專利名稱：篩選高親和力抗體的方法
篩選高親和力抗體的方法本發明報告了基于抗體的熱力學參數確定高親和力抗體的方法，特別是基于過渡 態的熱力學評估結合熵，例如標準締合結合熵(associationbinding entropy, AS°|aSS )
和在抗原結合步驟過程中的熵負荷。
背景技術：
產生具有卓越的抗原特異性和超乎尋常的抗原復合體穩定性的高親和力抗體是 診斷和治療抗體開發的主要目標。關于蛋白質-蛋白質相互作用的熱力學分析，最常用的技術是量熱法測定 (Chaires, J. B. , Annu. Rev. Biophys. 37(2008) 135-51 ；Perozzo, R.等 人’ J. Recept. Signal Transduct. Res. 24(1-2) (2004) 1-52 ；Li, L.等 A, Chem. Biol. Drug Des. 71(6) (2008)529-32 ；Liang, Y.，Acta Biochim. Biophys. Sin. (Shanghai)40(7)(2008)565-76 ； Thielges，M. C.等人，Biochemistry 47 (27) (2008) 7237-47)。反應量熱確定所需的樣品量 高，例如至少125μ g/ml的抗體濃度和至少150 μ 1的樣品體積。此外，反應量熱法需要高 的樣品純度且不耐受任何樣品雜質或樣品異質性，樣品緩沖液直接影響獲得的熱力學參數 的結果。反應量熱法僅能夠解析平衡熱力學。表面等離振子共振(SPR)儀器測量(Roos, H.等人，J. Mol. Recognit. 11(1-6) (1998) 204-10 ；Van Regenmorte 1, Μ. H.等人，J. Mol. Recognit. 11 (1-6) (1998) 163-7 ； Gunnarsson, K. , Curr. Protoc. Immunol, 第 18 章，(2001)Unit 18. 6 ；Drake, Α. W.等 人，Anal. Biochem. 328 (1) (2004) 35-43 ；Kikuchi, Y.等人，J. Biosci. Bioeng. 100 (3)
(2005)311-7)允許以高通量方式快速測定溫度依賴性動力學譜(參見例如，Canziani, G.A.等人，Anal. Biochem. 325(2) (2004)301-7 ；Safsten, P.等人，Anal. Biochem. 353(2)
(2006)181-190 ；Leonard, P.等人，J. Immunol. Methods 323 (2) (2007) 172-9)。ffassaf. D.等人(Anal. Biochem. 351 (2006) 241-253)報道了利用表面等離振子共 振微陣列高通量親和排列抗體。Roos, H.等人，J. Mol. Recognit. 11 (1998) 204-210中報道 了利用生物傳感技術進行蛋白質相互作用的熱力學分析。發明概述本發明提供了利用溫度不依賴性抗原復合體穩定性選擇高親和力抗體的方法，特 征是焓驅動的抗原締合，負的熵負荷和在抗原解離過程中大的熵改變。本發明的第一個方面是從結合抗原的多個抗體中選擇抗體的方法，所述方法包括 下列步驟-基于抗原的分子量優化表面等離振子共振測定中的信號應答，從而在測定的溫 度范圍內保持Rmax值恒定，-實施動力學篩選步驟，包括根據通式(I)基于表面等離振子共振測定計算抗原 復合體穩定性(I)抗原復合體穩定性=(I"[BL (RU)-SL (RU)/BL (RU)])BL表示設置在抗原注射終點不久前的結合晚期(Binding Late)參照點，SL表示 設置在復合體解離期終點不久前的穩定性晚期(lability Late)參照點，
