通過蛋白質和dna劑可控組裝和解組裝的納米顆粒體系的制作方法

專利名稱：通過蛋白質和dna劑可控組裝和解組裝的納米顆粒體系的制作方法
技術領域：
本發明涉及利用肽、蛋白質和其它寡聚體提供一旦檢測到靶分子正常猝滅的納米顆粒熒光可能被恢復的一種方法或裝置。此外，本發明提供了無需在檢測之前標記靶分子即可進行靶分子檢測的結構和方法。
背景技術：
納米技術研究及其結果已用于許多不同的研究領域，并且應用于科學研究和工業技術，如納米電子器件、傳感器和催化劑。處于新領域的能源、醫療和安全相關的納米技術將依賴于基于納米顆粒技術和生物科學的整合和優化，從而設計用于越來越清潔和更高效的能量轉換和儲存的混合(雜交)材料，以及具有更強的靈敏度的生物傳感器。這樣的整合不僅需要精確控制納米顆粒尺寸、形狀、組成和表面特性，而且還需要在生物體系容許的條件下用受控動力學和最終組裝形態自組裝和解離納米顆粒的能力。目前，利用生物構件(building blocks)自組裝具有金屬(Au、Ag、Pt)、半導體 (Cc^e、CdS、ZnS、GaAS)、和磁性(狗203)特性的納米顆粒通過兩種主要途徑來實現(i)基于 DNA的體系和(ii)基于蛋白質_(肽_)的體系。DNA的顯著特異性和可設計的相互作用允許DNA結合的納米顆粒的自組裝和復雜結構的構建。它們的復雜性和功能可以通過并入起生物傳感器作用或起復雜支架的形成體(organizer)作用的蛋白質而擴展。基于DNA的自組裝體系已表現出作為生物傳感器的很大潛能。已證明肽與無機表面的特異性結合，并且通過利用噬菌體展示體系可選擇這些肽。而且，該肽已經成功地用于納米結構的構建和無機納米顆粒的自組裝。由于蛋白質的功能多樣性，基于DNA和蛋白質的系統的結合在設計功能性混合(雜交)納米材料方面受到相當大的關注。利用DNA的納米顆粒的自組裝和可設計的復雜結構已經被證明。DNA誘導的納米顆粒的自組裝首先在1996年由Mirkin及其同事在其〃 ADNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopicmaterials, " Nature, 382(6592) :p. 607—609，1996，禾口Alivisatos及其同事，〃 Organization of' nanocrystal molecules' using DNA, “ Nature，382 (6592) :p. 609-611，1996 的開創性論文中被介紹， 這兩篇文章都以引用的方式整體合并在此。DNA的特異性雜交能力用于納米顆粒的自組裝， 在納米顆粒上化學固定了單鏈DNA(ssDNA)。聚集通過加入與結合到所述顆粒的ssDNA互補的單鏈接頭DNA獲得。ssDNA結合的納米顆粒的聚集伴隨有物理和光學特性的變化，并用于檢測DNA。加入與接頭互補的DNA片段導致聚集物解離。可替換地，該體系可設計成待檢測的DNA片段充當該接頭。取決于序列和長度的DNA熔化特性使得可以通過提高溫度來逆轉聚集物的自組裝(圖1)。序列依賴性熔化特性允許利用ssDNA結合的納米顆粒檢測單點突變。設計用于在3’和5’端互補結合從而形成發夾結構的金納米顆粒猝滅的熒光寡核苷酸已用作分子信標，用于檢測與該發夾結構雜交的靶DNA，導致猝滅的熒光發射。微陣列技術常規地用于高通量量化大量不同的DNA或RNA片段。基于陣列的體系需要通過C-DNA的合成標記靶DNA或RNA。ssDNA-結合的納米顆粒已用作探測它們的靶分子的候選物。另外，DNA的特異性相互作用已用來創建DNA構件，和構造復雜幾何結構和形態的構件的組裝體。

發明內容
雖然上述體系需要互補DNA鏈的雜交作為正確組裝的前提，并且通過在升高的溫度下熔化DNA來實現解組裝(disassembly)，但是該過程通常將導致功能部分，如蛋白質的不可逆滅活。本發明的方法允許可控的組裝非互補單鏈DNA-(ssDNA-)結合的納米顆粒， 其利用基因5蛋白質(g5p)作為分子“膠合劑(glue)”結合到兩個反平行ssDNA鏈。顆粒聚集體的組裝動力學的控制可以通過與互補ssDNA(C-ssDNA)的序列特異性雜交來獲得， 而聚集體的尺寸通過調節g5p的濃度來控制。g5p-ssDNA復合物的可控的解組裝可通過與 C-ssDNA的雜交來引發，其允許調節組裝動力學和顆粒聚集體在室溫或生理溫度下有效分解。另外，g5p蛋白允許構建功能性重組衍生物，該衍生物含有聚組氨酸或允許這些蛋白質特異地結合到納米顆粒表面的其它親和標簽。這允許無需熱處理即可控制納米顆粒的組裝和解組裝，并容易地將蛋白質并入到基于DNA的納米結構中，賦予設計成復合納米材料的潛能。本發明涉及利用肽、蛋白質和其它寡聚體提供一旦檢測到靶分子正常猝滅的納米顆粒熒光可能被恢復的方法或裝置。此外，本發明的技術提供了無需在檢測前標記靶分子即可進行靶分子的檢測的結構和方法。另一方面，描述了用于形成任意形狀的二維和三維蛋白質介導的納米顆粒結構的方法和所得的結構。蛋白質介導的結構形成自身可以利用多種有用部分來功能化。