用于檢測微生物的分子印跡聚合物的制作方法

專利名稱：用于檢測微生物的分子印跡聚合物的制作方法
技術領域：
本文描述的發明總體上涉及能夠結合微生物的分子印跡聚合物(MIP)，包括利用 MIP檢測、鑒定和/或定量微生物的方法和試劑盒。
背景技術：
MIP是對單個化合物或相關化合物家族表現出高親和力和選擇性的工程化交聯聚 合物。即使當分析物存在于復雜的基質(例如，血漿、尿、肌肉組織、食品基質、環境樣品、過 程溶液等等)中時，MIP也能夠結合分析物。MIP的重要力量是它們能夠在存在大量具有相 似物理化學特性的其他化合物的情況下結合痕量水平的靶分子。不像大多數只表現非選擇 性相互作用的分離粒子，MIP具有與特定的一種靶或一類靶在空間上和化學上互補的選擇 性合成識別位點(或印跡)。MIP的生產是經濟且快速的，并且MIP在儲存中是穩健且穩定 的。它們可以在升高的溫度、在有機溶劑中以及在極端PH值下使用。它們還展示了比基于 免疫親和性的吸附劑典型的樣品加載能力更高的樣品加載能力。這導致分析應用的較高回 收率和使用吸附劑用于半制備規模或制備規模分離的適合性。分子印跡包括圍繞模板(例如，偽靶分子、靶分子類似物、實際靶分子的全部或部 分等等)排列可聚合的功能單體，接著是聚合作用和模板移除。這種排列通常是通過以下 實現的(i)非共價相互作用(例如，H鍵、離子對相互作用)或(ii)可逆的共價相互作用。 在模板移除后，這些分子印跡聚合物能夠識別并結合實際的靶分子。由于MIP的受控合成和顯著的穩定性，它比起抗體用于診斷和樣品分析具有若干 優點。分子印跡起源于通過模板聚合在聚合物中產生度身定制的識別位點的概念(Moshch K.等人，Bio/technology，1996，14，163-170 ；Ansell R. J.等人，Curr. Opin. Biotechnol.， 1996，7，89-94 ；Wulff G. Angew. Chem. Int. Ed. Engl.，1995，34，1812-32 ；Vidyasankar S.等 人，Curr. Opin. Biotechnol. ,1995,6,218-224 ；禾口 Shea K. J,Trends In Polymer Science, 1994，2，166-173)。分子印跡聚合物展現了顯著的識別特性，這些特性被應用在多個領 域，諸如藥物分離(Fischer L.，等人，J. Am. Chem. Soc, 1991,113,9358-9360 ；Kempe M, 等人，J. Chromatogr.，1994，664，276-279 ；Nilsson K.，等人，J. Chromatogr.，1994，680， 57-61)、受體模擬物(Ramstrom 0.，等人，Tetrahedron =Asymmetry, 1994，5，649-656 ； Ramstrom 0.,等人，J. MoI. Recogn.，1996，9，691-696 ；Andersson L. L，等人，Proc. Natl. Acad. Sci.，1995，92，4788-4792 ；Andersson L. L, Anal. Chem.，1996，68，111-117)、生物模 擬傳感器(Kriz D.，等人，Anal. Chem.，1995，67，2142-2144)、抗體模擬物(Vlatakis G.， 等人，Nature，1993，361，645-647)、模板輔助合成(Bystrom S. E.，等人，J. Am. Chem. Soc, 1993，115,2081-2083)和催化(Muller R.，等人，Makromol. Chem.，1993，14，637-641 ；BeachJ. V.，等人.，J.Am· Chem. Soc，1994，116 卷，379-380)。在MIP上體現的巨大潛力產生了基于分子印跡的分析裝置以及檢測多種靶的方 法的眾多發明，綜述于 Ye 和 Haupt (Anal. Bioanal. Chem. 2004，378，1887-1897)。基于 MIP 的傳感器的一些實例描述于美國專利第5，587，273,6, 680，210,6, 833，274,6, 967，103和 6，461，873號中。使用與分析物-標志物的結合物的替換相聯合的MIP在幾個實驗室中顯 示是切實可行的(Vlatakis G.等人，Nature，1993，361，645-647，Levi 等人·，1997，Anal. Chem. 69. 2017-2021 ；Nathaniel Τ.等人，J. Am. Chem. Soc. 2005，127，5695-5700 ；Nicholls C.