細胞色素c乙酰化的檢測和調節的制作方法

專利名稱：細胞色素c乙酰化的檢測和調節的制作方法
技術領域：
本發明涉及診斷和治療神經退行性疾病和癌癥的方法。
背景技術：
細胞色素c是線粒體內膜中的含血紅素蛋白，其中其是電子傳遞鏈的成分。細胞色素C也是內源性凋亡途徑(intrinsic apoptotic pattiway)的一部分。在經歷細胞凋亡的細胞中，細胞色素c從線粒體膜釋放出來，與凋亡蛋白酶活化因子1 (apoptotic protease-activating factor-1) (APAFl)相互作用，從而形成凋亡體，該凋亡體激活參與介導細胞死亡的胱天蛋白酶(caspases)。細胞色素c的釋放和細胞至細胞凋亡的細胞定向(commitment)是被高度調控的過程，并且代表了與細胞凋亡相關的病癥的靶調控步驟。已顯示細胞色素c活性通過多個因子來調控，包括BCL2家族成員、胱天蛋白酶、熱激蛋白、影響線粒體分裂/融合的蛋白質、 鈣水平、細胞色素c的氧化還原狀態的調控、亞硝基化作用、組蛋白Hl. 2和細胞溶膠p53 (0w 等人，Q008) Nat Rev Mol Cell Biol 9:532-542)。發明概述
本文中描述了用于調控細胞色素c的新型方法，包括乙酰化的調控。已顯示細胞色素 C乙酰化與細胞經歷細胞凋亡相關聯。因此，細胞色素C乙酰化水平的檢測已用于神經退行性病癥的診斷，并且細胞色素C的脫乙酰化代表了用于治療神經退行性病癥的治療方法。 此外，通過細胞色素C的乙酰化產生的細胞凋亡的誘導和細胞色素C水平的監控具有對于癌癥的診斷和治療性應用。本發明的方面涉及用于通過檢測受試者的樣品中乙酰化細胞色素c水平表征受試者患神經退行性病癥的風險的方法，其中相對于預定值，受試者的樣品中升高的乙酰化細胞色素c水平標示著增加的患神經退行性病癥的風險。樣品中乙酰化細胞色素c的水平可通過本領域技術人員已知的任意方法例如使用特異性結合乙酰化細胞色素c的抗體和/ 或通過使用質譜法來檢測。在本發明的一些實施方案中，用于表征受試者的神經退行性病癥的風險的方法包括檢測受試者的樣品中相應于全長野生型細胞色素c多肽中的殘基K40的賴氨酸殘基的乙酰化，其中受試者的樣品中相應于全長野生型細胞色素c多肽中的殘基K40的賴氨酸殘基的乙酰化的存在表示受試者具有增加的患神經退行性病癥的風險。在某些實施方案中，通過質譜法檢測賴氨酸殘基K40的乙酰化。在本發明的一些實施方案中，用于表征受試者患神經退行性病癥的風險的方法包括檢測受試者的樣品中相應于全長野生型細胞色素c多肽的殘基K74的賴氨酸殘基的乙酰化，其中受試者的樣品中相應于全長野生型細胞色素c多肽中的殘基K74的賴氨酸殘基的乙酰化的存在表示受試者具有增加的患神經退行性病癥的風險。在某些實施方案中，通過質譜法檢測賴氨酸殘基K74的乙酰化。在一些實施方案中，用于表征受試者患神經退行性病癥的風險的方法包括檢測受試者的樣品中相應于全長野生型細胞色素C多肽的殘基K40和K74的賴氨酸殘基的乙酰化，其中相應于全長野生型細胞色素c多肽中的殘基K40和K74的賴氨酸殘基的乙酰化的存在表示受試者具有增加的患神經退行性病癥的風險。在某些實施方案中，通過質譜法檢測賴氨酸殘基K40和K74的乙酰化。本發明的方面涉及用于診斷受試者的神經退行性病癥的方法，包括檢測受試者的樣品中乙酰化細胞色素c水平，其中相對于預定值，受試者的樣品中升高的乙酰化細胞色素c水平標示著神經退行性病癥。在某些實施方案中，通過使用特異性結合乙酰化細胞色素c的抗體和/或通過使用質譜法檢測受試者的樣品中乙酰化細胞色素水c的水平。本發明的其他方面涉及用于評估療法在患有神經退行性病癥的受試者中的功效的方法，包括檢測受試者的樣品中細胞色素c的乙酰化水平，其中相對于預定值，受試者的樣品中細胞色素c的乙酰化水平標示著所述療法是否有效。在某些實施方案中，通過使用特異性結合乙酰化細胞色素C的抗體和/或通過使用質譜法檢測受試者的樣品中乙酰化的細胞色素C的水平。本文中還描述了用于治療患有神經退行性病癥的受試者的方法，包括給需要此種治療的受試者施用有效量的化合物以使受試者的乙酰化細胞色素c水平降至低于預定值，其中所述化合物是激活sirtuin的化合物。在一些實施方案中，本發明包括抑制細胞的細胞凋亡，其中通過將所述細胞與使細胞色素c脫乙酰化的試劑接觸來乙酰化細胞色素 c。使細胞色素c脫乙酰化的試劑可以是脫乙酰酶蛋白例如sirtuin。在一些實施方案中， sirtuin 是 SIRT3。本發明的其他方面涉及通過進行確定患者是否患有癌癥(所述癌癥顯示相應于全長野生型細胞色素c多肽中的殘基K40和K74的賴氨酸殘基的脫乙酰化)的測定來確定癌癥患者是否應當用乙酰細胞色素c的試劑來進行治療，其中如果患者患有顯示相應于全長野生型細胞色素c多肽中的殘基K40和K74的賴氨酸殘基的脫乙酰化的癌癥，那么患者是利用乙酰化細胞色素c的組合物的治療的候選者。本文中描述了用于誘導細胞的細胞凋亡的方法，其中通過將所述細胞與乙酰化細胞色素c的試劑接觸來使細胞色素c脫乙酰化，從而誘導細胞的細胞凋亡。在一些實施方案中，細胞存在于體內并且所述方法還包括將細胞與另外的治療劑接觸。本發明的一些實施方案包括方法，所述方法通過將顯示細胞色素C的脫乙酰化的癌細胞與以有效地減少癌細胞的活力的量的乙酰化細胞色素C的試劑接觸來減少所述癌細胞的活力。在一些實施方案中，細胞存在于體內并且所述方法還包括將所述細胞與另外的治療劑接觸。本文中還描述了特異性結合乙酰化細胞色素c多肽的表位的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述表位包含相應于全長野生型人細胞色素c氨基酸序列中的殘基K40的乙酰化殘基。在一些實施方案中，分離的抗體或其抗原結合片段以約1 χ IO-6MU χ ΙΟ"7 MU χ IO"8 MU χ IO-9MU χ 1(T1QM、5 χ 1(T1Q M 或 1 χ 1(Γ" M 或更小的結合親和力特異性結合表位。在某些實施方案中將抗體或其抗原結合片段連接至可檢測的標記物。本文中還包括編碼此類抗體的核酸分子、含有此類核酸分子的雜交瘤和產生此類抗體的雜交瘤細胞系。本發明的方面還包括含有編碼本文中描述的抗體或抗原結合片段的分離的核酸分子的表達載體、用此類表達載體轉化或轉染的宿主細胞和產生本文中描述的抗體或抗原結合片段的質粒。在一些實施方案中，本發明涉及包含本文中描述的抗體或抗原結合片段的組合物。本文中還描述了特異性結合乙酰化細胞色素c多肽的表位的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述表位包含相應于全長野生型人細胞色素c氨基酸序列中的殘基Κ74 的乙酰化殘基。在一些實施方案中，分離的抗體或其抗原結合片段以約1 χ IO-6MU χ ΙΟ"7 MU χ IO"8 MU χ IO-9MU χ 1(T1QM、5 χ 1(T1Q M 或 1 χ 1(Γ" M 或更小的結合親和力特異性結合表位。在某些實施方案中，將抗體或其抗原結合片段連接至可檢測的標記物。本文中還包括編碼此類抗體的核酸分子、含有此類核酸分子的雜交瘤和產生此類抗體的雜交瘤細胞系。本發明的方面還包括含有編碼本文中描述的抗體或抗原結合片段的分離的核酸分子的表達載體、用此類表達載體轉化或轉染的宿主細胞和產生本文中描述的抗體或抗原結合片段的質粒。在一些實施方案中，本發明涉及包含本文中描述的抗體或抗原結合片段的組合物。本文中還描述了用于鑒定調節SIRT3的脫乙酰酶活性的化合物的方法。此類方法包括在測試化合物存在的情況下將乙酰化細胞色素c多肽底物與SIRT3脫乙酰酶接觸，以及測定在所述測試化合物存在的情況下細胞色素c多肽底物的乙酰化水平。在一些實施方案中，細胞色素c多肽底物包含至少一個相應于全長野生型人細胞色素c多肽的殘基Κ40 和/或Κ74的乙酰化賴氨酸殘基。與對照相比較在測試化合物存在的情況下細胞色素c多肽底物的乙酰化水平的降低標示著增加SIRT3脫乙酰酶活性的化合物。與對照相比較，在測試化合物存在的情況下細胞色素c多肽底物的乙酰化水平的增加標示著減少SIRT3的脫乙酰酶活性的化合物。在一些實施方案中，使用質譜法測定細胞色素c多肽底物庫的乙酰化水平。在一些實施方案中，質譜是電噴霧電離(ESI)質譜法或基質輔助激光解析/電離(MALDI)質譜法。在上述方法的一些實施方案中，細胞色素c多肽底物包含單個多肽種類，然而在其他實施方案中，細胞色素c多肽底物包含兩個或更多個多肽種類的混合物。在一些實施方案中，細胞色素c多肽底物包括全長細胞色素c多肽。在其他實施方案中，細胞色素C多肽底物是細胞色素C的片段，其包含至少一個相應于全長野生型人細胞色素C多肽的殘基Κ40和/或Κ74的賴氨酸殘基。在其他實施方案中，細胞色素C多肽底物是細胞色素c的片段的融合物，其包含至少一個相應于全長野生型人細胞色素c多肽的殘基Κ40和/或Κ74的的賴氨酸殘基。在一些實施方案中，測試化合物是小分子，例如小有機分子。在一些實施方案中， 測試化合物是分子的文庫，該文庫在某些實施方案中可包括小分子例如小有機分子。在一些實施方案中，SIRT3脫乙酰酶來自細胞或組織裂解物。
在一些實施方案中，細胞色素c多肽底物存在于細胞中。在一些實施方案中，SIRT3是能夠在NAD+或NAD+類似物存在的情況下使包含乙酰化的K40和/或K74的細胞色素c底物脫乙酰化的全長(人)SIRT3的催化活性片段。本文中還描述了用于測定SIRT3的活性的乙酰化多肽底物。所述底物包括細胞色素c的片段，該片段包含至少一個相應于全長野生型人細胞色素c多肽的殘基K40和/或 K74的乙酰化賴氨酸殘基。在一些實施方案中，多肽底物是細胞色素c的片段的融合物，其包含至少一個相相應于全長野生型人細胞色素c多肽的殘基K40和/或K74的乙酰化賴氨酸殘基。本文中還提供了包括前述乙酰化多肽底物的試劑盒。參考本發明的附圖和詳細說明，本發明的這些和其他方面以及其各種實施方案將變得更顯然。附圖概述
附圖不想按規定比例畫圖。為清楚起見，可以不在每一個附圖中標記每一種成分。在附圖中


圖1提供了顯示鑒定細胞色素c中乙酰化位點的質譜分析的結果的表。圖1中顯示的小鼠細胞色素c的蛋白質序列提供為SEQ ID N0:1。圖2提供了顯示鑒定在轉染的hSIRT3不存在的情況下細胞色素c中乙酰化位點的質譜分析的結果的表。圖3提供了顯示在轉染的hSIRT3存在的情況下的質譜分析的結果的表，其顯示細胞色素c在SIRT3存在的情況下被脫去乙酰基。圖4提供了多個物種的細胞色素c蛋白的序列比對。人、小鼠、果蠅和釀酒酵母(5 cereWsiae)細胞色素c蛋白的蛋白質序列分別提供為SEQ ID NO:2,SEQ ID NO: USEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4。圖 5 提供顯示可使用抗 PAN 抗體(Cell Signaling Technology, Beverly, MA) 檢測K74的乙酰化的Wfestern印跡。圖6提供顯示證明細胞色素c與SIRT3相互作用的免疫沉淀實驗的結果的 Western 印跡。圖7提供顯示證明SIRT3可使內源細胞色素c脫乙酰化的脫乙酰化測定的結果的 Western 印跡。圖8提供了顯示使用SIRT3敲除小鼠進行的行為實驗的實驗步驟的示意圖。圖9提供了顯示紅藻氨酸對野生型和SIRT3敲除小鼠中原代小腦顆粒神經元的作用的圖和示意圖。圖10提供了顯示野生型和SIRT3敲除小鼠的體重變化的圖。圖11提供了顯示雌性野生型和SIRT3敲除小鼠的學習時間的圖。圖12提供了顯示雄性野生型和SIRT3敲除小鼠的學習時間的圖。圖13提供了顯示進行恐懼條件化實驗的實驗步驟的示意圖。圖14提供了顯示由紅藻氨酸注射引起的海馬和杏仁核神經元的丟失的圖。圖15提供了顯示SIRT3敲除小鼠的場景恐懼條件化實驗的結果的圖。圖16提供了顯示恐懼條件化實驗中活性水平的圖。圖17提供了描述使用曠場試驗測試小鼠的運動行為所遵循的實驗步驟的示意圖。圖18提供了顯示在曠場試驗和水迷宮測試中被測試的野生型和SIRT3敲除小鼠的體重的圖。圖19提供了顯示野生型和SIRT3敲除小鼠在曠場試驗中旅行的距離的圖。圖20提供了顯示野生型和SIRT3敲除小鼠在曠場試驗的運動速度的圖。圖21提供了顯示來自利用野生型和SIRT3敲除小鼠進行的水迷宮實驗的第1天的結果的圖，所述實驗使用用旗幟標記的可見平臺。圖22提供了顯示對野生型小鼠進行的水迷宮實驗的探索試驗2的結果的示意圖。圖23提供了顯示對SIRT3敲除小鼠進行的水迷宮實驗的探索試驗2的結果的示意圖。圖M提供了顯示野生型和SIRT3敲除小鼠在水迷宮實驗的探索試驗1中在不同象限中花費的時間的圖。圖25提供了顯示野生型和SIRT3敲除小鼠在水迷宮實驗的探索試驗1中在不同象限中花費的時間的百分比的圖。圖沈提供了顯示野生型和SIRT3敲除小鼠在水迷宮實驗的探索試驗2中在不同象限花費的時間的圖。圖27提供了顯示野生型和SIRT3敲除小鼠在水迷宮實驗的探索試驗2中在不同象限花費的時間的百分比的圖。圖觀提供了顯示使用PAN抗體(乙酰化-賴氨酸抗體，Cell Signaling Technology, Beverly, MA)進行的來自野生型和HRT3敲除小鼠的海馬裂解物的免疫沉淀實驗的結果并且揭示了 SIRT3敲除小鼠的海馬中蛋白質的超乙酰化的凝膠的圖像。圖四提供了與本發明相關的試劑盒的示意圖。圖四中顯示的試劑盒(10)包括一組用于裝化合物(12)或(14)例如用于激活SIRT3的化合物的容器。試劑盒任選地包括說明書00)。試劑盒中還可包括其他成分。發明詳述
本發明至少部分基于令人驚訝的發現細胞色素c在至少兩個賴氨酸(K)殘基Κ40和 Κ74上被乙酰化。已顯示細胞色素c的脫乙酰化是通過與脫乙酰酶SIRT3的相互作用介導的，在本文中顯示所述脫乙酰酶SIRT3參與保護神經元免受細胞死亡。監控和調控細胞色素c的乙酰化提供了用于多種疾病包括與細胞死亡相關的疾病的診斷和治療來源。本發明的方面涉及細胞色素c多肽的乙酰化的發現。如本文中所使用的，術語“蛋白質”和“多肽”可互換使用，從而術語多肽可用于指全長多肽并且也可用于指全長多肽的片段。術語“乙酰化細胞色素c多肽”意指在一個或更多個賴氨酸殘基上被乙酰化的細胞色素c多肽。在一些實施方案中，超過1個賴氨酸(K)殘基被乙酰化。在一些實施方案中，只有1個賴氨酸殘基被乙酰化。在一些實施方案中，細胞色素c多肽可以只在相應于野生型全長人細胞色素c多肽的Κ40殘基的殘基上被乙酰化。在一些實施方案中，細胞色素 c多肽可以只在相應于野生型全長人細胞色素c多肽的Κ74殘基的殘基上被乙酰化。在一些實施方案中，細胞色素c多肽可以在相應于野生型全長人細胞色素c多肽的殘基Κ40和殘基Κ74的殘基上被乙酰化。在一些實施方案中，細胞色素c多肽可以在相應于野生型全長人細胞色素c多肽的殘基Κ40和Κ74的殘基和在一個或更多個其他賴氨酸殘基上被乙酰化。在一些實施方案中，K40和/或K74或被乙酰化的其他賴氨酸位置可用于本發明的方法和/或產物。野生型全長人細胞色素c多肽的位置40中的殘基是賴氨酸，并且野生型全長人多肽中的該賴氨酸和相應于細胞色素c的片段和突變形式中的該位置的殘基在本文中可稱為“K40”。其中K40殘基被乙酰化的細胞色素c在本文中可稱為“K40-乙酰化細胞色素C”。野生型全長人細胞色素c多肽的位置74中的殘基是賴氨酸，并且野生型全長多肽中的該賴氨酸和相應于細胞色素c的片段和突變形式中的該位置的殘基在本文中可稱為 “K74”。其中K74殘基被乙酰化的細胞色素c在本文中可稱為“K74-乙酰化細胞色素C”。野生型全長人細胞色素c多肽具有如Genbank登錄號NP_061820所示的氨基酸序列。乙酰化野生型全長人細胞色素c多肽還具有Genbank登錄號NP_061820中所示的氨基酸序列，但其在一個或更多個其賴氨酸殘基上被乙酰化。編碼人野生型全長細胞色素c的核酸序列示于Genbank登錄號NM_018947。小鼠細胞色素c的核酸和蛋白質序列分別相應于 Genbank 登錄號 X01756 和 CAA25899。在本發明的細胞色素c多肽序列包括野生型細胞色素c多肽序列和/或突變的細胞色素c多肽序列中可存在等位基因變異。如本文中所使用的，術語“等位基因變體”意指占據相同染色體基因座的基因的兩個或更多個可選擇形式的任意形式。等位基因變異天然地通過突變產生，并且可導致群體內的多態性。基因突變可以是沉默的(編碼的多肽中無變化)或可編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。本領域技術人員理解此類等位基因變異可存在于全長野生型和突變的細胞色素C多肽中和野生型和突變的多肽的片段中。本發明的細胞色素C多肽可以是野生型細胞色素C或突變的細胞色素C多肽序列的等位基因變體。本領域技術人員將能夠使用常規方法鑒定野生型和突變的細胞色素C多肽的變體的哪個殘基相應于野生型細胞色素C多肽的殘基。片段
在一些實施方案中，細胞色素C多肽的片段中的乙酰化賴氨酸殘基稱為乙酰化K40殘基或K74殘基，即使所述片段不是全長細胞色素c多肽。本領域技術人員可通過使用常規序列比較方法容易地確定細胞色素c多肽序列(野生型或突變體)中的乙酰化殘基與全長野生型細胞色素c多肽中的殘基的相應性。在一些方面，本發明可包括乙酰化全長細胞色素c多肽或其乙酰化片段的合成。 本發明的合成方法可包括任何本領域已知的合成方法例如現有的天然或合成的細胞色素c 多肽的乙酰化，或在合成過程中乙酰化賴氨酸殘基至細胞色素c多肽中的摻入。乙酰化賴氨酸的摻入可包括下列乙酰化步驟，該摻入在賴氨酸的ε氨基上發生