-選擇具有大于95%復合體穩定性的抗體，-在171、211、251、291、331和37°C，通過表面等離振子共振確定溫度依賴性 動力學數據，-計算過渡態熱力學性質，-基于溫度依賴性增加的抗原復合體締合速率常數Ka[l/Ms]，以及保留的或降低 的抗原復合體解離速率常數kd[l/s]選擇抗體。在該方面的一個實施方案中，-基于表面等離振子共振測定和利用熱力學篩選計算所述抗體的熱力學性質，來 產生溫度依賴性動力學數據，所述熱力學篩選是在17°C用107nM、在21°C用78nM、在25°C用 70nM、在用64nM、在33°C用58nM和在37°C用53nM的抗體濃度來實施的，和/或-熱力學性質是焓驅動的AHc^ass抗原復合體締合期和低于10J/K女mol的結合 熵 AS。Jass^ / 或-用解離期選擇抗體，所述解離期表現出負的或接近零的解離活化能 (EadiSS[kJ/mol])、負的解離焓(AIPtdiSS [kj/mol])和大的負解離熵(ASIdisS [kj/ mol])ο本發明的一個方面是生產抗體的方法，包括下列步驟a)提供多個細胞，優選是雜交瘤細胞或B細胞，每種細胞都表達抗體，b)在不同的溫度和不同的抗體濃度下，通過表面等離振子共振確定所述抗體與各 抗原結合的時間依賴量，c)基于等式(II)至(XIII)，(II)AG° = ΔΗ° _T*AS°(III) AG° =-R*T*lnKD(IV)InK11 =-1/T*( Δ H。/R)/斜率-(Δ S。/R)/截距(V)R*T*lnKD = ΔΗ° T0_T*AS° T0+AC° p (T-T0)—Τ* Δ Cp° 1η(Τ/Τ0)(VI) ka =。禪町)(VII) lnka/T = -1/T * (ΔΗ。$/Ε)/斜率 ++ lnkb/Α)織距(VIII) ka = A*e-WK*T(IX) Inka = InA/ 截距-(l/I^Ea/R) / 斜率(χ) Icd = (kb*T/A)*e(-·。揮町)(XI) lnkd/Τ = -1/T * (AH。$/R)/斜率 + (ASI/R + InkeZA)/截距(XII) kd = A*e-WK*T(XIII) Inkd = InA/ 截距-(l/I^Ea/R) / 斜率用b)中確定的時間依賴量至少計算熱力學參數⑴標準締合結合熵(AS0Iass),(ii)標準解離結合熵(AS0Idiss)，(iii)標準結合熵(AS° )，(iv)自由(free)標準結合焓(AG° )，
(ν)標準解離自由結合焓(AG0Idiss)，(Vi)標準締合自由結合焓(AG0Iass),(vii)-T Δ S。，(viii)解離速率常數kd，(ix)平衡結合常數KD，和(χ)締合速率常數Ka，d)選擇生產這樣的抗體的細胞，所述抗體具有至少兩種下列的i)低于10J/K * mol的標準締合結合熵，ii)100J/mol * K或更高的絕對標準解離結合熵，iii)100J/mol * K或更高的絕對標準結合熵，e)在適合所述抗體表達的條件下，通過培養所述選定的細胞生產抗體，并從細胞 和/或培養基中回收所述抗體。在一個實施方案中，方法包括一個或多個下列額外的步驟-在a)之后和b)之前al)培養a)的細胞，并提供培養上清液，所述培養上清液 分別含有由所述細胞表達的抗體，-在d)之后和步驟e)之前dl)從所述選定的細胞中分離編碼所述抗體的核酸， 基于所述分離的核酸提供另一種核酸，所述另一種核酸編碼所述抗體的嵌合的、CDR移植 的、T細胞表位缺失的和/或人源化的變體，提供在表達盒中含有所述修飾的核酸的表達質 粒，和用所述表達質粒轉染CHO細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞或PER. C6細胞。本發明的另一個方面是用于從多個抗體中選擇溫度不依賴性抗原結合抗體的方 法，例如，用于治療性處理，從而用低于10J/K * mol的標準締合結合熵(AS0Iass)選擇抗 體。