鑒定疾病風險因子的方法

專利名稱：鑒定疾病風險因子的方法
技術領域：
本發明涉及基因組學、遺傳學、藥物遺傳學、和生物信息學領域，包括基因組分析和DNA序列變異研究。本發明還涉及DNA序列中的變異與預報個體對特定疾病、病癥、或疾患的易感性和/或對特定藥物或治療的響應之間的關聯的研究。
背景技術：
對與復雜疾病有關的遺傳標志物的搜索正在進行中。用SNP陣列進行的基因組尺度掃描研究繼續突顯ApoE區是對于阿爾茨海默氏病研究中的調查而言最重要的區域(Coon et al. , J. Clin. Psychiatry 68:613-8(2007) ；Li et al. , Arch. Neurol. 65 45-53(2007))ο先前提出ApoE 4同等型與晚期發作阿爾茨海默氏病形成風險升高有強關聯 (Pericak-Vance et al. , Am. J. Hum. Genet. 48,1034-50 (1991) ；Martin et al·，2000，美國專利 No. 6，027，896，Roses, et al.，美國專利 No. 5，716，828，Roses etal.)。該相關性是劑量依賴性的(Yoshizawa et al. , 1994 ；Schellenberg, 1995) 就是說，兩種 ApoE 4 等位基因的攜帶者比只有一種ApoE 4等位基因的攜帶者更有可能而且在更早的年齡形成晚期發作阿爾茨海默氏病(LOAD) (Corder etal.，Science 261,921-3(1993))。不過，E4等位基因只占遺傳性阿爾茨海默氏病的大約50%。一種解釋是ApoE 4 僅僅充當附近連鎖不平衡的某物的代替標志物。或者，考慮到最近發現ApoE 4在線粒體毒性中起機械作用(mechanistic role), ApoE 4的負面效應可能被附近編碼的另一種基因產物消除或加劇(Chang et al.，2005)。由于ApoE狀態還與冠狀動脈疾病并也有可能與眾多其它疾病和病癥的風險有關，ApoE區的研究的蘊涵不限于阿爾茨海默氏病，而是潛在深遠的(Mahley et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 =5644-51 (2006)) 0更廣泛而言，對變異序列檢查與已知涉及復雜疾病過程的其它遺傳區連鎖不平衡的基因周圍的過程或途徑會提供在解釋那些疾病的機制中有價值的信息。發明概述本文中提供的是一種用于鑒定與感興趣疾患形成(例如感興趣疾病的較早或較晚發作)有關的遺傳變體的方法，包括(a)根據含有DNA的生物學樣品測定由多名人類受試者個體在感興趣遺傳基因座處攜帶的核苷酸序列，其中所述受試者包括(i)受感興趣疾患影響的受試者和(ii)未受感興趣疾患影響的受試者二者；(b)自在所述多名受試者中觀察到的核苷酸序列鑒定所述遺傳基因座處的遺傳變體(例如使用多重序列比對分析)； (c)通過構建所述受試者的所述核苷酸序列的系統發生樹來將所述遺傳變體繪圖，所述樹包含鑒定所述受試者間變體變化(例如同一順反子上的變體變化)的分支；(d)檢查所述樹中作為分支呈現的遺傳變體并確定受影響的與未受影響的受試者之比以鑒定那些導致受影響與未受影響受試者之比變化的變化(優選地，其中起點是代表最大數目受試者的遺傳變體)；并然后(e)鑒定受影響與未受影響受試者之比與所述樹上一種或多種鄰近變體有實質性差異(例如相差至少 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、 或90%)的遺傳變體或變體組(單元型)以由此鑒定與所述感興趣疾患形成有關的遺傳變體。在一些實施方案中，所有受試者攜帶與所述感興趣疾患有關的相同已知多態性。在一些實施方案中，所述感興趣疾患是神經變性疾病、代謝疾病(例如血脂障礙)、心血管疾病、精神病癥、或癌癥。在一些實施方案中，所述感興趣疾病是疾病發病機制涉及ApoE和/或T0MM40的疾病。在一些實施方案中，所述感興趣疾患與升高或降低的線粒體功能障礙有關。在一些實施方案中，所述感興趣疾患是精神分裂癥。在一些實施方案中，所述感興趣疾患是冠狀動脈疾病。在一些實施方案中，所述感興趣疾患是II型糖尿病。在一些實施方案中，所述感興趣疾患是帕金森氏病。在一些實施方案中，所述感興趣疾患是阿爾茨海默氏病。在一些實施方案中，所述已知多態性風險因子是載脂蛋白E等位基因(例如ApoE 2、ApoE 3 或ApoE 4)。在一些實施方案中，所述感興趣遺傳基因座與所述已知多態性連鎖不平衡。在一些實施方案中，所述感興趣遺傳基因座與所述已知多態性在同一染色體上且相距小于10、 20、30、40、或50千堿基。在一些實施方案中，所述遺傳基因座是T0MM40。還提供了一種用于確定感興趣疾患形成風險升高的方法，包括(a)根據含有DNA 的生物學樣品確定由受試者個體攜帶的通過任何前述段落的方法鑒定的遺傳變體；并然后 (b)當所述遺傳變體存在時確定所述受試者形成所述感興趣疾患的風險升高。進一步提供了一種用于確定受試者(例如攜帶至少一種Apo E3等位基因的受試者)中阿爾茨海默氏病形成風險升高的方法，包括(a)根據取自所述受試者的含有DNA的生物學樣品檢測與阿爾茨海默氏病風險升高或降低有關的T0MM40基因遺傳變體的存在或缺失；并(b)當所述遺傳變體存在或缺失時確定所述受試者形成阿爾茨海默氏病風險的升高或降低。在一些實施方案中，確定所述受試者是否是Apo E2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/ E4、或E4/E4受試者。在一些實施方案中，確定所述受試者是否是Apo E3/E3或E3/E4受試者ο在一些實施方案中，所述方法進一步包括下述步驟(C)當所述受試者被確定為形成阿爾茨海默氏病的風險升高時以治療有效量給所述受試者施用抗阿爾茨海默氏病活性劑。在一些實施方案中，當與所述遺傳變體不存在或不缺失的受試者相比通過所述遺傳變體的存在或缺失所述受試者被確定為風險升高時在較小的年齡在所述受試者中進行所述施用步驟(例如，對于ApoE 4/4受試者，開始于45、46、47、48、49、50、51、52或53歲， 且在此后每一年持續進行，而非開始于55歲或更大；對于ApoE 4/3受試者，開始于50、51、 52、53、M、55、56、57或58歲，且在此后每一年持續進行，而非開始于60歲或更大；對于ApoE3/3受試者，開始于55、56、57、58、59、60、61、62或63歲，且在此后每一年持續進行，而非開始于65歲或更大；而對于ApoE 2/3受試者，開始于60、61、62、63、64、65、66、67或68
歲，且在此后每一年持續進行，而非開始于70歲或更大)。在一些實施方案中，所述活性劑選自下組乙酰膽堿酯酶抑制劑，NMDA受體拮抗劑，PPAR激動劑或調控劑(例如噻唑烷二酮或glitazar類中的藥物)，抗體，融合蛋白，治療性RNA分子，及其組合。在一些實施方案中，所述活性劑是羅格列酮或其藥學可接受鹽。在一些實施方案中，所述T0MM40遺傳變體是下文所示表1中列出的變體。還提供了一種通過以治療有效量給受試者施用抗阿爾茨海默氏病活性劑來治療受試者(例如具有至少一種ApoE 3等位基因的受試者)阿爾茨海默氏病的方法；改良包括當與不攜帶與阿爾茨海默氏病風險升高有關的T0MM40基因遺傳變體的相應受試者相比所述受試者攜帶所述遺傳變體時，在較小的年齡給所述受試者施用所述活性劑(例如， 對于ApoE 4/4受試者，開始于45、46、47、48、49、50、51、52、或53歲，且在此后每一年持續進行，而非開始于55歲或更大；對于ApoE 4/3受試者，開始于50、51、52、53、M、55、56、57、 或58歲，且在此后每一年持續進行，而非開始于60歲或更大；對于ApoE 3/3受試者，開始于55、56、57、58、59、60、61、62、或63歲，且在此后每一年持續進行，而非開始于65歲或更大；而對于ApoE 2/3受試者，開始于60、61、62、63、64、65、66、67、或68歲，且在此后每一年持續進行，而非開始于70歲或更大)。在一些實施方案中，所述受試者是Apo E2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4、E4/E4 受試者。在一些實施方案中，所述受試者是Apo E3/E3或E3/E4受試者。在一些實施方案中，所述活性劑選自下組乙酰膽堿酯酶抑制劑，NMDA受體拮抗劑，PPAR激動劑或調控劑(例如噻唑烷二酮或glitazar類中的藥物)，抗體，融合蛋白，治療性RNA分子，及其組合。在一些實施方案中，所述活性劑是羅格列酮或其藥學可接受鹽。在一些實施方案中，所述T0MM40基因遺傳變體是刪除/插入多態性(DIP)。在一些實施方案中，所述DIP是插入多態性。在一些實施方案中，所述DIP是poly-T刪除/插入多態性(例如5-100個、或10-80個、或20-50個bp的poly-T)。在一些實施方案中，所述T0MM40遺傳變體是下文所示表1中列出的變體。在一些實施方案中，所述DIP是rsl0524523、rsl06023^或DIP3。在一些實施方案中，所述DIP是 rsl0524523o進一步提供了一種為有所需要的患者治療感興趣疾患的方法，其中所述感興趣疾患與ApoE和/或T0MM40有關，所述方法包括下述步驟(a)確定由受試者個體攜帶的通過第1-12段的方法鑒定的遺傳變體的存在或缺失以生成所述患者的遺傳圖譜；并然后，若所述圖譜指示所述患者會對活性劑有響應，則(b)以治療有效量給所述受試者施用所述活性劑以治療所述感興趣疾患。在一些實施方案中，所述活性劑選自下組乙酰膽堿酯酶抑制劑，NMDA受體拮抗劑，PPAR激動劑或調控劑(例如噻唑烷二酮或glitazar類中的藥物)，抗體，融合蛋白，治療性RNA分子，及其組合。在一些實施方案中，所述活性劑是羅格列酮或其藥學可接受鹽。在一些實施方案中，所述T0MM40基因遺傳變體是刪除/插入多態性(DIP)。在一些實施方案中，所述DIP是插入多態性。在一些實施方案中，所述DIP是poly-T刪除/插入多態性(例如5-100個、或10-80個、或20-50個bp的poly-T插入)。
在一些實施方案中，所述T0MM40遺傳變體是下文所示表1中列出的變體。在一些實施方案中，所述DIP是rsl0524523、rsl06023^或DIP3。在一些實施方案中，所述DIP是 rsl0524523o還提供了一種在受試者中治療阿爾茨海默氏病的方法，包括(a)自取自所述受試者的含有DNA的生物學樣品檢測與對活性劑的響應性有關的T0MM40基因遺傳變體的存在或缺失；并若所述遺傳變體存在，則(b)以治療有效量給所述受試者施用所述活性劑以治療所述阿爾茨海默氏病。在一些實施方案中，所述受試者攜帶至少一種ApoE 3等位基因。在一些實施方案中，所述受試者是Apo E3/E3或E3/E4受試者。在一些實施方案中，所述活性劑選自下組乙酰膽堿酯酶抑制劑，NMDA受體拮抗劑，PPAR激動劑或調控劑(例如噻唑烷二酮或glitazar類中的藥物)，抗體，融合蛋白，治療性RNA分子，及其組合。在一些實施方案中，所述活性劑是羅格列酮或其藥學可接受鹽。在一些實施方案中，所述T0MM40基因遺傳變體是刪除/插入多態性(DIP)。在一些實施方案中，所述DIP是插入多態性。在一些實施方案中，所述DIP是poly-T刪除/插入多態性(例如5-100個、或10-80個、或20-50個bp的poly-T)。在一些實施方案中，所述T0MM40基因遺傳變體是下文所述表1中列出的變體。在一些實施方案中，所述DIP是rsl0524523、rsl06023^或DIP3。在一些實施方案中，所述 DIP 是rsl0524523。進一步提供了抗阿爾茨海默氏病活性劑用于制備藥物的用途，所述藥物用于進行依照上文所示段落治療阿爾茨海默氏病的方法。還提供了抗阿爾茨海默氏病活性劑用于進行治療阿爾茨海默氏病的方法的用途。提供了一種為處于阿爾茨海默氏病形成風險的患者確定預后的方法，包括獲得患者圖譜，其中所述獲得患者圖譜包括在所述患者的生物學樣品中檢測至少一種ApoE等位基因的存在或缺失，并檢測位于T0MM40基因內含子6或內含子9中的至少一種T0MM40刪除 /插入多態性(DIP)的存在或缺失，并然后將所述患者圖譜轉換成所述預后，其中所述ApoE 等位基因的存在及所述至少一種T0MM40 DIP多態性的存在將所述患者鑒定為處于阿爾茨海默氏病形成風險的患者。在一些實施方案中，所述DIP是插入多態性。在一些實施方案中，所述DIP是 poly-T刪除/插入多態性(例如5-100個、或10-80個、或20-50個bp的poly-T)。在一些實施方案中，所述DIP是rsl0524523、rsl06023^或DIP3。在一些實施方案中，所述DIP是rsl0524523。在一些實施方案中，所述方法進一步包括檢測所述受試者是否是ApoE2/E2、E2/ E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4、E4/E4受試者。在一些實施方案中，所述受試者是Apo E3/E3或 E3/E4受試者。還提供了一種用于將受試者分層入用于治療阿爾茨海默氏病的療法的臨床試驗的亞組的方法，所述方法包括在所述患者的生物學樣品中檢測至少一種ApoE等位基因的存在或缺失，并檢測位于T0MM40基因內含子6或內含子9中的至少一種T0MM40刪除/插入多態性(DIP)的存在或缺失，其中基于所述至少一種ApoE等位基因和/或T0MM40DIP等位基因存在或缺失將所述受試者分層入所述療法的所述臨床試驗的所述亞組。