在本發明的一些實施方式中，提供了利用g5p蛋白或類似DNA結合蛋白的可控和可逆納米顆粒組裝體。在一些變型中，該納米顆粒被包裹(encapsulated)在DNA和/或 RNA中，并且該納米顆粒與核苷酸結合蛋白組裝。在其它變型中，該納米顆粒被核苷酸結合蛋白包裹，并且該納米顆粒與DNA和/或RNA組裝。一些實施方式提供了多維結構，其包含單鏈DNA和/或RNA的分枝、核苷酸結合蛋白和納米顆粒。本發明的一些實施方式也提供了利用核苷酸結合蛋白來制備納米顆粒的可控和可逆組裝體的方法或工藝。本發明的其它實施方式提供了核酸結合蛋白介導的DNA裝配體(assemblage)，其包含結合到核苷酸結合蛋白上的非互補DNA或RNA鏈。本發明的其它實施方式提供了分子開關，其包含熒光猝滅的“關斷”位置和熒光發射的“開啟”位置，包含結合到熒光素上的ssDNA和結合到DABCYL上的第二 ssDNA。該開關可通過使互補ssDNA或ssRNA與熒光素-ssDNA鏈或ssDNA-DABCYL鏈雜交而被“開啟”。


圖1示出了 ssDNA-結合的納米顆粒的自組裝和解組裝的現有技術方法。圖2圖示了可控的g5p_介導的組裝和解組裝技術。圖3圖示了 ssDNA介導的g5p結合的納米顆粒的組裝和解組裝的示意圖。圖4示出了 g5p_介導的分子開關的運行。圖5示出了有序的肽結合的g5p和DNA納米顆粒的自組裝。圖6A和圖6B示出了電泳遷移率測定的結果。圖7A、7B和7C是來自g5p-介導的ssDNA-結合的金顆粒的組裝數據。圖8A和8B示出了 ssDNA-結合的金顆粒的動態光散射和紫外可見光分析的結果。圖9A和9B分別示出了 g5p蛋白介導的ssDNA-結合的金顆粒組裝的示意圖，以及這樣的組裝的流體力學直徑值的變化。圖10AU0B和IOC圖示了 g5p-介導的ssDNA-結合的金顆粒聚集體的分解。圖11示出了 C-ssDNA的加入對金顆粒聚集體的影響。
具體實施例方式與DNA相反，蛋白質不僅具有特異結合特性，而且還具有豐富的催化功能特性。蛋白質和肽的相互作用已用于納米顆粒的自組裝和有序化(ordering)。對無機化合物(金屬、半導體和磁性化合物)有特異性的肽已利用肽文庫進行選擇，并已成功用于無機納米顆粒的自組裝和生物礦化。注意到肽與無機表面之間的特定相互作用，本發明人認為無機納米顆粒可通過蛋白質的基因工程與蛋白質連接從而顯示肽。基于DNA和蛋白質的體系的結合因擴展了它們作為生物傳感器或復雜支架形成體的應用而引人注意。生物素結合的DNA已通過結合到可使該生物素結合的DNA交聯的鏈霉親和素上而用作組裝的構件。抗體已用于蛋白質輔助的DNA-結合的納米顆粒的自組裝， 該納米顆粒含有抗體的靶分子。盡管在利用DNA和蛋白質構建納米級材料方面具有這些進展，但是仍有許多限制和技術障礙。DNA需要用于期望雜交的適宜條件。DNA雜交存在固有限制，如G-C含量、鹽濃度和溫度。當均質時，僅通過控制組裝體的動力學和尺寸，組成結構中的蛋白質分配允許整個結構具有相同的官能度。在DNA-雜交誘導的ssDNA結合的納米顆粒的自組裝期間，很難在不化學修飾寡核苷酸，例如，生物素酰化的情況下引入蛋白質，從而結合蛋白質。增加的溫度可以誘導生物分子，尤其是蛋白質的不可逆滅活。由DNA雜交形成的聚集體的解組裝需要將溫度提高到熔解溫度以上，通常為約55°C以上，其可引起待用于生物環境中的體系的限制。為了利用基于陣列的體系檢測靶分子(DNA，RNA)，標記是關鍵的、昂貴的和耗時的步驟。靶分子的標記需要另外的時間用于樣品制備、限制快速檢測或診斷生物分子。利用基因5蛋白質(g5p)作為結合兩個反平行非互補單鏈DNA(ssDNA)的分子“膠合劑”，克服了通過結合DNA和上述蛋白質制造納米級材料的許多限制。也可利用與互補 ssDNA (C-ssDNA)的另外雜交，其引發g5p_ssDNA復合物解離。本發明的一個方面提供了可控和可逆納米顆粒的組裝體和制備它的方法。 在本發明的一些實施方式中，該納米顆粒是金屬的。在優選的實施方式中，該金屬是金、銀或鉬。在更優選的實施方式中，該納米顆粒是金。在其它實施方式中，該納米顆粒是半導體。在一些變型中，該半導體是硒化鎘、硫化鎘、硫化鋅，或砷化鎵。在其它實施方式中，該納米顆粒是磁性的。在一些變型中，該磁性納米顆粒包含鐵氧化物。在納米顆粒組裝體的一些實施方式中，該DNA和/或RNA是單鏈或雙鏈的。在優選的實施方式中，該DNA是單鏈的。在一些實施方式中，該核苷酸結合蛋白是可以結合于DNA或RNA的任何蛋白質。在優選的實施方式中，該核苷酸結合蛋白是基因5蛋白(g5p)。在一些實施方式中，提供了使用g5p蛋白或類似DNA結合蛋白的可控和可逆的納米顆粒組裝體。在一些實施方式中，該可控和可逆納米顆粒組裝體包含用非互補DNA和/或RNA 包裹的納米顆粒。在優選的實施方式中，用非互補DNA和/或RNA包裹的納米顆粒通過核苷酸結合蛋白結合在一起，從而形成納米顆粒組裝體。以這種方式，形成了可控和可逆的納米顆粒組裝體。在可控和可逆的納米顆粒組裝體的另外的實施方式中，通過進一步使該納米顆粒組裝體和與非互補DNA和/或RNA互補的DNA和/或RNA結合而使該納米顆粒組裝體解組裝。