專利名稱：結合trail-r1和trail-r2的多肽的制作方法
技術領域：
廣義地，本發明涉及癌癥和其它疾病的治療。具體地，本發明涉及結合TRAIL死亡受體并誘導表達TRAIL死亡受體的病原細胞凋亡的多肽。
背景技術：
TRAIL(腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體，除此之外，文獻中也稱為Apo2L和 TNFSF10)屬于腫瘤壞死因子(TNF)超家族，并且已經鑒定為腫瘤細胞中程序化細胞死亡或凋亡的激活劑。TRAIL在免疫系統細胞中表達，包括NK細胞、T細胞、巨噬細胞和樹突細胞， 并且位于細胞膜中。TRAIL可以由半胱氨酸蛋白酶加工，產生蛋白質的可溶形式。TRAIL 的膜結合和可溶形式均可作為三聚體并且能通過與靶細胞上的TRAIL受體相互作用而觸發凋亡。在人類中，已經鑒定了五個受體具有結合TRAIL的活性。這五個受體中的兩個， TRAIL-Rl (DR4, TNFSFlOa)和 TRAIL-R2 (DR5，TNFRSFlOb)，包含稱為死亡結構域(DD)的細胞質區域。這兩個受體分子上的死亡結構域是TRAIL結合受體后外在凋亡途徑TRAIL-活化所需要的。其余三個 TRAIL 受體(稱作 TRAIL-R3(DcRl，TNFRSFlOc)、TRAIL-R4 (DcR2, TNFRSFlOd)和循環骨保護素(OPG，TNFRSFllb))被認為是作為誘餌受體。這三個受體缺乏功能性DD，被認為主要通過隔絕TRAIL或刺激促存活信號而參與負調節凋亡。一旦TRAIL與TRAIL-Rl (DR4)或-R2 (DR5)結合，三聚受體就會募集幾種胞質蛋白，形成死亡誘導信號復合物(DISC)，之后由其活化半胱天冬酶-8或半胱天冬酶-10。這將觸發兩種不同的引起不可逆細胞死亡途徑之一，一條途徑中，半胱天冬酶-8直接激活效應物半胱天冬酶(半胱天冬酶_3、-6、-7)，導致細胞分解，而另一條途徑包括依賴促死亡 Bcl-2家族蛋白Bid的半胱天冬酶-8的裂解，并參加線粒體或內在死亡途徑。根據這種細胞死亡活性，正在研究幾種基于TRAIL的治療方法。在一些臨床前研究中，重組可溶TRAIL誘導了廣譜的人腫瘤細胞系中的凋亡，所述細胞系來自白血病、多骨髓瘤和成神經細胞瘤，以及肺、直腸、胸、前列腺、胰腺、腎和甲狀腺癌。已經在多種腫瘤異種移植物中觀察到了腫瘤生長的劑量依賴型抑制，同時沒有或有很小的全身毒性(Ashkenazi 1999, Jin 2004)。在這些研究中，雖然TRAIL的高度聚集形式與肝毒性有關，但是重組 TRAIL制劑表現出對于選擇性和抗腫瘤性質的重要性。重組TRAIL已經成功地用于患者。正在開發幾種TRAIL-Rl或-R2人拮抗單克隆抗體。在細胞系和小鼠模型中，這些抗體有效地誘導凋亡。目前至少五個單克隆抗體作為單一藥物治療或與小分子化療藥物組合而在進行臨床開發。在至少一項研究中，單克隆抗-DR4或-DR5抗體整體安全并且能夠良好耐受，使多名患者病情穩定(即本身沒有足夠的效力)，組合化學療法正在評價中。使用結合DR5的單克隆抗體的臨床前研究表明通過與二級抗體體外二次交聯而介導的TRAIL 受體超聚集(在體內很可能是通過抗體Fc結構域在腫瘤位點結合免疫細胞表面受體)表現出更強的活性。然而，上述治療方法有幾點缺陷。例如，盡管本體/重組TRAIL能結合TRAIL-Rl和 TRAIL-R2 (均為包含DD的受體)，但是它還結合誘餌受體，極大限制了其活性。此外，TRAIL 的半衰期非常短，為分鐘級，進一步限制了它的作用。盡管提供了半衰期更長的分子，但是每種抗體方法都是對某一類受體有特異性的。此外，大的抗體會限制其腫瘤穿透性。因此，本領域需要其他可結合TRAIL-Rl和TRAIL-R2的分子，包含這些分子的組合物，用于篩選這種分子的方法，和在多種癌癥的藥物治療中使用這種分子的方法。
