專利名稱：檢測抗睪丸抗原自身抗體的免疫測試的制作方法
檢測抗睪丸抗原自身抗體的免疫測試本發明涉及用于檢測抗睪丸抗原的自身抗體的免疫測試，所述睪丸抗原被看作在與雄性哺乳動物中由于免疫造成的和感染相關的不育方面上是高度相關的。該測試被用于對與偏高水平的抗睪丸抗原自身抗體相關聯的疾病的診斷和治療控制，相關疾病諸如與炎癥相關的雄性生育機能紊亂例如精子活力不足，而還可以是睪丸及相關的雄性性器官的征候性炎癥。
背景技術：
在德國，近似七分之一的夫婦受非意愿的不育困擾，這里面的原因男女幾乎各占一半。在男性這一方面，生育受限的最為重要的數個原因中，除特發性不育癥(近似30%) 之外，還有泌尿生殖感染或者其它的免疫方面的因素(共近似12% -15% )0雄性生殖道的系統性急性或者慢性炎癥性疾病及局部感染和炎癥作為雄性生育機能紊亂的單獨病因或者相關聯的病因始終發揮重要作用。睪丸的慢性炎癥性變化(睪丸的炎癥或睪丸炎)可能會導致精子生長停滯并導致精子數量和質量上的重大變化。在美國，附睪的炎癥(附睪炎)的估計年發病率為例如600000例，并且通常以組合為附睪-睪丸炎的方式發病。生育機能紊亂在臨床上另外與精子不移動和/或精子膠結自身抗體關聯。對于免疫引起的雄性不育及其后果的相關性的評估特別地受到期望大量無癥狀進展的病例的事實阻礙。對于輸精管感染的診斷是不令人滿意的，該診斷基于病原體檢測，即檢測精液中白血球和/或炎癥介導素含量增大及附腺的分泌活動降低。通過睪丸活檢通常僅能夠確定地診斷出睪丸的無癥狀炎癥性損傷，由此通常仍不被認為是生育機能紊亂的病因或者起作用因素。因此能夠想象到，炎癥也是大量特發性不育癥患者群中的一部分患者的病因，并且炎癥性病因比先前假設的病因具有更高的相關性。因此，需要一種適用于在體液或生物試樣中使用的測試，來鑒定炎癥性雄性生育機能紊亂，如舉例而言的精子不活動及睪丸和相關聯的雄性性器官的征候性炎癥，以便減小對睪丸活檢的需求。粒細胞彈性蛋白酶和IL-6可惜均是非特異性的，因而不適于用作標志物(marker)。迄今為止，還沒有適當的標志物，其適于炎癥性雄性生育機能紊亂的特異性檢測并由此能夠在化驗分析中使用。發明目的本發明的目的在于提供一種適用于炎癥性雄性生育機能紊亂的特異性檢測的標志物，和提供一種用于生物試樣中的該標志物的檢測的易于操作且非侵襲性的方法。目的另外還在于提供一種執行該方法用的測試套件。技術方案根據權利要求，該目的根據本發明通過用于對生物試樣中的炎癥性雄性生育機能紊亂具有特異性的抗睪丸抗原自身抗體的檢測和特異性測定的免疫測試而得以解決。在自身測試中，令人驚訝的是，在生物試樣中抗睪丸抗原的特異性自身抗體經鑒定為對男性免疫引起的不育的形成高度相關。這些結果顯示，如舉例而言具有各種形式的睪丸炎癥的患者血清的生物試樣通常顯示出高滴度的ER-60自身抗體和運鐵蛋白抗體滴度并且由此能夠與不具有炎癥性睪丸缺陷(例如，塞托利細胞僅存綜合征、精子生長停滯、少精子癥、弱精子癥和畸形精子癥 (oligoasthenoteratozoospermia))的健康人群或者男性區分開。為此，睪丸正常患者的睪丸浸膏劑通過技術人員已知的2D-SDS-PAGE技術分離， 并且被傳送到如《Journal of Pathology))(2005 ；207,127-138)中所公開的硝酸纖維素膜。 用女性的對照血清、健康受試者的對照血清或者用被診斷患有各種形式的病灶或者非經常地患有完全發展的睪丸炎癥的經過男科檢查后的患者的血清試樣來培養滲透膜。用質量光譜法(MALDI-MQ研究自體反應斑，并且鑒定在炎癥性不育癥男性的血清中經常受抗體抑制的蛋白質。