賴氨酸+乙酰-CoA ->乙酰-賴氨酸+ H2O
如本文中對于多肽，蛋白質或其片段所使用的，“分離的”意指從其天然環境分離并且以充足的量存在以允許其的鑒定或使用。分離的，當指蛋白質或多肽時，意指例如(i)通過表達克隆選擇性產生的或(ii)通過層析或電泳純化的。分離的蛋白質或多肽可以是但不必是大體上純的。術語“大體上純的”意指在對于它們的期望的用途是切實可行和適當的程度上蛋白質或多肽基本上不含與它們一起在生產、自然界或體內系統中被發現的其他物質。大體上純的多肽可使用本文中描述的方法來天然獲得或產生并且可用本領域內公知的技術來純化。因為可將分離的蛋白質與制劑中的治療成分，例如藥物制劑中的藥學上可接受的載體混合，因此，蛋白質可以只包含按重量計算少量百分比的制劑。然而，蛋白質是分離的因為已將其與在有生命系統中與其結合的物質分開，即從其他蛋白質分離的。根據本發明的一些方面，提供了全長野生型或突變型細胞色素c多肽的片段。本發明的片段優選是保持多肽的獨特功能能力的片段。可在片段中保留的功能能力包括乙酰化、與抗體的相互作用和與其他多肽或其片段的相互作用。可使用本領域內已知的方法合成多肽片段，并且可使用本文中例舉的方法測試其功能。乙酰化細胞色素c多肽的片段可包含至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、102 或更多個(包
括之間的每一個整數)具有在本文中描述的野生型人細胞色素c多肽或經修飾的細胞色素c多肽序列中發現的連續序列的細胞色素c多肽的連續氨基酸。在一些實施方案中，片段包括相應于全長野生型人細胞色素c多肽的K40和/或K74的賴氨酸殘基。相應于K40 和K74的殘基可以被或可以不被乙酰化.可使用本領域內已知的合成方法制備乙酰化細胞色素c多肽的片段或其可以是乙酰化細胞色素c多肽的天然片段。此類片段用于多種目的，包括用于特異性結合合成的和天然的乙酰化細胞色素c多肽的分子的制備和用于本領域技術人員公知的免疫測定，包括競爭性結合免疫測定。在一些實施方案中，乙酰化細胞色素c的片段可用于測定SIRT3的活性或抑制SIRT3的活性。本領域技術人員將理解制備全長野生型或突變的細胞色素c多肽的片段的方法。 全長野生型或突變的色素c多肽的乙酰化片段可包括相應于野生型全長人細胞色素c多肽的K40和/或K74賴氨酸的乙酰化賴氨酸和/或可包括相應于野生型全長人細胞色素c多肽的不同賴氨酸的乙酰化賴氨酸。此外，在本發明的一些實施方案中，細胞色素c多肽的片段可包括K40和/或K74殘基和一個或更多個另外的賴氨酸殘基，以及一個、每一個、一些或沒有一個賴氨酸可被乙酰化。本領域技術人員知道人細胞色素c的功能同源物存在于多個物種中。來自其他物種的功能上與人細胞色素c同源的乙酰化多肽(包括全長蛋白質和全長蛋白質的片段)與本發明是相容的。本領域技術人員知道鑒定同源蛋白質中在功能上與人細胞色素c的殘基 K40或K74同源的殘基的技術。例如，圖4提供了多個物種中細胞色素c蛋白的序列比對。 雖然人細胞色素c K74在各物種中是保守的，但在一些物種中該殘基不在該物種中的細胞色素c蛋白的位置74上。然而基于序列比對和本領域技術人員已知的其他方法，來自給定的物種的細胞色素c多肽的哪個殘基在功能上與人細胞色素c的殘基K74是同源的將是顯而易見的。應當理解，本發明的方面包括人野生型全長細胞色素c蛋白質的乙酰化的檢測， 以及還有人細胞色素c蛋白的片段、變體和突變體中細胞色素c蛋白的乙酰化的檢測。此外，本發明的方面包括來自任意其他物種的細胞色素C蛋白的乙酰化的檢測，包括來自任意其他物種的野生型全長細胞色素C蛋白的乙酰化的檢測，和來自任意其他物種的細胞色素C蛋白的片段、變體和突變體的乙酰化的檢測。“經修飾的”野生型或突變的色素c多肽或其片段可包括缺失、點突變、截斷、氨基酸置換和/或氨基酸或非氨基酸部分的添加。本發明的多肽的修飾可通過修飾編碼多肽的核酸來產生或可選地，修飾可以例如通過切割、連接體分子的添加、可檢測部分例如生物素的添加、載體分子的添加等來直接對多肽作出。修飾還包括包含全部或部分多肽的氨基酸序列的融合蛋白。一般地，經修飾的細胞色素c多肽包括經特殊修飾以改變多肽的與其生理活性無關的特征的多肽。例如，可置換或缺失半胱氨酸殘基以防止不期望的二硫鍵。多肽修飾可通過選擇氨基酸置換、缺失和/或添加來產生，以及經修飾的多肽可使用本領域已知的方法來合成。然后測試經修飾的多肽的一個或更多個活性(例如，抗體結合、抗原性等)以確定提供具有期望的性質的經修飾的多肽的修飾。本領域技術人員還認識到可在多肽中進行保守氨基酸置換以提供功能上等同的多肽，即，保持野生型或突變的色素c多肽的功能能力的經修飾的細胞色素c多肽。如本文中所使用的，“保守氨基酸置換”是指不改變其中進行了氨基置換的蛋白質的相對電荷或大小特征的氨基酸置換。可按照用于改變多肽序列并且本領域技術人員已知的方法制備經修飾的細胞色素c多肽。示例性功能上等同的細胞色素c多肽包括細胞色素c多肽或其片段的保守氨基酸置換。氨基酸保守置換包括下列組內的氨基酸之間進行的置換(a) M、I、L、 V; (b) F、Y、W; (c) K、R、H; (d) A、G; (e) S、T; (f) Q、N;和(g) E、D。細胞色素c多肽中的保守氨基酸置換通常可通過改變編碼多肽的核酸來產生。此類置換可利用本領域技術人員已知的多種方法來產生。例如，可利用PCR-定點突變、定點誘變或通過編碼細胞色素c多肽的基因的化學合成來產生。其中對多肽的小片段進行氨基酸置換，置換可通過直接合成多肽來產生。可通過將編碼改變的多肽的基因克隆入細菌或哺乳動物表達載體，將所述載體引入適當的宿主細胞，表達改變的多肽并且如本文中所公開的測試多肽的功能能力來測試功能性等同的細胞色素c多肽的片段的活性。如上所描述的，全長野生型或突變的細胞色素c多肽的片段可以是合成的多肽。 如本文中所使用的，術語“合成的”意指人工制備的。合成的多肽是被合成的并且不是天然產生的多肽分子(例如，不是動物或生物體中產生的)的多肽。要理解，天然多肽(例如，內源多肽)的序列可以與合成的多肽的序列相同，但后者將使用至少一個合成步驟來制備。如本文中所使用的，合成的乙酰化多肽是用合成方法乙酰化的多肽，所述方法可以是但不限于本發明的方法。本發明的乙酰化的多肽可以是天然地乙酰化的多肽(例如，內源性乙酰化多肽)或可以是合成的乙酰化多肽。雖然合成的乙酰化的多肽可以與天然的乙酰化的多肽不同，但針對本發明的合成的多肽產生的抗體將以高親和力特異性結合針對其產生了所述抗體的合成的多肽表位，以及也將以高親和力特異性結合多肽中的天然表位。 因此，即使合成的多肽的乙酰化的表位可在氨基酸序列上與天然乙酰化多肽中的相同表位略微不同，針對本發明的合成的乙酰化表位產生的抗體在大多數情況下以高親和力特異性結合天然乙酰化表位和結合合成的乙酰化表位。使用合成的乙酰化多肽產生的本發明的抗體在大多數情況下以高親和力特異性結合天然和合成的乙酰化多肽并且能夠區分天然 (異質(heterogeneous))乙酰化與天然非乙酰化的多肽，并且還能夠區分合成的乙酰化和合成的非乙酰化的多肽。通過SIRT3產生的細胞色素c脫乙酰化
組蛋白脫乙酰酶蛋白(HDAC)構成4個不同的種類。作為NAD+-依賴性脫乙酰酶的種類III HDAC被稱為sirtuins。Sirtuin是使組蛋白和非組蛋白細胞靶脫乙酰化的保守蛋白質。在人中，已鑒定了 7種sirtuin (SIRT1-7)，每一個sirtuin蛋白展示獨特的亞細胞定位和功能。已報導SIRT3蛋白展示細胞核和線粒體定位，并且已將SIRT3的功能與代謝和長壽發生關聯。在實施例部分，顯示了 SIRT3結合細胞色素c并且使其脫乙酰化。還顯示其中已將SIRT3功能敲除的小鼠展示減少的細胞存活率，這表明SIRT3在神經保護中的功能。此外，本文中顯示SIRT3在記憶形成和恐懼條件化中起作用。本發明的方面涉及調控細胞色素c的乙酰化和脫乙酰化。在一些實施方案中，本發明的方法包括增加sirtuin例如SIRT3的活性或蛋白質水平以減少細胞色素c的乙酰化。在一些實施方案中，通過施用sirtuin基因或蛋白質來增加sirtuin例如SIRT3的活性或蛋白質水平。在一些實施方案中，通過施用增加蛋白質水平或增加sirtuin的活性的化合物來增加sirtuin例如SIRT3的活性或蛋白質水平。用于激活sirtuins的方法和用于激活sirtuin的化合物的非限定性實例由美國專利申請2006/0025337(以其完整內容通過援引并入本文)中的式1_25、30和32-65提供。用于調節sirtuin的方法和化合物也提供于美國專利申請公開2007/0043050, 2007/0037865，2007/0037827，2007/0037809， 2007/0014833, 2006/0276416, 2006/0276393 和 2006/0229265 以及美國專利 7，345，178 中，將其全部以其全部內容通過援弓I并入本文。本發明還包括用于鑒定調節sirtuins例如SIRT3的化合物的篩選方法。調節 sirtuin例如SIRT3的活性的化合物在一些實施方案中可以是核酸(例如，例如適體)、多肽或小分子，例如小有機分子。在美國專利申請2006/0025337 (將其通過援引引入本文)中提供了用于調節sirtuin活性的化合物的非限定性實例，例如式1_25、30和32-65的分子或其類似物。應當理解，眾多的化合物和/或化合物文庫適合于本文中描述的篩選方法。可以以基于細胞或無細胞的形式進行測定。例如，測定可包括在其中可利用已知激活sirtuin的化合物激活sirtuin的條件下溫育(或接觸)sirtuin例如SIRT3和測試化合物，以及監控或測定與測試化合物不存在的情況下相比較在測試化合物存在的情況下 sirtuin的活化水平。sirtuin的活化水平可通過測定其使底物脫乙酰化的能力來測定。 示例性底物是乙酰化多肽或多肽的文庫或庫。在一些實施方案中，底物是細胞色素c多肽。 在一些實施方案中，底物包含單個多肽種類，然而在其他實施方案中，其包含兩個或更多個多肽種類的混合物。在一些實施方案中，底物包含一種或更多種具有一個或更多個乙酰化殘基的細胞色素c多肽。在某些實施方案中，底物包含一個或更多個具有相應于殘基K40 和/或K74的乙酰化賴氨酸殘基的細胞色素c多肽。多肽底物可單獨地或組合地包括例如全長蛋白質和/或蛋白質片段和/或異源性融合物。多肽可具有變化的長度。在一些實施方案中，細胞色素c多肽底物包括含有至少一個相應于殘基K40和/或K74的賴氨酸殘基的細胞色素c的片段的融合物。細胞色素c的片段的融合物可包含融合至任意其他多肽的片段的細胞色素c多肽的任意片段。在一些實施方案中，細胞色素c多肽底物存在于細胞中。用于篩選測定的底物在一些實施方案中可以是產熒光的。應當理解，本文中描述的方法和組合物可包括全長SIRT3蛋白或其部分。在一些實施方案中，可按照本文中描述的方法使用SIRT3的生物活性部分。SIRT3的生物活性部分是指蛋白質的具有生物活性例如在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAD+)或NAD+類似物存在的情況下使乙酰化底物(例如，細胞色素c或包含至少一個相應于殘基K40和/或K74的賴氨酸殘基的細胞色素c的片段)脫乙酰化的能力的部分。SIRT3的生物活性部分在一些實施方案中可包括NAD+結合結構域和/或底物結合結構域。在其他實施方案中， SIRT3的生物活性部分可以是通過利用線粒體基質加工肽酶(MPP)和/或線粒體中間物肽酶(mitochondrial intermediate peptidase) (MIP)的切割產生的 SIRT3 蛋白的片段。用于本文中描述的方法的SIRT3脫乙酰酶可來自細胞或組織裂解物。本文中描述的測定可用于確定SIRT3的部分是否是SIRT3的生物活性部分。在一些實施方案中，反應可進行約30分鐘，然后例如用煙酰胺終止。與HDAC熒光活性測定/藥物發現試劑盒(AK-500，BIOMOL Research Laboratories)中描述的測定相似的測定可用于測定乙酰化的水平。相似的測定描述于Bitterman等人Q002) J. Biol. Chem. 277:45099中。可將測定中sirtuin的活化水平與在一種或更多種(分開地或同時地)化合物存在的情況下sirtuin的活化水平(其可用作陽性或陰性對照)相比較。用于測定的Sirtuin可以是全長SIRT3蛋白或其生物活性部分。在一些實施方案中，用于測定的蛋白質包括SIRT3的N末端部分。用于篩選調節sirtuin例如SIRT3的化合物的方法通過援引美國專利 7，544, 497 和美國專利公開案 2009/0221020、2008/(^93081 和 2006/0252076 引入。方法可包括(i)在適合于sirtuin將多肽脫乙酰化的條件下將包含sirtuin例如 SIRT3的細胞與細胞色素c多肽底物接觸和(ii)測定多肽的乙酰化水平，其中在測試化合物存在的情況下相對于對照(例如在測試化合物不存在的情況下)多肽的乙酰化的不同水平表示測試化合物體內調節sirtuin的活性。應當理解，除了細胞色素c以外的其他底物在用于鑒定調節sirtuin的活性的化合物的此類測定中也是相容的。在一個實施方案中，篩選測定包括(i)在適合于在測試化合物不存在的情況下 sirtuin使底物脫乙酰化的條件下將sirtuin例如SIRT3與測試化合物和乙酰化底物接觸； ( )測定底物的乙酰化水平，其中與在測試化合物不存在的情況下相比較在測試化合物存在的情況下底物的更低的乙酰化水平表明所述測試化合物刺激由sirtuin產生的脫乙酰化作用，然而與在測試化合物不存在的情況下相比較在測試化合物存在的情況下底物的更高的乙酰化水平表明所述測試化合物抑制由sirtuin產生的脫乙酰化作用。用于鑒定體內調控例如刺激或抑制sirtuin例如SIRT3的化合物的方法可包括 ⑴在種類I和種類II HDAC的抑制劑存在的情況下，在適合于sirtuin在測試化合物不存在的情況下將底物脫乙酰化的條件下將細胞與測試化合物和能夠進入細胞的底物接觸；和 ( )測定底物的乙酰化水平，其中在測試化合物存在的情況下相對于測試化合物不存在的情況下底物的更低的乙酰化水平表示所述測試化合物刺激由sirtuin產生的脫乙酰化作用，然而在測試化合物存在的情況下相對于測試化合物不存在的情況下底物的更高的乙酰化水平表示所述測試化合物抑制由sirtuin產生的脫乙酰化作用。優選底物是乙酰化多肽，其也可以是發熒光的。方法還可包括裂解細胞以測定底物的乙酰化水平。在一些實施方案中，還可以以在約1 μ M至約IOmM,優選約10 μ M至ImM，更優選約ΙΟΟμΜ至ImM的范圍內變化的濃度例如約200 μ M向細胞中加入底物。在一些實施方案中，用于鑒定激活sirtuin例如SIRT3的化合物的方法可包括下文中進一步論述的質譜法。使用質譜法鑒定調控脫乙酰酶蛋白的活性的化合物的方法通過援引美國專利申請2009/0221020引入。質譜法可用于確定細胞色素c或sirtuin例如SIRT3的任意其他底物的乙酰化水平。在一些實施方案中，用于鑒定激活脫乙酰酶的化合物的方法包括在測試化合物存在的情況下將細胞色素c多肽與sirtuin例如SIRT3或其生物活性部分接觸，其中細胞色素c多肽包含至少一個乙酰化賴氨酸殘基，和使用質譜法測定細胞色素c多肽的乙酰化水平，其中在測試化合物存在的情況下與對照相比較多肽的乙酰化水平的降低標示著激活脫乙酰酶的化合物。質譜法在一些實施方案中可包括電噴霧電離 (ESI)質譜法和/或基質輔助激光解析/電離(MALDI)質譜法。在一些實施方案中，用于測定脫乙酰酶例如sirtuin的活性的方法包括將多肽與包含脫乙酰酶的細胞或組織裂解物接觸，其中多肽包含至少一個乙酰化賴氨酸殘基；以及使用質譜法測定多肽的乙酰化水平，其中多肽的乙酰化水平的降低標示著脫乙酰酶活性。脫乙酰酶可以是SIRT3并且可存在于細胞或組織裂解物中。細胞色素c多肽可存在于細胞中。在一些實施方案中，多肽底物的濃度低于sirtuin例如SIRT3對于多肽底物的Km。 例如，多肽底物的濃度可以是sirtuin對于多肽底物的Km的至多1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、 1/7、1/8、1/9、1/10、1/11、1/12、1/13、1/14、1/15 或低于 1/15。經歷本文中描述的篩選方法或由其鑒定的化合物質可以例如是小分子，例如小有機分子。此類小分子在本領域內是公知的；本文中和出版物例如US 7，544，497和US 2009/0221020中提供了此類分子的實例。本發明的方面包括制備一定量的此種化合物或其類似物，在一些實施方案中，就在動物中的功效和毒性進行化合物或其類似物的治療分析。用于進行治療分析的方法對于本領域技術人員來說是熟知的。在一些方面，方法包括使用標準方法在藥物制劑中配制化合物。本發明包括制造含有具有適當的動物毒性概況的本文中描述的的化合物或使用本文中描述的方法鑒定的化合物或其類似物的藥物制劑。可將含有具有適當的動物毒性概況的本文中描述的的化合物或使用本文中描述的方法鑒定的化合物或其類似物，的藥物制劑銷售給保健提供者(healthcare provider)。用于制備大量化合物或其類似物，進行化合物或其類似物的治療分析，在藥物制劑中配制化合物和制造包含化合物的藥物制劑的方法從美國專利7，544, 497和美國專利公開案2009/0221020 通過援引引入。本發明的方面還涉及用于測定SIRT3的活性的乙酰化多肽底物，其包括含有至少一個相應于殘基K40和/或K74的乙酰化賴氨酸殘基的細胞色素c的片段。多肽底物可以是包含至少一個相應于殘基K40和/或K74的乙酰化賴氨酸殘基的細胞色素c的片段的融合物。此類多肽可以化學合成，重組產生，或通過本領域內常規使用的任意其他方法產生。 可按照本領域內常規實踐的標準方法乙酰化所述多肽。本發明的方面還涉及包括此類乙酰化多肽底物的試劑盒，其可用于本文中描述的篩選方法。神經退行性病癥