在一些實施方案中，所述DIP是插入多態性。在一些實施方案中，所述DIP是 poly-T插入多態性(例如5-100個、或10-80個、或20-50個bp的poly-T插入)。在一些實施方案中，所述DIP是rsl0524523、rsl06023^或DIP3。在一些實施方案中，所述DIP是rsl0524523。在一些實施方案中，所述方法進一步包括檢測所述受試者是否是ApoE2/E2、E2/ E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4、E4/E4受試者。在一些實施方案中，所述受試者是Apo E3/E3或 E3/E4受試者。進一步提供了一種用于在阿爾茨海默氏病的治療的臨床試驗中鑒定患者的方法， 包括a)鑒定診斷有阿爾茨海默氏病的患者；并b)為所述診斷有阿爾茨海默氏病的患者確定預后，包括獲得患者圖譜，其中所述獲得患者圖譜包括i)在所述患者的生物學樣品中檢測至少一種ApoE等位基因的存在或缺失，ii)檢測位于T0MM40基因內含子6或內含子9中的至少一種T0MM40刪除/插入多態性(DIP)的存在或缺失，并iii)將所述患者圖譜轉換成所述預后，所述預后包括對患者是否是阿爾茨海默氏病的所述治療的所述臨床試驗的候選者的預測。在一些實施方案中，所述DIP是插入多態性。在一些實施方案中，所述DIP是 poly-T刪除/插入多態性(例如5-100個、或10-80個、或20-50個bp的poly-T)。在一些實施方案中，所述DIP是rsl0524523、rsl06023^或DIP3。在一些實施方案中，所述DIP是rsl0524523。在一些實施方案中，所述方法進一步包括檢測所述受試者是否是ApoE2/E2、E2/ E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4、E4/E4受試者。在一些實施方案中，所述受試者是Apo E3/E3或 E3/E4受試者。提供了一種用于確定受試者是否形成晚期發作阿爾茨海默氏病的風險升高的試劑盒，包括(A)至少一種特異性檢測ApoE 3,ApoE 4、或ApoE 2的試劑，其中所述試劑選自下組選擇性結合ApoE 3、ApoE 4、或ApoE 2的抗體，和選擇性結合編碼ApoE 3、ApoE 4、 或ApoE 2的DNA的寡核苷酸探針；⑶至少一種特異性檢測位于T0MM40基因內含子6或內含子9中的至少一種T0MM40刪除/插入多態性(DIP)的存在或缺失的試劑；和(C)通過下述步驟確定受試者是否形成晚期發作阿爾茨海默氏病的風險升高的用法說明，(i)用所述至少一種試劑在所述受試者中檢測所述ApoE同等型的存在或缺失；(ii)檢測位于T0MM40 基因內含子6或內含子9中的至少一種T0MM40刪除/插入多態性(DIP)的存在或缺失；并 (iii)通過觀察用所述至少一種試劑是否檢測到ApoE同等型及所述T0MM40DIP的存在來觀察所述受試者是否形成晚期發作阿爾茨海默氏病的風險升高，其中所述ApoE同等型及所述T0MM40DIP的存在指示所述受試者形成晚期發作阿爾茨海默氏病的風險升高。在一些實施方案中，所述至少一種試劑和所述用法說明包裝在一個容器中。在一些實施方案中，所述DIP是插入多態性。在一些實施方案中，所述DIP是 poly-T刪除/插入多態性(例如5-100個、或10-80個、或20-50個bp的poly-T)。在一些實施方案中，所述DIP是rsl0524523、rsl06023^或DIP3。在一些實施方案中，所述DIP是rsl0524523。在一些實施方案中，所述確定步驟進一步包括檢測所述受試者是否是Apo E2/E2、 E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4或E4/E4受試者。在一些實施方案中，所述受試者是Apo E3/E3或E3/E4受試者。提供了一種用于確定受試者是否會對用活性劑治療感興趣疾患有響應的試劑盒， 其中所述感興趣疾患與ApoE和/或T0MM40有關，所述試劑盒包括(A)至少一種特異性檢測ApoE 3,ApoE 4、或ApoE 2的試劑，其中所述試劑選自下組選擇性結合ApoE 3,ApoE 4、 或ApoE 2的抗體，和選擇性結合編碼ApoE 3, ApoE 4、或ApoE 2的DNA的寡核苷酸探針； (B)至少一種特異性檢測位于T0MM40基因內含子6或內含子9中的至少一種T0MM40刪除 /插入多態性(DIP)的存在或缺失的試劑；和(C)通過下述步驟確定受試者是否會對用所述感興趣活性劑治療所述感興趣疾患有響應的用法說明，(i)用所述至少一種試劑在所述受試者中檢測所述ApoE同等型的存在或缺失；(ii)檢測位于T0MM40基因內含子6或內含子9中的至少一種T0MM40刪除/插入多態性(DIP)的存在或缺失；并(iii)通過觀察用所述至少一種試劑是否檢測到所述ApoE同等型及所述T0MM40DIP的存在來確定受試者是否會對治療有響應，其中ApoE 3及所述T0MM40DIP的存在指示所述受試者會對用所述活性劑的所述治療有響應。在一些實施方案中，所述至少一種試劑和所述用法說明包裝在一個容器中。在一些實施方案中，所述DIP是插入多態性。在一些實施方案中，所述DIP是 poly-T刪除/插入多態性(例如5-100個、或10-80個、或20-50個bp的poly-T)。在一些實施方案中，所述DIP是rsl0524523、rsl06023^或DIP3。在一些實施方案中，所述DIP是rsl0524523。在一些實施方案中，所述確定步驟進一步包括檢測所述受試者是否是Apo E2/E2、 E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4、或E4/E4受試者。在一些實施方案中，所述受試者是Apo E3/ E3或E3/E4受試者。會理解，所有上述實施方案可以以任何方式和/或組合來組合。與本文一起提供的附圖中及下文所示說明書中更為詳細地解釋了本發明的上述和其它目的和方面。附圖簡述

圖1顯示依照一些實施方案鑒定感興趣遺傳基因座中的基因組序列的預定區域中可能與感興趣疾患有關的遺傳變體的一般流程圖。圖2顯示阿爾茨海默氏病發作的平均年齡圖，作為五種常見ApoE基因型的繼承的函數，而且呈現ApoE 4作為阿爾茨海默氏病的風險因子(1993)。圖3顯示染色體19上的區域A、B、和C，它們是例示性的感興趣遺傳基因座。 T0MM40基因密切接近ApoE基因且編碼一種指示線粒體外膜的40kD蛋白質。T0MM40與ApoE 在線粒體蛋白質輸入的調節中直接相互作用，而且現在的一種假說是特定T0MM40變體的存在加劇與ApoE 3等位基因的劑量依賴性存在有關的阿爾茨海默氏病風險升高。圖4以示意圖形式顯示如圖3所指示根據本文中詳述的一些實施方案構建的B區域的進化圖。每一個水平的橢圓代表一個觀察到的序列變體(例如，核苷酸變化)，而橢圓的大小代表其頻率。每一個變體稱為樹上的一個節點，而一個節點到另一個節點通過分支的連接代表觀察到由個體受試者攜帶的成順式的兩個變體。圖5是基于區域B為T0MM40構建的系統發生樹的示意圖，顯示了這個區域中 T0MM40變體的兩個主要分組或進化枝中ApoE表型的百分比。圖6是T0MM40-ApoE基因座的示意性總覽，包括顯示在探索性(Rl) (23Kb)和驗證性(R2) (IOKb)研究中進行一級測序的單元型區段和區域(NCBIBuild 36. 3)的LD圖。顯示了 Hapmap數據的LD圖(CEU分析小組)、實心脊的單元型區段定義、具有通過不同線特征呈現的D’ /LOD顏色方案的r2值。圖7顯示系統發生樹及變體分開的呈現。7A:SNP變體，進化枝A對B，E6-E10 代表T0MM40外顯子而垂直線指示SNP的大致位置。兩個主要分支的分開具有強自展 (bootstrap)支持(973/1000)。7B :rsl0524523長度多態性。為長度多態性的每個組提供了描述性統計。在樹或很小的進化枝中形成各個外類群(outgroup)的數種長單元型在鑒定為“其余”(Remainder)的組中。圖8 呈現通過 ApoE 基因型 3/3 (8A)、3/4(8B)、和 4/4 (8C)分層的 rs 10524523 長度多態性的長度的柱狀圖。N =210個單元型(AS群組)。圖9顯示60-86歲之間發作的患者的AD發作年齡與rsl0524523多態性長度之間的關聯。框圖指示95%范圍(垂直線)、中值(框中的水平線)和四分位間范圍(框)。發明詳述下文更詳細地解釋了本發明。此描述并非意圖作為可實施本發明的所有不同方式或可添加至本發明的所有特征的詳細目錄。例如，關于一個實施方案例示的特征可并入其它實施方案，而且關于特定實施方案例示的特征可自該實施方案刪除。另外，根據本公開， 對本文中建議的各種實施方案的不偏離本發明的眾多變更和添加對于本領域技術人員會是明顯的。因此，下面的說明意圖例示本發明的一些特定實施方案，而非窮盡地規定所有排列、組合及其變更。如本發明的說明書和所附權利要求書中使用的，單數形式“ 一個”、“ 一種，，和“所述”意圖也包括復數形式，除非上下文另外清楚指明。同樣，如本文中使用的，“和/或”指且涵蓋一個或多個所列項的任何和所有可能組合，以及當解釋為擇一(“或”)時組合的排除。本發明致力于用于揭示因復雜疾病和病癥而特別感興趣的區域中的遺傳變異的方法。它還涉及基于與表型信息的關聯，最有信息價值的遺傳標志物的發現。在一個實施方案中，本發明可用于定位與對特定疾病、病癥、或疾患的易感性有關的遺傳標志物。在另一個實施方案中，關于受試者對候選治療或藥物的響應的數據可包括在關于與對該治療或藥物的有利響應有關的遺傳標志物定位的系統發生分析中(即藥物遺傳學)。該方法可應用于來自特定基因座的遺傳變異的任何數據集。見圖1，它是依照本發明尋找遺傳風險因子的辦法的流程圖。在一個方面，遺傳變異分析基于變異序列數據。在第二個方面，使用二倍體基因型數據揭開結構，由此避免實驗或計算推斷成分單元型的需要(見例如美國專利 No. 6,027,896, Roses et al.)。在另一個方面，本方法可應用于源自用實驗規程查詢靶核酸(這提供存在的序列變異的記錄但是實際上沒有提供完整序列)的未表征等位基因變異。作為遺傳變異的基礎的結構對于自二倍體基因型數據推導組分單元型也是有用的。優選且涵蓋本文中描述的方法與本領域知道或記載的用于評估具有疾病或病癥 (例如那些被認為涉及線粒體功能障礙的(例如阿爾茨海默氏病或其它神經變性疾病))的受試者或用于評估懷疑具有此類疾病形成風險的受試者的其它臨床診斷信息聯合使用。本發明還可應用于其它復雜疾病、病癥、或疾患的遺傳風險因子的發現。
通過本文中的述及將本文中引用的所有美國專利參考文獻的公開內容完整收入本文。1.定義本文中使用了下面的定義“感興趣疾患”指被指派進行系統發生研究和/或后續診斷或預后的特定疾患、疾病、或病癥。如本文中使用的，“疾患”包括但不限于與ApoE和/或T0MM40和/或線粒體功能障礙有關的疾患，例如神經變性疾病、代謝疾病、精神病癥、和癌癥。 涉及ApoE和/或T0MM40的疾患的例子包括但不限于心血管疾病；代謝疾病；神經變性疾病；神經學創傷或疾病；自身免疫疾病(例如多發性硬化(Pinholt M，et al. Apo E in multiple sclerosis and optic neuritis :the apoE_epsilon4 allele is associated with progression of multiple sclerosis. Mult Scler.11 :511-5(2005) ；Masterman， T. &Hillert，J. The telltale scan :AP0E 4inmultiple sclerosis. Lancet Neurol. 3 331 (2004)).神經精神性系統性紅斑狼瘡(Pullmann Jr. R，et al. Apolipoprotein E polymorphism in patients withneuropsychiatric SLE.Clin Rheumatol.23 97-101 (2004)).等)；病毒感染(例如與丙肝感染有關的肝病(Wozniak MA, et al. Apolipoprotein E- ε 4protectsagainst severe liver disease caused by hepatitis C virus, !fepatol. 36 :456-463(2004))、HIV 疾病(Burt TD，et al. Apolipoprotein (apo) E4 enhances HIV-I eellentry in vitro, and the APOE epsilon4/epsilon4 genotype accelerates HIV diseaseprogression.Proc Natl Acad Sci USA. 105 8718-23(2008))、等)；髖骨折 / 骨質疏松(Pluijm SM, et al. Effects of gender and age on the association ofapolipoprotein E epsilon4 with bone mineral density, bone turnover and the riskof fractures in older people. Osteoporos Int. 13 701-9(2002))；線粒體疾病(Chang S，et al. Lipid-and receptor-binding regiohs of apolipoprotein E4fragments act in concert to cause mitochondrial dysfunction and neurotoxicity. Proc Natl Acad Sci USA. 102 :18694-9(2005))；衰老(Schachter F，et al. Geneticassociations with human longevity at the APOE and ACE loci. Nat Genet. 6 :29-32(1994) ；Rea IM, et al.，Apolipoprotein E alleles in nonagenarian subjectsin the Belfast Elderly Longitudinal Free-living Ageing Study (BELFAST). Mech.Aging and Develop. 122 :1367-1372(2001))；炎癥(Li L，et al.，Infection inducesa positive acute phase apolipoprotein E response from a negative acute phasegene :role of hepatic LDL receptors. J Lipid Res. 49 :1782-93(2008))； 禾口記憶功會邑障石尋(Caselli RJ, et al. Longitudinal modeling of age-related memory declineand the APOE epsilon4 effect. N Engl J Med. 361 :255-630009))。