陽性血清/血清總量 (%反應性)鑒定的蛋白質12/13 (92%)二疏化異構酶ER-60 (類似物Erp60, ERp57)8/13 (61%)運鐵蛋白(鐵轉運蛋白)對照血清對于鑒定的蛋白質不起作用。令人驚訝地，92%的蛋白質二硫化異構酶ER-60(類似物ERp57、p58，產品名 PDIA3_HUMAN)和61%的運鐵蛋白(鐵轉運蛋白)分別地對于患有不同形式的睪丸炎癥的患者的血清均表現出強烈的特異性自身反應性。為此，蛋白質二硫化異構酶ER-60(類似物ERp57、p58，產品名PDIA3_HUMAN)和運鐵蛋白(鐵轉運蛋白)被鑒定為雄性哺乳動物的睪丸炎癥的特異性標志物。利用這些標志物蛋白質的核酸序列和/或氨基酸序列，提供對于生物試樣的免疫檢測，該免疫檢測允許對抗睪丸抗原自身抗體的特異性檢測，特別地允許對與炎癥性雄性生育機能紊亂相關聯的ER-60自身抗體和/或運鐵蛋白自身抗體的特異性檢測。用于檢測和特異性測定生物試樣中的與炎癥性雄性生育機能紊亂相關聯的抗睪丸抗原自身抗體的免疫測試包括，使抗睪丸抗原自身抗體特別地是ER-60自身抗體和/或運鐵蛋白自身抗體與特異性睪丸抗原特別地ER-60或運鐵蛋白相結合。根據本發明的測試被用于診斷和治療性控制雄性哺乳動物的精子不活動，及睪丸及相關性器官的征候性發展炎癥。為此，確定雄性哺乳動物的生物試樣中的抗睪丸抗原自身抗體特別地是ER-60自身抗體和/或運鐵蛋白自身抗體的量，其中所述抗體在患有各種形式的睪丸炎癥的患者中頻繁出現。然后，將測定的抗睪丸抗原自身抗體的含量與參考值比較。在本發明的優選實施方式中，根據本發明的測試包括測定生物試樣特別地是血清中的ER-60自身抗體的含量。為此，以重組體的形式提供睪丸抗原特別地是蛋白質ER-60 作為標志物。這基于ER-60的核酸序列使用通常已知的分子生物法例如通過E. coli中的表達式和根據現有技術的狀態例如使用HPLC提純法來完成，所述核酸序列通過重組體手段在kq ID No. 1中指出。根據本發明，除如kq ID No. 1中公開的蛋白質二硫化異構酶ER_60(類似物 ERp57、p58，產品名PDIA3_HUMAN)的核酸序列之外，還包括通過添加、刪除和/或替換形成的核酸序列的微小變化所產生的蛋白質，但條件是轉換后的蛋白質的功能基本上不受 ER-60自身抗體的結合的影響。根據本發明，除了所公開的蛋白質二硫化異構酶ER-60的核酸序列之外，還包括同義蛋白質和同源蛋白質，比如ERp57、p58，產品名PDIA3_HUMAN。生物試樣是任何的從哺乳動物特別地是從人類獲取的包含自身抗體的生物材料， 例如體液比如全血、血清或血漿、精漿、腦脊髓液、腹膜液、唾液、淚液或尿、其它的活檢材料或組織。通過特異性地結合到各個睪丸抗原特別地分別是ER-60蛋白質和運鐵蛋白并且隨后使用適當的檢測方法進行檢測，而標識出生物試樣中存在的抗睪丸抗原的自身抗體特別地是ER-60自身抗體和/或運鐵蛋白自身抗體。根據本發明的優選實施方式，通過免疫學方法測定抗睪丸抗原自身抗體特別地是 ER-60自身抗體和/或運鐵蛋白自身抗體。特別地在免疫細胞化學方法中，證明通過放射性免疫測定(RIA)進行的測定或者使用酶聯免疫吸附測定(ELISA)進行的測定是特別適合的。替代地，該測試被布置在具有最小的體積要求(smallest volume requirement)的測試載體上，例如被布置在測試帶上。