本發明的方面涉及病癥的診斷和治療。如本文中所使用的，“病癥”是指與升高的或降低的細胞色素c乙酰化相關的任意病理狀態。在一些實施方案中，與升高的乙酰化細胞色素c相關的病癥或狀況是神經退行性病癥。如本文中所使用的，術語“神經退行性病癥”是指因神經系統的細胞和組織成分的惡化而引起的病癥、疾病或狀況。神經退行性病癥的一些非限定性實例包括中風、阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷頓病、腦室周圍白質軟化(PVL)、肌萎縮性側索硬化(ALS，“Lou Gehrig's disease”)、Guam的ALS-Parkinson’ s-Dementia綜合征、脊髓小腦性共濟失調、威爾森氏癥(Wilson’ s disease)、多發性硬化、腦癱、進行性核上性麻痹(Steel-Richardson syndrome)、延髓和假性延髓麻痹(bulbar and pseudobulbar palsy)、糖尿病性視網膜病、多發梗塞性癡呆、黃斑變性、Pick病(Pick，s disease )、彌漫性Lewy小體病、朊病毒病例如 Creutzfeldt-Jakob、GSS 氏病(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)、kuru 病及致死性家族性失眠癥、原發性側索硬化、degenerative ataxias、馬查多-約瑟夫病/ 脊髓小腦性共濟失調3型和橄欖體腦橋小腦變性、脊椎和脊延髓肌萎縮癥(肯尼迪病)、 家族性痙攣性截癱、沃-庫-韋三氏病、Tay-Sach's disease、多系統變性(multisystem degeneration) (Siy-Drager 綜合征)、Gilles de la Tourette 病、家族性自主神經失調癥(賴利-戴綜合征)、庫格爾貝格-韋蘭德病、亞急性硬化性全腦炎、韋德尼希-霍夫曼病、synucleinopathies (包括多系統萎縮)、Sandhoff 病(Sandhoff disease)、皮質基底變性(cortical basal degeneration)、痙攣性輕截癱、原發性進行性失語、進行性多灶性白質腦病、紋狀體黑質變性、家族性痙攣性疾病(familial spastic disease)、與神經退行性變才目關的慢性; 狀況(chronic epileptic conditions associated with neurodegeneration)、賓斯旺格病(Binswanger，s disease)禾口癡呆(包括癡呆的全部背后的病因學)。癌癥
本發明的方面還涉及癌癥的診斷和治療。如本文中所使用的，術語“癌癥”是指可干擾身體器官和系統的正常功能的細胞的不受控制的生長，其包括原發性和轉移性腫瘤。從它們的原始位置遷移并且接種(seed)重要器官的原發性腫瘤或癌癥最終可通過受影響的器官的功能衰退而導致受試者死亡。轉移灶是因癌癥細胞從原發性腫瘤傳播至身體的其他部分而引起的遠離原發性腫瘤位置的癌細胞或癌細胞團。轉移灶最終可導致受試者的死亡。如本文中所使用的，術語“癌癥”包括但不限于下列類型的癌癥乳腺癌(包括原位癌)、膽道癌；膀胱癌；腦癌包括成膠質細胞瘤和成神經管細胞瘤；宮頸癌；絨毛膜癌；結腸癌；子宮內膜癌；食管癌；胃癌；血液腫瘤(hematological neoplasms)包括急性淋巴細胞禾口髓性白血病(acute lymphocytic and myelogenous leukemia) ;T細胞急性成淋巴細胞白血病/淋巴瘤；多毛細胞白血病；慢性骨髓性白血病、多發性骨髓瘤；艾滋病相關白血病和成人T細胞白血病淋巴瘤；上皮內腫瘤包括鮑恩氏病(Bowen’ s disease)和帕哲氏病 (Paget' s disease)；肝癌；肺癌；淋巴瘤包括何杰金氏病和淋巴細胞淋巴瘤；間皮瘤、神經母細胞瘤；口腔癌包括鱗狀細胞癌；卵巢癌包括從上皮細胞、間質細胞(stromal cells)、 生殖細胞和間充質細胞產生的卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；直腸癌；肉瘤包括平滑肌肉瘤、 橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤，和骨肉瘤；皮膚癌包括黑色素瘤、Merkel細胞癌、卡波西肉瘤、基底細胞癌、和鱗狀細胞癌；睪丸癌包括生殖細胞瘤例如精原細胞瘤、非精原細胞瘤(畸胎瘤、絨毛膜癌)、間質瘤、和生殖細胞腫瘤；甲狀腺癌包括甲狀腺腺癌和髓樣癌； 和腎癌包括腺癌和腎母細胞瘤。癌前狀態的非限定性實例包括發育不良(dysplasia)、 癌前病變、結腸腺瘤息肉(adenomatous colon polyp)和原位癌例如導管原位癌(Ductal carcinoma in-situ) (DCIS)等。可用本發明的方法治療的其他癌癥對于本領域技術人員來說是已知的。在本發明的一些實施方案中，癌癥是黑色素瘤。在某些實施方案中，癌癥是腺癌。在一些實施方案中，癌癥是實體瘤癌癥。可使用本發明的方法治療或測定的癌癥還包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、間皮瘤等。測量細胞色素c的乙酰化
本發明在一些方面包括測定乙酰化細胞色素c多肽的水平和檢測細胞色素c的特定殘基(例如，K40和/或K74)上的乙酰化的各種測定。可用于測定細胞、組織、受試者和樣品 (例如，來自受試者的，培養中的等)中乙酰化細胞色素c多肽的水平的本發明的方法包括但不限于結合測定，包括例如使用特異性結合乙酰化細胞色素c多肽的本發明的抗體或其抗原結合片段的特異性結合測定；凝膠電泳；質譜法；NMR等。可根據本發明使用免疫測定， 包括但不限于夾心類型的測定、競爭性結合測定、一步直接測試(one-step direct test) 和兩步測試(two-step test)等。還可使用本領域已知的可檢測的標記物和適當的體內方法在體內-在活受試者中進行特異性結合乙酰化細胞色素c的抗體的結合的估量。本發明的方法和測定(例如，結合測定、凝膠電泳；質譜法；NMR等)可用于監控一段時間內細胞樣品和/或受試者中細胞色素c乙酰化水平的變化，或一段時間內細胞樣品和/或受試者中細胞色素c的特定殘基的乙酰化的變化。本文中描述的用于測量細胞色素 C的乙酰化的方法可用于如上所述的篩選Sirtuin活性例如SIRT3活性的調節劑的方法。質譜法
可利用質譜法測量細胞色素c的乙酰化。質譜法是蛋白質和肽的鑒定和蛋白質和肽內的修飾的殘基的鑒定中的重要工具。在一些實施方案中，質譜法用于測定細胞色素c的乙酰化水平。在一些實施方案中，質譜法用于確定細胞色素C是否在特定的殘基上被乙酰化。通過使用質譜法例如ESI或MALDI-MS，肽可被完整地電離成氣相并且其質量得到精確地測量。基于該信息，可使用蛋白質質量圖譜分析或肽質量圖譜分析容易地鑒定蛋白質，其中將這些測量的質量與從蛋白質數據庫推知的預測值相比較。還可通過在串聯MS實驗中片段化各個肽來獲得其他序列信息。將序列特異性蛋白酶或某些化學切割劑用于從靶蛋白獲得一組肽，然后分析其質量。將觀察到蛋白水解的片段的質量與序列數據庫中所列的所有蛋白質的理論“芯片 silicoY降解物相比較。然后按照最高概率在統計上評估和標記匹配或“命中”。串聯質譜實驗允許通過產生各個肽的片段化模式來進行肽鑒定。與肽圖譜分析實驗(P印tide mapping experiment)類似，可將實驗獲得的片段化模式與從搜索的數據庫中包括的每一個蛋白質產生的各種蛋白水解的肽的理論上產生的MS/MS片段化模式相比較。 結果的統計評估和使用搜索引擎例如％91^8〖(ThermoFinnigan Corp)和MASCOT (Matrix Science, Limited)評分算法促進最佳匹配的鑒定。串聯MS實驗中包括的部分序列信息比簡單使用肽的質量更具有特異性，因為具有相同氨基酸含量但不同氨基酸序列的兩個肽將展示不同的片段化模式。串聯質譜法，對這些離子引發片段化和進行連續質譜實驗的能力， 通常用于通過片段化獲得結構信息。 籍以起始片段化的方法之一稱為碰撞誘導解離(collision-induced dissociation) (CID)。通過用質量分析器(mass analyzer)選擇目的離子，然后使該離子經歷與中性原子或分子的碰撞來實現CID。選擇的離子將與碰撞氣體例如氬氣碰撞，從而導致片段離子，然后分析其質量。可用多種儀器，最常見地使用三重四極桿、四極桿離子阱、傅里葉變換離子回旋共振(FT-ICR)質譜儀(FTMS)、飛行時間反射器和四極桿飛行時間質譜分析器來實現 CID0與電噴霧組合的三重四極桿和四極桿離子阱是產生肽結構數據的常用方法，因為它們能夠高度靈敏，并且產生適當量的片段化信息。使用飛行時間反射器和傅里葉變換離子回旋共振的MALDI也是結構信息的常見來源。為了通過質譜法獲得肽序列信息，必須產生反映原始化合物的結構特征的離子的片段。大多數肽是線性分子，這允許相對直接地解釋片段化數據。通過將來自肽離子的一些動能轉化成振動能來起始該過程。這可通過將選擇的離子通常(M + H) +或(Μ + nH)n +離子引入碰撞小室，在碰撞小室中其與中性Ar、Xe或He原子發生碰撞，從而導致片段來實現。然后通過質量分析監控片段。串聯質譜法允許分析異質肽溶液，然后通過使目離子過濾進入碰撞室，可推知關于來自復合混合物的每一個肽的結構信息。存在使用串聯質譜法獲得完全序列信息的某些限制。例如，在測定肽的氨基酸序列中，不可能區分亮氨酸和異亮氨酸，因為它們具有相同的質量。對于賴氨酸和谷氨酰胺將產生相同的困難，因為它們具有相同的標稱質量，雖然高分辨率串聯分析儀(四極桿-TOF 和FTMQ可區分這些氨基酸。在一些優選實施方案中，可在質譜分析之前，通過凝膠電泳或液相色譜法分離蛋白質(或蛋白水解的降解物中的肽)的樣品。凝膠電泳是用于分離完整蛋白質的最廣泛使用的技術之一。在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(有時稱為一維凝膠電泳)中，用變性去垢劑SDS處理蛋白質，然后將其加載至凝膠上。在施加跨凝膠的電場時，蛋白質以與它們的大小成反比的速率朝向陽極遷移通過凝膠。在分離完成后，可使用許多不同的染色劑(考馬斯、Sypro Ruby或銀)中的任意染料使蛋白質可見，從凝膠物理切取單個條帶。將這些切取的點經歷脫色、還原烷基化、凝膠內降解、肽提取和最終進行用于蛋白質鑒定的質譜分析。SDS-PAGE電泳與等電聚集步驟的組合還使得能夠分離相似質量的蛋白質。在二維凝膠電泳OD-GE)中，首先根據它們的等電點(pi)通過將蛋白質電泳通過含有固定PH 梯度的溶液或凝膠來分離蛋白質，每一種蛋白質遷移至其中PH梯度相應于其等電點的位置。一旦完成等電聚焦步驟，在垂直方向上進行與SDS-PAGE相似的凝膠電泳以通過大小分離蛋白質。與ID凝膠一樣，可切取出2D凝膠，酶促降解，進行質譜分析以進行蛋白質鑒定。 通過使用該技術，可同時分離數千種蛋白質并且將其取出用于鑒定。已開發了用于肽圖譜分析實驗的自動液體操作機器人(Automated liquid handling robot)，該機器人可進行全部樣品制備步驟，包括凝膠脫色、烷基化/還原、凝膠內降解、肽提取和MALDI靶涂板(MALDI target plating)。已類似地使質譜數據獲取系統自動化來對大量樣品獲取譜、處理原始數據和進行數據庫搜索。可只在12小時內進行1，000多個圖譜分析實驗的商業MALDI-T0F系統是可獲得的。此類系統能夠進行自動化校準、改變激光能量和調整激光發射位置以使信號最大化，完整的數據獲取過程需要約30秒或更少。類似地，自動化數據處理系統可識別適當的信號，鑒定單同位素峰和將概況峰(summary peak)列表直接提交給搜索引擎。此類高通量蛋白組學系統使得能夠同時研究多個未知的樣品例如來自凝膠的樣品。此外，自動化獲取和數據分析軟件的靈活性允許以最小的用戶花費快速地再獲得和/ 或再分析整批樣品。然而自動化系統的局限在于它們取決于提供的數據的好壞。例如，顯示低信噪比的種類的檢測和精確質量賦值通常較差。此類問題已導致獲取后數據處理的開發。這些處理的改進已使得高通量自動化系統能夠獲得等于或高于通常獲得的鑒定“命中”率的鑒定命中率。對于凝膠電泳電泳技術的可選擇的方法包括分析分離法例如高效液相色譜法 (HPLC)的使用。然而凝膠電泳技術分離完整的蛋白質，可對蛋白水解的肽進行液相色譜法。進行肽LC-MS/MS的方法之一包括通過電噴霧離子化接口(electrospray ionization interface)將LC直接偶聯至離子阱質譜計(ion trap mass spectrometer)。適合用于這些實驗的其他質譜分析器包括三重四極桿和四極桿飛行時間。在一些實施方案中，質譜法用于確定細胞色素c是否被乙酰化以及細胞色素C 在哪個具體殘基上被乙酰化。質譜法用于鑒定蛋白質中的賴氨酸殘基的乙酰化的用途在 Zhang 等人，Q002) Mol Cell Proteomics 1 500-508 和 Dormeyer 等人，Q005) Mol Cell Proteomics 4:1226-1239 (將其通過援引完整引入本文)中進行進一步論述。神經退行性病癥和癌癥的風險的診斷和表征
用于檢測細胞色素c的乙酰化的方法和測定例如本文中論述的方法和測定允許監控被認為處于發生與細胞色素C活性相關的病癥的風險中的受試者的乙酰化細胞色素C多肽水平，和也使得能夠監控已知患有與細胞色素C活性相關的病癥的受試者的乙酰化細胞色素C多肽水平。本發明的方面涉及診斷特征在于細胞色素c的乙酰化的神經退行性病癥，或表征受試者患特征在于細胞色素C的乙酰化的神經退行性病癥的風險的方法。本發明的其他方面涉及診斷特征在于細胞色素C的脫乙酰化或表征受試者患特征在于細胞色素C的脫乙酰化的癌癥的風險的方法。方法包括檢測患者的樣品中細胞色素c多肽的乙酰化水平和將細胞色素c的乙酰化水平與對照樣品或預定值相比較。蛋白質的乙酰化狀態可通過本文中描述的任意方法來測定。基于檢測細胞和/或受試者中乙酰化細胞色素C的水平的測定包括測定受試者的神經退行性病癥或癌癥的發作、進展和/或消退；選擇用于受試者的神經退行性病癥或癌癥的治療；和評估受試者中細胞色素C多肽乙酰化狀態的治療。因此，可使用本發明的測定表征受試者，可監控治療方案，可選擇治療和可更好地理解疾病狀態。乙酰化細胞色素C多肽的水平可與受試者的神經退行性病癥或癌癥的狀態相關。本發明的一個方面涉及檢測體外或體內樣品(例如，組織學或細胞學樣本，實時體內測定，活組織檢查等)中的乙酰化細胞色素c多肽或其片段，和特別地區分樣品或受試者中乙酰化細胞色素C的水平與非乙酰化細胞色素C的水平。在一些實施方案中，該方法包括提供特異性結合乙酰化細胞色素C多肽的抗體或其抗原結合片段。可將抗乙酰化細胞色素C抗體結合至允許檢測乙酰化細胞色素C多肽的標記物。在一些實施方案中，可與在有效地允許抗乙酰化細胞色素C抗體與樣品中的乙酰化細胞色素C多肽結合的條件下將樣品與與標記的抗乙酰化細胞色素C抗體接觸。可通過檢測標記物來檢測樣品中乙酰化細胞色素C的存在。在一些實施方案中，在受試者的樣品中進行抗乙酰化細胞色素C抗體與樣品之間的接觸。在某些實施方案中，在受試者中進行抗乙酰化細胞色素C抗體與樣品之間的接觸。可對其施用本發明的方法的樣品包括組織樣品、細胞樣品，包括細胞培養物樣品、受試者樣品、體內樣品等。在一些實施方案中，將質譜法用于鑒定細胞色素C的乙酰化。可在來自培養物的細胞中、溶液中的細胞中、獲自受試者的樣品中和/或受試者中的樣品(體內樣品)中進行檢測細胞色素C的乙酰化的測定。如本文中所使用的，受試者是人、非人靈長類動物、牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓或嚙齒類動物。在一些實施方案中，人受試者是優選的。本文中使用的樣品包括任意細胞或組織樣品，并且可包括神經元細胞和 /或組織樣品。可對其應用本發明的特別重要的受試者是患有神經退行性病癥的受試者。術語 “患有神經退行性病癥的受試者”如本文中所使用的，意指在樣品被取出時已被診斷為患有神經退行性病癥的個體。本發明的方法還可用于檢測還未被診斷為患有神經退行性病癥的受試者中細胞色素c多肽乙酰化的異常水平。還可使用本發明的方法和抗體監控神經退行性病癥的發作、進展和/或消退。可對其應用本發明的特別重要的受試者是患有癌癥的受試者。術語“患有癌癥的受試者”如本文中所使用的，意指在取得樣品時已被診斷為患有癌癥的個體。本發明的方法還可用于檢測還未被診斷為患有癌癥的受試者中細胞色素c多肽乙酰化的異常水平。還可使用本發明的方法和抗體監控癌癥的發作、進展和/或消退。在一些實施方案中，本發明的方面涉及就與升高的乙酰化細胞色素c多肽的水平的存在相關的疾病篩選受試者。如本文中所使用的，術語“升高的”意指相對于對照水平更高例如升高的水平。