以這種方式，實現可控和可逆的納米顆粒解組裝。本發明的方法提供了利用g5p蛋白或類似DNA結合蛋白的可控非互補ssDNA-結合的納米顆粒組裝體。在組裝階段與低濃度C-ssDNA雜交可用來調節組裝動力學。另外， 在室溫(圖2、或生理溫度下已利用C-ssDNA實現顆粒聚集體的有效分解。該途徑使得無需熱處理即可控制納米顆粒組裝和解組裝，以及容易使例如含有親和標簽或另外的催化結構域的基于g5p的混合(雜交)蛋白并入到基于DNA的納米結構中，賦予設計復合納米材料的潛能。在該方法的一些實施方式中，可控納米顆粒組裝和解組裝過程通過如下步驟制備用DNA和/或RNA包裹納米顆粒，使包裹的納米顆粒與核苷酸結合蛋白結合，以及使該 DNA和/或RNA結合到該核苷酸結合蛋白上。以這種方式，制備了可控納米顆粒組裝過程。在該方法的一些變型中，通過進一步使該納米顆粒組裝體和與非互補DNA和/或 RNA互補的核苷酸結合，使該納米顆粒的組裝體解組裝。以這種方式，實現可控的納米顆粒解組裝過程。在該方法的一些實施方式中，納米顆粒組裝體通過如下來制備用非互補ssDNA 功能化多個納米顆粒，將該功能化的納米顆粒暴露于基因5蛋白，以及使ssDNA的至少兩條鏈與g5p相連。為了獲得納米顆粒響應于靶DNA的進一步敏感的組裝和解組裝，本發明考慮了使用g5p結合的納米顆粒，其可通過非互補ssDNA橋連和通過感測它的互補ssDNA而解離(圖 3)。聚組氨酸標記的g5p將固定在Ni-NTA結合的金納米顆粒上從而獲得定向的g5p，其中該DNA結合位點通過面向該納米顆粒的外圍方向而有活性。DNA的長度和形狀可影響該聚集體的尺寸或形態。這種DNA介導的g5p結合的納米顆粒的控制可以導致在生物條件下用于DNA的智能材料傳感器的設計。在一些實施方式中，納米顆粒的組裝體通過如下來制備用核苷酸結合蛋白功能化多個納米顆粒，將該功能化的納米顆粒與非互補DNA和/或RNA —起孵育，以及使該DNA 和/或RNA的至少兩條鏈與核苷酸結合蛋白連接。以這種方式，制備了納米顆粒的組裝體。
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為了獲得納米顆粒在多維上的精確自組裝，提出了結構化DNA和肽標記的g5p的復合物，其中該肽可以特異性結合到納米顆粒。通過結合到ssDNA區域上的g5p組織可以致使簡單構件形成DNA支架，而親和標簽可用于在該DNA支架上進一步有序化處理納米顆粒(圖5)。這種方法使得有可能設計復雜的非均質納米結構。在多維結構的一些變型中，DNA和納米顆粒-功能化g5p的多維結構包含具有多個ssDNA分枝的DNA結構、結合到g5p的肽，以及特異性結合到該肽的納米顆粒。在優選的實施方式中，該g5p結合到ssDNA上。以這種方式，形成DNA和納米顆粒-功能化g5p的復
合結構。在多維支架的一些變型中，該多維DNA支架包含在第一基因座通過C-ssDNA序列互相結合的ssDNA的兩條鏈(鏈1和2)、在第二基因座通過C-ssDNA序列互相結合的ssDNA 的兩條其它鏈(鏈3和4)、在第二基因座通過C-ssDNA序列互相結合的鏈2和鏈3，以及在結合的基因座之間一個或多個點處結合到ssDNA鏈中的至少兩條上的g5p。在多維支架的優選實施方式中，該多維支架進一步包含結合到g5p中的至少一個上的至少一種納米顆粒。在多維支架的更優選實施方式中，至少一種納米顆粒結合到DNA 的至少一個區域中。在一些實施方式中，目標在于改進DNA和蛋白質誘導的納米級材料和傳感器。在一些實施方式中，這可這樣實現使兩個反平行ssDNA通過g5p締合，以及使g5p通過互補 DNA或核酸的雜交從ssDNA中解離。在一些實施方式中，g5p_介導的DNA裝配體包含結合到核苷酸結合蛋白上的非互補DNA或RNA鏈。以這種方式，形成了裝配體。g5p被絲狀噬菌體編碼，其中它復合地結合到ssDNA上從而形成噬菌體顆粒組裝體的前體。在體外，g5p形成同型二聚體，其將非特異性地結合兩個反平行ssDNA，誘導具有8 9nm外徑的螺旋桿狀結構。結合每個g5p單體的核苷酸數目為2 4，并取決于結合條件，包括蛋白質與核苷酸的比率。g5p與ssDNA的結合親和力，約IO5至約ΙΟΙ1，取決于ssDNA序列和鹽濃度，優選結合到結構化DNA，如發夾和G-四鏈體。因而利用了用于 ssDNA-結合的納米顆粒的組裝和解組裝的g5p蛋白的DNA結合特性。為了研究g5p的不同結合特性及其優選的DNA拓撲結構，設計了具有三個不同區域的示例性DNA結構19個堿基配對的雙鏈DNA(dsDNA)區域，接著是32個核苷酸反平行聚-T ssDNA區域，和15個核苷酸的3，延伸的ssDNA尾部。用g5p (在IOmM iTris-HCl中， PH = 7. 4，200mM NaCl)滴定該DNA結構(1 μ M)，并利用電泳遷移率測定研究了 g5p結合。 觀察到三個不同的g5p結合階段，揭示其順序結合(sequential binding)(圖6A)。