等人，Biosens. Bioelec，2006，21，1171-1177)。迄今為止，分子印跡對包括大分子在內的較大分子的結合具有有限的應用。使用 靶氨基酸衍生物或肽作為模板創造了選擇性結合氨基酸衍生物和肽的合成聚合物(Kemp， 1996，Anal. Chem. 68 :1948-1953)。結合核苷酸衍生物的印跡也已經被創造出來(Spivak和 Shea, 1998，Macromolecules 31 :2160-2165)。通過混合基質材料與受分子圖像束縛的完整 多肽鏈創造了多肽的離子分子圖像(美國專利第5，756，717號)。細胞色素C、血紅蛋白和 肌紅蛋白的分子印跡也分別通過在存在每種完整蛋白的情況下聚合丙烯酰胺得以制備。馬 肌紅蛋白的印跡從包括鯨肌紅蛋白在內的蛋白混合物中選擇性結合馬肌紅蛋白(美國專 利第 5,814, 223 號)。盡管分子印跡的方法已對選擇性結合大分子顯示有限的成功，但是這些方法還沒 有被用于檢測或鑒定微生物。在該領域中的這些缺點被下述的本發明克服，本發明一方面 提供了可用于檢測、鑒定和/或定量樣品中或靶區域上的微生物的MIP。一般而言，下述本 發明的印跡組合物包括限定模板微生物的印跡的基質材料。基于MIP的材料的潛在優點包 括與生物識別元件相當的特異性；在極端化學條件和物理條件下的穩健性和穩定性；以 及設計缺乏適合的生物識別元件的靶分子的識別位點的能力。發明概述本文描述的發明的一個實施方案提供了能夠特異性結合微生物的分子印跡聚合 物(MIP)。本發明的另一個實施方案提供了檢測和/或鑒定微生物的方法，包括使一種或多 種MIP接觸所述微生物。本發明的另一個實施方案提供了用于診斷感染微生物的受試者的方法，所述方法 包括使從所述受試者獲得的生物樣品接觸一種或多種MIP，并且檢測和/或鑒定所述生物 樣品中所述微生物的存在。在本發明的一個實施方案中，微生物可以選自原核生物、真核生物、病毒和朊病毒 組成的組。在一個實施方案中，MIP能夠結合所述微生物獨有的大分子的全部或部分。在本發明的另一個實施方案中，MIP能夠結合所述大分子的表位。在本發明的一個實施方案中，大分子可以選自由以下組成的組外泌多糖、多糖、 蛋白、糖蛋白、肽聚糖、脂蛋白、肽、多肽和多核苷酸。在本發明的一個實施方案中，MIP能夠結合與耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌 (S. aureus) (MRSA)相關的大分子的全部或部分。在本發明的一個實施方案中，與MRSA相關的大分子是青霉素結合蛋白2a (PBP2a)。在本發明的另一個實施方案中，MIP能夠結合選自由以下組成的組的氨基酸序列 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO : 14和/或它們的片段。在本發明的一個實施方案中，MIP與轉導元件相偶聯，以響應于MIP與所述微生物 的結合產生可測量的信號。在本發明的一個實施方案中，MIP與轉導元件相偶聯，以響應于MIP與所述大分子 的全部或部分的結合產生可測量的信號。在本發明的一個實施方案中，與轉導元件相關聯的信號選自由以下組成的組比 色信號、熒光信號、放射性信號和酶信號。在本發明的一個實施方案中，生物樣品選自由以下組成的組生物流體 (biological fluid)、組織提取物和組織。在本發明的一個實施方案中，生物流體可以選自由以下組成的組血液、腦脊液、 血清、血漿、尿、乳頭抽吸物(nipple aspirate)、細針抽吸物、組織灌洗液、唾液、痰、腹水 液、精液、淋巴、陰道混合物(vaginal pool)、滑液、脊髓液、羊膜液、母乳(breast milk)、肺 痰或肺表面活性物(surfactant)、尿、糞便，從以下任何部位收集的流體肝、腎、乳房、骨、 骨髓、睪丸、腦、卵巢、皮膚、肺、前列腺、甲狀腺、胰、宮頸、胃、腸、結腸直腸、腦、膀胱、結腸、 鼻孔和子宮(nares and uterine)，頭和頸、鼻咽腫瘤和其他生物起源的液體樣品。在本發明的一個實施方案中，組織可以選自由以下組成的組肝、腎、乳房、睪丸、 腦、卵巢、皮膚、頭和頸、肺、前列腺、甲狀腺、胰、宮頸、胃、腸、結腸直腸、膀胱、結腸和子宮。在本發明的一個實施方案中，組織提取物可以選自由以下組成的組肝、腎、乳房、 睪丸、腦、卵巢、皮膚、頭和頸、肺、前列腺、甲狀腺、胰、宮頸、胃、腸、結腸直腸、膀胱、結腸和 子宮的提取物。本發明的一個實施方案提供了用于診斷感染微生物的患者的方法，所述方法包括 使從所述患者獲得的生物樣品接觸一種或多種MIP，并且檢測和/或鑒定所述生物樣品中 所述微生物獨有的大分子的存在。