在一些實施方案中，通過估量患有神經退行性病癥的受試者或培養物的樣品中乙酰化細胞色素c的水平來測定神經退行性病癥的狀態和/或分期。本發明的抗體用于區分受試者是否患有神經退行性病癥的測定，因為本發明的抗乙酰化細胞色素C抗體可用于定量患有神經退行性病癥或處于患神經退行性病癥的風險中的受試者的細胞和組織中乙酰化細胞色素C多肽的量。如上所述，質譜法還可用于鑒定受試者的樣品中被乙酰化的細胞色素C的具體殘基。樣品中乙酰化細胞色素C多肽的存在和/或樣品中細胞色素C的特定體殘基的乙酰化的檢測可用于確定細胞、細胞培養物或受試者的神經退行性病癥存在和/或狀態。本發明的方法可用于通過提供疾病發作和/或進展的早期指標來獲得有用的預后信息。在一些實施方案中，病癥是癌癥并且受試者顯示下降的乙酰化細胞色素 C的水平或增加的脫乙酰化細胞色素C的水平。當進行本發明的各種方法時，可以以許多方法測定乙酰化細胞色素c多肽的水平 (例如，K40-或K74-乙酰化細胞色素c多肽)。在一個測量中，相對于非乙酰化(或脫乙酰化)細胞色素c多肽測量乙酰化細胞色素c多肽的水平。因此，測量可以相對測量，其可表示為例如總細胞色素c多肽的百分比。本領域技術人員將理解可通過測量乙酰化細胞色素c多肽的相對量或非乙酰化細胞色素c多肽的相對量來測定乙酰化和非乙酰化細胞色素 c多肽的相對量。換句話說，如果90%的個體的細胞色素c多肽是非乙酰化細胞色素c多肽 (或減少的乙酰化細胞色素C多肽)，那么10%的個體的細胞色素C多肽將是乙酰化細胞色素c多肽。乙酰化細胞色素c水平的另一個測量是細胞色素c多肽乙酰化的絕對水平的測量。這可表達為例如每單位細胞或組織的乙酰化細胞色素C多肽。乙酰化細胞色素C多肽水平的另一個測量是一段時間內乙酰化細胞色素C多肽水平的變化的測量。這可以以絕對量表示或可以一段時間內的百分比增加或減少來表示。本發明的方面涉及通過監控一段時間內受試者或樣品(例如，細胞培養物)中乙酰化細胞色素C多肽的絕對或相對量的變化來表征細胞色素C多肽乙酰化水平。在一些實施方案中，大于0. 1%的相對或絕對乙酰化細胞色素c多肽的變化可表示異常。優選，表示異常的乙酰化細胞色素c多肽水平的變化大于0. 2%、大于0. 5%、大于1. 0%、2. 0%、3. 0%、4. 0%、 5. 0%、7· 0%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50% 或更大。可根據本發明測定乙酰化細胞色素c多肽的水平，并且將其與對照相比較。對照可以是預定值，其可采用許多形式。其可以是單截斷值例如中位數或平均數。其可基于比較組例如具有正常量的細胞色素c乙酰化的組和具有異常量的細胞色素c乙酰化的組來確定。比較組的另一個實例可以是具有神經退行性病癥的癥狀的組和不具有神經退行性病癥的癥狀的組。另一個比較組可以是具有神經退行性病癥的家族史的組和不具有這樣的家族史的組。在一些實施方案中，一個確定的組中的風險是另一個確定的組中的風險的二倍。可以例如設置預定值，其中將測定的群體等量地(或不等量地)分入組，例如低風險組、中等風險組和高風險組或分入四分位或五分位，最下四分位或五分位是具有最低風險和最少量的乙酰化細胞色素C多肽的個體，最上四分位或五分位是具有最高風險和最大量的乙酰化細胞色素C多肽的個體。當然預定值將取決于選擇的具體群體。例如，表觀健康的群體將具有與已知具有與異常細胞色素c多肽乙酰化相關的狀況的群體不同的“正常”范圍。因此，選擇的預定值可考慮其中個體或細胞落入的類別。可由本領域技術人員只使用常規實驗選擇適當的范圍和類別。如本文中所使用的，“異常”意指與對照相比較不正常。異常高意指相對于選擇的對照為高的。通常對照基于在適當的年齡范圍內的表觀健康正常個體或表觀健康細胞。還要理解，根據本發明的對照，除了預定值外，還可以是與實驗材料平行地測試的材料的樣品。實例包括待與實驗樣品平行地測試的來自對照群體的樣品或通過加工產生的對照樣品。評估治療功效
本發明的方法還可用于評估神經退行性病癥或癌癥的治療性療法的功效和用于估量不同時間點上受試者中乙酰化細胞色素c多肽的水平。例如，可在治療方案(神經退行性病癥或癌癥的預防或治療)開始前、治療方案的過程中和/或治療方案之后獲得受試者的乙酰化細胞色素c多肽的水平，從而提供關于方案在患者中的功效的信息。還可使用本發明的測定在來自培養的細胞中進行候選治療劑的功效的評估-例如，作為評估候選治療劑的篩選測定。要理解，治療方案可以是受試者的神經退行性病癥或癌癥的預防或治療。因此，本發明的方法可用于監控受試者對提供給受試者的神經退行性病癥或癌癥的預防性治療和/ 或治療的反應。本發明的方法(例如，結合測定、凝膠電泳；質譜法；NMR等)還可用于監控受試者的神經退行性病癥或癌癥的發作、進展或消退。可在分開的時間上測定獲自受試者的 2、3、4或更多個樣品的乙酰化細胞色素c多肽的水平。可比較樣品中乙酰化細胞色素c多肽的水平，在一段時間內水平的變化可用于評估受試者的神經退行性病癥或癌癥的狀態和分期和/或治療策略對受試者的神經退行性病癥或癌癥的影響。本發明的方面涉及監控治療或評估治療在受試者中的功效。所述方法包括獲得正在經歷治療的受試者的乙酰化細胞色素c水平。將乙酰化細胞色素c的水平與相應于乙酰化細胞色素C的對照水平(例如，表觀健康群體中的)的預定值相比較。確定乙酰化細胞色素C的水平是處于、低于還是高于預定水平將促成表明受試者可受益于使用相同療法的持續治療還是可受益于療法的改變的指標。健康護理從業人員(Healthcare practitioner)基于預期的對受試者的凈效益選擇用于治療的治療方案。凈效益來源于風險收益比。本發明允許確定受試者將受益于持續治療還是受益于治療的改變，從而幫助醫生選擇療法。有益性通常是神經退行性病癥或癌癥的體征和癥狀或并發癥的減少。神經退行性病癥和癌癥的體征、癥狀、表現和并發癥對于本領域技術人員來說是已知的。在一些實施方案中，乙酰化細胞色素c的水平處于或低于預定水平的確定可表示受試者將受益于使用相同療法的持續治療。在一些實施方案中，乙酰化細胞色素c的水平處于或高于預定水平的確定表明受試者將受益于治療的改變。在一些實施方案中，重復獲得乙酰化細胞色素c的水平以監控一段時間內受試者的乙酰化細胞色素c的水平。在一些實施方案中，受試者已經歷至少1、2、3、4、5、6、7天或更多天的治療。在一些實施方案中，受試者已經歷至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周或更多周的治療。在一些實施方案中，受試者可能已經歷至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個月或更多個月的治療。在一些實施方案中，可受益于持續治療的受試者是其乙酰化細胞色素c的治療中水平(on-therapy level)達到某個預定值或其乙酰化細胞色素c的水平不斷降低的受試者。在一些實施方案中，可受益于治療的改變的受試者是其乙酰化細胞色素c的治療中水平未達到某個預定值或其乙酰化細胞色素c的治療中水平不再下降的受試者。在一些實施方案中，可受益于持續治療的受試者是其乙酰化細胞色素c的治療中水平達到某個預定值或其乙酰化細胞色素c的水平不斷增加的受試者。在一些實施方案中，可受益于療法的改變的受試者是其乙酰化細胞色素c的治療中水平未達到某個預定值或其乙酰化細胞色素C的治療中水平不再增加的受試者。如本文中所使用的，“治療的改變”是指當前療法的劑量的增加或減少、從一種療法轉換至另一種療法、另一種療法至現有療法的添加或其組合。從一種療法至另一種療法的轉換可包括至具有高風險特征但其中預期的有益性的概率增加的療法的轉換。在一些實施方案中，優選療法是減少乙酰化細胞色素c的水平的療法。在一些實施方案中，優選療法是增加乙酰化細胞色素C的水平的療法。可通過增加當前療法的劑量而受益于療法的改變的受試者是例如正在治療中的但未接受療法的最大耐受劑量或最大允許劑量并且其乙酰化細胞色素C的水平未達到某一預定值的受試者。在此類情況下，增加現有療法的劑量直至乙酰化細胞色素C的水平達到某一預定值。在一些情況下，將當前療法的劑量從當前劑量增加至既不是療法的最大耐受劑量也不是治療的最大允許劑量的更高劑量。在其他情況下，將劑量增加至治療的最大耐受或最大允許劑量。可通過減少當前療法的劑量而受益于療法的改變的受試者是例如其乙酰化細胞色素C的治療中水平在使用更低劑量的療法的情況下達到或可達到某一預定值的受試者。可從從一種療法轉換至另一種療法獲益的受試者是例如接受療法的最大耐受劑量或最大允許劑并且其脫乙酰化細胞色素c的水平未達到某一預定值的受試者。另一個實例是未接受療法的最大耐受或最大允許劑量但被健康護理從業人員確定為更可能受益于另一種療法的受試者。這樣的確定基于例如在初始療法中不期望的副作用在受試者中發生或缺乏對初始療法的反應。可通過給當前療法添加另一種療法而受益于療法的改變的受試者是例如正接受療法但其乙酰化細胞色素c的水平未達到某一預定值的受試者。在此類情況下，向當前療法中添加另一種療法。添加至當前療法的療法可在降低乙酰化細胞色素c的水平中具有與當前療法不同的作用機制。在一些情況下，可使用上述療法的改變的組合。本領域技術人員公認可通過評估響應細胞與用于治療神經退行性病癥的候選試劑的接觸而發生的細胞色素c乙酰化的任何變化來體外測試候選治療劑的相似評估。本發明的方面涉及指導治療以改善受試者中的結果的乙酰化細胞色素c水平的測量。乙酰化細胞色素c的水平具有響應減少患有神經退行性病癥或癌癥的受試者的死亡率風險的治療的預測值。可從本發明的該方面獲益的受試者是正在經歷減少死亡率的風險 (例如，來自神經退行性病癥或癌癥)的治療的受試者。治療中的受試者是已被診斷患有神經退行性病癥或癌癥并且處于使用療法的治療過程的受試者。所述療法可可以是神經退行性病癥或癌癥的治療中使用的任意治療劑。神經退行性病癥或癌癥的治療中使用的治療劑對于本領域技術人員來說是已知的。療法還可以是非藥物治療。在一些實施方案中，療法是降低乙酰化細胞色素C的水平或升高脫乙酰化細胞色素C的水平的療法。在一些實施方案中，療法是升高乙酰化細胞色素C的水平或降低脫乙酰化細胞色素C的水平的療法。與本發明相關的用于鑒定細胞色素C的乙酰化狀態的方法可用于獲得代表受試者的神經退行性病癥或癌癥的診斷的測量。在一些情況下，受試者可以已經正在經歷神經退行性病癥或癌癥的藥物療法，然而在其他情況下，受試者可以不進行神經退行性病癥或癌癥的當前療法。治療的量可以例如通過增加或減少藥物試劑或治療組合物的量，通過改變施用的治療組合物，通過改變施用途徑，通過改變給藥時間安排等來改變。選擇進行治療的受試者
如本文中所使用的，術語治療、治療的或醫治，當用于病癥時，是指增加受試者對疾病的發生的抗性或換句話說減少受試者發生疾病的概率的預防性治療，以及在受試者已發生疾病后為了抵抗疾病或防止疾病惡化的治療。術語“治療”包括病癥或狀況的預防以及先前存在的病癥和狀況的抑制和/或好轉。受試者可接受治療，因為受試者已被確定處于發生病癥或狀況的風險中，或可選地，受試者可具有這樣的病癥或狀況。因此，治療可預防、減輕或完全消除病癥或狀況或防止其惡化。如本文中所使用的，術語“受試者”是指人或非人哺乳動物或動物。非人哺乳動物包括家畜類動物、伴侶動物、實驗室動物和非人靈長類動物。非人受試者還具體地包括但不限于雞、馬、牛、豬、山羊、狗、貓、豚鼠、倉鼠、貂和兔子。在本發明的一些實施方案中，受試者是患者。如本文中所使用的，“患者”是指在醫生或其他健康護理工作者的照護下的受試者， 包括已咨詢醫生或其他健康護理工作者，接受來其的建議或接受來自其的處方或其他推薦的受試者。本發明的方面涉及選擇進行治療的受試者，所述受試者具有異常水平的乙酰化細胞色素c多肽。治療可包括施用可介導細胞色素c的乙酰化或脫乙酰化的試劑。此類受試者可以已接受用于治療神經退行性病癥或癌癥的藥物。在一些實施方案中，受試者可以免受用于神經退行性病癥的任何現有治療，但使用本發明的方法和/或抗體監控細胞色素C 多肽乙酰化的水平可將受試者鑒定為進行增加細胞色素C的脫乙酰化的治療和/或減少細胞色素C多肽的乙酰化的治療的候選者。在一些實施方案中，受試者可以免受用于癌癥的任何現有治療，但使用本發明的方法和/或抗體監控細胞色素C多肽乙酰化水平可將受試者鑒定為進行增加細胞色素c的乙酰化的治療和/或減少細胞色素c多肽的脫乙酰化的治療的候選者。因此，作為測定細胞色素c的乙酰化狀態的測定的結果，可選擇受試者并且利用提高的水平的相同藥物或使用不同的療法治療受試者。根據本發明，一些受試者可能不具有否則需要使用特殊療法的治療的癥狀，并且利用本發明的方法例如抗細胞色素c多肽-乙酰化抗體的測試可將受試者鑒定為需要治療。這意味著由于不存在用本發明的抗體或其抗原結合片段估量乙酰化細胞色素c多肽的水平，因此受試者到本申請的提交日期為止按常規將不具有需要使用特殊療法來治療的癥狀。作為測量受試者具有的乙酰化細胞色素C多肽的水平的結果，受試者成為進行使用療法的治療的候選者。治療
根據本發明的另一個方面，可施用降低細胞色素c的乙酰化水平的化合物以抑制細胞的細胞凋亡以及預防和/或治療神經退行性病癥。在一些實施方案中，可施用包含脫乙酰化K40和K74殘基的細胞色素c的肽或多肽。用于降低細胞色素c的乙酰化水平并且可作為神經退行性病癥的療法施用的化合物包括但不限于脫乙酰酶蛋白。在一些實施方案中，所述脫乙酰酶蛋白為sirtuin。在一些實施方案中，sirtuin為SIRT3。在經測定具有異常高水平的細胞色素c多肽的乙酰化水平的受試者中，療法(例如，降低細胞色素c多肽的乙酰化水平的化合物)是有效地降低受試者的細胞色素c的乙酰化水平或增加受試者中脫乙酰化的量的那個量-所述各量將，相對于治療之前存在的水平，降低乙酰化細胞色素C多肽的水平。因此，可以以有效地抑制細胞凋亡和預防和 /或治療神經退行性病癥的量施用增加細胞色素C多肽的脫乙酰化水平的化合物(例如， SIRB)。通常在臨床試驗中確定降低乙酰化細胞色素c水平的化合物(例如，SIRT3或增加 SIRT3的表達或活性的化合物)的有效量，在盲研究(blind study)中確定相對于對照群體用于測試群體的有效劑量。在一些實施方案中，有效量將是導致期望的反應的量，例如，減少或消除神經退行性病癥的癥狀的量。在治療特定疾病或狀況的情況下，期望的反應是抑制疾病或狀況的進展。這可包括只暫時減緩疾病的進展，雖然更優選，其包括永久性停止疾病的進展。這可通過本領域技術人員已知的用于任何特定疾病的常規診斷方法來監控。對疾病或狀況的治療的期望的反應還可延遲疾病或狀況的發作或甚至阻止其發作。還可通過評估施用對細胞或受試者的生理效應例如在施用后疾病癥狀的減少來確定治療性化合物或組合物(其各自在本文中可稱為藥物或治療性化合物或組合物)的有效量。其他測定對于本領域技術人員來說是已知的并且可用于測量對治療的反應水平。治療的量可以例如通過增加或減少治療性組合物的量，通過改變施用的治療性組合物，通過改變施用途徑，通過改變給藥時間安排等來改變。有效量將根據待治療的具體狀況、待治療的受試者的年齡和身體健康狀況、狀況的嚴重度、治療的持續時間、同時療法(如果有的話)的性質、施用的具體途徑等在保健人員的知識和專家經驗范圍內的因素而變化。例如， 有效量可取決于個體具有異常升高的水平的細胞色素c多肽的乙酰化所達到的程度。可由各醫生或獸醫調整藥物化合物劑量，特別是如果發生任意并發癥時。治療有效量通常從0.01 mg/kg變化至約1000 mg/kg，優選從約0. 1 mg/kg變化至約200 mg/kg, 最優選從約0.2 mg/kg變化至約20 mg/kg，以每日一個或更多個劑量施用，進行1天或更多天。絕對量將取決于多個因素，包括選擇用以施用的材料，施用是以單劑量還是多個劑量進行以及個體受試者參數，包括年齡、身體健康狀況、大小、體重和疾病或狀況的分期。 這些因素對于本領域技術人員來說是公知的并且可僅用常規實驗來解決。本發明的其他方面涉及誘發展示脫乙酰化細胞色素c的細胞的細胞的細胞凋亡。 如上所論述的，乙酰化細胞色素c與細胞凋亡相關。因此將細胞與誘導細胞色素c的乙酰化或減少其脫乙酰化的試劑接觸代表了用于誘發細胞的細胞凋亡的方法。在一些實施方案中，與脫乙酰化細胞色素C相關的疾病或狀況是癌癥。在一些實施方案中，如果癌癥患者患有展示相應于全長野生型多肽中的殘基K40和/或K74的賴氨酸殘基的脫乙酰化的癌癥， 那么癌癥患者被選擇來進行治療并且用乙酰化細胞色素c或阻止細胞色素c脫乙酰化的試劑或組合物進行治療。在一些實施方案中，可施用包含乙酰化K40和K74殘基的細胞色素 c的肽或多肽。抗體