發明內容
在最廣泛的方面，本發明涉及非天然多肽，其包含三聚結構域和與至少一個TRAIL 死亡受體結合的至少一個多肽。在本發明的各個方面，三聚結構域包括在位置10、17、20、21、對、25、沈、28、四、30、 31、32、33、34或35有多達五個氨基酸取代的SEQ ID NO 10的多肽，并且其中三個三聚結構域形成三聚復合物。在另一個實施方案中，所述三聚結構域包括選自下述之一的三聚多肽hTRAF3[SEQ ID NO ]、hMBP [SEQ ID NO ]、hSPC300 [SEQ ID NO ]、hNEM0[SEQ ID NO:]、 hcubilin[SEQ IDNO ]、hThrombospondins [SEQ ID NO :]，和人 SP-D 的頸區[SEQID NO:]、 牛SP-D的頸區[SEQ ID NO ]、大鼠SP-D的頸區[SEQID NO ]、牛膠固素的頸區[SEQ ID NO ]；牛膠原凝集素的頸區[SEQ ID NO ]；和人SP-D的頸區[SEQ ID NO ]。在具體的實施方案中，本發明的非天然多肽結合TRAIL死亡受體DR4和DR5中的一個或兩個。結合TRAIL死亡受體的多肽可以是C型類凝集素結構域(CLTD)，其中環區段 A或環區段B的環1、2、3或4之一包含結合DR4和DR5中的一個或兩個的多肽序列。在另一個方面，本發明涉及非天然多肽，其包含三聚結構域和結合TRAIL死亡受體DR4的多肽，其中所述結合DR4的多肽包含C型類凝集素結構域(CLTD)，其包含CTLD的環1和4中序列的幾種可能組合。在類似的實施方案中，本發明涉及非天然多肽，其包含三聚結構域和結合TRAIL死亡受體DR5的多肽，其中所述結合DR4的多肽包含C型類凝集素結構域(CLTD)，其包含CTLD的環1和4中序列的幾種可能組合。在一個方面，本發明的非天然多肽不結合TRAIL誘餌受體，比如DcRl、DcR2和循環骨保護素(OPG)。此外，本發明的多肽可以是融合蛋白的形式。在本發明的各個方面，多肽結合DR4和DR5，或者多肽包含均結合DR4或均結合 DR5的兩個序列。例如，本發明的多肽可以包含結合DR4和DR5中至少一個的第一多肽，其位于三聚結構域的N-端或C-端之一，和結合DR4和DR5中至少一個的第二多肽，其位于三聚結構域的N-端或C-端中的另一端。第一和第二多肽均可結合DR4，或者第一和第二多肽均可結合DR5。或者，第一和第二多肽中的一個結合DR4，并且第一和第二多肽中的另一個結合DR5。
在另一個方面，本發明的多肽包括結合DR4或DR5的、位于三聚結構域的N-端和 C-端之一的序列，并且在N-端和C-端的另一端包括結合腫瘤相關抗原(TAA)或腫瘤特異性抗原(TSA)的多肽序列。在另一個方面，結合DR4或DR5的多肽位于三聚結構域的N-端和C-端之一，并且結合選自下組的受體的多肽位于N-端和C-端的另一端fnl4、FAS受體、 TNF受體和LIGHT受體。本發明的多肽還可以具有共價附著于多肽上的治療劑。此外，本發明涉及本發明的三個多肽的三聚復合物。例如，三聚結構域是四聯蛋白三聚結構元件。本發明還涉及誘導患者體內表達DR4和DR5中至少一個的腫瘤細胞凋亡的方法。 方法包括用本發明的三聚復合物接觸細胞。本發明還涉及三聚復合物和至少一種醫藥上可接受的賦形劑的藥物組合物。藥物組合物可以用于治療癌癥患者，并且可以與治療劑同時或順序施用。在另一個方面，本發明涉及制備可誘導細胞凋亡的多肽的方法。方法包括篩選結合DR4或DR5之一但不結合TRAIL誘餌受體的第一多肽，并將第一多肽與多聚結構域的 N-端或C-端之一融合。