如本文中使用的，“心血管疾病”指涉及心和/或血管的疾病，包括但不限于冠狀動脈疾病(Song Y，et al. Meta-analysis :apolipoprotein E genotypes andrisk for coronary heart disease.Ann Intern Med. 141 137-47 (2004)； Bennet AM，et al.，Association of apolipoprotein E genotypes with lipid levels and coronaryrisk. JAMA 298 :1300-11 (2007))、動脈粥樣硬化(Norata GD， et al.Effects ofPCSK9 variants on common carotid artery intima mediathickness and relation toApoE alleles. Atherosclerosis (2009)Jun 27. [Epub ahead of print]，doi :10. 1016/j.atherosclerosis 2009.06.023 ；Paternoster L， et al. AssociationBetween Apolipoprotein E Genotype and Carotid Intima-Media Thickness MaySuggest a Specific Effect on Large Artery Atherothrombotic Stroke. Stroke39 :48-54 (2008)) Λ 缺血性心臟病(Schmitz F，et al.，Robust association of theAPOE 4 allele with premature myocardial infarction especially in patientswithout hypercholesterolaemia the Aachen study.Eur. J. Cl in. Investigation 37 106-108 (2007))、血管病諸如缺血性發作(Peck G，et al. The genetics of primaryhaemorrhagic stroke， subarachnoid haemorrhage and ruptured intracranialaneurysms in adults.PLoS One.3 :e3691 (2008) ；Paternoster L, et al. AssociationBetween Apolipoprotein E Genotype and Carotid Intima-Media Thickness MaySuggest a Specific Effect on Large Artery Atherothrombotic Stroke. Stroke39 :48-54^008))、血管性癡呆(Bang OY，et al. Important link between dementiasubtype and apolipoprotein E :a meta-analysis. Yonsei Med J. 44 401-13 (2003) ；Baum L，et al. Apolipoprotein E epsilon4 allele is associated with vasculardementia. Dement Geriatr Cogn Disord. 22 :301-5(2006))等。如本文中使用的，“神經變性疾病”指阿爾茨海默氏病(Corder EH, et al. Gene dose of apolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer' s disease inlate onset families. Science 261:921-3 (1993) ；Corder EH, et al.There is apathologic relationship between ApoE-epsilon 4and Alzheimer ' s disease. ArchNeurol. 52 :650-1 (1995))、巾白金森氏病(Huang X， et al. Apolipoprotein E anddementia in Parkinson disease :a meta-analysis. Arch Neurol. 63 :189-93 (2006)； Huang X et al. APOE-[epsiIon]2alIele associated with higher prevalence ofsporadic Parkinson disease.Neurology 62 :2198-202 (2004) ；Martinez, M. et al. Apolipoprotein E4is probably responsible for the chromosome 191inkage peakfor Parkinson ' s disease. Am. J. Med. Genet. B Neuropsychiatr. Genet. 136B， 172-174^00 )、亨廷頓氏病和多種不太常見的引起神經元減退的疾病和病癥例如老年性黃斑變性(age-related mascular degeneration) (Thakkinstian A，etal. Association between apolipoprotein E polymorphisms and age-related maculardegeneration A HuGE review and meta-analysis. Am J Epidemiol. 164 :813-22 (2006) ；Bojanowski CM，et al. An apolipoprotein E variant may protect againstage-related macular degeneration through cytokine regulation. Environ MolMutagen. 47 :594_602(2006))。“神經學創傷或疾病”包括但不限于頭部損傷后的后果(Zhou W，et al. Meta-analysis of AP0E4 allele and outcome after traumatic brain injury. JNeurotrauma. 25 :279-90(2008) ；Lo TY, et al. Modulating effect ofapolipoprotein E polymorphisms on secondary brain insult and outcome afterchildhood brain trauma. Childs Nerv Syst. 25 :47-54(2009))(Gupta R, etal. Polymorphism in apolipoprotein E among migraineurs and tension-typeheadache subjects. J Headache Pain. 10 :115-2(K2009))、血管性水月中(James ML，et al. Apolipoprotein E modifiesneurological outcome by affecting cerebraledema but not hematoma size after intracerebral hemorrhage in humans. J StrokeCerebrovasc Dis. 18 :144-9(2009)； James ML, et al. Pharmacogenomic effects ofapolipoprotein e on intracerebral hemorrhage. Stroke 40 :632-9(2009))等。如本文中使用的，“代謝疾病”包括但不限于血脂障礙(Wilier CJ, et al. Newly identified loci that influence lipid concentrations and risk of coronaryartery disease. Nat Genet. 40 :161-9(2008) ；Bennet AM，et al.，Association ofapolipoprotein E genotypes with lipid levels and coronary risk. JAMA298 1300-11 (2007))、末期腎病(Oda H，et al. Apolipoprotein E polymorphismand renal disease. Kidney Int Suppl.71 :S25_7(1999) ；Hubacek JA, et al. Apolipoprotein E Polymorphism in Hemodialyzed Patients and Healthy 對照 s.Biochem Genet. (2009) Jun 30. [Epub ahead of print]D0I10. 1007/sl0528-009_9266-y·)、慢性腎病 (Yoshida T，et al. Association of apolymorphism of the apolipoprotein E gene with chronic kidney disease injapanese individuals with metabolic syndrome. Genomics 93 :221-6(2009) ；LeivaE，et al. Relationship between Apolipoprotein E polymorphism and nephropathyin type_2diabetic patients.Diabetes Res Clin Pract. 78 :196-201 (2007))Λ 膽囊病(Boland LL, et al.Apolipoprotein E genotype and gallbladder disease risk in alarge population-based cohort. Ann Epidemiol. 16 :763-9 (2006) ；Andreotti G，etal. Polymorphisms of genes in the lipid metabolism pathway and risk of biliarytract cancers and stones :a population-based case-對照 study in Shanghai, China. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 17 :525-34(2008))、糖尿病(II 型)(Elosua R，et al. Obesity Modulates the Association among APOE Genotype, Insulin，andGlucose in Men. Obes Res. 11 1502-1508(2003) ；Moreno JA, et al.TheApolipoprotein E Gene Promoter(-219G/ T)Polymorphism Determines InsulinSensitivity in Response to Dietary Fat in Healthy Young Adults. J. Nutr. 135 :2535_254(K2005))、代謝綜合征、膽石癥(Abu Abeid S， et al.Apolipoprotein-E genotype and the risk of developing cholelithiasis followingbariatric surgery :a clue to prevention of routine prophylactic cholecystectomy. Obes Surg. 12 :354-7(2002))等。如本文中使用的，“精神病癥”指精神分裂癥(Kampman 0，et al. Apolipoprotein E polymorphism is associated with age of onset in schizophrenia. J Hum Genet. 49 355-9(2004) ；Dean B. et al. ,Plasma apolipoprotein E isdecreased in schizophrenia spectrum and bipolar disorder. Psychiatry Res. 158 :75-78 (2008))Λ 強制性障礙 (0CD)、成癮性行為(吸煙成癮、酒精成癮等)、雙相型障礙(Dem B.et al. , Plasma apolipoprotein E is decreased inschizophrenia spectrum and bipolar disorder. Psychiatry Res. 158 :75-78 Q008))、和精神性質的其它疾病、病癥、或疾患。如本文中使用的，“疾患形成”指疾病、病癥、或其它醫學疾患的初始診斷，或受試者已診斷的現有疾病、病癥、或醫學疾患的加劇。如本文中使用的，“診斷”或“預后”指基于與共享共同核苷酸序列、癥狀、征候、家族史或考慮患者健康狀況有關的其它數據的多數個體的比較，使用信息(例如遺傳信息或來自對生物學樣品的其它分子測試的數據、征候和癥狀、身體檢查發現、認知性能結果等) 來預料最有可能的后果、時幀和/或對用于給定疾病、病癥或疾患的特定處理的響應。如本文中使用的，“生物學樣品”指懷疑含有感興趣核酸的材料。含有DNA的生物學樣品包括毛發、皮膚、頰拭樣和生物學流體諸如血液、血清、血漿、痰、淋巴液、精液、陰道粘液、糞便、尿液、脊髓液等等。自此類樣品分離DNA是本領域技術人員熟知的。依照一些實施方案的“受試者”指其基因型或單元型要與個體的狀況(即疾病或病癥狀態)和/或對候選藥物或治療的響應聯合來確定并記錄的個體。使用來自多數受試者的核苷酸序列來構建系統發生樹，并然后可以出于診斷或預后目的將來自受試者個體的同源核苷酸序列與系統發生樹上的那些比較。如本文中使用的，“基因”指含有用于RNA產物的受調節生物合成的所有信息的 DNA區段，包括啟動子、外顯子、內含子和控制表達的其它非翻譯區。如本文中使用的，“遺傳基因座”或“基因座”指染色體或DNA分子上的位置，常常對應于基因或身體或表型特征或特定核苷酸或核苷酸串。基因座的英文單數形式是locus， 復數形式是loci。如本文中應用于核酸的，“擴增”指任何導致核酸的一個或多個拷貝形成的方法， 其中優選擴增是指數式的。一種用于酶促擴增特定DNA序列的此類方法稱作聚合酶鏈式反應(PCR)，如記載于 &iiki et al.，1986，Science230 :1350_1354。PCR 中使用的引物正常情況長度變化自約10個至50個或更多個核苷酸，而且通常選擇為至少約15個核苷酸以確保足夠的特異性。生成的雙鏈片段叫作“擴增子”，而且長度變化可自少至約30個核苷酸至 20, 000個或更多個核苷酸。如本文中使用的，“標志物”或“遺傳標志物”指特定基因座處的已知DNA序列變異。變異可以由于突變或遺傳而存在于個體中。遺傳標志物可以是短DNA序列，諸如單個堿基對變化(單核苷酸多態性，SNP)周圍的序列，或長DNA序列，像微衛星。標志物可用于研究遺傳病與其遺傳原因(例如導致缺陷或其它不想要形式蛋白質的特定基因突變)之間的相關性。如本文中使用的，“遺傳風險因子”指與對疾患、疾病、或病癥的易感性升高有關的遺傳標志物。它還指與對感興趣的選定藥物或治療的特定響應有關的遺傳標志物。如本文中使用的，“與...有關的”指兩項或更多項特征的一起發生比預期會偶然單獨發生更常見。關聯的一個例子涉及白血球表面上稱作HLA(HLA代表人白細胞抗原)的一項特征。一種特定HLA類型，即HLA B-27型，與多種疾病包括強直性脊柱炎的風險升高有關。