因為在高的鹽濃度下，g5p與dsDNA的親和力比其與ssDNA的親和力低很多，所以推測下面的占位順序結合到反平行ssDNA區域，其中在10 μ M g5p下DNA條帶遷移較大，接著結合到ssDNA 尾部，最后在g5p濃度大于35 μ M時結合到dsDNA上。因而，g5p在結合到dsDNA區域之前結合到ssDNA區域，并且它對反平行區域的結合親和力稍稍高于其對ssDNA尾部的結合親合力。為了研究g5p締合對形成dsDNA異源雙鏈體的影響，并證實提出的與ssDNA區域的結合順序，加入可與ssDNA尾部雜交的等量(lyM)C-ssDNA。在加入C-ssDNA之后，觀察到兩個不同的條帶遷移階段，其中20μΜ和30μΜ g5p以更高的遷移率變化到不同的位置(圖 6B)，表明條帶遷移的第一階段由g5p與反平行ssDNA區域的結合引起。在45 μ M g5p下加入C-ssDNA之后的條帶拖尾效應表明在該濃度下g5p結合到dsDNA。通過比較在存在30 μ M g5p情況下的條帶與在控制條件下無g5p情況下的條帶的強度，確定了 C-ssDNA與g5p復合的ssDNA尾部的雜交效率為約82%，表明g5p沒有顯著抑制有效的DNA雜合。為了利用g5p組裝ssDNA-結合的納米顆粒的能力，合成了用大約50個拷貝的s sDNA (5 ‘ -HS-C3H6-(T) 15-TAACCTAACCTTCAT-3 ‘ ) (SEQ IDN0. 1)包裹的金納米顆粒(Au)， 并測試了 g5p-介導的ssDNA-結合的金納米顆粒(ssDNA-Au)組裝體。動態光散射(DLS) 用來測量流體力學直徑值(Dh)的變化，其與聚集體尺寸、顆粒間相互作用和幾何結構有關。 圖7A示出在g5p與ssDNA-Au孵育20分鐘期間Dh的起始組裝速率對g5p濃度高度敏感， 表明ssDNA-Au的g5p依賴性組裝體。在不存在g5p的情況下未觀察到組裝體。為了研究ssDNA-Au (20nM)在一系列g5p濃度下在延長的孵育期間( M小時)的組裝，利用紫外-可見分光光度法(UV-vis)研究了 ssDNA-Au表面等離子體(SP)共振譜帶。該SP譜帶與分離的Au和組裝的納米結構關聯。在增加增大的g5p濃度之后，分離的ssDNA-Au在 525nm處的SP譜帶紅移且譜帶增寬，表明顆粒之間的距離減小或聚集體尺寸增大(圖7B)。 由于較大聚集體的形成致使溶液混濁度降低，因此在10 μ M g5p以上觀察到較高的消光強度(extinctionintensity)。DLS和UV-vis結果都證實ssDNA-Au通過g5p組裝。利用透射電鏡(TEM)研究了 g5p-介導的ssDNA-Au組裝體的尺寸和形態(圖7C)。發現該聚集體尺寸隨著g5p濃度的增大而增大，如通過DLS和UV-vis所揭示的，而非組裝的顆粒數目降低， 揭示聚集體的尺寸可以通過g5p濃度簡單控制。聚組氨酸標記的YieF蛋白質(MW = 20KDa) 被用作陰性對照，對其在DLS和UV-vis研究期間未觀察到顆粒的聚集(圖8A和8B)。這些結果明顯表明，g5p可以用于通過改變蛋白質-納米顆粒比率控制的ssDNA-Au組裝。為了研究dsDNA對聚集體形成的抑制影響，在開始g5p_介導的組裝之前，首先使顆粒的 ssDNA-帽與 C-ssDNA (5 ‘ -ATGAAGGTTAGGTTA-3 ‘ ) (SEQ ID NO. 2)部分雜交(圖 9A)。利用DLS研究了組裝速率對C-ssDNA濃度反應的變化(圖9B)。當Au上C-ssDNA 與-ssDNA的分數(fc)大于約0.05時，該組裝速率急劇下降。由低密度dsDNA引起的這種較大的抑制影響揭示g5p_介導的ssDNA-Au組裝位阻較大。非互補ssDNA(NC_ssDNA， 5' -AATATTGATAAGG ATAGC-3‘ ) (SEQ ID NO. 3)被用作對照，從而消除由g5p與溶液中 ssDNA的結合引起的任何抑制滴定效應。發現NC-ssDNA對組裝速率的影響在統計學上不顯著(圖9B)。結合于ssDNA的g5p可由C-ssDNA雜交代替(圖6B)。這應導致聚集體的解離， 其可用來檢測C-ssDNA的存在。為了證明這點，通過孵育ssDNA-Au(lOnM)和g5p (5 μ M)約 24小時來制備聚集體，此后，在室溫下孵育該聚集體與C-ssDNA約12小時。利用UV-vis監測色度變化，其指示聚集體尺寸變化。該峰位置藍移超過近200nM的C-ssDNA (fc = 0. 4) (圖10A)，指示小團簇(cluster)的解離和單個顆粒的釋放。觀察到，在NC-ssDNA對照中， 該峰強度稍有降低但鋒位置沒有移動(圖10B) ；NC-ssDNA使聚集體分成更小的團簇，但未到單個顆粒的水平。具有200nM C-ssDNA的樣品的TEM圖像清楚地顯示與分散顆粒的解離 (圖10C)，而對于具有NC-ssDNA的樣品未觀察到這種解離。DNA控制的聚集體解離是g5p-SSDNA體系的有用特性。