在該方面的一個實施方案中，用至少下列2種選擇抗體a)低于10J/K * mol的標準締合結合熵(AS°|aSS ),b) I00j/mol * κ或更高的絕對標準解離結合熵(AS°|diss)，c)100J/mol * K或更高的絕對標準結合熵(AS° )。在根據本發明的方法的一個實施方案中，標準締合結合熵(AS0Iass)低于5J/K 女mol。在另一個實施方案中，標準締合結合熵(AS0Iass )低于0J/K rnol。在另一個實 施方案中，絕對標準解離結合熵(ASIdiss )是125J/mol * K或更高。在另一個實施方案 中，絕對標準解離結合熵(ASc5IcUss )是I50j/mol * κ或更高。在另一個實施方案中，絕 對標準結合熵)是125J/mol * K或更高。在另一個實施方案中，絕對標準結合熵 (AS° )是 150J/mol * K 或更高。在本發明的一個實施方案中，方法的特征是用-50kJ/mol或更低的自由標準結合 焓)選擇抗體。在另一個實施方案中，本發明方法的特征是用標準解離自由結合焓 (AG0Idiss)比標準締合自由結合焓(AGIass)的比例來選擇抗體，所述比例大于2. 3。 在另一個實施方案中，方法的特征是用以下的-τ △ S。值選擇抗體
a) -80k J/mo 1 或更低，或b)+40kj/mol 或更高。本發明的另一個方面是用于從多個抗體中選擇溫度不依賴性抗原結合抗體的方 法，例如用于藥物組合物，包括這樣的步驟，所述步驟是用隨著溫度增加而保持在相同數量 級，或降低至多兩個數量級的解離速率常數kd(l/s)選擇抗體。本發明的另一個方面是用于從多個抗體中選擇溫度不依賴性抗原結合抗體的方 法，例如用于藥物組合物，包括這樣的步驟，所述步驟是用隨著溫度增加而保持恒定或降低 的平衡結合常數kD (M)選擇抗體。在根據本發明的方法的一個實施方案中，溫度范圍是從13°C至37°C。本發明的另一個方面是用于從多個抗體中選擇溫度不依賴性抗原結合抗體的方 法，例如用于藥物組合物，包括步驟i)確定溫度-依賴性動力學數據，ii)計算過渡態(TS)熱力學性質，和iii)基于熱力學行為選擇抗體。在根據本發明的方法的一個實施方案中，特征是所述熱力學行為是溫度依賴性 增加的抗原復合體締合速率常數ka[l/Ms]，和保持的或降低的抗原復合體解離速率常數 kd[i/s]。在另一個實施方案中，所述熱力學行為是焓驅動的AHc^ass抗原復合體締合期， 和低于ioj/κ女mol的結合熵ASc^asso在另一個實施方案中，用解離期選擇抗體，所述解 離期表現出負的或接近零的解離活化能(EadiSS[kJ/mol])、負的解離焓(AHIdiSS [kj/ mol])和大的負解離熵([kj/mol])。在另一個實施方案中，通過表面等離振子共振確定溫度依賴性動力學數據，并包 括動力學篩選步驟和熱力學篩選步驟。在一個實施方案中，所述動力學篩選步驟包括基于 表面等離振子共振測定根據通式(I)計算抗原復合體穩定性(I)抗原復合體穩定性=(I"[BL (RU)-SL (RU)/BL (RU)])BL表示設置在抗原注射終點不久前的結合晚期參照點，SL表示設置在復合體解 離期終點不久前的穩定性晚期參照點。在另一個實施方案中，方法包括基于抗原的分子量 優化表面等離振子共振測定中的信號應答的步驟，從而在測定的溫度范圍內保持ILx值恒定。在根據本發明的方法的一個實施方案中，特征是所述通過表面等離振子共振測定 包括下列步驟a)通過結合在固體支持表面上的捕獲分子將抗體固定在所述固體支持表面上，b)提供包含抗原的溶液，c)將含有已知濃度的抗原的溶液流經固體支持表面，從而允許抗原與固定化抗體 的締合，d)將不含抗原的溶液流經固體支持表面，從而允許抗原從固定化抗體上解離，e)在步驟C)和d)的過程中監控與固體支持表面結合的抗原的時間依賴量，并收 集結合數據，其中用不同濃度的抗原重復步驟c)和d)至少1次，和f)通過將e)中獲得的結合數據擬合到預定模型中，計算動力學和/或熱力學參 數，所述預定模型是基于等式(II)至(XIII)用于抗原和固定化抗體之間相互作用的模型。