方法還可以包括篩選特異性結合DR4和DR5中另一個的第二多肽， 并將第二多肽與多聚結構域中N-端或C-端中另一端融合。在這個方面，方法可以包括篩選不結合TRAIL誘餌受體的多肽。本發明的再一個方面包括制備可誘導細胞凋亡的多肽復合物，所述細胞表達 TRAIL的至少一個死亡受體，其包含三個三聚多肽。本發明的其它方面包括制備誘導腫瘤細胞凋亡的多肽的方法。這個方面的方法包括，產生包含CTLD的多肽文庫，所述CTLD包含至少一個隨機環區域，并從可結合DR4或DR5 之一的文庫篩選第一多肽。這個方面還可以包括將所篩選的多肽與多聚結構域的N-端或 C-端融合，并篩選不結合TRAIL誘餌受體的多肽。
圖1描述人(SEQ ID NO :100)和鼠四聯蛋白(SEQ ID NO )成熟形式的編碼區域的核苷酸和氨基酸序列比對，并指示了已知的二級結構元件。圖2顯示四聯蛋白家族三聚結構元件的氨基酸序列比對。氨基酸序列(單字母編碼)對應于包含外顯子2的殘基V17至K52和人四聯蛋白的外顯子3的前三個殘基(SEQ ID NO 1)；鼠四聯蛋白(SEQ IDNO:) (Sorensen 等，Gene，152 :243_245，1995)；分離自礁鯊軟骨的四聯蛋白相似蛋白(SEQ ID NO:) (Neame和Boynton，1992，1996)；和分離自牛軟骨的四聯蛋白相似蛋白(SEQ ID NO ) (Neame和Boynton，數據庫登記號PATCHX :u22298)。七肽重復區域的a和d位置處的殘基用粗體字表示。列出的四聯蛋白家族三聚結構元件的保守序列(SEQ ID NO 10)包含圖中所示七肽重復區域a和d位置處的殘基，以及區域的其它保守殘基。“hy”表示脂肪族疏水殘基。圖3A、B、C和D顯示用作本發明示例的四聯蛋白三聚模塊截短型的實例。圖4顯示已知3D結構的十個CTLD的氨基酸序列比對。在每個序列上表示主要二級結構元件的序列位置，并按照數字順序標為“ α N”，表示α -螺旋數N，和“ β Μ”，表示 β-鏈數目Μ。參與CTLD的兩個保守二硫橋形成的四個半胱氨酸殘基在圖中分別標注為 “CI”、“Cn”、“Cin”和“CIV”。兩個保守的二硫橋分別為CI-CIV和CII-CIIL·人四聯蛋白序列中的各個環1-4和LSB(環5)用下劃線標出。十個C-型凝集素為hTN:人四聯蛋白(SEQ ID NO :XX), MBP 甘露糖結合蛋白(SEQ ID NO =XX) ；SP-D 表面活性劑蛋白D(SEQ ID NO =XX) ；LY49A :NK受體LY49A(SEQ ID NO :XX) ；Hl-ASR 無唾液酸糖蛋白受體的Hl 亞基 (SEQ ID NO :ΧΧ) ;MMR-4:巨噬細胞甘露糖受體結構域4(SEQ ID NO :XX) ；IX-A(SEQ ID NO: XX) ^P IX-B (SEQ ID NO :XX)凝結因子IX/X-結合蛋白結構域A和B ;Lit :胰腺石蛋白(SEQ IDNO :ΧΧ) ；TU14 被囊動物C-型凝集素(SEQ ID NO :XX) 0除TU14之外的所有這些CTLD都來自人蛋白。圖 5 描述分離自人(Swissprot P05452) (SEQ ID NO :XX)、小鼠(Swissprot P43025)(SEQ ID NO :XX)、雞(Swissprot Q9DDD4)(SEQ IDNO :XX)、牛(Swissprot Q2KIS7) (SEQ ID NO :XX)、大西洋鮭魚(Swissprot B5XCV4) (SEQ ID NO :XX)、青蛙(Swissprot Q5I0R9) (SEQID NO :XX)、斑馬魚(GenBank XP_701303) (SEQ ID NO :XX)的四聯蛋白的幾個C 型凝集素結構域，和分離自畜養牛(Swissprot U22298) (SEQ IDNO :XX)和礁鯊(Swissprot P26258) (SEQ ID NO :XX)軟骨的相關CTLD類似物的比對。