免疫測試的進行包括使抗睪丸抗原自身抗體的含量待被測定的雄性哺乳動物的血樣或者其它生物標本與吸附的睪丸抗原接觸；至少一個清洗步驟，以除去非吸附的成分； 和使用IgG抗體制劑檢測與吸附的抗原結合的自身抗體，所述IgG抗體對于待研究雄性哺乳動物具有物種特異性并且能夠以物種特異性的方式與自身抗體結合，例如在患者為人類的情況中，抗人類的IgG抗體制劑被標識出以使這些抗體能夠用生物素-鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶型或者堿性磷酸酶型的級聯反應被檢測出。在優選實施方式中，通過如下方式進行該測試使待結合的標志物蛋白質特別地是睪丸抗原例如蛋白質ER-60或者運鐵蛋白固定在表面上，所述表面例如是微孔板、聚氧乙烯板或者適當的組織板或者測試帶，及使非特異性結合部位飽和。待研究的生物試樣隨后被添加，優選地以液態形式被添加，由此其中包含的自身抗體與睪丸抗原結合，例如 ER-60自身抗體結合到固定的ER-60蛋白質和運鐵蛋白自身抗體結合到固定的運鐵蛋白。 如果蛋白質ER-60或者運鐵蛋白被固定在表面上，則該測試可選地另外檢測ER-60自身抗體和運鐵蛋白自身抗體。在至少一個清洗步驟之后，第二抗體被添加、與抗睪丸抗原自身抗體結合并且與酶例如堿性磷酸酶或者過氧化物酶聯接。在至少一個另外的清洗步驟之后， 與第二抗體聯接的酶的無色或者非熒光基片最后被添加到試樣。該酶將所述基片轉化成為彩色的或者熒光產物，能夠利用適當的檢測器例如光度計測定該產物的濃度。利用此免疫學上的ELISA含量測定，即便少量的抗睪丸抗原自身抗體特別地是 ER-60自身抗體和/或運鐵蛋白自身抗體也能夠快速可靠地檢測出。該測試的另一個優點在于，它能夠通過常用的ELISA裝置和商業上可得的具有96、256或甚至IOM個孔的微量滴定板進行，由此允許同時進行大量的分析。在RIA含量測定中，原理上采用如ELISA含量測定中說明的相同的步驟，不同之處在于使用被放射性標記的第二抗體來替代與適當的酶結合的第二抗體。在本示例中，利用閃爍計數器進行定量檢測。除上述方法之外，通過結合到標志物蛋白質，即分別地使ER-60自身抗體結合到固定的蛋白質ER-60和使運鐵蛋白自身抗體結合到固定的運鐵蛋白進行的抗睪丸抗原自身抗體的測定，也能夠利用本領域技術人員已知的其它免疫學方法來定性和定量評估，在這些方法中，這里僅提到了蛋白質印跡法和斑點印跡法。可選地，睪丸抗原特別地是ER-60和/或運鐵蛋白被施加到具有最小可能的體積要求的測試載體例如被施加到具有在適當的運載物質上的若干個吸附基質的測試帶，然后與可能為液態形式的生物試樣接觸，從而試樣中包含的抗睪丸抗原自身抗體能夠結合并且隨后通過適當的檢測系統例如通過形成可視線條而被檢測出。對于抗睪丸抗原自身抗體特別地對于ER-60自身抗體結合到固定的ER-60或者運鐵蛋白自身抗體結合到固定的運鐵蛋白的定性或定量檢測優選地在體液如來自個體的血清或者血漿中進行，由此作為結合的手段，例如在450和570nm波長時測定熒光光密度 (OD)。根據450nm波長和570nm波長時的光密度的差確定吸收值。該值與參考值比較。參考值例如根據從健康雄性哺乳動物和/或診斷有睪丸炎癥的雄性哺乳動物的生物試樣測量的數據計算出。可選地，使用具有限定濃度的睪丸抗原試樣，特別地具有限定濃度的ER-60或者運鐵蛋白，并且所述參考值例如從參考曲線或者參考表格計算出或者采用用作基準的比較值的形式。