強直性脊柱炎在具有HLAB-27的人中比在一般群體中發生的可能性高至87倍。由于遺傳風險因子而“疾患發生風險的升高的”受試者指易患疾患、對疾患具有遺傳易感性和/或比缺乏所述遺傳風險因子的受試者更有可能形成疾患的受試者。例如，由于存在一個或兩個ApoE 4等位基因而“阿爾茨海默氏病形成的風險升高的“受試者”比不攜帶ApoE 4等位基因的受試者更有可能形成阿爾茨海默氏病。如本文中使用的，“多態性”指基因組DNA中的特定基因座處存在兩種或更多種不同核苷酸序列。多態性可充當遺傳標志物，而且還可稱作遺傳變體。多態性包括核苷酸替代、插入、刪除和微衛星，而且可以但非必然導致基因表達或蛋白質功能的可檢測差異。多態性位點指基因座內至少一名群體中的個體的核苷酸序列與參照序列不同的核苷酸位置。如本文中使用的，“刪除/插入多態性”或“DIP”指一種型式(version)的序列中相對于另一種插入一個或多個核苷酸。如果已知哪種等位基因代表次要等位基因，那么在次要等位基因是核苷酸刪除時使用術語刪除，而且在次要等位基因是核苷酸添加時使用術語 “插入”。還在有多種形式或長度且次要等位基因不明顯時使用術語“刪除/插入多態性”。 例如，對于本文中描述的poly-T多態性，觀察到多種長度的多態性。如本文中使用的，“多態性數據”指關于特定基因的下面一項或多項的信息多態性位點的位置；那些位點處的序列變異；一個或多個群體中多態性的頻率；對于基因確定的不同基因型和/或單元型；一個或多個群體中一種或多種這些基因型和/或單元型的頻率；和性狀與基因的基因型或單元型之間的任何已知關聯。如本文中使用的，“單元型”指個體中至少一條染色體上攜帶的遺傳變體或變體組合。單元型常常包括多個毗鄰多態性基因座。如本文中使用的，單元型的所有部分存在于染色體或單倍體DNA分子的同一拷貝上。如無沒有相反證據，則假設單元型代表有可能在減數分裂期間一起遺傳的多個基因座的組合。每個人攜帶任何給定遺傳基因座的一對單元型，由在來自雙親的同源染色體上繼承的序列組成。這些單元型可以是相同的，或者可以代表給定基因座的兩種不同遺傳變體。單元型定型指用于確定個體中的一種或多種單元型的過程。單元型定型可以包括使用家族系譜、分子技術和/或統計推斷。如本文中使用的，“變體”、“變異”、或“遺傳變體”指群體中單元型的特定同等型， 即基因的序列內在至少一個并通常超過一個的變異位點或核苷酸的序列與同一單元型的其他形式不同的特定形式。這些在基因的不同等位基因間不同的變異位點處的序列稱作 “基因序列變體”、“等位基因”、“變異”或“變體”。術語“可變形式”指通過在基因序列內具有至少一個并通常超過一個的變異位點，能與其它等位基因區分的等位基因。本領域已知的等同于“變異”或“變體”的其它術語包括突變和單核苷酸多態性(SNP)。提到存在變異意味著特定變異，即特定多態性位點處的特定核苷酸，而非僅僅是存在基因的任何變異。如本文中使用的，“同等型”指基因、mRNA、cDNA或由其編碼的蛋白質的特定形式， 通過其特定序列和/或結構而與其它形式區分。例如，載脂蛋白E的ApoE 4同等型對ApoE 2或ApoE 3同等型。如本文中使用的，“順反子”指在單一染色體上發現的含有單一多肽的遺傳密碼且發揮遺傳單元的功能的DNA區段。順反子包括涉及單一功能單元(即基因)的外顯子、內含子和調節元件。該術語衍生自經典的順反測試，其用于確定遺傳元件，是在無論它們是否位于同一 DNA分子上時均能夠在功能上相互作用(“反式”互補)或者是只在它們位于同一 DNA分子上時能夠在功能上相互作用(“順式”作用元件)。在本發明的語境中，術語“基因型”指基因的特定等位基因形式，其可以通過特定位點處的核酸序列中存在的特定核苷酸來定義。基因型也可以指一個或多個多態性基因座處存在的等位基因對。對于二倍體生物體，諸如人類，兩個單元型構成基因型。基因型定型指用于確定個體的基因型的任何過程，例如通過核酸擴增、抗體結合或其它化學分析。所得基因型可以是未定相的(imphased)，意味著不知道找到的序列衍生自哪條親本染色體。如本文中使用的，“連鎖不平衡”指兩個或更多個基因座處的等位基因的非隨機關聯。連鎖不平衡描述如下的情況，其中等位基因或遺傳標志物的一些組合在群體中發生的頻率比基于等位基因的頻率預期會自等位基因隨機形成單元型的頻率更高或更低。不同基因座處的多態性間的非隨機關聯通過連鎖不平衡的程度來測量。如本文中使用的，“多重序列比對”或“MSA”指來自自多名個體衍生的基因組DNA 的三條或更多條核苷酸序列的比對，以確定序列間的同源性和異源性。一般地，假設查詢序列的輸入集具有進化相關性，由此它們共享一個譜系且遺傳自共同祖先。計算機算法最常用于實施對比對序列的分析。參照例示方法的框圖(例如圖1)描述了本發明的一些實施方案，它們可以包括由計算機和/或計算機程序產品執行的步驟。會理解，框圖和/或操作例示的每一個框，及框圖和/或操作例示的框組合可以由模擬和/或數字硬件和/或計算機程序指令來執行。可以給通用計算機、專用計算機、ASIC和/或其它可編程數據處理裝置的處理器提供這些計算機程序指令，使得經由計算機和/或其它可編程數據處理裝置的處理器執行的指令創建用于執行框圖和/或操作例示中規定的功能/作用的手段。因而，會領會，框圖和操作例示支持裝置、方法和計算機程序產品。還可以包括其它軟件，諸如操作系統。會進一步領會，多重序列比對模塊、作圖模塊和/或本文中描述的其它模塊的功能性可以(至少部分地)使用分立硬件組件、一個或多個特定用途集成電路(ASIC)和/或一個或多個特殊用途數字處理器和/或計算機來實現。如本文中使用的，“作圖”指創建系統發生樹，即給觀察到的每種新核苷酸序列變體指派節點，將該節點連接至代表由同一個體攜帶于同一染色體或順反子上的已知序列的另一節點，并對每個節點處代表的每種類型的受試者數目計數。見圖4，它是以這種方式建立的系統發生樹的一個例子。“系統發生”指涉及物種內各組生物體或個體間的進化聯系的研究。在易于獲得遺傳信息之前，系統發生主要基于表型觀察。如本文中使用的，“系統發生作圖”指使用 DNA序列數據來連接由多個個體攜帶的相關序列變體以確定進化聯系和分歧的時間順序 (chronology)。“系統發生樹”是對變體間聯系作圖的成果。如本文中使用的，“節點”指系統發生樹上代表由至少一名受試者攜帶的實際變異序列的多態性數據點。節點通過分支連接至另一節點，后者代表由同一個體攜帶于同一染色體上及同一順反子中的但位于順反子內不同遺傳基因座處的變異序列。存在節點指示至少一名受試者攜帶由該節點指代的序列以及由通過分支與其連接的鄰近節點代表的序列二者。如本文中使用的，“分支”指代表兩種不同變異序列或單元型的兩個節點之間的連接，其中所述兩種變體位于來自受試者個體的同一染色體上和同一順反子中。“分支點”指延伸出超過兩個分支的任何節點，但是它在本文中尤其用于指延伸出三個或更多個節點的根節點。“根節點，，代表共同進化祖先的遺傳序列，遺傳分歧自其產生各種各樣由連接的節點代表的附近序列變體。如本文中使用的，“迭代”指反復計算一個系列中每個特征的值。例如，分析系統發生樹上的每個節點以計算受感興趣疾患(諸如阿爾茨海默氏病)影響的受試者數目與對照未受影響受試者之比；將該比與連接的節點比較以定位與感興趣疾病、病癥、或疾患形成風險升高或降低的關系。一個節點與下一個之間該比的實質性變化指示存在升高或降低較早代檢查遺傳變體”指分析開始于代表由最多數目受試者個體共享的序列的節點并連續分析自該節點延伸出的分支連接的節點，接著是第二水平的節點，依此類推。然后，分析總體上自樹的根部向樹的外部分支和節點移動。如本文中使用的，“治療”包括任何試圖實現受試者健康的特定方面的變化(即致力于特定疾病、病癥或疾患)的藥物、方法、生活方式改變或引入的其它調整。如本文中使用的，“藥物”指給人施用來治療或預防或控制疾病或疾患的化學實體或生物學產品，或化學實體或生物學產品的組合。如本文中使用的，術語“藥物”與術語 “藥”、“藥劑”、“治療性干預”、或“藥學產品”同義。最優選地，藥物得到政府機構批準用于治療至少一種特定疾病或疾患。“疾病”、“病癥”、和“疾患”是本領域普遍公認的，而且指個體或患者中存在一般公認為異常和/或不想要的征候和/或癥狀。疾病或疾患可以基于病理變化來診斷和歸類。 疾病或疾患可以為選自標準教科書諸如Harrison，sPrinciples of Internal Medicine, 1997 或 Robbins Pathologic Basis of Disease，1998 中列出的疾病類型。如本文中使用的，“線粒體功能障礙”指細胞內線粒體的任何有害異常。本領域現在已知與線粒體功能障礙有關的一些疾病、病癥、或疾患包括阿爾茨海默氏病、帕金森氏病和其它神經變性疾病、中風和心臟病發作中的缺血-再灌注損傷、癲癇、糖尿病和衰老。本領域已經將許多其它疾病、病癥和疾患與線粒體功能障礙關聯起來。確實，線粒體對于大多數細胞類型的正常機能是至關重要的，而且線粒體減退常常導致細胞死亡。通過損害ATP 生成、破壞鈣穩態和提高氧化應激，這種線粒體功能障礙引起細胞損傷和死亡。此外，通過引起細胞色素c和其它促凋亡因子釋放入細胞質，線粒體損傷可導致凋亡性細胞死亡(綜述見Wallace，1999 ；Schapira，2006)。關于本文中發現的一個特定例子，假設ApoE 3和 ApoE 4同等型經由與T0MM40的相互作用來引起線粒體功能障礙。一些T0MM40變體可以與ApoE 3同等型協同作用來加速線粒體減退。認為這種線粒體機制促成多種復雜遺傳性疾病、病癥和疾患。如本文中使用的，“受試者”優選但不限于人類受試者。受試者可以是男性或女性，而且可以是任何人種或種族，包括但不限于白人(Caucasian)、非洲裔美國人 (African-American)、非洲人、亞洲人、西班牙語裔(Hispanic)、印第安人等。受試者可以是任何年齡，包括新生兒、嬰兒、幼兒、兒童、青少年、成人和老人。受試者還可以包括動物受試者，特別是哺乳動物受試者，諸如犬、貓、牛、山羊、馬、綿羊、豬、嚙齒類(例如大鼠和小鼠)、 兔類、靈長類(包括非人靈長類)等，其經篩選用于獸醫用藥或藥學藥物開發目的。如本文中使用的，“治療”或“處理”指對罹患疾病的患者給予好處(包括患者的疾患(例如一種或多種癥狀)的改善、疾病的發作或進展的延遲等)的任何類型的措施。如本文中使用的，“晚期發作阿爾茨海默氏病”或“LOAD”是本領域已知的，而且是阿爾茨海默氏病在65歲后發作或診斷的情況中使用的分類。它是阿爾茨海默氏病的最常見形式。2.用于鑒定遺傳變體的方法雖然自基因組尺度掃描推導的關聯表是有用的，但是它們一般不足以解釋疾病復雜性。家族、途徑和基因相互作用可提供特異性。高分辨率變異作圖可揭示復雜遺傳相互作用的答案。在自身不能完全解釋與感興趣疾病、病癥、或疾患的關聯的一種已知遺傳風險因子可能呈現卓越候選遺傳基因座用于更詳細的調查的情況中，這是特別適用的。此外，藥物遺傳學在可用于藥物開發的同時，還能延伸生物學關聯性。分析來自大量個體的序列數據以發現群體中個體間基因序列變異會導致群體中所有變體的更大部分的檢測。要通過本發明的方法來分析的初始序列信息衍生自多個受試者的基因組DNA。生物體可以是其多種序列可得的任何生物體，但是優選來自人類。在鑒定新變異時，篩選基于人種、種族、性別和/或地理起源的不同群體組常常是有用的，因為特定變異的頻率在此類組間可能不同。最優選地，對于認為是多基因的疾病或病癥(遺傳復雜疾病/病癥)，由受試者群體呈現的表型來自型譜的極端。含有DNA的生物學樣品可以是血液、精液、頰拭樣等。自此類樣品分離DNA是本領域公知的。在一些實施方案中，本發明涉及分析來自具有給定疾病、病癥或疾患(遺傳的或其它的)的至少一種已知風險因子的多個受試者的核苷酸序列數據。分析核苷酸序列以生成單元型數據，并然后將單元型或遺傳變體繪圖到系統發生樹上以展現所代表的序列的進化。通過將此樹與關于多個受試者的表型數據比較，有可能為攜帶在系統發生樹上觀察到的單元型的受試者個體做出預后或診斷。在其它實施方案中，本發明涉及藥物遺傳學和藥物基因組學領域及遺傳單元型信息用于預測個體對疾病的易感性和/或他們對一種或多種特定藥物的響應的用途，從而可以開發適應群體組的遺傳差異的藥物和/或將其施用于具有適宜遺傳譜的個體。核苷酸序列信息衍生自基因組DNA。使用的基因組序列數據可以得自臨床或非人動物或得自培養的細胞或分離的組織研究。生物體可以是其多種序列可得的任何生物體， 但是優選來自人類。在鑒定新變異時，篩選基于人種、種族、性別和/或地理起源的不同群體組常常是有用的，因為特定變異的頻率在此類組間可能不同。最優選地，對于認為是多基因的疾病或病癥(遺傳復雜疾病/病癥)，由受試者群體呈現的表型是極端對立項。含有DNA的生物學樣品可以是血液、精液、頰拭樣等。自此類樣品分離DNA是本領域公知的。用于確定特定感興趣遺傳基因座處的DNA序列的方法也是本領域已知的。自動化測序現在是廣泛可得的，而且只需要分離的DNA樣品和至少一種特異性設計成識別感興趣遺傳基因座內或附近高度保守序列的引物。依照一些實施方案，自包括對特定病癥完善表征的患者的人群組，仔細測序出感興趣的限定遺傳區或基因座(例如由一套正向和反向PCR引物限定的)。確定共有序列，并且將給定基因座的所有觀察到的序列變體匯編成表。具有最大數目觀察到的變體的基因座代表來自共同祖先的進化分歧。因此，這些基因座是順式連接于只具有一個或很少觀察到的變體的基因座的。至少在調查的初始階段期間，優選配對成受試者組的群體共享代表相似祖先的共同一般表型。否則，經由構建系統發生樹來分析這些數據會需要極大數目的受試者。3.多重序列比對確定群體中基因或基因區中特定變異或多處變異的存在可以以多種方式來實施， 它們都涉及通過靶向感興趣區域內已知高度保守的序列來定位特定遺傳基因座。根據高度保守的基因座，經由本領域公知的多種技術之一易于獲得毗鄰序列。分析來自多個受試者的平行DNA序列中的第一步是多重序列比對(“MSA”)。MSA 通常用于展示來自在基因或基于區內具有多態性差異的同源樣品的序列比對以顯示保守區域和變異序列。可以使用各種已知技術之一或更多和公眾可得軟件來構建在感興趣基因座處獲得的序列信息的MSA，而且它們是公眾自許多來源(包括因特網)可得的。本領域已知的用于分析多重序列比對的方法包括例如美國專利6，128，587，Sjolander ；美國專利 6，291，182，Schork et al.；及美國專利 6，401，043，Manton et al.中記載的那些。4.系統發生樹和分析各種用于構建“系統發生樹”的方法是本領域已知的(見例如Sanderson，2008)。 Sim等人使用“單元型區段”分析來研究toll樣受體(TLR)變體與前列腺癌之間的關聯 (2005)，而Bardel等人Q005)使用進化枝分析辦法來調查CARD15基因變體與克羅恩氏病之間的關聯。然而，均未利用先前與疾病關聯起來的遺傳基因座來調查連鎖。依照一些實施方案的系統發生樹可以用拓撲來構建，其中在所研究人類受試者個體中觀察到的單元型序列變體形成樹上的節點(代表在數據中觀察到的每一種序列)。節點可連接其它節點，而且在樹的分支位點、共同根或根節點處找到共同祖先。系統發生樹反映所分析數據的遺傳基因座間的進化相關性(見Sanderson，2008 ；Tzeng,2005 ；SeItman, 2003)。