圖6顯示用于在CTLD中產生隨機環的PCR策略。圖7顯示經過修正包含克隆用限制性位點的人四聯蛋白CTLD的DNA和氨基酸序列，表明Ca2+結合位點。限制性位點用加粗下劃線標出。環用虛線下劃線標出。鈣配位殘基用加粗斜體表示，并包括位點1 D 116,^ 120，G1 147，五150，TV 151 ；位點2 .Q 143,D 145，五150,2) 165。CTLD結構域在氨基酸A45處開始，加粗表示(即ALQTVCL. · ·)。用小寫字母表示對本體四聯蛋白(TNCTLD)堿基序列的改變。使用不改變本體氨基酸序列的沉默突變產生限制性位點。
具體實施例方式在各個方面，本發明涉及TRAIL受體激動劑(agonist)，其包括具有多聚結構域的多肽和一個或多個結合TRAIL死亡受體的多肽。多肽中的兩個、三個或多個能多聚形成激動劑，其為多聚復合物，包括結合TRAIL死亡受體的多肽。一旦與呈現這種受體的細胞上的TRAIL死亡受體結合，激動劑可誘導細胞凋亡。在另一個實施方案中，多肽結合死亡受體但不是受體的激動劑，使與多肽相關(例如，共價結合)的治療劑，比如auristatin、 maytansinoid等靶向傳遞。此外，本發明提供通過對受試對象施用激動劑而治療受試對象的癌癥和其它疾病的方法。多肽包括一個或多個多肽，其特異性地結合TRAIL-Rl (DR4)或 TRAIL-R2 (DR5)中的一個或兩個，并且，優選地，不結合TRAIL誘餌受體。定義在詳細限定本發明之前，定義多個術語。除非本文提供術語的具體定義，否則本公開文件中使用的術語和短語應理解為具有本領域通常所理解的含義。此外，如同本文和附加權利要求中所使用的，除非上下文明確指出，否則單數形式包括復數指示對象。“TRAIL”或“TRAIL 多肽”指 SEQ ID NO :62，以及 SEQ ID NO 62 的生物活性片段。 片段包括，但不限于，具有SEQ ID NO 62的5至50個氨基酸殘基，或5至25，或10至20個殘基，或12至20個氨基酸殘基的序列(例如，25、23、21、19、17、15或更少的氨基酸殘基)。如本文所使用的，術語“TRAIL死亡受體”指可結合TRAIL，并且一旦結合TRAIL即活化腫瘤細胞中的程序化細胞死亡(凋亡)的蛋白質。TRAIL死亡受體的某些非限定性實例包括常稱作 TRAIL-Rl (DR4) (SEQ ID NO 42)或TRAIL-R2 (DR5) (SEQ ID NO 43)的受體蛋
白之一。術語“DR4”、“DR4受體“和“TRAIL-R1”在本文互換使用，指SEQ ID NO :42的全長TRAIL受體序列和Pan等，Science, 276 :111-113(1997) ； 1998年7月30日公開的 W098/32856 ；2002年1月四日提交的美國專利No. 6，342, 363 ；和1999年7月四日公開的 W099/37684中所述的受體的可溶、胞外結構域形式。術語“DR5”、“DR5受體“和“TRAIL-R2”在本文互換使用，指SEQ ID NO :43的全長 TRAIL 受體序列和 Pan 等，Science, 276 :111-113(1997) ；Pan 等，Science, 277 815-818 (1997)，2000 年 6 月 6 日提交的美國專利 No. 6，072，047 ；美國專利 No. 6，342，369， 1009 年 11 月 19 日公開的 W098/51793 ； 1998 年 9 月 24 日公開的 W098/41629 ；Screaton 等，Curr. Biol.