在一個實施方案中，所述抗體的固定通過物種特異性抗體捕獲分子進行。本發明的一個方面是藥物組合物，所述組合物包含用本發明的方法生產的抗體在一個實施方案中，通過選擇具有大于95%的復合體穩定性的抗體，來實施動力 學篩選中的抗體選擇。在另一個實施方案中，基于抗原的分子量優化抗原信號應答。本發明的另一個方面是通過表面等離振子共振選擇抗體的方法，其中產生溫度依 賴性動力學數據從而計算過渡態(TS)的熱力學性質，并基于熱力學行為來選擇抗體，其中 所述溫度依賴性動力學數據的產生是基于表面等離振子共振測定和利用熱力學篩選進行 的所述抗體的熱力學性質計算，所述熱力學篩選是在17°c用107nM、在21°C用78nM、在25°C 用70nM、在29°C用64nM、在33°C用58nM和在37°C用53nM的抗體濃度來實施的。發明詳述本發明報告了選擇與抗原結合的抗體的方法，特征是產生溫度依賴性的動力學數 據從而計算過渡態(TS)的熱力學性質，和基于熱力學行為選擇抗體。已發現基于表面等離振子共振的動力學方法比傳統的量熱法測定有若干優勢-能夠進行高通量處理，_低樣品消耗，-測量親和力(affinity)取代親合力(avidity)，和-使用粗制的細胞上清液或復雜的培養混合物。表面等離子生物傳感表面是親和力基質，用于例如從細胞培養上清液中捕獲抗 體。因此，可以使用粗制的和復雜的混合物作為樣品。由于相互作用的搭檔之一固定在傳感 器的表面上，而將第二種化合物注射到流動系統中，因此能夠測量平衡和過渡態的熱力學， 因為FIA(流動注射分析)系統可以獨立的監控復合體的締合和解離期。利用該技術，能夠 計算熱力學參數-自由標準結合焓ΔG。，-標準結合焓ΔΗ°，-標準結合熵AS°，和過渡態參數-自由標準締合焓AG0Iass,
-標準締合焓 AHQ:j:ass,-標準締合熵AS0Iass,-活化能Eaass，-自由標準解離能AGIdiss,-標準解離焓AHIdiss,-標準解離熵ASIdiss^-解離能Eadiss。在使用非線性范特霍夫等式(van，t Hoff equation)的情況下，確定ACp值。本發明的一個方面是基于其熱力學特征選擇抗體的方法。通常，基于SPR的動力學抗體篩選(參見例如，Steukers, M.等人，J. Immunol. Methods 310 (1-2) (2006) 126-35 ；Rich, R. L.等人，Anal. Biochem. 361 (1) (2007) 1-6)后續 第二個步驟為更高解析度的熱力學sra分析。
利用本發明方法可以選擇抗體，所述抗體在升高的溫度下具有至少恒定的或增加 的親和力，即在升高的溫度下至少恒定或增加的抗原復合體穩定性。抗原復合體穩定性是 抗體篩選工藝中的主要選擇標準。僅選擇原代細胞培養物，所述培養物生產分別在25°c或 37°C下具有高穩定性抗原復合體的抗體。產生生產抗體的細胞培養物，并在一個實施方案中進行高通量分析，其中為了計 算過渡態(TS)的熱力學性質，產生溫度依賴性的動力學數據。根據本發明方法，基于其熱 力學行為進行抗體選擇。在該方面的一個實施方案中，選定的抗體的特征是溫度依賴性增加的抗原復合體 締合速率常數Ka[l/Ms]，以及保持的或降低的抗原復合體解離速率常數kd[l/s]。此類抗體 通常特征是焓驅動的AHIass抗原復合體締合期和負的結合熵ASIass，其在本申請中 表示“熵負荷”。用本發明方法選定的抗體的特征是抗原相互作用機制，表現為在結合平衡 中大的熵改變。