參考值優選地與試樣分析并行地測定。參考值和試樣的雙重測定可選地也是可能的。參考值例如使用來自健康供體的生物試樣的測量數據計算出，由此在本情況中參考值優選地低于0. 35的OD值。該參考值例如用被診斷患有精子不活動或者征候性發展的睪丸炎癥的供體的生物試樣的測量數據計算出，由此在本情況中參考值大于0. 35的OD值，優選地大于0. 4的OD值。如果生物試樣中的抗睪丸抗原自身抗體的含量，特別地是ER-60自身抗體和運鐵蛋白自身抗體的含量大于0. 35的OD值，優選地大于0. 4的OD值，則這標識存在炎癥性生育機能紊亂。該免疫測試允許改進的非侵襲性診斷，特別地在具有精子不活動或者征候性炎癥性生育機能紊亂患者的生物試樣的情況中，并且避免了進行睪丸活檢。特別地，利用根據本發明的免疫測試檢測ER-60自身抗體和運鐵蛋白自身抗體。 這允許將睪丸炎癥和炎癥性精子發生缺陷(塞托利細胞僅存綜合征)的診斷結果區分開。 新的系統分析還考慮到了無聯系的變化，比如彌散性的和低密度的淋巴細胞。根據本發明的免疫測試另外用于評估炎癥性生育機能紊亂的治療成功率。由于根據本發明的免疫測試能夠容易地被標準化，其可以用于人體醫學特別地用在體外受精監測或者用在受精診斷和專家意見中，并且另外還可用于現代的牲畜繁殖。根據本發明，生物試樣從雄性哺乳動物中獲取，特別優選地從人體中獲取。根據本發明的免疫測試能夠容易地以易用的“套件”的形式提供，所述套件包括吸附到載體表面的ER-60抗原和/或運鐵蛋白抗原、對于待研究雄性哺乳動物具有物種特異性并且能夠以物種特異性的方式結合到自身抗體的IgG抗體制劑，例如在人類的情況下，抗人類IgG抗體制劑被標識使得這些能夠通過生物素-鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶型或者堿性磷酸酶型的級聯反應被檢測到。可選地，該套件包括載體和另外的緩沖器和試劑，例如檢測反應所需要的試劑，如與產生顯色反應的標志物聯接的抗生蛋白鏈菌素。可選地，該套件另外包括校準套件所用的ER-60抗體或者運鐵蛋白抗體的標準試樣，由此ER-60自身抗體的標準試樣被用于檢測ER-60自身抗體，而運鐵蛋白自身抗體的標準試樣被用于檢測運鐵蛋白自身抗體。
具體實施例1.準備 ER-60優選地，在大腸埃希氏菌(E.coli)中表述為重組蛋白質二硫化物異構酶 ER-60(類似物ERp57、p58，產品名PDIA3_HUMAN)。這樣例如用包含人類ER-60的NDA 序列的表達克隆來完成，例如在toade等人在1997年的J. Biochem. 122第834至842頁中描述的Pet-Her-60表達克隆。該蛋白質例如根據toade等人在J Biochem. 267 (21) 15152-15159提出的規約例如在大腸埃希氏菌BL21 (DE3)中表述，并且例如用HPLC提純。為此，表達質粒pET_hER60被轉換成為大腸埃希氏菌BL21(DE3)并且在適當的條件下被培養，例如在400ml的氨芐西林介質(500yg/ml)中培養，所述介質例如是30°C 下的LB-medium(l%胰胨、0. 5%酵母浸出物，NaCl ;pH 7.0)。蛋白質表達在適當的 OD600nm值例如在OD6tltlnm值=0. 5的情況下被誘導出，例如利用30°C的0. 5mM異丙基-1-硫代-β-D-呋喃半乳糖苷(IPTG)進行近似2小時。