圖4顯示為圖3所示遺傳基因座的B區構建的詳細系統發生樹。系統發生樹評估的起點一般是MSA(見上文)。可使用多種軟件基于序列數據來構建系統發生樹。見例如美國專利7, 127，466和美國專利6，532，467, Brocklebank, et al.。 基本前提在于展現許多變體的遺傳基因座由順式連接的這些變體呈現。多態性在樹中創建分支點(節點)，其限定相關序列或單元型的組。利用系統發生樹來獲得信息，即迭代檢查受疾患影響的受試者與未受影響對照受試者之比；計算開始于在最大數目受試者中觀察到的節點并向樹的外圍移動至在較少受試者中觀察到的節點。目的是定位受感興趣疾患影響的受試者與未受影響對照受試者之比有實質性變化的分支點、分支、或節點。此類分支點代表較高風險受試者相對于較低風險受試者的進化分歧，反之亦然。對生成的系統發生樹的統計分析可以依照本領域已知方法來實施。一種本領域公認的方法是計算自展置信水平(見Efron et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93， 13429-13434(1996))ο5.患者評估一旦為特定遺傳基因座生成系統發生樹，就可以評估受試者個體，即將他們的DNA 序列與構成系統發生樹的序列比較。存在與代表具有更高感興趣疾患發病率的受試者(即受疾病或病癥影響的受試者與未受影響的對照受試者之比更高)的樹區域對應的單元型或序列變體會意味著該受試者個體也具有升高的風險。相反，實質更低的比對應于感興趣疾患形成的風險較低。也可以依照一些實施方案基于感興趣疾患對感興趣的活性劑治療或治療方法的響應性來分析系統發生樹。6. APOE 和 T0MM40ApoE表型和基因型是本領域公知的。為ApoE建立的命名系統以及其表型和基因型記載于例如Zannis et al.，1982，通過本文中的述及而收錄。T0MM40(線粒體外膜通道亞基，40kDa)表型和基因型也是已知的。T0MM40作為見于線粒體膜中的轉位酶的通道形成亞基的發揮其功能，其對于將蛋白質輸入線粒體是必需的。來自阿爾茨海默氏病患者研究的基因組尺度關聯掃描數據毫無疑義地鑒定出含有載脂蛋白E(ApoE)基因的連鎖不平衡區域。自1993年的最初出版物(見例如Corder et al.)起，ApoE 4變體作為經過證實的易感性基因已經得到廣泛復制。然而，基因組尺度關聯掃描數據導致在細胞生物學研究中觀察到引人注目的“巧合”，涉及ApoE和T0MM40共定位至線粒體外膜。在1998年對ApoE周圍的連鎖不平衡建模的研究期間首次遭遇這種其它基因，T0MM40。多態性定位于ApoE鄰近的連鎖不平衡小區域內。ApoE共定位至線粒體外膜，提示同等型特異性相互作用導致ApoE誘導的線粒體凋亡作為阿爾茨海默氏病表達中早期步驟的潛在作用。生物學數據已經證明神經元細胞培養物中活動線粒體的比例以及它們移動的速度及它們穿過的距離是影響線粒體凋亡升高的因素。系統發生數據提示T0MM40對阿爾茨海默氏病形成的獨立遺傳效應。ApoE特異性結合人類神經元培養物中的線粒體(Chang，2005)，而且對數以百計的阿爾茨海默氏病患者和匹配對照中這個連鎖不平衡區域的測序，與T0MM40遺傳變體進化的作圖組合，為ApoE-T0MM40相互作用限定了一個特別感興趣的區域，如圖3所示。這些進化數據進一步支持ApoE與T0MM40之間的遺傳關聯，而且提示線粒體功能障礙可能導致多年里緩慢發生的神經元死亡。阿爾茨海默氏病的發作年齡分布(見例如美國專利 6，027，896，Roses etal.)可能反映兩種生物化學相互作用蛋白質導致疾病臨床表達的緊密連鎖變體的繼承。如本文中詳述的，T0MM40變體的多種單元型與ApoE等位基因之間的相互作用促成阿爾茨海默氏病發病機制；特別地，與ApoE的E 3等位基因連鎖的T0MM40單元型促成疾病發病機制。數種T0MM40基因變體僅與ApoE 3順式連鎖地進化。(類似地，特定T0MM40 變體可能與ApoE 4或ApoE 2順式連鎖地進化。)如此，T0MM40變體添加的任何遺傳效應與ApoE 4獨立地分離，但是兩種變異蛋白質產物可以在功能上反式相互作用，以生成給定的可見的表型或性狀。如此，T0MM40變體添加的任何遺傳效應與ApoE 4獨立地分離。鄰近相互作用基因的這種“巧合”可解釋在所有阿爾茨海默氏病基因組尺度關聯掃描研究中找到的特別顯著的統計關聯數據。有趣的是注意到最初的商品化基因組尺度關聯掃描平臺不含有任何ApoE多態性，但是用T0MM40和ApoCl SNP標示-但是該區域事實上始終稱作 "ApoE 區”。還可以在藥物遺傳學背景內審視組合了疾病遺傳與發病機制的推定分子機制的這些數據。由于繼承ApoE 4等位基因的強遺傳效應，ApoE 4被稱作復雜易感性基因已經超過十年。發作年齡分布作為ApoE基因型的函數的一致再現證實了 ApoE 3繼承的作用不完全是良性的，而是在較低疾病發作率觀察到的較低風險因子。有T0MM40遺傳變體只定位在連鎖不平衡區域中含有ApoE 3的DNA鏈上(Roses et al.，未發表的數據)，且因此沒有處于基因組尺度關聯組中的SNP所要求的Hardy-Weinberg平衡。T0MM40序列中只與ApoE 3順式連鎖的進化變化起提高與ApoE 3有關的阿爾茨海默氏病風險的作用，而與ApoE 3順式連鎖的其它T0MM40變體降低與ApoE 3有關的風險。一種獨立遺傳測試會是確定那些與較少阿爾茨海默氏病有關的T0MM40多態性是否在含有ApoE 3的基因型[ApoE 3/3或ApoE 4/3]的發作年齡分布圖中在較大的年齡隔離。檢測受試者中ApoE 2、3或4和/或T0MM40單元型或編碼它們的DNA(在一些實施方案中，包括每一項的等位基因數目)的存在或缺失可以通過任何合適手段直接或間接進行。本領域技術人員知道多種技術。一般都涉及自受試者收集含有DNA或蛋白質的生物學材料的樣品，并然后檢測受試者是否具有感興趣單元型的步驟。例如，關于ApoE的檢測步驟可如下進行，即自受試者(例如自腦脊液或含有ApoE的任何其它流體或組織)收集ApoE 樣品，并然后確定ApoE樣品中ApoE 2、3、或4同等型的存在或缺失(例如通過等電聚焦或免疫測定法)。確定編碼ApoE和/或T0MM40同等型的DNA的存在或缺失可以通過用經合適可檢測基團標記的寡核苷酸探針對感興趣基因組DNA區域直接測序來進行，和/或通過擴增反應的手段來進行，諸如聚合酶鏈式反應或連接酶鏈式反應(然后可以用經標記的寡核苷酸探針或多種其它技術來檢測該擴增反應的產物)。另外，檢測步驟可以包括檢測受試者對于編碼ApoE和/或T0MM40單元型的基因是雜合還是純合的步驟。知道可用來進行本發明的多種不同寡核苷酸探針測定形式。見例如美國專利No. 4，302，204，Wahl et al.；美國專利 No. 4，358，535，Falkow et al.；美國專利 No. 4，563，419，Ranki et al.；及美國專利 No. 4，994，373，Stavrianopoulos et al.(申請人明確意圖通過述及將本文中引用的所有美國專利參考文獻的公開內容收入本文)。在一些實施方案中，檢測可以包括多重DNA擴增(例如等位基因特異性熒光PCR)。 在一些實施方案中，檢測可以包括與微陣列(芯片、珠等)雜交。在一些實施方案中，檢測可以包括對含有試圖檢測的單元型的基因的適宜部分測序。在一些實施方案中，改變對一種或多種內切核酸酶限制酶消化的易感性的單元型可用于檢測。例如，可使用限制性片段長度多態性(RFLP)，其指在將各種限制酶施于DNA時的消化樣式。在一些實施方案中，一種或多種單元型的存在可通過等位基因特異性擴增來確定。在一些實施方案中，單元型的存在可通過引物延伸來確定。在一些實施方案中，單元型的存在可通過寡核苷酸連接來確定。在一些實施方案中，單元型的存在可通過與可檢測標記的探針的雜交來確定。見例如美國專利申請公開號 2008/0153088，Sun etal. ；Kobler et al.，Identification of an IlT allele in the polypyrimidine tract ofintron 8of the CFTR gene, Genetics in Medicine 8(2) :125-8(2006) ；Costa et al., Multiplex Allele-Specific Fluorescent PCR for Haplotyping the IVS8 (TG)m (T)nLocus in the CFTR Gene, Clin. Chem. ,54 1564-1567 (2008) ； Johnson et al. , AComparative Study of Five Technologically Diverse CFTR Testing Platforms, J. Mol. Diagnostics,9 (3) (2007) ；Pratt et al., Development of Genomic ReferenceMaterials for Cystic Fibrosis Genetic Testing, J. Mol. Diagnostics, 11 :186-193(2009)。可以通過任何合適手段對自生物學樣品分離的DNA進行選定核酸序列或靶核酸序列的擴增。一般見D. Kwoh and Τ. Kwoh, 19900合適擴增技術的例子包括但不限于聚合酶鏈式反應、連接酶鏈式反應、鏈置換擴增(一般見Walker et al. , 1992a ；Walker et al., 1992b)、基于轉錄的擴增(見Kwoh et al.，1989)、自主序列復制(“3SR”)(見Guatelli et al. ,1990),Q β復制酶系統(見Lizardi et al.，1988)、基于核酸序列的擴增(“NASBA”) (見 Lewis, 1992)、修復鏈反應(impair chain reaction, “RCR” )(見 Lewis,見上)、及飛反 DNA 擴增(boomerang DNA amplification, “BDA”)(see Lewis, supra)。聚合酶鏈式反應是當前優選的。
諸如前述的DNA擴增技術可涉及使用一種探針、一對探針、或兩對探針，這些探針特異性結合編碼ApoE 4的DNA，但是在相同雜交條件下不結合編碼ApoE 2或ApoE 3的 DNA，而且充當用于在擴增反應中擴增ApoE 4DNA或其部分的引物。同樣地，可以使用一種探針、一對探針、或兩對探針，這些探針特異性結合編碼ApoE 2的DNA，但是在相同雜交條件下不結合編碼ApoE3或ApoE 4的DNA，而且充當用于在擴增反應中擴增ApoE 2DNA或其部分的引物；而且可以使用一種探針、一對探針、或兩對探針，這些探針特異性結合編碼 ApoE 3的DNA，但是在相同雜交條件下不結合編碼ApoE 2或ApoE 4的DNA，而且充當用于在擴增反應中擴增ApoE 3DNA或其部分的引物。類似地，可以使用一種探針、一對探針、或兩對探針，這些探針特異性結合編碼感興趣的T0MM40單元型的DNA，但是在相同雜交條件下不結合其它T0MM40單元型，而且充當用于在擴增反應中擴增T0MM40DNA或其部分的引物。一般地，用于檢測編碼ApoE和/或T0MM40單元型的DNA的寡核苷酸探針是結合編碼感興趣的單元型的DNA，但是在相同雜交條件下不結合編碼其它單元型的DNA的寡核苷酸探針。用合適的可檢測基團標記寡核苷酸探針，諸如下文關于抗體列出的那些。可以依照已知技術進行聚合酶鏈式反應(PCR)。見例如美國專利No. 4，683，195 ； 4，683，202 ；4, 800，159 ；和4，965，188。一般地，PCR涉及首先在雜交條件下用針對要檢測的特定序列的每一條鏈的一種寡核苷酸引物處理核酸樣品(例如在熱穩定的DNA聚合酶存在下)，從而合成每種引物的延伸產物，其與每一條核酸鏈互補，其中引物與其要雜交的特定序列的每一條鏈足夠互補，使得當與其互補物分開時，自每種引物合成的延伸產物能充當模板來合成其它引物的延伸產物，并然后在變性條件下處理樣品以將引物延伸產物與其模板分開，如果要檢測的序列存在的話。循環重復這些步驟，直至獲得期望程度的擴增。擴增序列的檢測可以如下進行，向反應產物添加能夠與反應產物雜交的寡核苷酸探針(例如本發明的寡核苷酸探針)，該探針攜帶可檢測標記物，并然后依照已知技術或通過直接在凝膠上顯現來檢測標記物。當PCR條件容許擴增所有ApoE等位基因類型時，可以通過與等位基因特異性探針的雜交、通過限制性內切核酸酶消化、通過變性梯度凝膠上的電泳、或其它技術來區分各類型。用于確定ApoE基因型的一種PCR方案記載于Wfenham et al. (1991)，通過本文中的述及而收錄。其中記載了有效擴增及鑒定ApoE同等型的引物的例子。可以采用對ApoE多態性區域具(無論Ap0E4、E3或E 特異性的引物。在Wfenham中，例如，采用擴增跨越ApoE 多態性位點(密碼子112和158，其含有核苷酸3745和3883)的227bp DNA區域的PCR引物。然后使擴增的片段接受限制性內切核酸酶CfoI作用，其自六種可能的ApoE基因型提供不同限制性片段，可以在電泳凝膠上識別。別的方法還可見Hixon et al. (1990) ；Houlston et al. (1989) ；Wenham et al. (1991)；及Konrulaet al. (1990)，這些均通過本文中的述及而收錄。在阿爾茨海默氏病之外，有數種其它遺傳上復雜的疾病和病癥，對于它們，本發明的方法提供勝過現有分析的優點。例如，來自多項2型糖尿病遺傳研究的數據支持為通過基因組尺度關聯研究來限定基因座提供統計顯著性會需要很多臨床病例/對照系列的觀
點ο7.活性劑、組合物和治療