為了證明這點，通過孵育 ssDNA-Au 顆粒和用 C-ssDNA (5 ‘ -HS-C3H6-(T) 15-ATGAAGGTTAGGTTA_3 ‘ ) (SEQ ID NO. 4) 包裹的它們的靶顆粒(C-ssDNA-Au)的傳統雜交方法，將金納米顆粒組裝成聚集體。形成之后，研究聚集體的解離作為增加增大的C-ssDNA濃度的函數。然而，在fc接近約16之前， 未觀察到聚集體解離(圖11)。對于ssDNA-Au和C-ssDNA-Au顆粒的正確組裝，DNA序列固有的特性，如G-C含量， 通常控制該組裝過程。使用g5p作為驅動力，用于可控的非互補ssDNA-結合的納米顆粒組裝體的本發明的方法是新穎的。組裝動力學的控制和顆粒聚集體的解離可通過與C-ssDNA 的序列特異性雜交獲得，而聚集體的尺寸通過調節g5p濃度來控制。本發明的另一個方面包括分子開關。在該分子開關的變型中，其包含熒光猝滅的 “關斷”位置和熒光發射的“開啟”位置。在熒光猝滅“關斷”位置的優選實施方式中，第一 ssDNA在5’端結合到熒光素上從而形成熒光素-ssDNA鏈，第二 ssDNA在3’端結合到DABCYL 上從而形成ssDNA-DABCYL鏈，該熒光素-ssDNA鏈和該ssDNA-DABCYL鏈與g5p結合在一起。 通過使互補ssDNA或ssRNA與熒光素-ssDNA鏈或ssDNA-DABCYL鏈雜交，可以“開啟”該開關。以這種方式，除去了熒光素猝滅劑并使得熒光能被檢測，將該開關從“關斷”位置切換到“開啟”位置。在該分子開關的另一種變型中，激活的“開啟”開關包含dsDNA節段、ssDNA的第一鏈，該第一鏈在各個端結合到該dsDNA兩條鏈中的一條和DABCYL上。該開關也包括ssDNA 的第二鏈，其在各個端結合到該dsDNA兩條鏈中的另一條和熒光素上，ssDNA的該兩條鏈彼此不互補。通過使g5p附著至至少一對尖端有DABCYL和尖端有熒光素的ssDNA鏈上，可以 “關斷”該開關，使來自熒光素的熒光在通過g5p附著期間猝滅。肽已經成功地用于構建納米結構和無機納米顆粒的自組裝。用于顯示肽的g5p蛋白的基因工程提供了設計精細納米材料的另外的機會。在C-ssDNA的存在下無需熱處理即可進行的聚集體敏感解組裝，如基于互補DNA的納米顆粒聚集體的情況，表明這種途徑在設計生物功能雜交材料和基于DNA的生物傳感器方面的潛能；而熱處理這些雜交材料通常導致功能部分如蛋白質的不可逆滅活，加入C-ssDNA不應影響它們的活性。我們也注意到這種基于g5p和ssDNA的新組裝途徑可以擴展到其它類型的納米材料，包括碳納米管、半導體和磁性納米顆粒。圖1示出用于ssDNA-結合的納米顆粒自組裝和解組裝的現有技術方法。在這種傳統方法中，ssDNA-結合的納米顆粒自組裝通過使其與互補DNA雜交進行，而解組裝通過將溫度增大到雜交DNA的熔解溫度(Tm)以上進行。納米顆粒110用ssDNA序列112功能化， ssDNA序列112的至少一些是彼此互補的。納米顆粒的互補DNA序列114允許雜交116，導致納米顆粒的自組裝。組裝的納米顆粒118然后形成聚集體120，其可通過將溫度增大到 dsDNA鏈126的溶解溫度124以上進行解組裝，導致功能化納米顆粒的解聚和解組裝128。圖2圖示了可控的g5p_介導的非互補ssDNA-結合的納米顆粒的組裝和解組裝。 可以觀察到組裝的抑制和解組裝的誘導可通過與互補DNA雜交引起。納米顆粒210用非互補DNA252功能化。加入g5p 254并將納米顆粒自組裝體加入到裝配體256中，并且需要時， 加入到聚集體220中。加入與功能化納米顆粒258的序列互補的DNA導致納米顆粒的解聚和解組裝沈0。這些組裝/解組裝過程也可逆向進行。圖3示出ssDNA介導的g5p-結合的納米顆粒組裝和解組裝的示意圖。這里，納米顆粒310用g5p 3 功能化。將單鏈DNA312加入到該溶液和該功能化納米顆粒自組裝體中。當加入C-ssDNA 314時，該納米顆粒解組裝。
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圖4描繪了 g5p_介導的分子開關的功能化。g5p 454與反平行ssDNA區域462的結合使得DABCYL (Q) 464靠近熒光素466移動，導致熒光猝滅。這可以看作位于正常“關斷” 位置的分子開關，或檢測器的制造。熒光發射可通過使互補RNA (C-RNA)或C-DNA 468與反平行鏈中任何一個雜交來恢復。該過程相當于檢測靶或“開啟”該分子開關。圖5示出有序的肽結合的g5p和DNA的納米顆粒的自組裝。與ssDNA的四個分枝一起在此示出的DNA結構570通過肽結合的g5p 554組裝，并且納米顆粒510通過特異性結合到該肽而有序化。這可產生任意結構化的納米顆粒結構。圖6A和6B示出電泳遷移率測定的結果。用不同拓補結構的三個區域滴定DNA片段在圖6A中示出。該區域為dsDNA的19個堿基對、反平行聚_T ssDNA(32個堿基)，和15 個堿基的ssDNA尾部。結合的模型描繪在右組中。圖表底部示出具有該三個區域的結構化 DNA。圖6B描繪了在C-ssDNA結合到ssDNA尾部之后g5p復合物的遷移率，其中結合的模型在右組中。