該熵貢獻(entropic contribution)來自抗體-抗原復合體解離步驟，其 中發生了解離熵ASc^diss的大的正改變和大的負改變。此外，用本發明方法選定的抗體可 以具有源自抗原解離期的熱力學異常，其中在升高的溫度下解離速率常數kd[l/s]令人驚 訝的和預料之外的降低。此類抗體的特征由熱力學參數表征，例如i)表現出負的或接近零 的解離活化能EadiSS [kj/mol]的解離期，ii)負的解離焓AHc^diSS [kj/mol]，和iii)大 的負解離熵ASc^diss [kj/mol]。需要指出的是這是該效應的完全理論的處理。因此，本發明的方法允許基于熱力學參數從大量的高親和力抗體中選擇抗體，所 述參數提供了選定的抗體與抗原的相互作用模式的基礎，即，抗體誘導抗原的構象改變或 抗體本身經歷了構象改變。因此，方法可用于選擇生產具有高的抗原復合體穩定性的抗體 的 細胞。在一個實施方案中，本發明的方法包括動力學篩選步驟和熱力學篩選步驟。對于 動力學篩選，在抗原注射終點不久前設置結合晚期(BL)參照點，在復合體解離期終點不久 前設置穩定性晚期(SL)參照點。在一個實施方案中，用X-Y-點示BL和SL數據，X軸 顯示結合晚期參照點的應答單位(RU)值，Y軸以應答單位(RU)顯示穩定性晚期參照點的 值(示例性的點圖參見
圖1)。此外，基于BL和SL數據，可以根據通式(I)計算抗原復合體 穩定性抗原復合體穩定性=(1-[BL(RU)-SL (RU)/BL (RU)]) (I)在另一個實施方案中，是通過X-Y點示了 BL和抗原復合體穩定性數據，X軸 以應答單位(RU)顯示結合晚期參照點的值，Y軸顯示針對復合體穩定性的百分比值(示例 性的點圖參見圖2)。在一個實施方案中，在25°C實施動力學篩選步驟。在另一個實施方案 中，在37°C實施動力學篩選步驟。在另一個實施方案中，在13°C和42°C之間的一組兩個或 多個不同的溫度實施動力學篩選步驟。在熱力學篩選之前，在一個實施方案中，使用RPMI 1640培養基在100ml旋轉培養 瓶中培養單細胞保藏的克隆。在另一個實施方案中，在熱力學篩選之前，通過蛋白A瓊脂糖 (TM)柱色譜，從上清液中純化抗體。在一個實施方案中，用于熱力學篩選的系統緩沖液是 HBS-EP0在另一個實施方案中，樣品緩沖液添加了 lmg/ml羧甲基葡聚糖，以降低非特異性 的傳感基質效應。下文可以以抗人PTH抗體的分析作為一個實例，描述本發明的方法。該實例不需理解為對本發明方法的限制，其實際上是為了示例本發明方法的教導而存在的。本申請的 范圍敘述在權利要求中。在第一步中，實施雜交瘤上清液的動力學篩選。圖1示意了來自549雜交瘤原代 培養物經過多次免疫和融合行動的結合晚期數據和穩定性晚期數據。選擇具有充分的抗原 應答(BL)和緩慢的抗原復合體解離(SL)的雜交瘤細胞用于進一步的篩選步驟。例如，使 用編號123、119、499、133和295的細胞進行后續處理(參見圖1中的圓圈)，由于不充分的 復合體穩定性拋棄了編號189、263和341的細胞(參見圖1中 的方框)。為了便于鑒別具有高抗原應答和高復合體穩定性的抗體，可以使用圖表，在所述 圖表中，以]表示的獲得的復合體穩定性相對于結合晚期應答信號繪制(參見例如圖 2)。在一個實施方案中，對于動力學篩選中的抗體選擇，選擇具有95%或更高的復合體穩定 性的高抗原復合體穩定性結合子。使用基于SPR的測量的大部分出版物不使用抗體捕獲系統作為傳感器表面呈遞 技術。通常，抗體或其片段共價的固定在傳感器上。該技術不可以高通量形式使用，因為表 面不適合多目的的抗體呈遞，除了其技術上受配體固定的傳感器數目限制以外。如果使用捕獲系統進行熱力學測量，抗體捕獲水平隨動力學的溫度靈敏度而改變 (參見圖15)。為了使用用于熱力學的抗體捕獲系統，絕對需要保證同質的、溫度不依賴性 的抗體捕獲水平。