細菌培養物隨后被采集并且團粒被再懸浮在適當的緩沖液中并被析出，例如再懸浮在IOml的緩沖液中比如20mM的HEPES_K0H(pH 6. 8)、50mM KCl、5mM EDTA (pH 8.0)、ImM PMSF 并進行超聲處理。細胞裂解液在4°C下以5000Xg的離心力被離心處理近似30分鐘，并且在4°C下利用60%和70%的飽和硫酸銨析出上清液30分鐘，隨后以5000Xg的離心力進行30分鐘離心處理。蛋白質團粒被再懸浮在500 μ 1的緩沖液中，例如20mM HEPES_K0H(pH 6. 8)、50mM KCl、5mM EDTA (pH 8. 0) UmM DTT，并且例如使用 HPLC 中的凝膠過濾(Superdex 200HR)進行提純。在可選的步驟中，包含Her-60的這些碎片被進一步提純，例如使用Mono Q柱例如在IOml的緩沖液中提純，所述緩沖液例如是20mM的HEPES_K0H(pH 6. 8)、50mM KCl、5mM EDTA(pH 8. 0) UmM DTT。估計例如SDS-PAGE凝膠中的蛋白質純度。2.免疫測試ELISA板例如MaxiSorp ELISA板(Nunc)被涂覆重組體ER-60，例如在4°C下在pH 9. 5的0. IM的碳酸鈉溶液中以2. 5μ g/ml的重組體密度被涂覆一晚上，然后用適當的緩沖液如磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7. 2+0. 05% Tween-20)沖洗，并且例如利用2%的脫酯奶粉在 PBS中在室溫(RT)下被閉塞2. 5小時。在非特異性結合部位的閉塞之后，待測試的對照試樣和血清的稀釋系列(范圍從未稀釋至封閉液中1 1000的稀釋度)均被施加雙重涂鍍并且在RT下被培養1小時。在該培養時間之后，孔被至少清洗一次并且隨后被在RT下利用第二物種特異性抗體例如是抗人IgG-生物素(在封閉液中1 100000)培養至少一小時。在至少一個清洗步驟之后，試樣在RT下在清洗緩沖液中利用抗生蛋白鏈菌素-山葵過氧化物酶(GE Healthcare)以1 4000稀釋度培養20分鐘。在至少一個清步驟之后，顯色反應例如通過TMB (3，3’，5，5’ -四甲基聯苯胺；BD Biosciences)發展20分鐘。顯色反應例如通過2N H2SO4被停止。確定波長為450nm和570nm時的吸收(0D值)。根據波長為 450nm和570nm時的差得出吸收值。3.數據分析對于免疫學含量測定的評估優選地通過生物試樣中的優選地通過血清或者血漿中的ER-60自身抗體的量化來進行。將測量值與參考值比較。參考值例如通過健康供體試樣的測量數據而計算出，并且在本情況中優選地低于0. 35的OD值。替代地，參考值能夠通過診斷患有睪丸炎癥的供體試樣的測量數據而計算出，借此所述參考值在本情況中為大于 0.35的OD值，優選地大于0.4。替代地，具有限定的ER-60濃度的試樣被使用并且參考值例如通過對比曲線或者對比表格計算出，或者基于對比值而計算出。參考值優選地與試樣分析并行地確定。如果試樣中的ER-60自身抗體的含量大于0. 35的OD值，優選地大于0. 4，則標識存在雄性哺乳動物的炎癥性生育功能紊亂。4.驗證為驗證根據本發明的免疫測試，進行外延測試系列，由此在對照組中使用無男科性預存情況的人的血清及正常精液進行的ER-60自身抗體的檢測被與不同的患者組進行比較。這些患者組由以下內容構成1.生育受限男性的血清。選取標準精子濃度小于10百萬/ml，且沒有感染或者炎癥征候。2.滿足如下標準的男性的血清基于精液檢查確定有輸精管炎癥。3.患有睪丸炎癥的男性的血清，借助于睪丸活檢檢測到睪丸炎癥。4.利用雙氯芬酸治療診斷患有睪丸炎癥和/或輸精管炎癥的男性的血清，以評估 ER-60自身抗體滴定量是否與治療成功相關。