圖7A、7B和7C是來自g5p-介導的ssDNA-結合的金顆粒組裝體的數據。圖7A中的圖表示出，在ssDNA-Au (5nm)和g5p孵育期間流體力學直徑值(Dh)作為g5p ( μ Μ)濃度的函數，其是利用DLS分析技術進行的。觀察到Dh隨著g5p的濃度單調遞增。圖7B示出了隨著 IOmMTris-HCl, pH 7. 44，200mM NaCl 溶液中 g5p 濃度從 0 變化到 15 μ M 時 UV-vis 光譜的變化。隨著g5p的濃度增大，不僅強度變化，而且峰也向更長的波長移動(經受紅移)。圖7C是當 IOmM Tris-HCl,pH 7. 44,200mM NaCl 溶液中 g5p濃度從0增加到 10 μ M 時，一系列的納米顆粒組裝體形態的TEM圖像。在無g5p的情況下，該納米顆粒稀少地并相對不均勻地間隔在底物上。將濃度增大至2. 5μ M時，形成更大、更密集間隔的納米顆粒組裝體。g5p的濃度進一步增大至5 μ M導致顆粒開始聚集。示出在10 μ M濃度下納米顆粒實際上完全聚集。圖8Α和8Β示出ssDNA-結合的金顆粒的DLS和UV_vis分析結果。在圖8A中，DLS 示出與2. 5 μ M g5p和2. 5 μ M YieF 一起孵育的5nmssDNA_Au的Dh為5nm。示出在YieF的存在下ssDNA-Au的Dh沒有變化，而與g5p —起孵育的ssDNA_Au的Dh增大到近1. 5 μ M。圖 8Β示出，在20nm ssDNA-Au與15 μ M YieF孵育近20小時之后的UV_vis光譜，示出峰位置為約525nm。圖9A和9B分別示出g5p-介導的ssDNA-結合的金顆粒組裝體的示意圖，以及這樣的組裝體的流體力學直徑值的變化。圖9A示意性示出與dsDNA 952相比，g5p %4優選與反平行ssDNA 912結合。圖9B示出每分鐘Dh的變化作為fc的函數(該溶液中C-ssDNA 的數量分數，即，C-ssDNA數量除以該金納米顆粒910上ssDNA的總數量)。該圖示出，在 (2. 5 μ M) g5p蛋白-介導的ssDNA-結合的金顆粒(ssDNA-Au ^ 5nM)組裝期間Dh的變化， 其中該金顆粒與C-ssDNA預雜交。圖10AU0B和IOC描繪了，當加入C-ssDNA時g5p-介導的ssDNA-結合的金顆粒聚集體的分解。圖IOA和IOB示出在與C-ssDNA(圖10A)或NC_ssDNA(圖10B)孵育約12 小時之后納米顆粒聚集體(IOnMssDNA-Au和5μ M g5p)的UV_vis數據。如從圖中可以看出，與C-ssDNA孵育的ssDNA-Au復合物的峰吸收波長發生移動，而與NC_ssDNA孵育的那些則沒有。圖IOC示出在與IOOnM (fc = 0. 2)和200nM C-ssDNA (fc = 0. 4)孵育之后樣品的TEM圖像。
圖11示出加入C-ssDNA對金顆粒聚集體的影響。通過孵育ssDNA_Au和它們的用該互補ssDNA包裹的靶顆粒(C-ssDNA-Au)的傳統雜交方法，將金納米顆粒組裝成聚集體。 單鏈 DNA-Au (IOnM)和 C-ssDNA-Au (IOnM)在 IOnM Tris-HCl,pH 7. 4,200mM NaCl 中孵育約 24小時，使得峰從約525nm(對照1130)移動到約548nm(0 μ M 1132)。在與C-ssDNA (8 μ M 1134)孵育之后未觀察到峰移動的恢復。示例件方法下面的明確描述僅作為具體實例而提供。本文包括的內容沒有暗示支持任何產品或制造商的背書。具體商品名、模型和制造商僅為具體說明而提供，并且可用類似功能的設備和類似質量的試劑代替。另外，時間、數量、濃度等的所有測量值均在實驗和人為誤差范圍內。蛋白質制備噬菌體Μ13 的 g5p 基因(New England Biolabs (NEB))利用引物 5 ‘ -TAATTCC ATATGATTAAAGTTG MATTA AACC A-3‘ (SEQ ID NO. 5)禾口 5 ‘ -TAGCTTGCTCTTCCGCACTTAGCCG GAACGAGGCG-3' (SEQ ID NO. 6)通過聚合酶鏈反應(PCR)來擴增。這通常導致側面有NdeI 和SapI限制性位點的DNA片段。該PCR產物用NdeI和SapI (NEB)消化并連接到pET_30b 載體(Novagen)中。在證實序列之后，利用Gene Pulser XcellSystem(Bio-Rad)將重組質粒引入到BL21-DE3電轉化感受態細胞中。通過在具有卡那霉素(Kanamycin) (100yg/ml) (sigma)的溶菌肉湯(lysogeny broth) (LB)培養基中加入異丙基-β-D-1-硫代乳吡喃糖苷(IPTG) (Sigma)，誘導G5p蛋白表達。在表達期之后，用超聲波處理細胞，并利用Ni-NTA 柱Oliagen)純化His標記的g5p蛋白。利用快速蛋白質液相色譜(FPLC) (AKTA explorer, GE Healthcare)獲得另外的g5p存化，該色譜具有丙烯葡聚糖凝膠S-200高分辨率篩分(sizing)柱(Amersham Biosciences)。