如上所述，也可基于感興趣疾患對依照一些實施方案的感興趣活性劑治療或治療方法的響應性來分析使用本文中詳述的方法創建的系統發生樹，而且為受試者或患者做出的治療決策可以基于所鑒定的特定遺傳變體。活性劑。活性劑包括已知用于治療感興趣疾患的那些，而且包括抗阿爾茨海默氏病活性劑，包括但不限于乙酰膽堿酯酶抑制劑、NMDA受體拮抗劑、和過氧化物酶體增殖子活化的受體(PPAR)激動劑或調控劑，包括但不限于噻唑烷二酮或glitazar類中的那些藥物。 活性劑還可以是生物藥學產品，例如抗體(例如單克隆抗體、多克隆抗體、抗體衍生物或經修飾抗體諸如DomainAntibodiesTM、Bapineuzumab、等)、融合蛋白或治療性RNA分子。活性劑還可以是任何這些產品的組合。乙酰膽堿酯酶抑制劑的例子包括但不限于多奈哌齊(donepezil)(可作為 ARICEPT購買)、加蘭他敏(galantamine)(可作為RAZADYNE購買)、和利凡斯的明 (rivastigmine)(可作為EXELON購買)及其藥學可接受鹽。別的例子包括但不限于美國專利 No. 6，303,633 ；5, 965, 569 ；5，595,883 ；5，574，046 ；和 5，171，750 中記載的那些(通過本文中的述及完整收錄本文中引用的所有美國專利參考文獻的公開內容)。NMDA受體拮抗劑的例子包括但不限于美金剛(memantine)(可作為AKATIN0L、 AXURA, EBIXIA/ABIXIA、MEMOX和NAMENDA購買)及其藥學可接受鹽。別的例子包括但不限于美國專利 No. 6，956，055 ；6，828，462 ；6，642，267 ；6，432，985 ；和 5，990126 中記載的那些。噻唑烷二酮的例子包括但不限于羅格列酮(rosiglitazone)(可作為AVANDIA購買)及其藥學可接受鹽。別的例子包括但不限于5-(4-[2-(N-甲基-N-(2-苯并噻唑基) 氨基)乙氧基]芐基)_2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-(2-苯并噻唑基)氨基)乙氧基]苯亞甲基)-2，4_噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-(2-苯并P惡唑基)氨基)乙氧基]芐基)-2，4_噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-(2-苯并P惡唑基)氨基)乙氧基]苯亞甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-(2-嘧啶基)氨基)乙氧基]芐基)_2， 4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-(2-嘧啶基)氨基)乙氧基]苯亞甲基)-2，4_噻唑烷二酮；5-(442-(N-甲基-N-[2-(4，5-二甲基噻唑基)]氨基)乙氧基]芐基)_2，
4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-[2-(4，5-二甲基噻唑基)]氨基)乙氧基]苯亞甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-(2-噻唑基)氨基)乙氧基]芐基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-(2-噻唑基)氨基)乙氧基]苯亞甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-[4-(N-甲基-N-(4-苯基噻唑基))氨基)乙氧基)芐基]_2，4-噻唑烷二酮；
5-(4-[2-(N-甲基-N-(4-苯基噻唑基))氨基)乙氧基]苯亞甲基)_2，4-噻唑烷二酮； 5-(4-[2-(N-甲基-N-[2-(4-苯基-5-甲基噻唑基)]氨基)乙氧基]芐基)_2，4_噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-[2-(4-苯基-5-甲基噻唑基)]氨基)乙氧基]苯亞甲基)-2， 4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-[2-(4-甲基-5-苯基噻唑基)]氨基)乙氧基]芐基)-2，4_噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-[2-(4-甲基-5-苯基噻唑基)]氨基)乙氧基]苯亞甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-[2-(4-甲基噻唑基)]氨基)乙氧基]芐基)_2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-[2-(4-甲基噻唑基)]氨基)乙氧基] 苯亞甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-[4-(N-甲基-N-[2-(5-苯基P惡唑基)]氨基)乙氧基) 芐基]-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-[2-(5-苯基P惡唑基)]氨基)乙氧基]苯
27亞甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-[2-(4，5-二甲基P惡唑基)]氨基)乙氧基]芐基)_2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-[2-(4，5-二甲基P惡唑基)]氨基)乙氧基]苯亞甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-[4-(2-嘧啶基氨基)乙氧基)芐基]-2，4-噻唑烷二酮；5-[4-(2-嘧啶基氨基)乙氧基)苯亞甲基]-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-乙酰基-N-(2-嘧啶基)氨基)乙氧基]芐基)_2，4-噻唑烷二酮；5-(4-(N-(2-苯并噻唑基)-N-芐基氨基)乙氧基)苯亞甲基)-2，4_噻唑烷二酮；5-(442-(N-(2-苯并噻唑基)-N-芐基氨基)乙氧基)芐基)_2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[3-(N-甲基-N-(2-苯并P惡唑基)氨基)丙氧基]芐基)_2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[3-(N-甲基-N-(2-苯并P惡唑基)氨基)丙氧基]苯亞甲基)-2，4_噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-(2-吡啶基)氨基)乙氧基]芐基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-甲基-N-(2-吡啶基)氨基)乙氧基]苯亞甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-W-(N-甲基-N-(2-苯并P惡唑基)氨基)丁氧基]苯亞甲基)-2，4-噻唑烷二酮；5-(4-W-(N-甲基-N-(2-苯并P惡唑基)氨基)丁氧基]芐基)_2，
4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-(2-苯并P惡唑基)氨基)乙氧基]苯亞甲基)2，4-噻唑烷二酮；
5-(4-[2-(N-(2-苯并P惡唑基)氨基)乙氧基]芐基)_2，4-噻唑烷二酮；5-(4-[2-(N-異丙基-N-(2-苯并P惡唑基)氨基)乙氧基]芐基)_2，4-噻唑烷二酮，及其藥學可接受鹽。見例如美國專利No. 5，002953o如上所述，可以以其藥學可接受鹽的形式來制備本文中公開的活性劑。藥學可接受鹽指保持親本化合物的期望生物學活性且不產生不想要的毒理學效果的鹽。此類鹽的例子有(a)與無機酸形成的酸加成鹽，無機酸例如氫氯酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等等；和與有機酸形成的鹽，有機酸諸如例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、葡糖酸、 檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、苯甲酸、鞣酸、棕櫚酸、海藻酸、多聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、萘二磺酸、多聚半乳糖醛酸、等等；(b)自元素陰離子形成的鹽，元素諸如氯、溴、 和碘；及(c)自堿衍生的鹽，諸如銨鹽、堿金屬鹽諸如鈉和鉀鹽、堿土金屬鹽諸如鈣和鎂鹽、 及與有機堿的鹽，有機堿諸如二環己胺和N-甲基-D-葡萄糖胺。可以作為前藥來施用活性劑。如本文中使用的，“前藥”指本發明化合物的如下前藥，其在合理醫學判斷的范圍內，適合于接觸人類和較人低等的動物的組織使用而沒有不當的毒性、刺激、過敏反應等等，與合理的風險/利益比相稱，且有效實現它們的預定用途，以及在可能的情況中本發明化合物的兩性形式。術語“前藥”指如下的化合物，其在體內，例如通過血液中的水解迅速轉化以生成上式的親本化合物。詳盡的討論見 T. Higuchi and V. Stella, Prodrugs as Novel delivery Systems, Vol.14, the A.C.S.SymposiumSeries 及 Edward B. Roche, ed. , Bioreversible Carriers in Drug Design, AmericanPharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987,Μ ^^φ 的述及收錄二者。還可見美國專利No. 6，680，299。例子包括如下的前藥，其在體內被受試者代謝成具有本文中描述的活性化合物的活性的活性藥物，其中所述前藥是醇或羧酸基團的酯，如果化合物中存在此類基團的話；醇基團的縮醛或縮酮，如果化合物中存在此類基團的話；胺基團的N-Marmich堿或亞胺，如果化合物中存在此類基團的話；或羧基的khiff 堿、肟、乙縮醛、烯醇酯、U惡唑烷或噻唑燒，如果化合物中存在此類基團的話，諸如美國專利 No. 6，680，324和美國專利No. 6，680，322中記載的。組合物。為了施用，可以依照已知技術在藥學載體中配制上文所述活性劑。見例如 Remington，The Science And Practice of Pharmacy (9th EcL 1995)。在依照本發明的藥物配制劑的制造中，通常將活性化合物(包括其藥學可接受鹽)與可接受載體等混合。 當然，載體必須是就與配制劑中的任何其它組分相容而言可接受的，而且不能是對患者有害的。載體可以是固體或液體或二者兼有，而且優選與化合物一起配制成單位劑量配制劑， 例如片劑，其可以含有0.01或0.5%至95%或99% (以重量計)的活性化合物。可以在本發明的配制劑中摻入一種或多種活性化合物，配制劑可以通過藥學的任何公知技術來制備，包括將各成分(任選包括一種或多種助劑)混合。本發明的配制劑包括那些適合于口服、直腸、表面、口腔(例如舌下)、陰道、胃腸外(例如皮下、肌肉內、皮內、或靜脈內)、表面(即皮膚和粘膜表面，包括氣道表面)和經皮施用，盡管任何給定情況中最合適的路徑會取決于所治療疾患的性質和嚴重性及所使用特定活性化合物的性質。適合于口服施用的配制劑可以呈現為分立的單元，諸如膠囊劑、扁囊劑、錠劑、或片劑，每個含有預定量的活性化合物；為粉劑或顆粒劑；為水或非水液體中的溶液或懸浮液；或為水包油或油包水乳劑。此類配制劑可以通過藥劑學的任何合適方法來制備，其包括使得活性化合物與合適載體(其可以含有一種或多種上文所述助劑)相關聯的步驟。一般地，如下制備本發明的配制劑，即將活性化合物與液體或粉碎的(finely divided)固體載體或二者兼有均勻且密切混合，并然后在必要時對所得混合物定型。例如，可以通過對含有活性化合物及任選的一種或多種助劑的粉末或顆粒壓制或鑄模來制備片劑。可以通過在合適的機器中對自由流動形式的化合物(諸如粉末或顆粒，任選與粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑和/或表面活性/分散劑混合)壓制來制備壓制片劑。可以通過在合適的機器中對用惰性液體粘合劑潤濕的粉化化合物鑄模來制備模制片劑適合于口腔(舌下)施用的配制劑包括在有香味的基材(通常是蔗糖和阿拉伯樹膠或黃芪樹膠)中包含活性化合物的錠劑；和在惰性基材諸如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯樹膠中包含化合物的軟錠劑。適合于胃腸外施用的本發明配制劑包括活性化合物的無菌的水和非水注射溶液， 該制劑優選與預定接受者的血液等張。這些制劑可以含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使得配制劑與預定接受者的血液等張的溶質。水和非水無菌懸浮液可以包括懸浮劑和增稠劑。 配制劑可以在單劑或多劑容器中呈現，例如密封的安瓿和管形瓶，而且可以在冷凍-干燥 (凍干)條件中保存，只需要在臨使用前添加無菌液體載體，例如鹽水或注射用水。可以自先前描述種類的無菌粉劑、顆粒劑和片劑制備臨場配制的注射溶液和懸浮液。例如，在本發明的一個方面，在密封容器中以單位劑量形式提供了包含活性劑或其鹽的可注射的、穩定的、無菌的組合物。以凍干物的形式提供化合物或鹽，其能夠用合適的藥學可接受載體重建以形成適合于注射入受試者的液體組合物。單位劑量形式通常包含約IOmg至約IOg化合物或鹽。當化合物或鹽基本上不溶于水時，可以以足夠數量采用足夠量的生理學可接受的乳化劑以在水載體中乳化化合物或鹽。一種此類有用乳化劑是磷脂酰膽堿。適合于表面應用于皮膚的配制劑優選采取軟膏劑、乳膏劑、洗劑、糊劑、凝膠劑、噴霧劑、氣霧劑或油的形式。可使用的載體包括石油凝膠、羊毛脂、聚乙二醇、醇、經皮強化劑及其兩種或更多種的組合。適合于經皮施用的配制劑可以呈現為分立的貼劑，適應保持與接受者的表皮密切接觸較長一段時間。適合于經皮施用的配制劑也可以通過離子電滲來投遞(見例如 Pharmaceutical Research 3(6) :318 (1986))，而且通常采取活性化合物的任選緩沖的水溶液的形式。合適配制劑包含檸檬酸鹽或bis\tris緩沖液(pH 6)或乙醇/水且含有0. 1 至0. 2M活性組分。在活性劑之外，藥物組合物可以含有其它添加劑，諸如調節pH的添加劑。具體而言，有用的PH調節劑包括酸(諸如氫氯酸)、堿或緩沖劑(諸如乳酸鈉、乙酸鈉、磷酸鈉、檸檬酸鈉、硼酸鈉或葡糖酸鈉)。另外，組合物可以含有微生物防腐劑。有用的微生物防腐劑包括對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯和苯甲醇。在將配制劑放置在為多劑使用設計的管形瓶中時，通常采用微生物防腐劑。當然，如指出的，可以使用本領域公知的技術將本發明的藥物組合物凍干。劑量。其使用在本發明的范圍中的任何特定活性劑的治療有效劑量會隨化合物的不同及患者的不同而有所變化，而且會取決于患者的狀況及投遞的路徑。對于口服施用，可使用1、2或3mg至30、40或50mg的總日劑量，作為每日單劑給予或分成分成每日兩或三齊IJ。治療。本文中描述的或使用本文中教導的方法發現的遺傳變體可用于確定受疾患 (例如與ApoE和/或T0MM40有關的疾患)影響的患者的治療過程，通過例如基于一種或多種遺傳變體的存在或缺失來確定施用哪種活性劑和/或治療過程。遺傳變體的存在或缺失可指示活性劑和/或治療過程對患者的功效，預測疾患發作年齡，指示優選的劑量方案， 等。可以為患者生成遺傳譜，而且參考該譜來確定該患者是否在有可能對特定活性劑有響應的患者組中。關于使用的用法說明可以與活性劑一起包裝或以其它方式與活性劑關聯，指明基于遺傳變體的存在或缺失關于治療、治療時機、劑量方案等的推薦。8.