本發明在一個方面中包括特異性結合合成的和天然的乙酰化細胞色素c的抗體，和用于它們制備和使用的方法。本發明部分地包括用于制備乙酰化細胞色素c多肽包括但不限于K40-和K-74-乙酰化細胞色素c多肽的方法。乙酰化細胞色素c多肽可用作產生特異性結合乙酰化細胞色素c多肽的抗體的抗原。用于產生本發明的抗體的組合物可包括乙酰化細胞色素c多肽分子。在一些實施方案中，乙酰化細胞色素c多肽或其片段可以是乙酰化全長野生型或突變的細胞色素c多肽或為乙酰化片段的野生型或突變的全長細胞色素c 的片段。本發明的方法還可包括使用細胞色素c多肽的片段產生特異性結合乙酰化細胞色素C多肽的抗體。在一些實施方案中，作為被抗體特異性識別的表位的部分的細胞色素C 多肽的乙酰化的賴氨酸殘基是相應于野生型全長細胞色素C多肽的乙酰化殘基的賴氨酸殘基。在一些實施方案中，乙酰化的殘基相應于野生型全長人細胞色素C多肽的殘基K40 或K74。在一些實施方案中，抗原性多肽在長度上可以小至5個氨基酸。在一些實施方案中，當多肽抗原的大小在長度上小于約8個氨基酸時，可將第二載體分子例如牛血清白蛋白(BSA)連接至多肽以增加多肽的抗原性。因此，包括期望的用于抗體產生的表位的細胞色素c的小片段可用于特異性結合表位的抗體的產生，所述小片段包括乙酰化的賴氨酸殘基(例如，K40-或K74-乙酰化的殘基)。可將包括乙酰化的賴氨酸殘基的任意細胞色素c多肽片段與第二分子例如上述鑰孔嘁血藍蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)結合用作利用其制備特異性結合細胞色素c 乙酰化多肽的抗體的抗原性多肽。在一些實施方案中，抗原性多肽可以是包含乙酰化K40 和/或K74的細胞色素c多肽片段，并且從這樣的抗原產生的抗體將特異性結合細胞色素 c多肽的K40-或K74-乙酰化的表位。可使用本領域已知的親和純化和/或親和選擇方法純化抗細胞色素c多肽抗體或其抗原結合片段。親和選擇是就與靶材料(例如，乙酰化細胞色素c多肽)的結合進行的抗體或其抗原結合片段的選擇。本領域技術人員將理解在本發明的方法中用作免疫原性片段的細胞色素c多肽的片段優選在長度上為至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個氨
基酸。如果細胞色素c多肽的片段包含超過1個賴氨酸殘基，那么在一些實施方案中，期望只有一個賴氨酸殘基是乙酰化的賴氨酸殘基。本領域技術人員將能夠使用本文中提供的指導產生可用于本發明的方法的細胞色素c多肽的片段。在一些實施方案中用于產生抗體的細胞色素c的片段包含相應于野生型全長人細胞色素c多肽中的殘基K40的乙酰化的賴氨酸殘基。在一些實施方案中，用于產生抗體的細胞色素c的片段包含相應于野生型全長人細胞色素c多肽中的殘基K74的乙酰化的賴氨酸殘基。在一些實施方案中，用于產生抗體的細胞色素c的片段包含超過一個乙酰化的賴氨酸殘基。如本文中所使用的，術語“抗體”指可包括通過二硫鍵鏈間連接的至少兩條重(H) 鏈和兩條輕(L)鏈的蛋白質。每一條重鏈由重鏈可變區(在本文中縮寫為HCVR或Vh)和重鏈恒定區組成。重鏈恒定區由3個結構域CH1、Ch2和Ch3組成。各輕鏈由輕鏈可變區(在本文中縮寫為LCVR或^和輕鏈恒定區組成。輕鏈恒定區由一個結構域CL組成。Vh* Vl區可進一步細分成稱為互補決定區(CDR)的高變區，其間散置有稱為構架區(FR)的更保守的區域。每一個Vh和\由3個⑶R和4個FR按下列順序從氨基端排列至羧基端組成 FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區包含與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恒定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子包括免疫系統的各種細胞(例如， 效應細胞)和經典補體系統的第一成分(Clq)的結合。如本文中所使用的術語抗體的“抗原結合片段”是指保持特異性結合抗原(例如， 乙酰化細胞色素c多肽以及在一些實施方案中，乙酰化細胞色素c多肽是K40-或K74-乙酰化的細胞色素c多肽或細胞色素c多肽片段中的相應殘基)的能力的抗體的一個或更多個部分。已顯示抗體的抗原結合功能可通過全長抗體的片段來進行。術語抗體的“抗原結合片段”所包括的結合片段的實例包括(i)Fab片段，由\、VH、(^和ChI結構域組成的單價片段；(ii) F(ab' )2片段，包含兩個由在鉸鏈區的二硫橋連接的Fab片段的雙價片段； (iii)由Vh和CHl結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單臂的\和Vh結構域組成的Fv 片段，(ν) dAb片段(Ward等人，(1989) Nature 341 544-546)，其由Vh結構域或重鏈抗體例如駱駝重鏈抗體的可變結構域(例如Vhh)組成；(vi)分離的互補決定區(⑶R);和(vii) 包含(i) - (vi)的抗原結合片段的多肽結構。此外，雖然Fv片段的兩個結構域\和Vh 由分開的基因編碼，但可使用重組方法，利用合成的連接體將它們連接，所述連接體使得它們能夠以單蛋白質鏈(其中\和Vh區配對形成單價分子(稱為單鏈Fv (scFv)；參見，例如，Bird 等人(1988) Science 242:423-426;和 Huston 等人(1988) Proc. Natl. Acad. ScL USA 85:5879-588 )形式產生。此類單鏈抗體也意欲包括在術語抗體的“抗原結合部分”中。使用常規方法例如如 J. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp 98-118 (N. Y. Academic Press 1983)(將其通過援引并入本文)中描述的蛋白水解片段化方法以及利用本領域技術人員已知的其他技術例如重組核酸的表達來獲得此類抗體片段。以與對于完整抗體相同的方式就效用篩選片段。本發明的分離的抗體包括不同的抗體同種型例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、 IgAl、IgA2、IgAsec、IgD、IgE。如本文中所使用的，“同種型”是指由重鏈恒定區基因編碼的抗體種類(例如，IgM或IgGl)。本發明的抗體可以是全長的或可以只包含抗原結合片段例如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgAsec、IgD 或 IgE 的抗體恒定和 / 或可變結構域或可由Fab片段、F(ab’)2片段和Fv片段組成。本發明的抗體可以是多克隆、單克隆抗體或多克隆與單克隆抗體的混合物。本發明的抗體可通過本文中公開的方法或通過許多本領域內已知的技術產生。在一些實施方案中，被本發明的抗體識別的表位包括相應于全長野生型細胞色素c多肽中的K40和/或K74 的乙酰化的賴氨酸。在一些實施方案中，被本發明的抗體識別的表位包括相應于野生型全長細胞色素c多肽中的K40和/或K74的乙酰化的殘基。可使用本領域內已知的技術制備單克隆和多克隆抗體。如本文中所使用的術語 “單克隆抗體”是指單一分子組成的抗體分子的制劑。單克隆抗體展示對于特定表位的單一結合特異性和親和力。單克隆抗體展示對于特定表位的單一結合特異性和親和力。術語 “多克隆抗體”是指包含特異性結合特定抗原的抗體活性的混合物的抗體分子的制劑。單克隆抗體產生的過程可包括獲得具有產生抗體的潛力的免疫體細胞特別是B 淋巴細胞，其之前已用目的抗原進行了體內或體外免疫并且適合于與B細胞淋巴瘤系融合。在本發明中，哺乳動物淋巴細胞通常通過用期望的蛋白質或多肽例如用乙酰化細胞色素c多肽或其片段或K40-或K74-乙酰化細胞色素c或其片段體內免疫動物(例如，小鼠) 來進行免疫。在一些實施方案中，多肽是如本文中描述的經修飾的多肽。必要時以達到數周的間隔重復此類免疫以獲得充足的抗體滴度。一旦免疫，就可將動物用作可被克隆和重組表達的抗體產生性淋巴細胞的來源，如在下文中進一步論述的。在最后一次抗原加強后， 處死動物并且取出脾細胞。小鼠淋巴細胞產生了更高百分比的與本文中描述的小鼠骨髓瘤品系的穩定融合細胞。在這些小鼠當中，BALB/c小鼠是優選的。然而，其他小鼠品系、大鼠、 兔子、倉鼠、綿羊、山羊、駱駝、美洲駝羊、蛙等也可用作制備抗體產生性細胞的宿主。參見； Goding (in Monoclonal Antibodies Principles and Practice,第 2版，pp. 60-61， Orlando, Fla.，Academic Press, 1986)。還可使用已將人免疫球蛋白基因插入基因組(并且不能產生小鼠免疫球蛋白)的小鼠品系。實例包括由Medarex/GenWiarm International 產生的HuMAb小鼠品系和由Abgenix產生的XenoMouse品系。此類小鼠響應免疫而產生完全人免疫球蛋白分子。處于分裂成漿細胞期的那些抗體產生性細胞優先融合。體細胞可獲自抗原接觸動物(antigen-primed animal)的淋巴結、脾和外周血，并且選擇的淋巴細胞很大程度上取決于它們在特定融合系統中的經驗有用性。然后將抗體分泌淋巴細胞與能夠在細胞培養中無限復制的(小鼠)B細胞骨髓瘤細胞或轉化的細胞融合，從而產生永生化的免疫球蛋白分泌細胞系。培養所獲得的融合細胞或雜交瘤，并且就期望的單克隆抗體的產生篩選所得的克隆。克隆產生此類抗體的集落，并且進行體內或體外培養以產生大量抗體。融合此類細胞的理論基礎和實踐方法的說明示于Kohlei^PMilstein，Nature 256:495 (1975)(將其通過援引引入本文)中。適合用于產生雜交瘤的融合方法的骨髓瘤細胞系優選是非抗體產生性的，具有高融合效率和使得它們不能在某些支持期望的雜交瘤生長的選擇培養基中生長的酶缺陷。可用于產生融合細胞系的此類骨髓瘤細胞系的實例包括但不限于Ag8、P3-X63/ Ag8、X63-Ag8. 653、NS1/1. Ag 4.1、Sp2/0_Agl4、F0、NS0/U、MPC-IU MPC11-X45-GTG 1. 7、 S194/5XX0 Bul，其全部來源于小鼠；來源于大鼠的R210. RCY3、Y3_Ag 1. 2. 3、IR983F和 4B210 ；以及 U466、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2、UC7^_6，其全部來源于人 Coding, in Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,第 2 片反，pp. 65-66, Orlando, Fla. , Academic Press, 1986； Campbell, in Monoclonal Antibody Technology,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology 第13卷，Burden禾口 Von Knippenberg, eds. pp. 75-83，Amsterdam, Elsevier, 1984)。本令頁域技術人員知
道產生單克隆抗體的許多常規方法。利用標準和公知的技術，例如通過使用聚乙二醇("PEG")或其他融合劑(參見 Milstein和Kohler, Eur. J. Immunol. 6:511 (1976)，將其通過援引并入本文)，實現與哺乳動物骨髓瘤細胞或能夠在細胞培養中無限復制的其他融合伴侶的融合。產生多克隆抗體的方法對于本領域技術人員來說是公知的。作為非限定性實例， 可通過將乙酰化的細胞色素多肽皮下施用給首先已被放血以獲得免疫前血清的新西蘭白兔來產生抗乙酰化細胞色素c多克隆抗體。可在6個不同的部位以每部位100 μ 1的總體積接種(例如，在該處注射)乙酰化細胞色素(通常與一種或更多種佐劑一起)。然后在第一注射后2周將兔子放血，每6周3次用相同抗原進行周期性加強。在每一次加強后10 天收集血清的樣品。優選利用親和層析，使用乙酰化細胞色素捕獲抗體來從血清回收多克隆抗體。用于產生多克隆抗體的該方法和其他方法公開于Ε. Harlow,等人，editors， Antibodies: A Laboratory Manual (1988)中，將其通過援引并入本文。本領域技術人員知道產生多克隆抗體的許多常規方法。在一些實施方案中，被本發明的多克隆抗體識別的表位包含相應于野生型全長細胞色素c多肽的K40或K74的乙酰化殘基。在其他實施方案中，抗體可以是重組抗體。術語“重組抗體”，如本文中所使用的， 意欲包括通過重組方法制備、表達、產生或分離的抗體，例如對于另一種物種的免疫球蛋白基因轉基因的動物(例如，小鼠)分離的抗體，通常為基因工程抗體、使用轉染入宿主細胞的重組表達載體表達的抗體、從重組組合抗體文庫分離的抗體或通過任意其他方法(其包括免疫球蛋白基因序列至其他DNA序列的剪接)制備、表達、產生或分離的抗體。本發明還提供了編碼抗乙酰化細胞色素c抗體(例如，抗K40-或K74-乙酰化細胞色素c抗體)的核酸分子和包含本文中描述的核酸分子的載體。提供的載體可用于轉化或轉染用于產生具有本文中描述的抗體的特異性的抗乙酰化細胞色素c抗體的宿主細胞。 在一些實施方案中，載體可包括編碼由核酸分子編碼的本發明的抗體的重鏈和/或輕鏈的分離的核酸分子。在其他實施方案中，提供了產生本文中描述的抗體或抗原結合片段的質粒。本發明的抗體或抗原結合片段優選是分離的。“分離的，，，如本文中針對抗體和其抗原結合片段所使用的，意欲指基本上不含具有不同抗原特異性的其他抗體(或抗原結合片段)的抗體(或其抗原結合片段)(例如，特異性結合乙酰化細胞色素c多肽的分離的抗體基本上不含特異性結合除乙酰化細胞色素c多肽外的抗原的抗體)。然而，特異性結合乙酰化多肽(例如，乙酰化細胞色素C多肽)的表位、同種型或變體的分離的抗體可以具有對其他相關抗原例如細胞色素C的突變形式或來自其他物種的多肽(例如，細胞色素C物種同源物)的交叉反應性。此外，分離的抗體(或其抗原結合片段)可基本上不含其他細胞材料和/或化學物品。本發明的抗體包括但不限于特異性結合乙酰化細胞色素c多肽的抗體。在某些實施方案中，本發明的抗體特異性結合在相應于全長野生型細胞色素c多肽的K40和/或 K74殘基的殘基上被乙酰化的細胞色素C。如本文中所使用的，“特異性結合”是指抗體以使得抗體能夠被用于將預定抗原與其他抗原相區別至允許本文中描述的診斷和其他測定的程度的偏好性結合預定抗原。與K40-或K74-乙酰化細胞色素c多肽的特異性結合意指抗體不僅相對于其他多肽優先結合細胞色素c多肽，而且其還優選于未被乙酰化的細胞色素c多肽結合乙酰化的細胞色素c多肽。通常，抗體以為其對于除預定抗原外的抗原的結合的親和力的至少2倍的親和力結合。在一些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段特異性結合K40-或K74-乙酰化細胞色素c多肽。要理解，包含相應于全長野生型細胞色素c多肽的乙酰化K40或K74的乙酰化殘基的細胞色素c多肽或其片段可以是細胞色素 c多肽的野生型或突變體形式-只要存在被特異性結合乙酰化細胞色素c多肽殘基(包括相應于全長野生型細胞色素c多肽的乙酰化K40或K74殘基的殘基)的抗體識別的表位。本發明的抗K40-或K74-乙酰化細胞色素c抗體或抗原結合片段可以以亞納摩爾(sub-nanomolar)親和力特異性結合K40-或K74-乙酰化細胞色素c多肽。結合親和力可以為約1 χ 10_6、1 χ 10_7、1 χ 10_8、1 χ 101或更小，優選約1 χ 10_1(ΙΜ或更小，更優選 1 χ 10_"Μ或更小。在特別優選實施方案中，結合親和力小于約5 χ 10_1(ΙΜ。在本發明的一些方面中，抗體或其抗原結合片段結合乙酰化細胞色素c多肽內的構象表位。為了確定選擇的抗乙酰化細胞色素c抗體是否結合構象表位，可在使用天然蛋白質(例如，非變性免疫沉淀、細胞表面結合的流式細胞術分析)和變性蛋白質(例如， Western印跡法、變性蛋白質的免疫沉淀)的測定中測試每一種抗體。結果的比較將表明抗體是否結合構象表位。結合天然蛋白質但不結合變性蛋白質的抗體是結合構象表位的抗體，并且是優選抗體。在本發明的一些實施方案中，抗體競爭性抑制第二抗體與其乙酰化細胞色素c多肽上的靶乙酰化的表位特異性結合。在一些實施方案中，靶表位包含相應于野生型全長細胞色素c多肽的K40或K74的乙酰化殘基。為了測定競爭性抑制，可使用本領域技術人員已知的許多測定。例如，競爭性測定可用于確定抗體是否競爭性抑制另一種抗體對乙酰化細胞色素c (或K40-或K74-乙酰化細胞色素c)的結合。此類方法可包括使用流式細胞術或固相結合分析的基于細胞的方法。還可使用其他測定，所述測定估計抗體對固相或溶液相中的乙酰化細胞色素c多肽(或K40-或K74-乙酰化細胞色素c多肽)分子的交叉競爭的能力。某些抗體競爭性抑制第二抗體與其乙酰化細胞色素c多肽上的靶表位(或 K40-或K74-乙酰化細胞色素c多肽)的特異性結合至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、 70%、80%、90%、95%或99%。可以以不同的摩爾比或質量比估量抑制；例如可利用為第二抗體的2倍、3倍、4倍、5倍、7倍、10倍或更多倍的摩爾數的第一抗體進行競爭性結合實驗。本發明的其他抗體可包括特異性結合由第二抗體確定的乙酰化細胞色素c多肽上的表位的抗體。為了確定表位，可使用本領域內已知的標準表位圖譜分析法。例如，可將結合第二抗體的K40-或K74-乙酰化細胞色素c多肽抗原的片段(多肽)用于確定候選抗體是否結合相同的表位。在一些實施方案中，表位包含相應于野生型全長細胞色素c多肽的 K40或K74的乙酰化殘基。對于線性表位，可合成確定長度(例如，5、6、7、8或更多個氨基酸) 的重疊多肽。多肽優選偏移1個氨基酸，以便制備一系列覆蓋乙酰化細胞色素c多肽序列的每一個4、5、6、7或8個氨基酸的片段(分別地)的多肽。可通過使用更大的偏移例如2或3 個氨基酸制備更少的多肽。此外，可合成更長的多肽(例如，9、10或11聚體)。可使用標準方法包括表面等離子共振技術(BIAC0RE)和ELISA測定法測定多肽與抗體的結合。為了檢查
