品，這些患者用貝伐珠單抗處理后患有復發的轉移性乳腺癌，并且可從這些患者在第0天至第56天(第0天、第14天、第觀天、第42天和第56天)至少兩個時間點獲得血漿樣品。
根據制造商的說明書，在治療開始之前的第0天時用MSD MS6000人生長因子試劑盒(K11029C-1 Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD)測量患者血漿中的基線 PlGF 水平。為了使PlGF水平和臨床結果關聯，使用Kaplan-Meier方法學和時序(log-rank) (Mantel-Cox)檢驗用于分析從研究起始(首次給藥)的存活期。結果該時序檢驗(log-rank test)確定在基線的^pg/ml血漿PlGF水平與患者的總存活相關顯著變化(P < 0. 0026 ；見圖1)。在開始治療之前第O天具有大于^pg/ml的基線血漿PlGF水平的患者中，中值總存活時間是171天。相比之下，在開始治療之前第O天具有小于或等于^pg/ml的基線PlGF水平的患者中，中值總存活時間是417天。這些結果表明患者基線血漿PlGF水平是進行抗-血管發生療法的癌癥患者的存活益處的預測指標 (predictor)0實施例2 用貝伐珠單抗治療的患者中血漿PlGF水平增加如上面實施例1中所描述，治療患者并收集血漿樣品。在貝伐珠單抗治療的過程中監測血漿PlGF水平。結果顯示用貝伐珠單抗治療之后血漿PlGF水平增加(見圖幻。用貝伐珠單抗治療之后的第14、28、42和56天在患者中觀察到超過1. 5倍的中值增加。實施例3 用貝伐珠單抗治療之后的患者中更高的血漿PlGF水平與更短的總存活相關如上面實施例1中所描述，治療患者，測量血漿樣品和血漿PlGF水平。為了使血漿PlGF水平和臨床結果相關，使用Kaplan-Meier方法學和時序(Mantel-Cox)檢驗用于分析從研究起始(首次給藥)的存活期。時序檢驗結果表明在貝伐珠單抗治療第14天50pg/ml的血漿PlGF水平是與患者的總存活相關的重要變量(P < 0. 0003 ；見圖3)。開始貝伐珠單抗治療之后具有大于50pg/ ml的基線血漿PlGF水平的患者的中值存活時間為165天。相比之下，開始貝伐珠單抗治療之后具有小于或等于50pg/ml的血漿PlGF水平的患者的中值存活時間為431天。這些結果表明已經開始用抗血管生成療法(例如貝伐珠單抗)治療的患者中血漿PlGF水平是進行抗-血管發生療法的癌癥患者中存活益處的預測指標(predictor)。
權利要求
1.鑒定可受益于不同于抗-血管生成療法的抗癌療法或除抗-血管生成療法以外的抗癌療法的患有癌癥的患者的方法，包括確定從所述患者獲得的樣品中胎盤生長因子(PlGF)的表達水平， 其中，與參照樣品相比較，從所述患者獲得的樣品中PlGF增加的表達水平表明所述患者可受益于不同于抗-血管生成療法的抗癌療法或除抗-血管生成療法以外的抗癌療法。
2.預測患有癌癥的患者對抗-血管生成療法的反應性的方法，包括確定從所述患者獲得的樣品中PlGF的表達水平，其中，與參照樣品相比較，從所述患者獲得的樣品中PlGF增加的表達水平表明所述患者對單獨的抗-血管生成療法有反應的可能性更低。
3.監測抗-血管生成療法的效力的方法，包括確定從患者獲得的樣品中PlGF的表達水平，其中，與參照樣品相比較，從所述患者獲得的樣品中PlGF增加的表達水平表明所述患者對單獨的抗-血管生成療法有反應的可能性更低。
4.優化癌癥治療的治療功效的方法，所述方法包括確定從患者獲得的樣品中PlGF的表達水平，其中，與參照樣品相比較，從所述患者獲得的樣品中PlGF增加的表達水平表明所述患者對單獨的抗-血管生成療法有反應的可能性更低。
5.權利要求1-4中任意一項的方法，其中從所述患者獲得的樣品中PlGF的表達水平與參照樣品相比較增加至少大約1. 5倍。
6.權利要求1-4中任意一項的方法，其中所述抗-血管生成療法包括施用VEGF拮抗劑。
7.權利要求6的方法，其中所述VEGF拮抗劑是抗-VEGF抗體。
8.權利要求7的方法，其中所述抗-VEGF抗體是貝伐珠單抗。
9.權利要求5的方法，其中所述癌癥是乳腺癌。
10.權利要求1-4中任意一項的方法，其中從所述患者獲得的樣品是血漿。
11.權利要求10的方法，其中PlGF的表達水平通過檢測血漿中的PlGF蛋白來確定。
12.權利要求1-4中任意一項的方法，其中所述樣品在抗-血管生成療法之前從所述患者獲得。
13.權利要求1-4中任意一項的方法，其中所述樣品在抗-血管生成療法開始之后從所述患者獲得。
14.權利要求12的方法，其中所述樣品在抗-血管生成療法開始之后的M小時內從所述患者獲得。
15.權利要求12的方法，其中所述樣品在抗-血管生成療法開始之后的14天內從所述患者獲得。
16.權利要求1-4中任意一項的方法，還包括向所述患者施用抗癌療法，其中所述抗癌療法不同于抗-血管生成療法或是除抗-血管生成療法以外的抗癌療法。
17.權利要求16的方法，其中，從所述患者獲得樣品中PlGF的表達水平與參照樣品相比較增加時，向所述患者施用所述抗癌療法。
18.檢測PlGF表達水平的試劑盒，所述試劑盒包括能夠特異性檢測PlGF表達水平的化合物；和使用所述試劑盒預測患有癌癥的患者對單獨抗-血管生成療法的反應性的說明書，其中，與參照樣品相比較，PlGF增加的表達表明所述患者可受益于不同于抗-血管生成療法的抗癌療法或除抗-血管生成療法以外的抗癌療法。
全文摘要
本文公開了用于鑒定可能賦予患有癌癥患者最佳臨床益處療法的方法和組合物。
文檔編號G01N33/574GK102265157SQ200980152483
公開日2011年11月30日 申請日期2009年12月22日 優先權日2008年12月23日
發明者嚴義兵, 保羅·J·菲爾德, 吳群·珍妮 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司