獲得> 95 %的純度，如在用考馬斯藍在15 % SDS-聚丙烯酰胺凝膠上染色之后，通過利用Quantity One software (Bio-Rad)分析蛋白質譜帶所確定的。74501^(^-1的摩爾消光系數用來確定蛋白質濃度。按照a^ng，Y. B.等人 Functionalized carbon nanotubesfor detecting viral proteins. Nano Letters， 7(10) :pp. 3086-3091,2007先前描述的來制備該YieF蛋白質，將其全部內容以引用方式并入本文中。電泳遷移率測定通過分別用序列5' -GACCACATACCGCACCATC (T) 32CTGCTACGAGACTTC-3 ‘ (SEQ ID N0. 7)和 5 ‘ - (T) 32GATGGTGCGGTATGTGGTC-3 ‘ (SEQ ID N0. 8)退火兩個 ssDNA，獲得用于結合研究的DNA。在37°C下，孵育該退火的DNA(IyM)和g5p 10分鐘。通過溴化乙錠染色在瓊脂糖凝膠O. 5%)電泳之后可視化該DNA。將具有序列5' -GAA GTC TCGTAG CAG-3' (SEQ ID N0. 9)的C-ssDNA加入到g5p和退火DNA的復合物中，并在電泳之前在37°C下孵育15 分鐘。在溴化乙錠染色之后分析該DNA譜帶的相對強度。特征利用PerkinElmer Lambda 35光譜儀獲得紫外可見光譜。利用MalvernZetasizer ^5儀器測量DLS，該儀器裝配有633nm激光和173°的反向散射檢測器。為了可視化 ssDNA-Au，在120kV下操作JEOL 1300TEM。通過在碳涂覆的銅格柵上孵育樣品10分鐘并用蒸餾水清洗兩次，制備TEM樣品。
考慮到本文的教導，本發明人和本領域其他技術人員可將該方法擴展到用于組裝納米顆粒的更復雜DNA_g5p結構中。g5p的C-末端處的功能性肽的顯示可允許具有生物活性的納米材料。另外，對于更潛在的應用，考慮使用其它類別的納米顆粒(半導體的、磁性的)。所描述的操作(work)可進一步用于開發生物傳感器，包括開發用于微陣列設計的途徑。本方法使得無需熱處理即可在生物條件下控制DNA-結合的納米顆粒的組裝和解組裝，使得容易將蛋白質并入到基于DNA的納米結構中，暗示設計復合納米材料的很大潛在性，并可以設計用于檢測核苷酸序列(DNA，RNA)而無需對它們進行標記的途徑。雖然已經參照本發明的單個實施方式進行了前面的描述，但應當理解，利用本文的教導，本領域技術人員可以在更多的方面提出各種變化和修飾而不偏離本發明。例如，可以利用除g5p以外的基因蛋白質。在另一個實施方式中，本發明可以用于檢測用于安全應用的化學物質。前面的描述是說明性的，本發明僅由所附的權利要求限定。
1權利要求
1.一種可控和可逆的納米顆粒組裝體，包含用非互補DNA和/或RNA包裹的納米顆粒， 所述非互補DNA和/或RNA通過核苷酸結合蛋白結合從而形成納米顆粒組裝體。
2.根據權利要求1所述的可控和可逆的納米顆粒組裝體，其中，通過進一步使所述納米顆粒組裝體和與所述非互補DNA和/或RNA互補的DNA和/或RNA結合，使所述納米顆粒組裝體解組裝。
3.根據權利要求1所述的可控和可逆納米顆粒組裝體，其中，所述納米顆粒是金屬。
4.根據權利要求3所述的可控和可逆納米顆粒組裝體，其中，所述金屬選自由金、銀和鉬組成的組。
5.根據權利要求4所述的可控和可逆納米顆粒組裝體，其中，所述金屬是金。
6.根據權利要求1所述的可控和可逆納米顆粒組裝體，其中，所述納米顆粒是半導體。
7.根據權利要求6所述的可控和可逆納米顆粒組裝體，其中，所述半導體選自由硒化鎘、硫化鎘、硫化鋅和砷化鎵組成的組。
8.根據權利要求1所述的可控和可逆納米顆粒組裝體，其中，所述納米顆粒是磁性的。
9.根據權利要求8所述的可控和可逆納米顆粒組裝體，其中，所述納米顆粒是鐵氧化物。
10.根據權利要求1所述的可控和可逆納米顆粒組裝體，其中，所述DNA和/或RNA是單鏈的。
11.根據權利要求1所述的可控和可逆納米顆粒組裝體，其中，所述DNA和/或RNA是雙鏈的。
12.根據權利要求1所述的可控和可逆納米顆粒組裝體，其中，所述核苷酸結合蛋白是g5p0
13.—種可控納米顆粒組裝和解組裝的方法，包括 用DNA和/或RNA包裹納米顆粒；使所述包裹的納米顆粒與核苷酸結合蛋白結合；以及使所述DNA和/或RNA結合到所述核苷酸結合蛋白上，從而形成納米顆粒的組裝體。
14.根據權利要求13所述的可控納米顆粒組裝和解組裝的方法，其中，通過進一步使所述納米顆粒組裝體和與所述非互補DNA和/或RNA互補的核苷酸結合，使所述納米顆粒的組裝體解組裝。
15.根據權利要求13所述的可控納米顆粒組裝和解組裝的方法，其中，所述納米顆粒是金屬ο
16.根據權利要求15所述的可控納米顆粒組裝和解組裝的方法，其中，所述金屬選自由金、銀和鉬組成的組。