30構象表位，可使用更大的乙酰化細胞色素c多肽片段，包括在一些實施方案中使用K40-或 K74-乙酰化細胞色素c多肽。已描述了使用質譜法確定構象表位的其他方法并且可使用所述方法(參見，例如，Baerga-Ortiz 等人，Protein Science 11:1300-1308, 2002 和其中引用的參考資料)。用于表位測定的其他方法提供于標準實驗參考著作，例如Ω/rr皿 Pro toco Is in Immunology StJ 6. 8 -^-71 ( "Phage Display Selection and Analysis of B-cell Epitopes，，)禾口第 9. 8 單兀("Identification of Antigenic Determinants Using Synthetic polypeptide Combinatorial Libraries") , Coligant ^A , eds., John Wiley & Sons。可通過將點突變或缺失引入已知的表位，然后利用一種或更多種抗體測試結合以確定哪些突變減少抗體的結合來確認表位。本發明的抗體或抗原結合片段可單獨地或與本領域內已知的某些抗體結合用于診斷方法。已知的抗體包括抗細胞色素c抗體以及結合乙酰化的多肽的抗乙酰化-部分抗體。可將本發明的抗體或其抗原結合片段連接至可檢測的標記物。可通過本領域已知的標準方案將本發明的可檢測的標記物連接至本發明的抗體或其抗原結合片段。在一些實施方案中，可將可檢測的標記物共價連接至本發明的抗乙酰化細胞色素c抗體或其抗原結合片段。共價結合可通過現有側鏈的直接縮合或通過摻入外來橋連部分來實現。許多二價或多價試劑用于將蛋白質分子偶聯至其他蛋白質、多肽或胺官能團等。例如，文獻記載了許多偶聯劑例如碳二亞胺類、二異氰酸酯、戊二醛和、重氮苯。該名錄無意窮盡本領域內已知的各種偶聯劑，但相反地，其是更常見偶聯劑的示例。用于本發明的可檢測的標記物的其他描述提供于本文中其他地方。本發明部分地還包括編碼用于產生抗體的多肽序列的核酸序列。例如，本發明包括編碼細胞色素c多肽或其片段的核酸序列，并且包括可用于產生多肽的核酸序列的用途，所述多肽可用作利用其產生識別乙酰化細胞色素c多肽的抗體的抗原。可檢測地標記本發明的多肽和/或核酸以用于本發明的方法和/或組合物。眾多可檢測的標記物可獲得用于本發明的方法并且可包括提供直接檢測(例如，熒光、比色法或光學等)或間接檢測(例如，酶產生的發光、表位標簽例如FLAG表位、酶標簽例如辣根過氧化物酶、標記的抗體等)的標記物。取決于標記物和其他測定成分的性質，許多方法可用于檢測可檢測的標記物。可通過光學或電子密度、輻射發射、非輻射能量轉移等直接檢測標記物，或利用抗體綴合物、鏈霉抗生物素蛋白-生物素綴合物等間接檢測標記物。使用和檢測標記物的方法對于本領域技術人員來說是公知的。本發明的方法可用于體內、體外和/或離體成像，包括但不限于實時成像。受試者中標記的抗體的存在可使用標準方法通過體內、 離體或體外成像來檢測。檢測方法的實例包括但不限于MRI、功能MRI、X射線檢測、PET、CT 成像、免疫組織化學、組織或細胞的Western印跡法，或利用任何其他適當的檢測方法。如此處使用的術語“可檢測的標記物”意指優選選自但不限于熒光、酶、放射性、金屬、生物素、化學發光和生物發光分子的分子。如本文中所使用的，可檢測的標記物可以是比色標記物(colorimetric label)例如生色團分子。在本發明的一些方面，可使用單個或使用兩個或更多個本文中所示的可檢測的標記物或其他本領域已知的可檢測的標記物可檢測地標記多肽或抗體。放射性或同位素標記物可以是例如14C，3H, 35S, 125I和^3。熒光標記物可以是發射電磁輻射(所述電磁輻射是由于入射輻射的吸收而產生的并且只要持續刺激輻射就可保持)，優選可見光的任意化合物。可用在本發明的多肽和/或抗體上和本發明的方法中的熒光標記物的實例包括但不限于2，4- 二硝基苯基、吖啶、cascade藍、羅丹明、4_苯甲酰基苯基、7_硝基苯_2_嗜 -1, 3- 二唑、4，4- 二氟-4-bora-3a, 4a- 二氮雜-3—indacene 禾口熒光胺(fluorescamine)。 基于吸光度的標記物可以是可根據不同電磁輻射的吸收水平檢測的分子。此類分子可以是例如上述熒光標記物。本發明中的化學發光標記物是指作為非酶促化學反應的結果發射光的化合物。本發明的方法還可包括熒光可檢測診斷分子例如增強綠色熒光蛋白(EGFP)、螢光素酶Hmc) 或另一種可檢測的表達產物的使用。可使用用于檢測的酶促方法，包括堿性磷酸酶和過氧化物酶的使用。其他酶還可用于本發明的方法和試劑盒中的檢測。如本文中所使用的，熒光基團包括但不限于覆蓋整個可見和近紅外光譜的胺反應性熒光基團。此類熒光基團的實例包括但不限于4-甲基傘形酮酰磷酸酯、異硫氰酸熒光素 (FITC)、四甲基若丹明異硫氰酸酯(TRITC)、B0DIPY染料；Oregon綠、羅丹明綠染料；紅色熒光羅丹明Red-X、德克薩斯紅染料；和紫外光可激發的Cascade藍、Cascade黃、Marina 藍、Pacific藍和AMCA-X熒光基團。熒光基團還可包括用于熒光共振能量轉移(FRET)的非熒光染料。可從本領域內已知的標準部分制備本發明的標記的多肽或抗體。如被本領域技術人員所公認的，用于制備可檢測的標記的多肽、抗體或其片段的標記方法可根據多肽或抗體和可檢測的標記物的分子結構而變化。本領域技術人員常規地使用用一個或更多個類型的可檢測標記物標記多肽和/或抗體的方法并且充分理解該技術。本發明的組合物(例如，乙酰化多肽、針對乙酰化細胞色素c的抗體和其衍生物/ 綴合物等)具有診斷和治療效用。如本文中所述，本發明的抗體或抗原結合片段可用于例如鑒定和/或分離細胞色素c多肽和/或乙酰化和/或非乙酰化細胞色素c多肽。可將抗體偶聯至特異性診斷標記試劑以用于突變的和/或野生型細胞色素C多肽或其片段的成像。還可使用本領域技術人員已知的標準方法將本發明的抗體或其抗原結合片段用于免疫沉淀、免疫印跡細胞色素C和/或乙酰化細胞色素C。在一些實施方案中，特異性結合乙酰化細胞色素c多肽的本發明的抗體或抗原結合片段可存在于溶液中或可被連接至表面(例如，浸漬片(dipstick)、微量滴定板、多孔板、 塑料、載玻片、卡片等)。然后可將受試者的樣品施用于基質，然后處理基質以估計特異性結合是否可在抗體與多肽或樣品的其他成分之間發生。如本文中所使用的，基質可由材料包括任意合成的或天然的材料制造。本發明的基質的實例可包括但不限于玻璃、塑料、尼龍、 金屬、紙、紙板、濾紙、濾膜等，并且可存在于許多形式中，包括但不限于試管、離心管、比色杯、卡片、載玻片、浸漬片、珠粒、蓋玻片、多孔板、培養皿等。本領域技術人員公認許多其他類型的表面可用于本發明的方法。如將被本領域技術人員所理解的，還可通過將受試者的樣品與本發明的抗體或其抗原結合片段接觸在溶液中進行使用本發明的抗體的結合測定，此時將抗體或其抗原結合片段置于例如在96孔板、試管、載玻片上的小滴等中。
如本文中所使用的術語“連接至表面”意指化學地或生物學地連接至表面并且不可隨意地從表面移去。連接的實例(雖然不期望是限定性的)是底物與抗體之間的共價結合、通過特異性生物學結合的連接等。例如“連接”在本說明書中包括化學連接、化學/生物學連接等。如本文中所使用的術語“共價連接的”意指通過一個或更多個共價鍵連接的。 如本文中使用的術語“特異性連接的”意指如上文針對“連接的”的定義所述將抗體或其片段化學或生物化學地連接至表面，但不包括所有非特異性結合。在本發明的方法中，連接被連接至基質的抗體以便抗體在不使用特殊剝離方法或溶液的情況下不能從基質移去。此類剝離法可包括但不限于物理方法例如刮擦或加熱、酶促方法和化學方法，其可包括但不限于將連接的抗體和基質與溶液接觸以便使基質與表面之間的連接斷裂，從而釋放基質。在本發明的一些實施方案中，將抗體或其抗原結合片段連接至基質，例如浸漬片， 并且將其與來自培養物或受試者的樣品細胞或組織接觸。然后可使用本領域技術人員公知的方法處理基質的表面，以評估特異性結合是否在抗體與受試者樣品中的多肽(例如，乙酰化細胞色素c多肽)之間發生。例如，方法可包括但不限于與第二抗體的接觸，或顯示特異性結合存在的其他方法。施用
用于本發明的方法的藥物試劑優選是無菌的并且以適合于給受試者施用的重量或體積的單位包含有效地產生期望的反應的量的一種或更多種試劑。可根據不同的參數，特別是根據所使用的施用模式和受試者的狀態選擇給受試者施用的藥物試劑的劑量。其他因素包括期望的治療周期。如果受試者的反應在使用的初始劑量上不充分，那么可使用更高的劑量(或通過不同的更局部的遞送途徑產生的有效更高的劑量)達到患者的耐受力可允許的程度。藥物試劑的劑量可由各醫生或獸醫調整，特別是如果發生任意并發癥時。治療有效量通常從0.01 mg/kg變化至約1000 mg/kg,優選從約0. 1 mg/kg變化至約500 mg/kg, 最優選從約0. 2 mg/kg變化至約250 mg/kg,以每日1劑或更多劑施用，進行1或更多天。與本發明相關的試劑和任選地其他治療劑可以以其本身施用或以藥學上可接受的鹽的形式施用。各種施用模式對于本領域技術人員來說是已知的，所述施用模式有效地將本發明的藥物試劑遞送至期望的組織、細胞或體液。施用方法在本申請的其他地方進行了論述。 本發明不限于本文中公開的特定施用模式。本領域中的標準參考資料(例如， Pharmaceutical Sciences,第 20 片反，Lippincottj Williams and Wilkinsj Baltimore MD, 2001)提供了用于遞送藥物載體中的不同藥物制品和制劑的施用模式和制劑。用于本發明的藥物試劑的施用的其他方案對于本領域技術人員來說是已知的，其中施用的劑量、 施用時間安排、施用的部位、施用的模式等依本文中提供的藥物試劑而變化。當施用時，以藥學上可接受的量和以藥學上可接受的組合物應用本發明的藥物制劑。術語“藥學上可接受的”意指不干擾活性成分的生物活性的效力的無毒性物質。此類制劑可常規地包含鹽、緩沖劑、防腐劑、相容性載體和任選地其他治療劑。當用于藥劑時，鹽應當是藥學上可接受的，但非藥學上可接受的鹽可方便地用于制備其藥學上可接受的鹽并且包括在本發明的范圍內。此類藥理學上和藥學上可接受的鹽包括但不限于從下列酸配制的鹽鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來酸、乙酸、水楊酸、檸檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。 同樣地，可將藥學上可接受的鹽制備為堿金屬或堿土金屬鹽例如鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽。
必要時可將藥物試劑或組合物與藥學上可接受的載體組合。如本文中所使用的術語“藥學上可接受的載體”意指適合于施用至人內的一種或更多種相容性固體或液體填充劑、稀釋劑或封裝物質。術語“載體”是指與活性成分組合以促進應用的天然或合成的有機或無機成分。藥物組合物的成分也能夠以使得不存在可顯著削弱期望的藥物功效的相互作用的方式與本發明的藥物試劑混合，以及彼此混合。藥物組合物可包含上述適當的緩沖劑，包括乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、甘氨酸、 硼酸鹽、碳酸鹽，碳酸氫鹽，氫氧化物(和其他堿)和上述化合物的藥學可接受的鹽。藥物組合物還可任選地包含適當的防腐劑例如苯扎氯銨、三氯叔丁醇、對羥苯甲酸類和硫柳藥物組合物可以單位劑型方便地提供并且可利用藥學領域內公知的任意方法來進行制備。所有方法包括將活性試劑與載體結合的步驟，所述載體組成一個或更多個輔助成分。通常，通過將活性化合物與液體載體、細微的固體載體或兩者均勻且緊密地混合在一起來制備組合物，然后需要時塑造產品的形狀。當期望將化合物全身性遞送時，可將其配制用以通過注射，例如通過快速濃注 (bolus injection)或連續輸注外胃腸外施用。用于注射的制劑可以以加入防腐劑的單位劑型(例如在安瓿瓶中或在多劑量容器中)提供。組合物可采取這樣的形式如油性或水性載體中的懸浮液、溶液或乳劑，并且可包含配制劑例如混懸劑、穩定劑和/或分散劑。用于胃腸外施用的藥物制劑包括以水溶性形式存在的活性化合物的水溶液。此外，可將活性化合物的懸浮液制備為適當的油狀注射懸浮液。適當的親脂性溶劑或媒介物包括脂肪油例如芝麻油或合成的脂肪酸酯例如油酸乙酯或甘油三酯類或脂質體。水性注射懸浮液可包含增加懸浮液的粘度的物質，例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。任選地， 懸浮液還可包含適當的穩定劑或增加化合物的溶解性以允許高度濃縮的溶液的制備的試劑。可選地，活性化合物可以以粉劑形式存在，以在使用前用適當的媒介物(例如，鹽水、緩沖液或無菌無熱原水)重建。適合于口服施用的組合物可以以分開的單位提供，例如膠囊、片劑、丸劑、錠劑，各自包含預定量的活性化合物。其他組合物包括水性液體或非水性液體中的懸浮劑例如糖漿劑、酏劑、乳劑或凝膠。用于口服使用的藥物制劑可作為固體賦形劑獲得，任選地研磨所得的混合物，以及必要時在加入適當的助劑后加工顆粒的混合物以獲得片劑或糖錠劑核心。適當的賦形劑是，特別地，填充劑例如糖類，包括乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇或纖維素制劑例如玉米淀粉、 小麥淀粉、米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃蓍樹膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。必要時，可加入崩解劑例如交聯的聚乙烯吡咯烷酮、 瓊脂或海藻酸或其鹽例如海藻酸鈉。任選地還可將口服制劑配制在鹽水或緩沖液中，即用于中和內部酸條件的EDTA或可被施用而無需任何載體。還特別地涉及上述成分的口服劑型。可化學修飾成分以便衍生物的口服遞送是有效的。通常，涉及的化學修飾是將至少一個部分連接至成分分子本身，其中所述部分允許 (a)抑制蛋白水解；和(b)從胃或腸吸收至血流中。還期望增加成分的總體穩定性和增加體內循環時間。此類部分的實例包括聚乙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸。Abuchowski和Davis，1981，"Soluble Polymer-Enzyme Adducts" In: Enzymes as Drugs, Hocenberg 禾口 Roberts, eds., ffiley-Interscience, New York, NY, pp. 367-383; Newmark,等)κ, 1982, J. App 1. Biochem. 4:185-189。可使用的其他聚合物是聚_1，3- 二氧戊烷和聚_1，3，6-tioxocane。 如上文所指出的，對于藥物應用優選的是聚乙二醇部分。對于成分(或衍生物)，釋放位置可以是胃、小腸(十二指腸、空腸或回腸)或大腸。 本領域技術人員具有在胃中不溶解的但仍可在十二脂腸中或腸的其他地方釋放材料的可獲得的制劑。優選，釋放通過保護試劑或通過在胃環境以外例如腸中釋放生物活性材料來避免胃環境的有害作用。為了確保完全胃抗性，對至少pH 5. O是不可滲透的包衣是必需的。用作腸溶包衣的更常用的惰性成分的實例是乙酸-1，2，4-苯三酸纖維素(cellulose acetate trimellitate)(CAT)、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯(HPMCP)、HPMCP 50,HPMCP 55、聚醋酸乙烯鄰苯二甲酸酯(PVAP)、Eudragit L30D、Aquateric、醋酸鄰苯二甲酸纖維素(CAP)、 Eudragit L、Eudragit S和Shellac。此類包衣可用作混合的薄膜。包衣或包衣的混合物還可用于片劑上，其非欲意保護防止胃的破壞。所述包衣可包括糖包衣或使片劑更容易吞咽的包衣。膠囊可由硬殼(例如明膠)組成以用于遞送干治療劑即粉劑；對于液體形式，可使用軟明膠殼。扁囊劑的殼材料可以是厚淀粉或其他可食用紙。對于丸劑、錠劑、模制片劑或模印片劑，可使用濕法制丸(moist massing)技術。可將治療劑作為以約1 mm顆粒大小的顆粒或丸劑形式存在的細微多顆粒包含在制劑中。用于膠囊施用的材料的制劑也可作為粉劑、輕輕壓制的塞(lightly compressed plug)或甚至作為片劑。可通過壓制制備治療劑。著色劑和調味劑都可包括。例如，可配制試劑(例如利用脂質體或微球體封裝)，然后將其進一步包含在可食用產品例如含有著色劑和調味劑的冷飲(refrigerated beverage)中。可用惰性材料稀釋或增加治療劑的體積。此類稀釋劑可包括碳水化合物，特別是甘露醇、乳糖、無水乳糖、纖維素、蔗糖、修飾的葡聚糖和淀粉。某些有機鹽也可用作充填劑， 包括三磷酸鈣、碳酸鎂和氯化鈉。一些商購可得的稀釋劑是I^ast-FlcKEmdehSTA-Rx 1500、 Emcompress 禾口 Avicell。可在治療劑至固體劑型的配制中包含崩解劑。用作崩解劑的材料包括但不限于淀粉，包括基于淀粉的商業崩解劑Explotab。羧甲淀粉鈉、Amberlite、羧甲基纖維素鈉、 ultramylopectin、海藻酸鈉、明膠、橙皮、酸性羧甲基纖維素、天然海綿和膨潤土都可使用。 崩解劑的另一種形式是不溶性陽離子性交換樹脂。粉末膠(Powdered gum)可用作崩解劑和用作粘合劑，這些試劑可包含粉末膠例如瓊脂、卡拉牙膠或黃蓍膠。