在低溫下，熱力學測量有兩個主要的問題。第一，在低溫下，抗體捕獲系統的動力 學太緩慢而不能捕獲足夠的二級抗體進行分析。第二，抗原_抗體相互作用的動力學也減 慢。動力學顯示，由于在4°C和irC的緩慢的動力學導致強烈的損失了測定解析度。在完 整的溫度范圍內未能實現任何平衡。在溫度梯度中，Rmax值小且非同質的。隨著增加溫度， 由于二級抗體更快的締合速率，捕獲的mAb的量同步增加。隨著增加溫度，抗原動力學也 加速，且抗原Rmax值增加。由于未達到任何平衡，故這些測定的Rmax值更確切的是試錯的 (error-prone) 0非同質的傳感器性能導致熱力學計算的高誤差。計算的參數都不能達到 95%顯著性。因此，需要優化實驗使用的溫度梯度以及傳感器表面的制備。已發現，主要通過 抗體捕獲系統的溫度依賴性滴度，利用優化的溫度梯度和調試的注射時間，來優化傳感器 的性能，使得在完整的運行過程中Rmax值是恒定的。圖15中比較了結果。Rmax平均值是 35RU+/-3RU。在> 30°C的溫度下達到平衡。本文使用的最低溫度是15°C。表1比較了 關于平衡的(線性范特霍夫)、締合期的(Eyring和Arrhenius)和解離期的(Eyring和 Arrhenius)熱力學參數計算，利用傳統測定與優化測定進行比較。表1 在非優化和優化形式中相互作用的熱力學
權利要求
1.從多個抗體中選擇抗體的方法，所述方法包括下列步驟-基于抗原的分子量優化表面等離振子共振測定中的信號應答，從而在測定的溫度范 圍內保持Rmax值恒定，-實施動力學篩選步驟，包括基于表面等離振子共振測定根據通式(I)計算抗原復合 體穩定性(I)抗原復合體穩定性=(I"[BL (RU)-SL (RU)/BL (RU)])BL表示設置在抗原注射終點不久前的結合晚期參照點，SL表示設置在復合體解離期 終點不久前的穩定性晚期參照點，-選擇具有大于95%復合體穩定性的抗體，-在171、211、251、291、331和37°C，通過表面等離振子共振確定溫度依賴性動力 學數據，-基于等式(II)至(XIII)，計算過渡態熱力學性質，-基于溫度依賴性增加的抗原復合體締合速率常數Ka[l/Ms]，以及保持的或降低的抗 原復合體解離速率常數kd[l/s]選擇抗體。
2.權利要求1的方法，特征是-所述熱力學性質是焓驅動的AHc^ass抗原復合體締合期和低于10J/K * mol的結合 熵 AS。Jass^ / 或-用解離期選擇抗體，所述解離期表現出負的或接近零的解離活化能(fedissDa/ mol])、負的解離焓(AH。|diss [kj/mol])和大的負解離熵(AS。|diss [kj/mol])。
3.用于從多個抗體中選擇溫度不依賴性抗原結合抗體的方法，例如，用于治療性處理， 其中用低于10J/K女mol的標準締合結合熵(AS0Iass)選擇抗體。
4.權利要求3的方法，特征是用至少下列2種選擇抗體a)低于10J/K* mol的標準締合結合熵(AS°|aSS ),b)100J/mol * K或更高的絕對標準解離結合熵(AS0Idiss)， C) 100J/mol K或更高的絕對標準結合熵(Δ S° )。
5.權利要求3或4的方法，特征是標準締合結合熵(AS0Iass)低于5J/K * mol。
6.權利要求3-5的任一項的方法，特征是標準締合結合熵(AS0Iass)低于0J/K*mol ο
7.權利要求3-6的任一項的方法，特征是絕對標準解離結合熵(AS0Idiss)是125J/ mol -k K或更高。
8.權利要求3-7的任一項的方法，特征是絕對標準解離結合熵(AS0Idiss)是150J/ mol -k K或更高。
9.權利要求3-8的任一項的方法，特征是絕對標準結合熵(AS°)是125J/mol女K 或更高。
10.權利要求3-9的任一項的方法，特征是絕對標準結合熵(AS°)是150J/mol女K或更高。