權利要求
1.用于抗睪丸抗原自身抗體的檢測和特異性測定的免疫測試，所述睪丸抗原與在哺乳動物的生物取樣中的雄性哺乳動物的炎癥性生育機能紊亂相關聯，其特征在于，所述測試包括將這些自身抗體與特定的睪丸抗原結合。
2.根據權利要求1所述的免疫測試，其特征在于，特定地確定ER-60自身抗體和/或運鐵蛋白自身抗體作為抗睪丸抗原自身抗體。
3.根據權利要求1所述的免疫測試，其特征在于，特定的睪丸抗原是ER-60和/或運鐵蛋白。
4.根據先前權利要求所述的免疫測試，其特征在于，所述對抗睪丸抗原自身抗體的檢測通過放射性免疫測定(RIA)或者通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)以免疫細胞化學的方式進行。
5.根據先前權利要求所述的免疫測試，其特征在于，所述對抗睪丸抗原自身抗體的檢測在具有低體積要求的測試帶上進行。
6.根據先前權利要求所述的免疫測試，其特征在于，將所確定的抗睪丸抗原自身抗體的含量與參考值比較。
7.根據先前權利要求所述的免疫測試，其特征在于，進行該測試包括使取自雄性哺乳動物的血樣或者其它生物標本與吸附的特定睪丸抗原接觸，所述血樣或者其它生物標本的抗睪丸抗原自身抗體的含量待測定；至少一個清洗步驟，以除去非吸附的成分；和使用IgG抗體制劑檢測與所述吸附的抗原結合的抗睪丸抗原自身抗體，所述IgG抗體對于待研究的雄性哺乳動物具有物種特異性且能夠以物種特性異的方式與所述抗睪丸抗原自身抗體結合，并且以如下方式被標識它們通過生物素-鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶型或者堿性磷酸酶型的級聯反應被檢測出。
8.根據先前權利要求所述的免疫測試的使用，以測量抗睪丸抗原自身抗體的含量來確定在雄性哺乳動物中因免疫引起的不育和感染引起的不育的存在，所述抗睪丸抗原與生物取樣中的雄性哺乳動物的炎癥性生育機能紊亂相關聯。
9.用以進行先前權利要求中的任一項所述的免疫測試的套件，其特征在于，所述套件包括特定的睪丸抗原，其被吸附到載體；和IgG抗體制劑，其對于待研究的雄性哺乳動物具有物種特異性且能夠以物種特異性的方式與抗睪丸抗原自身抗體結合，并且以如下方式被標識它們通過生物素-鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶型或者堿性磷酸酶型的級聯反應被檢測出。
10.根據權利要求9所述的套件，其特征在于，所述特定的睪丸抗原是ER-60和/或運鐵蛋白。
全文摘要
本發明揭露一種用于抗睪丸抗原自身抗體的檢測和特異性測定的免疫測試，所述睪丸抗原與在雄性哺乳動物的生物采樣中的雄性哺乳動物的炎癥性生育機能紊亂有關，特別地用于檢測睪丸ER-60自身抗體和/或運鐵蛋白自身抗體。該免疫測試用以確定雄性哺乳動物特別地人類的免疫引起的不育和感染相關的不育的存在。
文檔編號G01N33/68GK102292639SQ200980143142
公開日2011年12月21日 申請日期2009年10月22日 優先權日2008年10月28日
發明者安德里斯·邁因哈特, 莫妮卡·菲拉科 申請人:尤斯圖斯-李比希-吉森大學