海藻酸和其鈉鹽也用作崩解劑。粘合劑可用于將治療劑保持在一起以形成堅硬的片劑并且其包括來自天然產物例如阿拉伯膠、黃蓍膠、淀粉和明膠的材料。其他粘合劑包括甲基纖維素(MC)、乙基纖維素 (EC)和羧甲基纖維素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羥丙基甲基纖維素(HPMC)都可用于醇溶液中以粒化治療劑。減摩劑(anti-frictional agent)可包含在治療劑的制劑中以防止在配制過程中粘結。潤滑劑可用作治療劑與模具壁之間的層，此類物質可包括但不限于硬脂酸，包括其鎂鹽和鈣鹽、聚四氟乙烯(PTFE)、液體石蠟、植物油和石蠟。還可使用可溶性潤滑劑例如十二烷基硫酸鈉、月桂硫酸鎂，不同分子量的聚乙二醇Carbowax 4000和6000。可加入可改善配制過程中藥物的流動性質和在壓制過程中幫助重排的助流劑。助流劑可包括淀粉、滑石、熱解硅膠和水化硅鋁化合物。為了幫助將治療劑溶解于水性環境中，可加入表面活性劑作為濕潤劑。表面活性劑可包括陰離子性去垢劑例如十二烷基硫酸鈉、二辛基硫化琥珀酸鈉和二辛基磺酸鈉。可使用陽離子性去垢劑，其可包括苯扎氯銨或氯化芐乙氧銨(benzethomium chloride)。可作為表面活性劑包含在制劑中的潛在非離子性去垢劑的名錄是聚桂醇400、硬脂酸-40-聚烴氧基酯、聚氧化乙烯氫化蓖麻油10、50和60，單硬脂酸甘油酯，聚山梨酯40、60、65和80、 蔗糖脂肪酸酯、甲基纖維素和羧甲基纖維素。此類表面活性劑可單獨地或以不同比率作為混合物存在于試劑的制劑中。可口服使用的藥物制劑包括由明膠制造的推入配合膠囊(push-fit capsules)以及由明膠和增塑劑例如甘油或山梨醇制造的軟密封膠囊。推入配合(push-fit)膠囊可包含與填充劑例如乳糖、粘合劑例如淀粉和/或潤滑劑例如滑石或硬脂酸鎂以及任選地穩定劑混合的活性成分。在軟膠囊中，可將活性化合物溶解或懸浮在適當的液體例如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇中。此外，可加入穩定劑。還可使用配制用于口服施用的微球體。此類微球體在本領域內已被良好地定義。 用于口服施用的所有制劑應當以適合于此種施用的劑量存在。為了進行頰給藥，組合物可采用以常規方式配制的片劑或錠劑形式。為了通過吸入施用，可以以氣溶膠噴霧(利用適當的噴射劑例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他適當的氣體，從增壓組件(pressurized pack)或霧化器提供的)的形式方便地遞送按照本發明使用的化合物。在增壓的氣溶膠的情況下，可通過提供閥門來遞送計量的量來確定劑量單位。可配制例如用于吸入器或吹入器的明膠的膠囊和藥筒，其包含化合物和適當的粉基質例如乳糖或淀粉的粉劑混合物。本文中還涉及肺遞送(pulmonary delivery)。當吸氣時，試劑可被遞送至哺乳動物的肺，其橫穿肺上皮層至血液。吸入的分子的報導包括Adjei等人，1990， Pharmaceutical Research, 7:565-569; Adjei 等人，1990, International Journal of Pharmaceutics, 63:135-144 (醋酸亮丙瑞林)；Braquet 等人，1989，Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13 (suppl. 5) : 143-146 (內 1 _1) ; Hubbard ^A , 1989，Annals of Internal Medicine,第 III 卷，pp. 206-212 (al_ 抗胰蛋白酶)； Smith 等人，1989，J. Clin. Invest. 84:1145-1146 (a_l_ 蛋白酶)；Oswein 等人， 1990, "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March,(重組人生長激素)；Debs等人，1988， J. Immunol. 140:3482-3488 (干擾素-Y和腫瘤壞死因子α )和Platz等人，美國專利 No. 5, 284, 656 (粒細胞集落刺激因子)。用于藥物的肺遞送(以產生全身效應)的方法和組合物描述于屬于Wong等人的1995年9月19日發布的美國專利No. 5，451，569中。涉及用于本發明的實踐中的是眾多設計用以治療劑產品的肺遞送的機械裝置，包括但不限于噴霧器、計量吸入器和干粉吸入裝置，其全部對于本領域技術人員來說是非常熟悉的。適合用于本發明的實踐的商購可得的裝置的一些具體實例是由Mallinckrodt， Inc. , St. Louis, Missouri Ij^JitWUltravent； ^Marquest Medical Products, Englewood, Colorado 制造的 Acorn II 噴霧器；由 Glaxo Inc. , Research Triangle Park, North Carolina 制造的 Ventolin 計量吸入器；和由 Fisons Corp. , Bedford, Massachusetts制造的Spinhaler干粉吸入裝置。所有此類裝置需要使用適合用于分散給定的試劑的制劑。通常，各制劑對使用的裝置的類型是專門的，除了治療中使用的常見稀釋劑、佐劑和/或載體外，其還可包括使用適當的噴射材料。同樣地，還涉及脂質體、微膠囊或微球體、包合絡合物(inclusion complexe)或其他類型的載體的使用。適合用于噴霧器(噴射式或超聲式)的制劑通常可包含以約每mL溶液0. 1至25 mg 的生物活性劑的濃度溶解在水中的試劑。制劑還可包含緩沖劑和單糖(例如，用于滲透壓的穩定和調節)。噴霧器制劑還可包含表面活性劑以減少或防止在形成氣溶膠中由溶液的霧化引起的表面誘導的試劑聚集。用于計量吸入器裝置的制劑通常包含極細胞粉末，所述粉末含有借助表面活性劑懸浮在噴射劑中的試劑。噴射劑可以是用于該目的任意常規材料，例如氟氯碳、氫氯氟碳、 氫氟碳或烴，包括三氯氟甲烷，二氯二氟甲烷，二氯四氟乙醇和1，1，1，2_四氟乙烷或其組合。適當的表面活性劑包括三油酸山梨坦和大豆卵磷脂。油酸還可用作表面活性劑。用于從干粉吸入裝置分散的制劑可包含含有試劑的極細干粉并且還可以以促進粉劑從裝置擴散的量(例如按重量計算制劑的50至90%)包含填充劑例如乳糖、山梨醇、蔗糖或甘露醇。應當最有利地以具有小于10 mm (或微米)，最優選0.5至5 mm的平均顆粒大小的顆粒形式來制備試劑，以最有效地遞送至遠端肺。還涉及本發明的藥物組合物的鼻(或鼻內)遞送。鼻遞送允許在將治療性產物給鼻施用后使本發明的藥物組合物直接通過進入血流而無需產物在肺中沉積。用于鼻遞送的制劑包括具有葡聚糖或或環糊精的制劑。為了進行鼻遞送，有用的裝置是將計量噴霧器(metered dose sprayer)連接至其的小的堅硬的瓶子。在一個實施方案中，通過將本發明的藥物組合物抽入確定體積的小室來遞送計量的劑量，該小室具有尺寸經定制用以當壓縮小室內的液體時通過形成噴霧使氣溶膠制劑成煙霧狀散開的小孔。壓縮小室以施用本發明的藥物組合物。在具體的實施方案中，小室是活塞裝置。此類裝置是商購可得的。可選地，使用塑料擠瓶，其具有尺寸經定制用以當擠壓時通過形成噴霧使氣溶膠制劑成煙霧狀散開的小孔或開口。開口通常見于瓶子的頂部，并且頂部通常逐漸變細以部分適合鼻道，以便氣溶膠制劑的高效施用。優選，鼻吸入器可提供計量量的氣溶膠制劑以施用測量的劑量的藥物。還可將化合物配制在直腸或陰道組合物例如栓劑或保留灌腸(例如包含常規栓劑基質例如可可脂或其他甘油酯類)中。除了之前描述的制劑外，還可將化合物配制為貯庫制劑(cbpot pr印aration)。可用適當的聚合物或疏水性材料(例如作為可接受的油中的乳劑)或離子交換樹脂(或作為略溶衍生物例如作為略溶性鹽)配制這樣的長效作用制劑。
藥物組合物還可包含適當的固體或凝膠相載體或賦形劑。此類載體或賦形劑的實例包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖類、淀粉、纖維素衍生物、明膠和聚合物例如聚乙二適當的液體或固體藥物制劑形式是例如用于吸入的水溶液或鹽溶液、微型膠囊封裝的、encochleated、包被至微小金顆粒上的、包含在脂質體中的、霧化的，氣溶膠、用于植入皮膚的丸劑或干燥至銳物上以擦傷施入皮膚。藥物組合物還包括顆粒、粉劑、片劑、包被的片劑、(微)膠囊、栓劑、糖漿劑、乳劑、懸浮劑、乳膏劑、滴劑或活性化合物延長釋放的制齊U，在其制劑中賦形劑和添加劑和/或助劑例如崩解劑、粘合劑、包衣劑、泡脹劑(swelling agent)、潤滑劑、調味劑、甜劑或增溶劑如上所述通常地使用。藥物組合物適合用于許多藥物遞送系統。關于用于藥物遞送的方法的概述，參見Langer，Science 249:1527-1533, 1990，將其通過援引引入本文。可將治療劑在顆粒中提供。本文中使用的顆粒意指納米或微米顆粒(或在一些情況下更大)，其可全部或部分由本文中描述的治療劑組成。顆粒可在由包衣包括但不限于腸溶包衣包圍的核心含有治療劑。治療劑也可分散在整個顆粒中。治療劑也可吸收入顆粒中。顆粒可以是任意級釋放動力學，包括零級釋放、一級釋放、二級釋放、延遲釋放、持續釋放、立即釋放和其任意組合等。除了治療劑以外，顆粒還可包含藥學和醫學領域內常規使用的那些材料的任意材料，包括但不限于易蝕的、耐腐蝕的(nonerodible)、生物可降解的或不能生物降解的材料或其組合。顆粒可以是包含以溶液或以半固體狀態存在的本文中描述的治療劑的微膠囊。顆粒可以實際上是任意形狀。不能生物降解的和生物可降解的聚合材料都可用于制造用于遞送治療劑的顆粒。此類聚合物可以是天然或合成的聚合物。基于期望釋放所經歷的時期選擇所述聚合物。特殊目的生物粘附聚合物包括由H. S. Sawhney, C. P. I^athak和J. A. Hubell在 Macromolecules, (1993) 26:581-587 (將其教導在此引入)中描述的生物蝕解水凝膠類。 此類聚合物包括聚透明質酸、酪蛋白、明膠、明膠蛋白、聚酐、聚丙烯酸、藻酸酯、殼聚糖、聚 (甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸異丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸異癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸異丙酯)、聚(丙烯酸異丁酯)和聚(丙烯酸十八酯)。可將治療劑包含在控制釋放系統中。術語“控制釋放“意欲指其中藥物從制劑釋放的方式和特征受到控制的任意包含藥物的制劑。這是指立即釋放制劑以及非立即釋放制劑，非立即釋放制劑包括但不限于持續釋放和延遲釋放制劑。術語“持續釋放"(也稱為 “延長釋放“)以其常規意義使用，是指在延長的時期內提供藥物的逐步釋放，并且優選，雖然不是必需地，導致在延長的時期內藥物的血液水平基本恒定的藥物制劑。術語“延遲釋放“以其常規意義使用，是指其中在制劑的釋放與藥物從其釋放之間存在時間延遲的藥物制劑。"延遲釋放"可以包括或可以不包括在延長的在時期內藥物的逐步釋放，從而可以是或可以不是“持續釋放”。長期持續釋放植入物的使用可以特別適合于慢性狀況的治療。“長期”釋放，如本文中所使用的，意指構建和排列植入物以遞送治療水平的活性成分進行至少7天，優選30 至60天。長期持續釋放植入物對于本領域技術人員來說是公知的并且包括一些本文中描述的釋放系統。為了對眼、鼻膜、粘膜或對皮膚局部施用，可將治療劑配制為軟膏、乳膏劑或洗劑，或配制為透皮貼劑或眼內插入物(intraocular insert)或離子電滲療法 (iontophoresis).例如，可用水性或油性基質單獨地或與適當的增稠劑和/或膠凝劑一起配制軟膏和乳膏劑。可用水性或油性基質配制洗劑，其通常還包括一種或更多種乳化劑、 穩定劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑或著色劑。(關于基于藥學上可接受的凝膠的局部載體的描述，參見，例如，屬于 Mueller, D.，等人的 U. S. 5，563，153，名稱為 ‘Sterile Topical Anesthetic Gel，，)。一般地，治療劑以在按重量計算約0. 01%至約30. 0% (基于組合物的總重量)的范圍內變化的量存在于局部制劑中。優選，試劑以在按重量計算約0.5至約30%的范圍內變化的量存在和，最優選試劑以在按重量計算約0.5至約10%的范圍內變化的量存在。在一個實施方案中，本發明的組合物包含凝膠混合物以最大化與局部疼痛的表面的接觸和最小化緩和局部疼痛所必需的體積和劑量。GELF0AM (由Upjohn Corporation制造的基于甲基纖維素的凝膠)是優選的藥學上可接受的局部載體。其他藥學上可接受的載體包括用于經皮膚藥物遞送的離子電滲療法。本發明還涉及試劑盒的使用。在本發明的一些方面，試劑盒可包括藥物制劑小瓶、 藥物制劑稀釋劑小瓶和一種或更多種治療劑。在一些實施方案中，試劑盒包括用于診斷目的試劑例如單種抗體或多種抗體。裝有藥物制劑的稀釋劑的小瓶是任選的。稀釋劑小瓶裝有稀釋劑例如用于稀釋可以是治療劑的濃縮液或凍干粉劑的物質的生理鹽水。說明書可包括關于將特定量的稀釋劑與特定量的濃縮藥物制劑混合，由此制造用于注射或輸注的終制劑的說明書。說明書可包括關于用有效量的治療劑治療受試者的說明書。說明書可包括關于診斷患者、表征患者患給定疾病的風險或評估給定的療法對于患者的功效的說明書。還要理解，裝有制劑的容器，無論容器是瓶子還是具有中隔的小瓶、具有中隔的安瓿、輸液袋 (infusion bag)等，其可包含標記例如當制劑已進行了高壓滅菌或以其它方式已滅菌時改變顏色的常規標記。與本發明相關的試劑盒示于圖17中。本發明通過下列實施例進一步舉例說明，所述實施例絕不應當被解釋為進一步限定。整個本申請中引用的全部參考資料(包括文獻參考、發布的專利、公開的專利申請和共同未決的專利申請)的完整內容明確地通過援引引入本文。因此在已描述本發明的至少一個實施方案的若干方面后，要理解各種改變、變動和改進對于本領域技術人員來說可容易地發生。這樣的改變、變動和改進意欲為本公開內容的部分，并且意欲在本發明的精神和范圍內。因此，上述描述和附圖僅作舉例說明。
實施例方法
細胞培養和轉染
將SH-SY5Y細胞培養在補充有10%胎牛血清(FCS)的達爾伯克氏改良伊格爾培養基 (DMEM)中。用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)轉染 SH-SY5Y 細胞。從出生后第5天的小鼠幼崽的小腦制備顆粒神經元培養物。將神經元置于多鳥氨酸包被的96 孔板上并且于補充有 10%小牛血清(Hyclone Laboratories, Logan, UT) ,25 mM KC1、2 mM谷氨酰胺，青霉素和鏈霉素的eagle基本培養基(BME) (Sigma, St. Louis, MO)中培養。 在制備培養物1天后，用10 MM抗有絲分裂劑胞嘧啶-D-阿糖胞苷(Sigma，St. Louis, MO) 處理它們以防止非神經元細胞增殖。質粒構建
通過使用基于PCR的標準克隆策略產生全部表達構建體，并且通過DNA測序驗證全部表達構建體。從pEGFP-小鼠細胞色素c-GFP載體(來自D. Green, St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, TN的禮物)PCR擴增小鼠細胞色素c編碼序列并且將其克隆入pcDNA3. 1+ anvitrogen)-衍生的載體pcDNAFlag以產生具有C末端Flag標簽的細胞色素c。將定點誘變用于構建pcDNA-小鼠細胞色素c K74R-Flag、pcDNA-小鼠細胞色素c K40R-Flag和pcDNA-小鼠細胞色素c K88R_Flag。通過DNA測序驗證全部構建體。pcDNA-人 SIRT3-Flag 和 pcDNA-人 SIRT3-HA 載體由 B. Schwer, University of California, San Francisco 提供。免疫印跡
使用的抗體是抗Flag M2、兔多克隆抗Flag和抗FLAG M2瓊脂糖親和凝膠(Sigma， St. Louis, M0)、抗HA單克隆抗體(Sigma)、乙酰化-賴氨酸多克隆抗體(Cell Signaling Technology, Beverly, MA) ^ ^fiM M^M c (Pharmingen and Santa Cruz Biotechnology)。用增強化學發光(GE Healthcare)使免疫印跡顯色。免疫沉淀
在含有蛋白酶抑制劑混合物(Roche)的冰冷緩沖IP緩沖液(1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 0. 5 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4)中裂解細胞。在4°〇下以16，000 g 離心裂解物10分鐘，通過使用抗FLAG M2瓊脂糖親和凝膠(Sigma，St. Louis, MO)在4°C下進行免疫沉淀12小時。當將抗細胞色素c (Santa Cruz Biotechnology)抗體用于免疫沉淀時，將樣品在4°C下溫育4小時。在IP緩沖液中洗滌樣品4次。通過SDS-PAGE分離純化的蛋白質，然后進行免疫印跡。細胞色素c的大規模純化，然后進行串聯質譜法