，7 :693-696(1997) ；Walczak 等，EMBO J.，16 :5386-5387(1997) ；Wu 等， Nature Genetics, 17 :141-143(1997) ；1998 年 8 月 20 日公開的 W098/35986 ；1998 年 10 月 14日公開的EP870，827 ；1998年10月22日公開的W098/46643 ；1999年1月21日公開的 W099/(^653 ;1999 年 2 月 25 日公開的 W099/09165 ;1999 年 3 月 11 日公開的 W099/11791 中所述的受體的可溶、胞外結構域形式，所述文獻均通過引用全部并入本文。如本文所使用的，術語“TRAIL誘餌受體“指可結合TRAIL并且，一旦結合TRAIL， 不會活化腫瘤細胞中程序化細胞死亡(凋亡)的蛋白質。因此，認為TRAIL誘餌受體起程序化細胞死亡信號抑制劑而不是傳感器的作用。TRAIL誘餌受體的某些非限定性實例包括常稱作 TRAIL-R3 (也稱作 DcRl，TRID, LIT 或 TNFRSFlOc) [(Pan 等，Science, 276 :111-113 (1997) Sheridan 等，Science，277 :818-821 (1997) ；McFarlane 等，J.Biol· Chem.，272 :25417-25420 (1997) ；Schneider 等，FEBS Letters,416 :329-334(1997)； Degli-Esposti 等，J.Exp· Med.，186 :1165-1170(1997)；和 Mongkolsapaya 等，J. Immunol.， 160 :3-6(1998)] (SEQ ID NO 44)，TRAIL-R4(也稱作 DcR2, TRUNDD 禾口 TNFRSFlOd) (SEQ IDNO 45), [Marsters 等，Curr. Biol.，7 :1003-1006(1997) ；Pan 等，FEBSLetters，424 41-45(1998) ；Degli-Esposti 等，Immunity, 7 :813-820(1997)]和循環骨保護素(也稱作 0PG, TNFRSFllb) (SEQ ID NO 46)中的任何受體蛋白，所述文獻均通過引用全部并入本文。使用術語“TRAIL受體激動劑”或“激動劑”最廣泛的含義，并且其中包括在體外、 原位或體內，部分或全部增強、刺激或活化DR4和DR5及其生物活性變體的一種或多種生物活性的任何分子。這種生物活性的實例包括凋亡以及文獻中進一步報道的活性。激動劑可以以直接或間接的形式起作用。例如，，，TRAIL死亡受體激動劑“可以通過直接結合DR4或 DR5，其可引起受體活化或信號轉換，在體外、原位或體內，部分或全部增強、刺激或活化DR4 和DR5的一種或多種生物活性。TRAIL受體激動劑包括本文定義的TRAIL多肽以及可結合 TRAIL受體的、不被當作TRAIL多肽的多肽；例如，使用本文所述方法特異性結合TRAIL死亡受體但不結合TRAIL誘餌受體的多肽。如本文所使用的，術語“結合成員，，指彼此之間有結合特異性的分子對中的成員。 結合對的成員可以天然產生或者全部或部分合成產生。分子對中的一個成員有表面區域或凹陷處，可結合并因此與分子對中另一個成員的特定空間和極性組織互補。因此分子對成員可以彼此特異性結合。在本發明的各個方面，TRAIL死亡受體的結合成員是TRAIL受體激動劑。這些成員包括本文所述TRAIL多肽，以及包括TRAIL多肽和多聚(例如，三聚)結構域的多肽，和包括多聚結構域和非TRAIL多肽的多肽，但是其可結合并刺激TRAIL死亡受體，如本文所進一步描述的。