17.根據權利要求16所述的可控納米顆粒組裝和解組裝的方法，其中，所述納米顆粒是金。
18.根據權利要求13所述的可控納米顆粒組裝和解組裝的方法，其中，所述納米顆粒是半導體。
19.根據權利要求18所述的可控納米顆粒組裝和解組裝的方法，其中，所述半導體選自由硒化鎘、硫化鎘、硫化鋅和砷化鎵組成的組。
20.根據權利要求13所述的可控納米顆粒組裝和解組裝的方法，其中，所述納米顆粒是磁性的。
21.根據權利要求20所述的可控納米顆粒組裝和解組裝的方法，其中，所述納米顆粒是鐵氧化物。
22.根據權利要求13所述的可控納米顆粒組裝和解組裝的方法，其中，所述DNA和/或 RNA是單鏈的。
23.根據權利要求13所述的可控納米顆粒組裝和解組裝的方法，其中，所述DNA和/或 RNA是雙鏈的。
24.根據權利要求13所述的可控納米顆粒組裝和解組裝的方法，其中，所述核苷酸結合蛋白是g5p。
25.一種用于組裝納米顆粒的方法，包括 用核苷酸結合蛋白功能化多個納米顆粒；將所述功能化的納米顆粒與非互補DNA和/或RNA —起孵育；以及使所述DNA和/或RNA的至少兩條鏈與所述核苷酸結合蛋白連接，從而形成納米顆粒的組裝體。
26.根據權利要求25所述的方法，其中，所述納米顆粒是金屬。
27.根據權利要求沈所述的方法，其中，所述金屬選自由金、銀和鉬組成的組。
28.根據權利要求27所述的方法，其中，所述納米顆粒是金。
29.根據權利要求25所述的方法，其中，所述納米顆粒是半導體。
30.根據權利要求四所述的方法，其中所述半導體選自由硒化鎘、硫化鎘、硫化鋅和砷化鎵組成的組。
31.根據權利要求25所述的方法，其中，所述納米顆粒是磁性的。
32.根據權利要求31所述的方法，其中，所述納米顆粒是鐵氧化物。
33.一種包含熒光猝滅的關斷位置和熒光發射的開啟位置的分子開關，其中，所述熒光猝滅的關斷位置包含在5’端結合到熒光素上從而形成熒光素-ssDNA鏈的第一 ssDNA、在3，端結合到DABCYL上從而形成ssDNA-DABCYL鏈的第二 ssDNA，所述熒光素-ssDNA鏈和所述ssDNA-DABCYL鏈與g5p結合在一起；并且所述熒光發射的開啟位置進一步包含與所述熒光素-ssDNA鏈或所述ssDNA-DABCYL鏈雜交的互補ssDNA或ssRNA，從而除去熒光素猝滅劑并能夠實現熒光檢測。
34.一種分子開關，包括 dsDNA的節段；ssDNA的第一條鏈，其在各個端結合到所述dsDNA兩條鏈中的一條和DABCYL上； ssDNA的第二條鏈，其在各個端結合到所述dsDNA兩條鏈中的另一條和熒光素上，所述 ssDNA的兩條鏈彼此不互補；以及g5p，附著于至少一對尖端有DABCl和尖端有熒光素的ssDNA鏈上，以使來自所述熒光素的熒光在通過g5p附著期間猝滅。
35.一種g5p介導的DNA裝配體，包括非互補DNA或RNA鏈，所述非互補DNA或RNA鏈結合到核苷酸結合蛋白上，從而形成裝配體。
36.根據權利要求35所述的g5p介導的DNA裝配體，其中，所述DNA或RNA是單鏈的。
37.根據權利要求35所述的g5p介導的DNA裝配體，其中，所述核苷酸結合蛋白是g5p。
38.一種用于組裝納米顆粒的方法，所述方法包括 用非互補ssDNA功能化多個納米顆粒；將所述功能化的納米顆粒暴露于基因5蛋白；以及使所述ssDNA的至少兩條鏈與g5p相連，從而形成納米顆粒的組裝體。
39.一種DNA和納米顆粒-功能化的g5p的多維結構，包括具有多個ssDNA分枝的DNA 結構、結合至g5p的肽，其中所述g5p結合到所述ssDNA上，并且納米顆粒特異性地結合于所述肽，從而形成DNA和納米顆粒功能化g5p的復合結構。
40.一種多維DNA支架，包括在第一基因座通過C-ssDNA序列互相結合的ssDNA的第一條鏈和第二條鏈； 在第二基因座通過C-ssDNA序列互相結合的ssDNA的第三條鏈和第四條鏈； 在第二基因座通過C-ssDNA序列互相結合的ssDNA的所述第二條鏈和第三條鏈；以及在所述結合的基因座之間的一個或多個點處結合到ssDNA的至少兩條鏈上的g5p。
41.根據權利要求40所述的支架，進一步包含結合于至少一個所述g5p的至少一種納米顆粒。
42.根據權利要求41所述的支架，進一步包含結合于至少一個DNA區域的至少一種納米顆粒。
全文摘要
本發明涉及利用肽、蛋白質和其它寡聚體提供一旦檢測到靶分子正常猝滅的納米顆粒熒光可能被恢復的一種方法或裝置。此外，本發明的技術提供了無需在檢測之前標記靶分子即可進行靶分子檢測的結構和方法。另一方面，描述了形成任意形狀的二維和三維DNA結合蛋白介導的納米顆粒結構的方法和所得的結構。具體的實施方式是利用基因5蛋白(g5p)。蛋白質介導的結構形成自身可以利用多種有用部分進行功能化，該有用部分包括催化官能團。
文檔編號G01N33/53GK102203246SQ200980129743
公開日2011年9月28日 申請日期2009年6月2日 優先權日2008年6月2日
發明者丹尼爾·范德勒利耶, 奧列格·甘格, 李樹官 申請人:布魯克哈文科學協會有限公司