對來自用pcDNA-小鼠細胞色素c-Flag +/- pcDNA- hSIRT3_HA轉染的SH-SY5Y細胞的10 xl5 cm-板的細胞提取物進行大規模Flag-免疫沉淀，然后用3X Flag肽洗脫。通過 SDS-PAGE分離純化的蛋白質，然后切取相應于細胞色素c的條帶，利用MS/MS進行分析。細胞存活測量
將來源于WT和SIRT3 null小鼠的原代顆粒神經元的對紅藻氨酸的抗性定量為利用50 uM紅藻氨酸進行4小時和M小時的處理后活細胞的百分比。使用MTT測定定量紅藻氨酸處理后死亡的細胞，使用 CellTiter 96 Nonradioactive Cell Proliferation Assay 試劑盒(!Iomega)進行MTT測定。動物實驗
將同胞仔(Littermate)U9/Sv (6-8周齡)小鼠用于研究。SIRT3 / 小鼠在129/ sv背景中。在控制溫度(25°C)和光照下圈養小鼠，并且喂以正常飲食。為了誘發癲癇(seizures)，用30 mg/kg KA腹膜內注射WT雌性(n = 6)和KO雌性(n = 5)小鼠以及WT雄性(n = 5)和KO雄性(n = 6)小鼠。該KA劑量在全部小鼠中引發癲癇。
使用計算機化恐懼條件化系統(TSE，Bad Homburg, Germany)進行恐懼條件化實驗。在籠子(36 cmX21 cmX20 cm)中進行恐懼條件化。在每一次試驗后使用95%乙醇清洗箱子。場景依賴個生恐'県條件化(Context-dependent fear conditioning)
訓練由將小鼠暴露于條件化箱(conditioning box)(場景)3分鐘，然后進行足電擊 (foot shock) O秒，0.7 mA,恒定電流)組成。M小時后，通過將再小鼠暴露于條件化場景內3分鐘進行記憶測試。在3分鐘(總共18個取樣間隔)的過程中由兩個受過訓練的觀察者(一個不知道實驗條件)每10秒記錄一次僵直不動(freezing)(定義為除了心率和與屈膝姿勢(crouching posture)相關的呼吸外缺乏運動)。作為來自兩個觀察者的平均數獲得的表示僵直不動的觀察的次數表示為總觀察次數的百分比。在訓練過程中，將小鼠的對照組只暴露于場景(3分鐘)，或立即足電擊O秒，0.7 mA,恒定電流)，然后場景(3 分鐘)。音調依賴性恐懼條件化(Tone-d印endent fear conditioning)
訓練由將小鼠暴露于條件化箱(場景)3分鐘，然后給予音調[30秒，10 kHz, 75 dB 聲壓水平(SPL)]和足電擊O秒，0.7 mA,恒定電流)組成。M小時后通過將小鼠暴露于新場景中進行3分鐘，然后再暴露于音調(10 kHz, 75 dB SPL)進行3分鐘來進行記憶測試。如上所述由兩個無偏見的觀察者每10秒鐘一次記錄僵直不動。轉棒(Rotarod)
在小鼠變得熟悉過程后，將它們置于轉棒(TSE，Bad Homburg, Germany)上，測量在對小鼠設置的新程序(18 rpm)上直至紅藻氨酸注射的小鼠跌落轉棒的時間。進行6次試驗。曠場試驗
將小鼠置于曠場設備G4 X 44 X 30 cm)中央。通過自動監控系統(TSE Systems, Bad Homburg, Germany)跟蹤動物的運動10 分鐘。水迷宮測試
在充滿不透明水的圓形大水槽中進行水迷宮示例。將平臺(11 X 11 cm)在靶象限的中央沉沒在水的表面下面。利用攝影機記錄小鼠的游泳途徑并且利用Videomot 2軟件 (TSE)分析途徑。對于每一個訓練期，隨后從水槽的4個隨機點將小鼠置于迷宮中。使小鼠尋找平臺60秒。如果小鼠在60秒內沒有發現平臺，則輕輕地將它們導向平臺。使小鼠在平臺上保持30秒。在記憶測試(探針測試)中，從水槽除去平臺，讓小鼠在迷宮中游泳60 秒。MM
質譜分析顯示細胞色素c蛋白的殘基K40和K74在SH-SY5Y細胞中被乙酰化(圖1)。 當在hSIRT3不存在的情況下用細胞色素c蛋白轉染SH-SY5Y細胞時，檢測到細胞色素c的殘基K40和K74的乙酰化(圖2)，然而當與細胞色素c共轉染hSIRT3時，不再檢測到細胞色素c的殘基K40和K74的乙酰化(圖3)，這表明SIRT3對細胞色素c蛋白的脫乙酰化。 細胞色素c蛋白在許多物種中是保守的(圖4)。通過用精氨酸殘基置換每一個殘基來突變殘基K40、K73和K88。免疫沉淀實驗顯示可使用抗PAN抗體(乙酰化的-賴氨酸多克隆抗體)(Cell Signaling Technology,Beverly, ΜΑ)檢測Κ74的乙酰化(圖5)。為了研究SIRT3是否與細胞色素c相互作用并且使其脫乙酰化，進行共免疫沉淀實驗和脫乙酰化實驗。圖6和7顯示SIRT3與細胞色素c之間的相互作用以及通過SIRT3 產生的細胞色素c的脫乙酰化。為了研究SIRT3的功能，產生SIRT3敲除小鼠(T3_/_)。圖8提供了使用Τ3_/_小鼠進行的實驗方法的概述。圖9顯示紅藻氨酸對原代小腦顆粒神經元的作用。Τ3-/-小鼠在紅藻氨酸注射后顯示減少的細胞存活。圖10顯示在包括紅藻氨酸注射的實驗過程中野生型與Τ3-/-小鼠之間的體重比較。使小鼠經歷恐懼條件化實驗并且比較野生型與Τ3-/-小鼠之間的學習時間。圖11 和12顯示Τ3-/-突變對學習時間的影響。顯示恐懼條件化實驗的示意圖示于圖13中。還通過檢查海馬和杏仁核神經元來研究紅藻氨酸注射對記憶功能的效應。圖14 顯示海馬和杏仁核神經元在Τ3-/-小鼠中丟失。場景性恐懼條件化實驗顯示Τ3-/-小鼠展示比經歷恐懼條件化的野生型小鼠更低百分比的僵直不動行為。揭示恐懼條件化實驗中的行為水平的圖示于圖16中。 為了研究SIRT3在行為中的作用，使Τ3-/-小鼠經歷行為分析，包括測試運動行為的曠場試驗。表示用于評估運動行為的實驗方法的流程圖示于圖17中。用于運動行為實驗的Τ3-/-和野生型小鼠的體重描述于圖18中。測試Τ3-/-和野生型小鼠的旅行距離和運動速度。發現Τ3-/-小鼠在曠場試驗中比野生型小鼠旅行稍微更遠的距離并且以略微更快的速度運動(圖19-20)。然后在水迷宮測試中測試小鼠的運動能力。在第1天習慣化階段中，發現Τ3-/-小鼠逃出水迷宮的能力比野生型小鼠略弱(圖21)。在多天訓練后，跟蹤小鼠在水迷宮中的運動(圖22-23)。在試驗1中，發現Τ3-/-小鼠在目標象限中花費的時間比野生型小鼠少，在相反象限(opposite quadrant)中花費的時間比野生型小鼠多(圖M-25)。在試驗2中觀察到相同的結果(圖26-27)。這些結果表明在運動行為測試中T3-/-小鼠相對于野生型小鼠學習能力降低。為了確定T3-/-小鼠的海馬中蛋白質的乙酰化狀態，使用PAN抗體(Cel 1 Signaling Technology, Beverly, ΜΑ)從野生型和T3_/_小鼠的海馬裂解物進行免疫沉淀實驗。這些實驗顯示蛋白質在Τ3-/-小鼠的海馬中超乙酰化(圖觀)。與本發明相關的試劑盒的示意圖示于圖四中。等同物
本領域技術人員將承認或能夠僅使用常規實驗確定，本文中描述的本發明的特定實施方案的許多等同物。此類等同物意欲由下列權利要求包括。本文中公開的全部參考資料包括專利文獻全文通過援弓I并入本文。
權利要求
1.表征受試者患神經退行性病癥的風險的方法，所述方法包括檢測受試者的樣品中乙酰化細胞色素c的水平，其中相對于預定值，受試者的樣品中升高的乙酰化細胞色素c水平標示著增加的患神經退行性病癥的風險。
2.權利要求1的方法，其中樣品中乙酰化細胞色素c的水平通過使用特異性結合乙酰化細胞色素的抗體來檢測。
3.權利要求1的方法，其中樣品中乙酰化細胞色素c的水平通過使用質譜法來檢測。
4.表征受試者患神經退行性病癥的風險的方法，所述方法包括檢測受試者的樣品中相應于全長野生型細胞色素c多肽中的殘基K40的賴氨酸殘基的乙酰化，其中受試者的樣品中相應于全長野生型細胞色素c多肽的殘基K40的賴氨酸殘基的乙酰化的存在表明所述受試者具有增加的患神經退行性病癥的風險。
5.權利要求4的方法，其中利用質譜法檢測受試者的樣品中相應于全長野生型細胞色素c多肽的殘基K40的賴氨酸殘基的乙酰化。
6.表征受試者患神經退行性病癥的風險的方法，所述方法包括檢測受試者的樣品中相應于全長野生型細胞色素c多肽中的殘基K74的賴氨酸殘基的乙酰化，其中受試者的樣品中相應于全長野生型細胞色素c多肽的殘基K74的賴氨酸殘基的乙酰化的存在表明所述受試者具有增加的患神經退行性病癥的風險。
7.權利要求6的方法，其中利用質譜法檢測受試者的樣品中相應于全長野生型細胞色素c多肽的殘基K74的賴氨酸殘基的乙酰化。
8.表征受試者患神經退行性病癥的風險的方法，所述方法包括檢測受試者的樣品中相應于全長野生型細胞色素c多肽中的殘基K40和K74的賴氨酸殘基的乙酰化，其中相應于全長野生型細胞色素c多肽的殘基K40和K74的賴氨酸殘基的乙酰化的存在表明所述受試者具有增加的患神經退行性病癥的風險。
9.權利要求8的方法，其中利用質譜法檢測受試者的樣品中相應于全長野生型細胞色素c多肽的殘基K40和K74的賴氨酸殘基的乙酰化。
10.診斷受試者的神經退行性病癥的方法，所述方法包括檢測受試者的樣品中乙酰化細胞色素C的水平，其中相對于預定值，受試者的樣品中升高的乙酰化細胞色素c水平標示著神經退行性病癥。
11.權利要求10的方法，其中受試者的樣品中乙酰化細胞色素C的水平通過使用特異性結合乙酰化細胞色素c的抗體來檢測。
12.權利要求10的方法，其中受試者的樣品中乙酰化細胞色素c的水平通過質譜法來檢測。
13.評估療法在患有神經退行性病癥的受試者中的功效的方法，所述方法包括檢測受試者的樣品中細胞色素c的乙酰化水平，其中相對于預定值，受試者的樣品中細胞色素c的乙酰化水平標示著所述療法是否有效。
14.權利要求13的方法，其中受試者的樣品中乙酰化細胞色素c的水平通過使用特異性結合乙酰化細胞色素c的抗體來檢測。
15.權利要求13的方法，其中利用質譜法檢測受試者的樣品中乙酰化細胞色素c的水平。
16.治療患有神經退行性病癥的受試者的方法，所述方法包括給需要此種治療的受試者施用有效量的化合物以使受試者中乙酰化細胞色素c的水平降至低于預定值，其中所述化合物是激活sirtuin的化合物。
17.抑制其中細胞色素c被乙酰化的細胞的細胞凋亡的方法，包括將所述細胞與使細胞色素c脫乙酰化的試劑接觸，從而抑制細胞的細胞凋亡。
18.權利要求17的方法，其中使細胞色素c脫乙酰化的試劑是脫乙酰酶蛋白。
19.權利要求18的方法，其中所述脫乙酰酶蛋白是sirtuin。
20.權利要求19的方法，其中所述sirtuin是SIRT3。
21.確定癌癥患者是否應當用乙酰化細胞色素c的試劑來進行治療的方法，所述方法包括進行確定患者是否患有癌癥的測定，所述癌癥顯示相應于全長野生型細胞色素c多肽中的殘基K40和K74的賴氨酸殘基的脫乙酰化，其中如果患者患有顯示相應于全長野生型細胞色素c多肽中的殘基K40和K74的賴氨酸殘基的脫乙酰化的癌癥，那么所述患者是利用乙酰化細胞色素c的組合物的治療的候選者ο
22.誘導其中細胞色素c被脫乙酰化的細胞的細胞凋亡的方法，包括 將所述細胞與乙酰化細胞色素c的試劑接觸，從而誘導細胞的細胞凋亡。
23.權利要求22的方法，其中所述細胞存在于體內并且所述方法還包括將所述細胞與另外的治療劑接觸。
24.減少展示細胞色素c的脫乙酰化的癌細胞的活力的方法，所述方法包括將顯示細胞色素c的脫乙酰化的癌細胞與有效地減少癌細胞的活力的量的乙酰化細胞色素c的試劑接觸。
25.權利要求M的方法，其中所述細胞存在于體內并且所述方法還包括將所述細胞與另外的治療劑接觸。
26.特異性結合乙酰化細胞色素c多肽的表位的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述表位包含相應于全長野生型人細胞色素c氨基酸序列中的殘基K40的乙酰 化殘基。
27.權利要求沈的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體以約1χ IO-6MU χ 1(Γ7 Μ、1 χ 1(Γ8 Μ、1 χ IO-9MU χ 1(Γ10Μ、5 χ 1(Γ10 M 或 1 χ 1 (Γ11 M 或更小的結合親和力特異性結合表位。
28.權利要求沈的分離的抗體或其抗原結合片段，其中將所述抗體或其抗原結合片段連接至可檢測的標記物。
29.編碼權利要求沈的抗體的核酸分子。
30.含有權利要求四的核酸分子的雜交瘤。
31.產生權利要求沈的抗體的雜交瘤細胞系。
32.包含編碼權利要求沈的抗體或其抗原結合片段的分離的核酸分子的表達載體。
33.用權利要求32的表達載體轉化或轉染的宿主細胞。
34.產生權利要求沈的抗體或其抗原結合片段的質粒。
35.包含權利要求沈至34的任一項的抗體或其抗原結合片段的組合物。
36.特異性結合乙酰化細胞色素c多肽的表位的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述表位包含相應于全長野生型人細胞色素c氨基酸序列中的殘基K74的乙酰化的殘基。
37.權利要求36的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體以約1χ IO-6MU χ 1(Γ7 Μ、1 χ 1(Γ8 Μ、1 χ IO-9MU χ 1(Γ10Μ、5 χ 1(Γ10 M 或 1 χ 1 (Γ11 M 或更小的結合親和力特異性結合所述表位。
38.權利要求36的分離的抗體或其抗原結合片段，其中將所述抗體或其抗原結合片段連接至可檢測的標記物。
39.編碼權利要求36的抗體的核酸分子。
40.含有權利要求39的核酸分子的雜交瘤。
41.產生權利要求36的抗體的雜交瘤細胞系。
42.包含編碼權利要求36的抗體或其抗原結合片段的分離的核酸分子的表達載體。
43.用權利要求42的表達載體轉化或轉染的宿主細胞。
44.產生權利要求36的抗體或其抗原結合片段的質粒。
45.包含權利要求36至44的任一項的抗體或其抗原結合片段的組合物。
46.。
47.鑒定調節SIRT3的脫乙酰酶活性的化合物的方法，包括在測試化合物存在的情況下將乙酰化細胞色素c多肽底物與SIRT3脫乙酰酶接觸，以及測定在所述測試化合物存在的情況下細胞色素c多肽底物的乙酰化水平，其中與對照相比較在測試化合物存在的情況下細胞色素c多肽底物的乙酰化水平的降低標示著增加 SIRT3脫乙酰酶活性的化合物，以及其中與對照相比較，在測試化合物存在的情況下細胞色素c多肽底物的乙酰化水平的增加標示著減少SIRT3脫乙酰酶活性的化合物。
48.權利要求47的方法，其中所述細胞色素c多肽底物包含至少一個相應于全長野生型人細胞色素c多肽的殘基Κ40和/或Κ74的乙酰化的賴氨酸殘基。
49.權利要求47或權利要求48的方法，其中使用質譜法測定細胞色素c多肽底物庫的乙酰化水平。
50.權利要求49的方法，其中質譜法是電噴霧電離(ESI)質譜法或基質輔助激光解析 /電離(MALDI)質譜法。
51.權利要求47至50的任一項的方法，其中所述細胞色素c多肽底物包含單個多肽種類。
52.權利要求47至51的任一項的方法，其中所述細胞色素c多肽底物包含全長細胞色素c多肽。
53.權利要求47至50的任一項的方法，其中所述細胞色素c多肽底物包含兩個或更多個多肽種類的混合物。
54.權利要求47至53的任一項的方法，其中所述細胞色素c多肽底物是細胞色素c的片段，其包含至少一個相應于全長野生型人細胞色素c多肽的殘基K40和/或K74的賴氨酸殘基。
55.權利要求47至53的任一項的方法，其中所述細胞色素c多肽底物是細胞色素c的片段的融合物，其包含至少一個相應于全長野生型人細胞色素c多肽的殘基K40和/或K74 的賴氨酸殘基。
56.權利要求47至55的任一項的方法，其中所述測試化合物是小分子。
57.權利要求47至55的任一項的方法，其中所述測試化合物是分子的文庫。
58.權利要求57的方法，其中所述文庫包括小分子。
59.權利要求47至58的任一項的方法，其中SIRT3脫乙酰酶來自細胞或組織裂解物。
60.權利要求47至59的任一項的方法，其中所述細胞色素c多肽底物存在于細胞中。
61.權利要求47至60的任一項的方法，其中SIRT3是能夠在NAD+或NAD+類似物存在的情況下使包含乙酰化的K40和/或K74的細胞色素c底物脫乙酰化的全長(人)SIRT3 的催化活性片段。
62.用于測定SIRT3的活性的乙酰化多肽底物，其包括細胞色素c的片段，該片段包含至少一個相應于全長野生型人細胞色素c多肽的殘基K40和/或K74的乙酰化的賴氨酸殘基。
63.權利要求64的多肽底物，其中所述多肽底物是細胞色素c的片段的融合物，其包含至少一個相應于全長野生型人細胞色素c多肽的殘基K40和/或K74的乙酰化賴氨酸殘基。
64.包含權利要求62或權利要求63的乙酰化多肽底物的試劑盒。
全文摘要
本發明涉及細胞色素c乙酰化的檢測和調控。本發明具有對于神經退行性病癥和癌癥的診斷和治療應用。
文檔編號G01N33/68GK102265159SQ200980152255
公開日2011年11月30日 申請日期2009年10月23日 優先權日2008年10月23日
發明者V. 哈夫納 A., A. 辛克萊爾 D. 申請人:哈佛大學校長及研究員協會