在其它方面，本發明的多肽結合TRAIL死亡受體，但不是受體的激動劑。如本文所使用的，術語“多聚結構域”表示氨基酸序列，其包含能和兩個或多個其它氨基酸序列形成三聚物或其它多聚復合物的功能。在一個實例中，多肽包含氨基酸序列-“三聚結構域”-其與兩個其它三聚結構域形成三聚復合物。三聚結構域能聯合相同氨基酸序列的其它三聚結構域(同三聚體)，或不同氨基酸序列的三聚結構域(異三聚體)。 這種相互作用可能是由于三聚結構域組分之間的共價鍵合以及氫鍵力、疏水力、范德華力和鹽橋而引起的。在本發明的各個實施方案中，多聚結構域是二聚化結構域、三聚結構域、 四聚化結構域、五聚化結構域等。這些結構域能形成本發明的兩個、三個、四個、五個或多個多肽的多肽復合物。本發明的多肽的三聚結構域可以來自美國專利申請公開No.2007/01M901( ‘901 申請)中所述的四聯蛋白，其通過引用全部并入本文。本文中以SEQ ID NO :100提供成熟人四聯蛋白單鏈多肽序列(參見，例如，表1)。四聯蛋白三聚結構域的實例包括SEQ ID NO 1的氨基酸17至49、17至50、17至51和17-52，其代表由人四聯蛋白基因的外顯子2編碼的氨基酸，和可選地由所述基因的外顯子3編碼的前一個、兩個或三個氨基酸。其它實例包括氨基酸1至49、1至50、1至51和1至52，其代表所有外顯子1和2，和可選地由所述基因的外顯子3編碼的前一個、兩個或三個氨基酸。可替換地，在三聚結構域中僅包括外顯子 1編碼的部分氨基酸序列。具體地，三聚結構域的N-端可以在SEQ ID N0:1的殘基1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16和17的任何位置開始。在具體的實施方案中，N端是 I10或V17，并且C-端是Q47、;Γ48、V49、C(S)50、L51或K52(根據SEQ ID N0:1編號)。此外，圖3A-3D提供多種人四聯蛋白三聚結構域的可能的截短型變體。在本發明的一個方面，三聚結構域是包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列的四聯蛋白三聚結構元件(“TTSE”)，其為四聯蛋白家族三聚結構元件的保守序列，US 2007/00154901 中有更完整的描述，其通過引用全部并入本文。如圖2所示，TTSE環抱著四聯蛋白的蛋白家族天然產生成員的變體，和具體地，氨基酸序列經過修正不會對TTSE形成α螺旋卷曲螺旋三聚體的能力產生任何實質的負面影響的變體。在本發明的各個方面，根據本發明的三聚多肽包括作為三聚結構域的TTSE，其與SEQ ID NO 10的保守序列具有至少66%的氨基酸序列同一性；例如與SEQ ID NO 1的保守序列具有至少73%，至少80%，至少86%或至少92%的序列同一性(僅計算確定(不包括X)殘基)。即，SEQID NO 1中確定的氨基酸中至少一個，至少兩個，至少三個，至少四個，或至少五個可以被取代。在一個具體的實施方案中，SEQ ID NO 63在位置50 (C50)處的半胱氨酸可以有利地突變為絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸或任何其它氨基酸殘基，以避免形成不理想的鏈間二硫橋，其會產生不理想的多聚。其它已知的變體包括選自第6、21、22、24、25、27、觀、31、32、35、 39,41和42個(根據SEQ ID NO 63編號)的氨基酸殘基的至少一個氨基酸殘基，其可以由任何非螺旋阻斷的氨基酸殘基取代。這些殘基已經表現出不會直接參與分子間的相互作用，所述相互作用可以穩定本體四聯蛋白單體的三個TTSE之間的三聚復合物。