11.權利要求3-10的任一項的方法，特征是用-50kJ/mol或更低的自由標準結合焓(AG0 )選擇抗體。
12.權利要求3-11的任一項的方法，特征是用標準解離自由結合焓(AG0Idiss)與標 準締合自由結合焓(AG0Iass)大于2. 3的比例來選擇抗體。
13.權利要求3-12的任一項的方法，特征是用以下的-TΔ S。值選擇抗體a)-80kJ/mol或更低，或b)+40kj/mol或更高。
14.用于從多個抗體中選擇溫度不依賴性抗原結合抗體的方法，包括用隨著溫度增加 而保持在相同數量級，或降低至多兩個數量級的解離速率常數kd(l/s)選擇抗體的步驟。
15.用于從多個抗體中選擇溫度不依賴性抗原結合抗體的方法，包括用隨著溫度增加 而保持恒定或降低的平衡結合常數kD(M)選擇抗體的步驟。
16.權利要求3-15的任一項的方法，特征是溫度范圍從13°C至37°C。
17.用于從多個抗體中選擇溫度不依賴性抗原結合抗體的方法，包括步驟i)確定溫度-依賴性動力學數據， )計算過渡態(化)熱力學性質，和iii)基于熱力學行為選擇抗體。
18.權利要求17的方法，特征是所述熱力學行為是溫度依賴性增加的抗原復合體締合 速率常數ka[l/Ms]，和保持的或降低的抗原復合體解離速率常數kd[l/s]。
19.權利要求17或18的方法，特征是所述熱力學行為是焓驅動的AHc^ass抗原復合 體締合期，和低于10J/K * mol的結合熵AS°:j:ass0
20.權利要求17-19的任一項的方法，特征是用解離期選擇抗體，所述解離期表現出負 的或接近零的解離活化能(EadiSS[kJ/mol])、負的解離焓(AHIdiSS [kj/mol])和大的 負解離熵(AS°|diss [kj/mol])。
21.權利要求3-20的任一項的方法，特征是通過表面等離振子共振確定溫度依賴性動 力學數據，并包括動力學篩選步驟和熱力學篩選步驟。
22.權利要求21的方法，特征是所述動力學篩選步驟包括基于表面等離振子共振測定 根據通式(I)計算抗原復合體穩定性(I)抗原復合體穩定性=(1-[BL(RU)-SL(RU)/BL(RU)]),BL表示設置在抗原注射終點不久前的結合晚期參照點，SL表示設置在復合體解離期 終點不久前的穩定性晚期參照點。
23.權利要求21或22的方法，特征是方法包括基于抗原的分子量優化表面等離振子共 振測定中的信號應答的步驟，從而在測定的溫度范圍內保持Rmax值恒定。
24.權利要求21-23的任一項的方法，特征是所述通過表面等離振子共振測定包括下 列步驟a)通過結合在固體支持表面上的捕獲分子將抗體固定在所述固體支持表面上，b)提供包含抗原的溶液，c)將含有已知濃度的抗原的溶液流經固體支持表面，從而允許抗原與固定化抗體的締合，d)將不含抗原的溶液流經固體支持表面，從而允許抗原從固定化抗體上解離，e)在步驟c)和d)的過程中監控與固體支持表面結合的抗原的時間依賴量，并收集結 合數據，其中用不同濃度的抗原重復步驟c)和d)至少1次，和f)通過將e)中獲得的結合數據擬合到預定模型中，計算動力學和/或熱力學參數，所 述預定模型基于等式(II)至(XIII)用于抗原和固定化抗體之間的相互作用。
25.權利要求對的方法，特征是通過物種特異性抗體捕獲分子固定所述抗體。
26.權利要求17-25的任一項的方法，特征是通過用大于95%的復合體穩定性選擇抗 體，來實施動力學篩選。
27.權利要求21-26的任一項的方法，特征是基于抗原的分子量優化抗原信號應答。