確定疾病風險預測或預后的方法為了依照本發明的一些實施方案確定無癥狀個體的疾病風險預測或預后(根據疾病的通常過程或病例的特性預料痛苦或疾病過程的前景)，可以加工診斷數據包括患者的診斷或醫學史和遺傳數據諸如患者的基因型(例如ApoE和/或T0MM40基因型)以提供治療選項和后果預測。加工可以包括獲得“患者譜”，諸如患者的醫學史的集合，包括年齡和性別、感興趣基因座的基因型定型(例如使用適當設計的引物及使用RT-PCR或PCR擴增步驟)和/或表型定型(例如使用抗體介導的方法或酶測試)、及將此原始數據轉換成預后的統計分析或其它分析。預后可以包括預測患者疾病發作年齡、對藥物療法的響應、治療的時機、治療功效等。在一些實施方案中，預后可以包括使用計算機軟件程序來分析患者數據并針對關系數據庫運行統計交叉核對以將患者數據或譜轉換成預后。“患者譜”包括關于正在實施預測和/或預后分析的患者的數據和/或材料。數據可以包括關于患者的診斷、年齡、性別和/或基因型的信息。患者譜還可以包括來自患者的材料，諸如血液、血清蛋白質樣品、腦脊液或純化的RNA或DNA。9.臨床試驗中的基因型分層在進行臨床試驗時可以使用本文中教導的或用本文中的方法確定的基因型的檢測，其方式就像使用其它基因型信息來進行臨床試驗，諸如例如美國專利No. 6，573，049、 6，368，797 和 6，291，175 中記載的。在一些實施方案中，此類方法有利地將患者群體分層或容許患者群體細化(例如通過將群體分成一個或多個亞組)，使得能更加準確地檢測特定治療方案的優點，特別是對于具有特定基因型的特定患者亞群。在一些實施方案中，此類方法包括給多個受試者施用測試活性劑或療法(通常給分開的但相似表征的多個受試者施用對照或安慰劑療法)并在多個受試者中如上所述檢測基因型(例如ApoE和/或T0MM40)的存在或缺失。可以在施用測試療法的步驟之前、之后或同時檢測基因型。然后可以根據任何合適參數或潛在治療結果或后果(包括但不限于所述療法的功效、療法的副作用的缺失等)來確定一種或多種檢測到的等位基因對測試療法的影響。對于診斷有疾病或有疾病形成風險的受試者，可以建立臨床試驗來測試測試化合物治療任何數目已經確定與特定基因型有關的疾病的功效。如果在臨床試驗完成后對受試者進行基因型定型，那么該分析仍可致力于確定對疾病的治療與要評估功效的等位基因之間的相關性。或者，如果有癥狀的或無癥狀的受試者尚未診斷出疾病但已經確定有疾病形成風險，那么可以進行與上文所述臨床試驗相似的臨床試驗。在設計治療組時也可以考慮根本的生物學機制。例如，ApoE 4(1-272)片段比 ApoE 3(1-272)更多地結合線粒體，降低線粒體細胞動力學及降低突觸發生。羅格列酮，一種用于治療阿爾茨海默氏病的藥物候選，提高有絲分裂及提高突觸發生-對抗ApoE片段結合的效果-影響ApoE 3的程度比ApoE 4高。因此，可以基于根本的作用機制來選擇藥物或治療候選(例如羅格列酮)，因為它涉及用于分層的遺傳標志物(例如ApoE 2、E 3、E 4 和/或T0MM40變體)。為試驗選擇的藥物的功效評估可以包括監測受試者一段時間并分析疾病發作的延遲和發作時疾病的強度，以及測量與疾病有關的癥狀的發作。在臨床試驗中消除或延遲疾病發作或減輕疾病癥狀的的藥物可能是在診斷有疾病或有疾病形成風險的患者中使用的有益藥物。在此類試驗中可以使用的測試化合物包括上文所述藥劑，包括先前批準用于臨床使用的藥劑和尚未批準使用或未批準用于治療特定疾病的的新化合物。如此，在一些實施方案中，臨床試驗可以包括優化藥物施用，包括劑量、施用的時機、毒性或副作用、施用的路徑和治療的功效。10.可用于檢測感興趣基因座處的基因型變體的試劑盒本文中提供了用于確定受試者是否處于疾病形成風險升高、在較早的發作年齡形成疾病和/或為特定治療的候選者的試劑盒，其中所述疾病與ApoE和/或T0MM40有關(例如晚期發作阿爾茨海默氏病)。試劑盒包括至少一種對于檢測本文所述ApoE和/或T0MM40 變體的存在或缺失具特異性的試劑，而且可以包括有助于確定受試者是否疾病形成風險升高的用法說明。試劑盒可以任選包括用于檢測ApoE基因(例如ApoE 2,ApoE 3和/或ApoE 4)的核酸或關于用于檢測ApoE基因型的等電聚焦方法的用法說明；和/或用于檢測本文所述T0MM40變體的核酸。在一些實施方案中，試劑盒可以任選包括一種或多種結合ApoE 2,ApoE 3,ApoE 4或T0MM40同等型的抗體。可以以任何合適方式來包裝測試試劑盒，通常所有要素與一張關于進行測試的印刷用法說明一起置于一個容器中。在一些實施方案中，試劑盒可以任選含有緩沖液、酶和試劑，用于通過引物指導的擴增來擴增基因組核酸。試劑盒還可以包括一種或多種用于檢測擴增核酸中特定單元型的存在或缺失的裝置。此類裝置可以包括一種或多種與單元型核酸雜交的探針，其可以附著至生物芯片或微陣列裝置，諸如美國專利No. 6，355，429中記載的生物芯片或微陣列裝置
31之任一。生物芯片或微陣列裝置任選具有至少一種能與單元型序列雜交的捕捉探針，附著于表面。在優選的實施方案中，生物芯片或微陣列含有多種探針，且最優選含有針對單元型序列的至少一種探針，若單元型序列存在的話，它會通過一套側翼引物來擴增。例如，如果五對側翼引物用于擴增，那么該裝置會含有針對每一種擴增產物的至少一種單元型探針， 即至少五種探針。試劑盒還優選包括關于使用試劑盒成分的用法說明。在下面的非限制性實施例中更為詳細地解釋本發明。實施例1 系統發生樹的構建所有已知基因組尺度掃描研究在載脂蛋白Cl[ApoCl]基因座周圍展現極其顯著的 P 值(Mahley et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:5644—51(2006) ；Coon et al.， J. Clin. Psychiatry 68 :613-8(2007) ；Li et al.，Arch. Neurol. 65 :45-53 (2007))。同樣重要的是每個系列鑒定出ApoE連鎖不平衡區域以外的一個“偏愛”臨界顯著的候選基因， 但是每一項研究中的這些偏愛候選基因是不同的。T0MM40靠近ApoCl，而且與ApoE連鎖不平衡。認為ApoE 3或ApoE4與不同T0MM40同等型之間的相互作用與較早年齡范圍內阿爾茨海默氏病形成風險升高或降低有關。Apo 4/4、3/4、3/3、2/4、和2/3基因型的發作年齡曲線顯示于圖2，指示疾病較早形成的一系列風險，這取決于ApoE譜。然而，ApoE本身似無法解釋這些發作年齡曲線中的所有數據。已經提出了用于與不同ApoE等位基因有關的阿爾茨海默氏病風險的多態性制譜的各種方法(見例如Cox等人的美國申請No. 20060228728 ；Li和Grupe的美國申請 No. 20080051318)。本文中展現了用于解決ApoE 4之謎的一種系統發生辦法。生物學樣品、DNA分離、感興趣基因座擴增。總共340名受試者包括A組中的135 個阿爾茨海默氏病病例和99個年齡匹配對照以及B組中的57個病例和49個對照。所有受試者攜帶先前與較高風險的較早疾病發作關聯起來的ApoE基因型(即3/3、3/4、或4/4)。 自所有受試者收集含有DNA的生物學樣品。然后依照常規方法分離基因組DNA，用于對染色體19上的遺傳基因座測序。圖3顯示染色體19上使用來自多份報告的基因組尺度掃描數據的研究所靶向的遺傳區域。該區域涵蓋在GenBank參照序列AF0501M內。使用軟件來為變異基因座生成多重序列比對(例如 ClustalW2，European Bioinformaticshstitute)。隨后，使用用于形成系統發生樹的軟件來分析多重序列比對(例如MEGA version 2. 1，Center for Evolutionary Functional Genomics, TREEV0LVE, Department of Zoology, University of Oxford，或基于簡約性的構建軟件，諸如PAUP，Sinauer Associates)。可以用例如遺傳數據分析(GDA 用于分析分立遺傳數據的軟件，北卡羅來納州州立大學的生物信息研究中心)來實施統計分析。B區分析的結果展現于圖4的系統發生樹中。圖4中的每個數據代表一個觀察到的序列變體。這些變體可以是核苷酸替代、插入、刪除或微衛星，而且可以導致或不導致基因表達或蛋白質功能的可檢測差異。每個節點代表在超過一條染色體上發生的一種變體(或一些變體)。鄰近節點限定順式的，且因此更有可能作為受試者的染色體上感興趣區域中的一個單元繼承的序列的邊界。在最大數目的后續節點之前的節點代表隨時間發生遺傳分歧的進化祖先變體。存在對應于代表具有實質性更高阿爾茨海默氏病發病率的受試者(即受疾病影響的受試者與未受影響的對照受試者的比更高)的樹區域單元型或序列變體會意味著該受試者個體也處于升高的風險。相反，實質性更低的比對應于阿爾茨海默氏病形成風險降低。在線粒體蛋白質輸入的調節中，T0MM40與ApoE直接相互作用，而且當前的一種假說是特定T0MM40變體的表達加劇與ApoE 3等位基因的劑量依賴性存在有關的相對中等的阿爾茨海默氏病風險。使用本發明的方法在B區內發現此類T0MM40變體。對人類受試者測試新藥物具有極大的風險(見Kenter and Cohen, Lancet, 368 1387-91 (2006))0使用系統發生樹來預料個體對感興趣藥物或治療的響應有可能顯著降低該風險。預備研究指示羅格列酮(Avandia)在阿爾茨海默氏病的治療中可能具有遺傳譜特異性功效(見Risner et al. ,ThePharmacogenomics Journal 6,246-254(2006) ；Brodbeck et al.，Proc. Nat. Acad. Sci. 105，1343-6 (2008)) II 期臨床試驗數據指示沒有 ApoE 4 等位基因的阿爾茨海默氏病患者比攜帶1個或2個ApoE 4等位基因的患者更好地響應羅格列酮(未顯示的數據)。這支持用本文中教導的方法鑒定出的變體可用于基于基因型來預料個體對治療的響應的假說。實施例2 感興趣T0MM40變體的鑒定使用CLUSTAL X程序(version 2. 0. 10, Larkin et al.，Clustal W and ClustalX version 2. 0. Bioinformatics, 23 :2947-2948 (2007))比對 174 條序列(87 名受試者每人 2 條)。使用歐洲生物信息研究所(EBI)網站上執行的近鄰連接算法((Saitou and Nei,The neighbor-joining method :a new method for reconstructingphylogenetic trees. Mol. Evol.Biol.，4 :406-425(1987)),使用多重序列比對來構建系統發生樹。所得系統發生樹具有在第一分歧處有兩個大組(A、B)的結構。將這些組的ApoE 基因型頻率制表并顯示于圖5。顯然B組含有主要為ε 3/ε 3和ε 3/ε 4ΑροΕ基因型的受試者單元型，而且幾乎沒有ε 4/ ε 4的受試者單元型。A組含有幾乎所有是ε 4/ ε 4基因型的受試者單元型。使用通過SNP發現平臺(Polymorphic)生成的多態性表來鑒定將數據隔離成兩個組的特定T0MM40基因變體。使用似然比檢驗來鑒定ρ值小于0. 005的重要變體。變體表匯總于表1。在該表中，在次要等位基因是核苷酸刪除時使用術語“刪除”， 而在次要等位基因是核苷酸添加時使用術語“插入”。在有超過兩種可能形式且次要等位基因不明顯時使用術語“刪除/插入多態性”。例如，對于poly-T多態性，觀察到多種長度多態性。該表的第二欄提供關于與將序列分成兩個組的變體有關的特定等位基因的身份的信息。例如，T > A指示T等位基因將序列分離入系統發生樹上的“A”組。在列出兩種等位基因時，例如G > B ;A > A，每一種等位基因獨特地將序列數據分離入兩個組，而在列出一種等位基因時，它與數據的優勢分離有關，而剩余等位基因沒有獨特地將數據分離成同質組， 而是兩個組的混合。表1 與系統發生樹上通過ApoE基因型來分區的組有關的T0MM40變體
3權利要求
1.一種用于鑒定與感興趣疾患形成有關的遺傳變體的方法，包括(a)根據含有DNA的生物學樣品測定由多名人類受試者個體在感興趣遺傳基因座處攜帶的核苷酸序列，其中所述受試者包括(i)受感興趣疾患影響的受試者和(ii)未受感興趣疾患影響的受試者二者；(b)實施多重序列比對分析以自在所述多名受試者中觀察到的核苷酸序列鑒定所述遺傳基因座處的遺傳變體；(c)將所述遺傳變體繪圖以構建所述受試者的系統發生樹，所述樹包含鑒定同一順反子上所述受試者間變體變化的分支；(d)檢查所述樹中作為分支呈現的遺傳變體并確定受影響的與未受影響的受試者之比以鑒定那些導致受影響與未受影響受試者之比變化的變化；和然后(e)鑒定受影響與未受影響受試者之比與所述樹上一種或多種鄰近變體相差至少5% 的遺傳變體以由此鑒定與所述感興趣疾患形成有關的遺傳變體。
2.權利要求1的方法，其中所有受試者攜帶所述感興趣疾患的相同已知多態性。
3.權利要求1或權利要求2的方法，其中所述已知多態性是載脂蛋白E等位基因。
4.權利要求1-3任一項的方法，其中所述感興趣遺傳基因座與所述已知多態性連鎖不平衡。
5.權利要求1-4任一項的方法，其中所述感興趣遺傳基因座與所述已知多態性在同一染色體上且相距小于10、20、30、40或50千堿基。
6.權利要求1-5任一項的方法，其中所述遺傳基因座是T0MM40。
7.權利要求1-6任一項的方法，其中所述感興趣疾患與升高或降低的線粒體功能障礙有關。
8.權利要求1-7任一項的方法，其中所述感興趣疾患是神經變性疾病、代謝疾病、心血管疾病、精神病癥或癌癥。
9.權利要求1-7任一項的方法，其中所述感興趣疾患是冠狀動脈疾病。
10.權利要求1-7任一項的方法，其中所述感興趣疾患是II型糖尿病。
11.權利要求1-7任一項的方法，其中所述感興趣疾患是帕金森氏病。
12.權利要求1-7任一項的方法，其中所述感興趣疾患是阿爾茨海默氏病。
13.一種用于確定感興趣疾患形成風險升高的方法，包括(a)根據含有DNA的生物學樣品確定由受試者個體攜帶的通過權利要求1-12任一項的方法鑒定的遺傳變體；和然后(b)當所述遺傳變體存在時確定所述受試者形成所述感興趣疾患形成的風險升高。
14.一種用于確定受試者中阿爾茨海默氏病形成風險升高的方法，包括(a)自取自所述受試者的含有DNA的生物學樣品檢測與阿爾茨海默氏病風險升高或降低有關的T0MM40基因遺傳變體的存在或缺失，其中所述變體是T0MM40基因內含子6或內含子9中的刪除/插入多態性；和(b)當所述遺傳變體存在或缺失時確定所述受試者形成阿爾茨海默氏病風險的升高或降低。
15.權利要求14的方法，進一步包括檢測所述受試者是否是ApoE2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4 或 E4/E4 受試者。
16.權利要求14的方法，進一步包括檢測所述受試者是否是ApoE3/E3或E3/E4受試者ο
17.權利要求14-16任一項的方法，進一步包括下述步驟(c)當所述受試者被確定為形成阿爾茨海默氏病的風險升高時以治療有效量給所述受試者施用抗阿爾茨海默氏病活性劑。