在圖2所示的一個方面，TTSE具有分子式為a-b-C-d-e-f-g(N至C)的重復的七肽重復序列，其中殘基 a和d(即，位置沈、33、37、40、44、47和51)可以是任何疏水氨基酸(根據SEQ ID N0:1編號)。在進一步的實施方案中，TTSE三聚結構域可以通過摻入聚組氨酸序列和/或蛋白酶裂解位點，例如，血凝因子)(a或顆粒酶B (參見US2005/0199251，其通過引用并入本文)， 并通過包括C-端KG或KGS序列而修正。此外，為了幫助純化，位置2的脯氨酸可以用甘氨酸取代。TTSE截短型和變體的具體的非限定性實例如圖3A-3D所示。此外，已知多個與人四聯蛋白的三聚結構域具有實質相似性(大于66%)的三聚結構域。表 權利要求
1.非天然多肽，其包含三聚結構域和與至少一個TRAIL死亡受體結合的至少一個多肽。
2.權利要求1的多肽，其中所述三聚結構域包含SEQID NO :10的多肽，其在位置10、 17、20、21、24、25、26、28、29、30、31、32、33、34或35有多達五個氨基酸取代，并且其中三個三聚結構域形成三聚復合物。
3.權利要求1的多肽，其中所述三聚結構域包含選自下組的三聚多肽hTRAF3[SEQID NO ]、hMBP [SEQ ID NO ]、hSPC300 [SEQID NO ]、hNEM0[SEQ ID NO ]、hcubilin[SEQ ID NO ]、hThrombospondins[SEQ ID NO ]，和人 SP-D 的頸區[SEQ IDNO ]、牛 SP-D 的頸區 [SEQ ID NO ]、大鼠SP-D的頸區[SEQ IDNO ]、牛膠固素的頸區[SEQ ID NO ]；牛膠原凝集素的頸區[SEQID NO ]；和人SP-D的頸區[SEQ ID NO ]。
4.權利要求1的多肽，其中至少一種TRAIL死亡受體是DR4或DR5。
5.權利要求1的多肽，其中所述結合TRAIL死亡受體的至少一種多肽包含C型類凝集素結構域(CLTD)，其中環區段A或環區段B的環1、2、3或4中的一個包含結合DR4和DR5 中至少一個的多肽序列。
6.權利要求1的多肽，其中所述結合TRAIL死亡受體的至少一個多肽結合DR4，并且包含C型類凝集素結構域(CLTD)，其包含環1和4中序列的下述組合之一
7.權利要求1的多肽，其中所述結合TRAIL死亡受體的至少一個多肽與DR5結合，并包含C型類凝集素結構域(CLTD)，其包含環1和4中序列的下述組合之一
8.權利要求1的多肽，其中所述結合TRAIL死亡受體的至少一個多肽不結合TRAIL誘餌受體。
9.權利要求8的多肽，其中所述TRAIL誘餌受體是DcRl、DcR2和循環骨保護素(OPG) 中的至少一個。
10.權利要求1的多肽，其中所述多肽是融合蛋白。
11.權利要求10的多肽，其中所述結合至少一個TRAIL死亡受體的多肽與DR5結合，并包含下述序列ACFPIMTLHCGGG[SEQ IDNO ]。
12.權利要求1的多肽，其中所述結合TRAIL死亡受體的至少一個多肽包含結合DR4的多肽和結合DR5的多肽。
13.權利要求12的多肽，其中所述結合DR4和DR5中至少一個的第一多肽位于三聚結構域的N-端或C-端之一，并且所述結合DR4和DR5中至少一個的第二多肽位于三聚結構域的N-端或C-端中的另一端。
14.權利要求13的多肽，其中所述第一和第二多肽均結合DR4。
15.權利要求13的多肽，其中所述第一和第二多肽均結合DR5。
16.權利要求13的多肽，其中所述第一和第二多肽中的一個結合DR4，所述第一和第二多肽中的另一個結合DR5。
17.權利要求13的多肽，其中所述第一和第二多肽中至少一個包含CTLD，其中環區段 A或環區段B的環1、2、3或4之一包含結合DR4和DR5中至少一個的多肽。