28.用于生產抗體的方法，包括下列步驟a)提供多個細胞，每種細胞都表達抗體，b)在不同的溫度和不同的抗體濃度下，通過表面等離振子共振確定與各抗原結合的所 述抗體的時間依賴量，c)基于等式(II)至(XIII)，(II)= ΔΗ° -T*AS°(III)AG° =-R*T*lnKD(IV)InK11= _1/Τ*( Δ H° /R)/斜率-(Δ S。/R)/截距(V)R*T*lnKD= ΔΗ° T0_T*AS° T0+AC° ρ (T-T0)-Τ* Δ Cp° 1η(Τ/Τ0)(VI)ka = (kb*T/A)*e(-AG°_*T)(VII)lnka/T = -1/Τ * (AH。J/R)/斜率 + (AB°i*R + InkbZA)/截距(VHDka = A*e-Ea/E*T(IX)Inka = InA/ 截距-(l/T*Ea/R) / 斜率(X)kd = (kb*m)*eWi/R*T)(XI)lnk/Γ = -1/Τ * (ΔΗΙ/R)/斜率 + (AS0JZR + Inke/A)/截距(XH)kd = A*e-Ea/E*T(XIII) Inkd = InA/ 截距-(1/I^Ea/R) / 斜率 用b)中確定的時間依賴量至少計算熱力學參數 ⑴標準締合結合熵(AS0Iass),(ii)標準解離結合熵(AS°:j:diss)，(iii)標準結合熵(as°)，(iv)自由標準結合焓(AG°)，(V)標準解離自由結合焓(AGQ|diss)，(vi)標準締合自由結合焓(AG0Iass),(vii)-TAS°，(viii)解離速率常數kd，(ix)平衡結合常數KD，和(x)締合速率常數Ka，d)選擇生產這樣的抗體的細胞，所述抗體具有至少兩種下列的i)低于10J/K女mol的標準締合結合熵，ii)100J/mol* K或更高的絕對標準解離結合熵，iii)100J/molK或更高的絕對標準結合熵，e)在適合所述抗體表達的條件下，通過培養所述選定的細胞生產抗體，并從細胞和/ 或培養基中回收所述抗體。
29.權利要求觀的方法，包括一個或多個下列額外的步驟-在a)之后和b)之前al)培養a)的細胞，并提供培養上清液，所述培養上清液分別 含有由所述細胞表達的抗體，-在d)之后和步驟e)之前dl)從所述選定的細胞中分離編碼所述抗體的核酸，基于 所述分離的核酸提供另一種核酸，所述另一種核酸編碼所述抗體的嵌合的、CDR移植的、T 細胞表位缺失的和/或人源化的變體，提供在表達盒中含有所述修飾的核酸的表達質粒， 和用所述表達質粒轉染CHO細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞或PER. C6 細胞。
30.藥物組合物，包含權利要求1- 的任一項的方法生產的抗體。
全文摘要
本發明報告了用于生產抗體的方法，包括步驟a)提供多個雜交瘤細胞，每種細胞都表達抗體，b)在不同的溫度和不同的抗體濃度下，通過表面等離振子共振確定所述抗體與各抗原結合的時間依賴量，c)基于等式(II)至(XIII)，用b)中確定的時間依賴量至少計算熱力學參數(i)標準締合結合熵式(A)，(ii)標準解離結合熵式(B)，(iii)標準結合熵(ΔS°)，(iv)自由標準結合焓(ΔG°)，(v)標準解離自由結合焓式(C)，(vi)標準締合自由結合焓式(D)，(vii)-TΔS°，(viii)解離速率常數kd，(ix)平衡結合常數KD，和(x)締合速率常數Ka，d)選擇生產這樣的抗體的雜交瘤細胞，所述抗體具有至少兩種下列的i)低于10J/K＊mol的標準締合結合熵，ii)100J/mol＊K或更高的絕對標準解離結合熵，iii)100J/mol＊K或更高的絕對標準結合熵，e)在適合所述抗體表達的條件下，通過培養所述選定的細胞生產抗體，并從細胞或/和培養基中回收所述抗體。
文檔編號G01N21/55GK102132143SQ200980133062
公開日2011年7月20日 申請日期2009年8月25日 優先權日2008年8月27日
發明者普羅夫 L·范, M·施拉伊姆爾 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司