18.權利要求17的方法，其中當與所述遺傳變體不存在或不缺失的受試者相比通過所述遺傳變體的存在或缺失所述受試者被確定為風險升高時在較小的年齡在所述受試者中進行所述施用步驟。
19.權利要求17或權利要求18的方法，其中所述活性劑選自下組乙酰膽堿酯酶抑制劑，NMDA受體拮抗劑，過氧化物酶體增殖子活化的受體激動劑或調控劑，抗體，融合蛋白，治療性RNA分子，及其組合。
20.權利要求17或權利要求18的方法，其中所述活性劑是羅格列酮或其藥學可接受 ο
21.權利要求14-20任一項的方法，其中所述T0MM40遺傳變體是NCBIBuild36. 3基因組位置50，094, 889處的poly-T插入變體。
22.一種通過以治療有效量給受試者施用抗阿爾茨海默氏病活性劑來治療受試者阿爾茨海默氏病的方法；改良包括當與不攜帶與阿爾茨海默氏病風險升高有關的T0MM40基因遺傳變體的相應受試者相比所述受試者攜帶所述遺傳變體時在較小的年齡給所述受試者施用所述活性劑，其中所述T0MM40遺傳變體是T0MM40基因內含子6或內含子9中的刪除/插入多態性 (DIP)。
23.權利要求22的方法，進一步包括檢測所述受試者是否是ApoE2/E2、E2/E3、E2/E4、 E3/E3、E3/E4 或 E4/E4 受試者。
24.權利要求23的方法，進一步包括檢測所述受試者是否是ApoE3/E3或E3/E4受試者ο
25.權利要求22-M任一項的方法，其中所述活性劑選自下組乙酰膽堿酯酶抑制劑， NMDA受體拮抗劑，過氧化物酶體增殖子活化的受體激動劑或調控劑，抗體，融合蛋白，治療性RNA分子，及其組合。
26.權利要求22-M任一項的方法，其中所述活性劑是羅格列酮或其藥學可接受鹽。
27.權利要求2216任一項的方法，其中所述T0MM40基因遺傳變體是選自下組的變體 rsl0524523, rsl0602329 和 DIP3。
28.權利要求2216任一項的方法，其中所述DIP是插入多態性。
29.權利要求2246任一項的方法，其中所述DIP是poly-T刪除/插入多態性。
30.權利要求22- 任一項的方法，其中所述T0MM40基因遺傳變體是rsl0524523。
31.權利要求2246任一項的方法，其中所述DIP是poly-T刪除/插入多態性，具有為至少27個連續堿基對的poly-T。
32.權利要求2246任一項的方法，其中所述DIP是poly-T刪除/插入多態性，具有為 rsl0524523處的至少27個連續堿基對的poly-T。
33.一種為有所需要的患者治療感興趣疾患的方法，其中所述感興趣疾患與ApoE和/ 或T0MM40有關，所述方法包括(a)確定由受試者個體攜帶的通過權利要求1-12任一項的方法鑒定的遺傳變體的存在或缺失以生成所述患者的遺傳圖譜；和然后，若所述圖譜指示所述患者會對活性劑有響應，則(b)以治療有效量給所述受試者施用所述活性劑以治療所述感興趣疾患。
34.權利要求33的方法，其中所述活性劑選自下組乙酰膽堿酯酶抑制劑，NMDA受體拮抗劑，過氧化物酶體增殖子活化的受體激動劑或調控劑，抗體，融合蛋白，治療性RNA分子， 及其組合。
35.權利要求33的方法，其中所述活性劑是羅格列酮或其藥學可接受鹽。
36.權利要求33-35任一項的方法，其中所述T0MM40遺傳變體是選自下組的 NCBI Build 36. 3 遺傳位置處的 T0MM40 變體50，092，565，50，092，587，50，093，506， 50，093，609，50，094，317，50，094，558，50，094，716，50，094，733，50，094，889，50，095，252， 50，095，506,50, 095, 698,50, 095, 764,50, 096, 271,50, 096, 531,50, 096, 647,50, 096, 697， 50，096，812，50，096，902，50，097，361，50，098，378，50，098，513 和 50，099，628。
37.權利要求33-36任一項的方法，其中所述T0MM40基因遺傳變體是刪除/插入多態性(DIP)。
38.權利要求37的方法，其中所述DIP是插入多態性。
39.權利要求37的方法，其中所述DIP是poly-T刪除/插入多態性。
40.權利要求37-39任一項的方法，其中所述DIP是rsl0524523、rsl06023^或DIP3。
41.權利要求37-39任一項的方法，其中所述DIP是rsl0524523。
42.一種在受試者中治療阿爾茨海默氏病的方法，包括(a)自取自所述受試者的含有DNA的生物學樣品檢測與對活性劑的響應性有關的 T0MM40基因遺傳變體的存在或缺失；并若所述遺傳變體存在，則(b)以治療有效量給所述受試者施用所述活性劑以治療所述阿爾茨海默氏病。
43.權利要求42的方法，進一步包括檢測所述受試者是否是ApoE2/E2、E2/E3、E2/E4、 E3/E3、E3/E4 或 E4/E4 受試者。
44.權利要求42的方法，進一步包括檢測所述受試者是否是ApoE3/E3或E3/E4受試者ο
45.權利要求42-44任一項的方法，其中所述活性劑選自下組乙酰膽堿酯酶抑制劑， NMDA受體拮抗劑，過氧化物酶體增殖子活化的受體激動劑或調控劑，抗體，融合蛋白，治療性RNA分子，及其組合。
46.權利要求42-44任一項的方法，其中所述活性劑是羅格列酮或其藥學可接受鹽。
47.權利要求42-46任一項的方法，其中所述T0MM40基因遺傳變體位于選自下組的 NCBI Build 36. 3 的遺傳位置處:50，092，565，50，092，587，50，093，506，50，093，609， 50，094，317，50，094，558，50，094，716，50，094，733，50，094，889，50，095，252，50，095，506， 50，095，698，50，095，764，50，096，271，50，096，531，50，096，647，50，096，697，50，096，812， 50，096，902，50，097，361，50，098，378，50，098，513 和 50，099，628。
48.權利要求42-47任一項的方法，其中所述T0MM40基因遺傳變體是刪除/插入多態性(DIP)。
49.權利要求48的方法，其中所述DIP是rsl05M523、rsl06023^或DIP3。
50.權利要求48或權利要求49的方法，其中所述DIP是插入多態性。
51.權利要求48或權利要求49的方法，其中所述DIP是poly-T刪除/插入多態性。
52.權利要求48或權利要求49的方法，其中所述DIP是rsl0524523。
53.抗阿爾茨海默氏病活性劑用于制備藥物的用途，所述藥物用于進行權利要求 17-52任一項的方法。
54.抗阿爾茨海默氏病活性劑用于進行權利要求17-52任一項的方法的用途。
55.一種在患者中確定阿爾茨海默氏病預后或形成風險的方法，包括獲得患者圖譜，其中所述獲得患者圖譜包括在所述患者的生物學樣品中檢測至少一種ApoE 2, ApoE 3或ApoE 4等位基因的存在或缺失，和檢測位于T0MM40基因內含子6或內含子9中的至少一種T0MM40刪除/插入多態性 (DIP)的存在或缺失，和然后將所述患者圖譜轉換成所述預后，其中所述ApoE 2、ApoE 3或ApoE 4等位基因的存在及所述至少一種T0MM40DIP多態性的存在將所述患者鑒定為處于阿爾茨海默氏病形成風險的患者。
56.權利要求55的方法，其中所述DIP是rsl05M523、rsl06023^或DIP3。
57.權利要求55的方法，其中所述DIP是插入多態性。
58.權利要求55的方法，其中所述DIP是poly-T刪除/插入多態性。
59.權利要求55的方法，其中所述DIP是rsl0524523。
60.權利要求55-59任一項的方法，進一步包括檢測所述受試者是否是ApoE2/E2、E2/ Ξ3、E2/E4、E3/E3、E3/E4 或 E4/E4 受試者。
61.一種用于將受試者分層入用于治療阿爾茨海默氏病的療法的臨床試驗的亞組的方法，所述方法包括在所述患者的生物學樣品中檢測至少一種ApoE 2, ApoE 3或ApoE 4等位基因的存在或缺失，檢測位于T0MM40基因內含子6或內含子9中的至少一種T0MM40刪除/插入多態性 (DIP)的存在或缺失，并基于所述至少一種ApoE 2、ApoE 3或ApoE 4等位基因和/或T0MM40DIP等位基因存在或缺失將所述受試者分層入所述療法的所述臨床試驗的所述亞組。
62.權利要求61的方法，其中所述DIP是插入多態性。
63.權利要求61的方法，其中所述DIP是poly-T刪除/插入多態性。
64.權利要求61的方法，其中所述DIP是rsl05M523、rsl06023^或DIP3。
65.權利要求61的方法，其中所述DIP是rsl0524523。
66.權利要求61-65任一項的方法，進一步包括檢測所述受試者是否是ApoE2/E2、E2/ Ξ3、E2/E4、E3/E3、E3/E4 或 E4/E4 受試者。
67.一種用于在阿爾茨海默氏病的治療的臨床試驗中鑒定患者的方法，包括(a)鑒定診斷有阿爾茨海默氏病的患者；并(b)為所述診斷有阿爾茨海默氏病的患者確定預后，包括獲得患者圖譜，其中所述獲得患者圖譜包括(i)在所述患者的生物學樣品中檢測至少一種ApoE3, ApoE 4和/或ApoE 2等位基因的存在或缺失，(ii)檢測位于T0MM40基因內含子6或內含子9中的至少一種T0MM40刪除/插入多態性(DIP)的存在或缺失，并(iii)將所述患者圖譜轉換成所述預后，所述預后包括對患者是否是阿爾茨海默氏病的所述治療的所述臨床試驗的候選者的預測。
68.權利要求67的方法，其中所述DIP是插入多態性。
69.權利要求67的方法，其中所述DIP是poly-T刪除/插入多態性。
70.權利要求67的方法，其中所述DIP是rsl05M523、rsl06023^或DIP3。
71.權利要求67的方法，其中所述DIP是rsl0524523。
72.權利要求67-71任一項的方法，進一步包括檢測所述受試者是否是ApoE2/E2、E2/ Ξ3、E2/E4、E3/E3、E3/E4 或 E4/E4 受試者。
73.一種用于確定受試者是否形成晚期發作阿爾茨海默氏病的風險升高的試劑盒，包括(A)至少一種特異性檢測ApoE3,ApoE 4和/或ApoE 2的試劑，其中所述試劑選自下組選擇性結合ApoE同等型的抗體，和選擇性結合編碼ApoE等位基因的DNA的寡核苷酸探針；(B)至少一種特異性檢測位于T0MM40基因內含子6或內含子9中的至少一種T0MM40 刪除/插入多態性(DIP)的存在或缺失的試劑；和(C)通過下述步驟確定受試者是否形成晚期發作阿爾茨海默氏病的風險升高的用法說明，(i)用所述至少一種試劑在所述受試者中檢測ApoE3、ApoE4和/或ApoE 2同等型的存在或缺失；(ii)檢測位于T0MM40基因內含子6或內含子9中的至少一種T0MM40刪除/插入多態性(DIP)的存在或缺失；并(iii)通過觀察用所述至少一種試劑是否檢測到ApoE3, ApoE 4、和/或ApoE 2及所述T0MM40DIP的存在來觀察所述受試者是否形成晚期發作阿爾茨海默氏病的風險升高，其中ApoE 3、ApoE4和/或ApoE 2同等型及所述T0MM40DIP的存在指示所述受試者形成晚期發作阿爾茨海默氏病的風險升高。
74.權利要求73的試劑盒，其中所述至少一種試劑和所述用法說明包裝在一個容器中。
75.權利要求73或權利要求74的試劑盒，其中所述DIP是插入多態性。
76.權利要求73或權利要求74的試劑盒，其中所述DIP是poly-T刪除/插入多態性。
77.權利要求73或權利要求74的試劑盒，其中所述DIP是rsl0524523、rsl06023^或 DIP3。
78.權利要求73或權利要求74的試劑盒，其中所述DIP是rsl0524523。
79.權利要求73-78任一項的試劑盒，其中所述確定步驟進一步包括檢測所述受試者是否是 Apo E2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4 或 E4/E4 受試者。
80.一種用于確定受試者是否會對用活性劑治療感興趣疾患有響應的試劑盒，其中所述感興趣疾患與ApoE和/或T0MM40有關，所述試劑盒包括(A)至少一種特異性檢測ApoE3,ApoE 4和/或ApoE 2的試劑，其中所述試劑選自下組選擇性結合ApoE同等型的抗體，和選擇性結合編碼ApoE等位基因的DNA的寡核苷酸探針；(B)至少一種特異性檢測位于T0MM40基因內含子6或內含子9中的至少一種T0MM40 刪除/插入多態性(DIP)的存在或缺失的試劑；和(C)通過下述步驟確定受試者是否會對用所述感興趣活性劑治療所述感興趣疾患有響應的用法說明，(i)用所述至少一種試劑在所述受試者中檢測ApoE3、ApoE4和/或ApoE 2同等型的存在或缺失；(ii)檢測位于T0MM40基因內含子6或內含子9中的至少一種T0MM40刪除/插入多態性(DIP)的存在或缺失；并(iii)通過觀察用所述至少一種試劑是否檢測到ApoE3,ApoE 4和/或ApoE 2同等型及所述T0MM40DIP的存在來確定受試者是否會對治療有響應，其中ApoE 3、ApoE 4和/或 ApoE 2及所述T0MM40DIP的存在指示所述受試者會對用所述活性劑的所述治療有響應。
81.權利要求80的試劑盒，其中所述至少一種試劑和所述用法說明包裝在一個容器中。
82.權利要求80或權利要求81的試劑盒，其中所述DIP是插入多態性。
83.權利要求80或權利要求81的試劑盒，其中所述DIP是poly-T刪除/插入多態性。
84.權利要求80或權利要求81的試劑盒，其中所述DIP是rsl0524523、rsl06023^或 DIP3。
85.權利要求80或權利要求81的試劑盒，其中所述DIP是rsl0524523。
86.權利要求80-85任一項的試劑盒，其中所述確定步驟進一步包括檢測所述受試者是否是 Apo E2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4 或 E4/E4 受試者。
全文摘要
本文中提供的是一種用于鑒定與感興趣疾患(例如阿爾茨海默氏病)形成有關的遺傳變體的方法及如此鑒定的遺傳變體。還提供了在檢測到本文中所描述的遺傳變體后，用活性劑(例如用特定活性劑和/或在較早的年齡)治療的方法。在一些實施方案中，所述遺傳變體是TOMM40基因的刪除/插入多態性(DIP)。還提供了用于確定受試者是否處于晚期發作阿爾茨海默氏病形成風險升高的試劑盒。進一步提供了用于確定受試者是否會對用活性劑治療感興趣疾患有響應的試劑盒。
文檔編號G01N33/48GK102177436SQ200980140279
公開日2011年9月7日 申請日期2009年8月11日 優先權日2008年8月12日
發明者艾倫·D·羅塞斯 申請人:金帆德爾制藥股份有限公司