18.權利要求4的多肽，其中所述結合DR4或DR5的多肽位于三聚結構域的N-端和 C-端之一，并且在N-端和C-端中的另一端還包含結合腫瘤相關抗原(TAA)或腫瘤特異性抗原(TSA)的多肽序列。
19.權利要求18的多肽，其中所述多肽結合腫瘤相關抗原(TAA)或腫瘤特異性抗原 (TSA)的親和力比所述多肽結合DR4或DR5的親和力至少高兩倍。
20.權利要求4的多肽，其中結合DR4或DR5的多肽位于三聚結構域的N-端或C-端之一，并且在N-端和C-端中的另一端還包含結合選自下組的受體的多肽序列而14、FAS受體、TNF受體和LIGHT受體。
21.權利要求1的多肽，其還包含共價附著于多肽上的治療劑。
22.包含三個如權利要求1所述的多肽的三聚復合物。
23.權利要求22的三聚復合物，其中所述三聚結構域是四聯蛋白三聚結構元件。
24.權利要求22的包含三個多肽的三聚復合物，其中所述復合物包含結合DR4的三個多肽序列，其中所述序列相同或不同，并且所述復合物包含特異性結合DR5的三個多肽序列，其中所述序列相同或不同。
25.編碼多肽的分離的多核苷酸，所述多肽包含權利要求1的多肽。
26.包含權利要求25的多核苷酸的載體。
27.包含權利要求沈的載體的宿主細胞。
28.誘導患者體內表達DR4和DR5中至少一個的腫瘤細胞凋亡的方法，其包含用權利要求22的三聚復合物接觸細胞。
29.權利要求觀的方法，其中所述三聚復合物誘導半胱天冬酶依賴型凋亡。
30.權利要求四的方法，其中所述三聚復合物誘導半胱天冬酶非依賴型凋亡。
31.藥物組合物，其包含權利要求22的三聚復合物和至少一種醫藥上可接受的賦形劑。
32.治療癌癥患者的方法，其包含對有需要的患者施用權利要求31的藥物組合物。
33.權利要求32的方法，其還包含對患者同時或順序施用治療劑。
34.包含權利要求22的復合物的DR4受體激動劑。
35.包含權利要求22的復合物的DR5受體激動劑。
36.用于制備誘導細胞凋亡的多肽的方法，其包含a)選擇結合DR4或DR5之一但不結合TRAIL誘餌受體的第一多肽；b)將第一多肽與多聚結構域的N-端或C-端之一融合。
37.權利要求36的方法，其還包含a)選擇特異性結合DR4和DR5中另一個的第二多肽；b)將第二多肽與多聚結構域的N-端或C-端中的另一端融合。
38.權利要求37的方法，其中步驟(a)還包含選擇不結合TRAIL誘餌受體的多肽。
39.用于制備誘導細胞凋亡的多肽復合物的方法，其中所述細胞表達TRAIL的至少一個死亡受體，所述方法包含將根據權利要求37制備的三個多肽三聚。
40.用于制備誘導腫瘤細胞凋亡的多肽，其包含a)建立包含CTLD的多肽文庫，所述CTLD包含至少一個隨機環區；b)從文庫中選擇結合DR4和DR5之一的第一多肽。
41.權利要求40的方法，其還包含(c)將選擇的多肽附著于多聚結構域的N-端或 C-端。
42.權利要求40的方法，其中步驟(b)還包含選擇不結合TRAIL誘餌受體的多肽。
全文摘要
本發明涉及TRAIL死亡受體的激動劑，所述激動劑包括具有多聚例如三聚結構域的多肽和與TRAIL死亡受體TRAIL-R1和TRAIL-R2中至少一個相結合的多肽序列。所述激動劑不結合TRAIL誘餌受體。三聚結構域可以來自人四聯蛋白。激動劑能夠誘導表達TRAIL死亡受體的病原細胞中的凋亡。所述藥物組合物用于治療與表達DR4和DR5的細胞如腫瘤細胞相關的疾病。用于篩選多肽并制備多聚復合物的方法。
文檔編號G01N33/68GK102317314SQ200980149692
公開日2012年1月11日 申請日期2009年10月9日 優先權日2008年10月10日
發明者凱瑟琳.鮑迪什, 安克.克雷茨-羅梅爾, 林冰, 馬克.倫肖, 馬薩.懷爾德 申請人:阿納福公司