本發明的一個實施方案提供了利用能夠結合與MRSA相關的大分子的全部或部分 的MIP檢測或鑒定MRSA的方法。 本發明的另一個實施方案提供了利用能夠結合PBPh的全部或部分的MIP檢測或 鑒定MRSA的方法。本發明的另一個實施方案提供了利用能夠結合選自由以下組成的組的氨基酸序 列的 MIP 檢測或鑒定 MRSA 的方法SEQ ID NO =USEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO :5, SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14 和 / 或它們的片段。在本發明的一個實施方案中，在結合與MRSA相關的大分子的全部或部分后產生 了可檢測的信號。在本發明的一個實施方案中，在MRSA與MIP結合后產生了可檢測的信號，所述MIP 能夠結合PBP2a的全部或部分。
在本發明的另一個實施方案中，在MRSA與MIP結合后產生了可檢測的信號，所述 MIP能夠結合選自由以下組成的組的氨基酸序列SEQ ID NO =USEQ ID N0:2、SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO :4,SEQ ID NO :5、SEQID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :11、SEQ ID NO : 12、SEQ ID NO :13, SEQ ID NO : 14 禾口 / 或它們的片段。本發明的一個實施方案提供了診斷具有MRSA感染的患者的方法。在本發明的一個實施方案中，診斷具有MRSA感染的患者的方法包括使從所述患 者獲得的生物樣品接觸一種或多種能夠結合與MRSA相關的大分子的MIP。在本發明的另一個實施方案中，診斷具有MRSA感染的患者的方法包括測量在從 所述患者獲得的生物樣品中的MRSA與MIP結合后產生的可檢測信號，所述MIP能夠結合與 MRSA相關的大分子。在本發明的一個實施方案中，診斷具有MRSA感染的患者的方法包括使從所述患 者獲得的生物樣品接觸一種或多種能夠結合PBP2a的全部或部分的MIP。在本發明的另一個實施方案中，診斷具有MRSA感染的患者的方法包括測量在從 所述患者獲得的生物樣品中的MRSA與MIP結合后產生的可檢測信號，所述MIP能夠結合 PBP2a的全部或部分。本發明的一個實施方案中，診斷具有MRSA感染的患者的方法包括使從所述患者 獲得的生物樣品接觸一種或多種MIP，所述MIP能夠結合選自由以下組成的組的氨基酸序 列SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6、 SEQ ID NO :7, SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO : 14 和 / 或它們的片段。在本發明的另一個實施方案中，診斷具有MRSA感染的患者的方法包括測量在從 所述患者獲得的生物樣品中的MRSA與MIP結合后產生的可檢測的信號，所述MIP能夠結合 選自由以下組成的組的氨基酸序列:SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO :5, SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO :11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO : 14 和 / 或它們的片段。本發明的一個實施方案提供了用于確定受試者中與微生物相關的感染的發生、進 展或退行的方法，其中通過使從受試者獲得的生物樣品接觸一種或多種MIP篩選所述生物 樣品的所述微生物。本發明的一個實施方案提供了包含用于檢測或鑒定微生物的一種或多種MIP的
試齊U盒。本發明的另一個實施方案提供了檢測靶區域上微生物的存在的方法，所述方法包 括使所述靶區域接觸一種或多種MIP。在一個實施方案中，靶區域包括環境的表面，諸如在醫院、運動設備和醫療裝置 中。在本發明的另一個實施方案中，靶區域可以選自由以下組成的組床欄桿、門把手 和計算機鍵盤。附圖簡述

圖1展示了產生MIP的方法。
圖2A展示了產生針對與微生物有關的大分子的MIP的示意圖。圖2B展示了利用本發明的MIP檢測微生物的示意圖。圖3A顯示在PBP2A的晶體結構內的SEQ ID NO 4的鏈視圖。圖;3B顯示在PBP2A的晶體結構內的SEQ ID NO 4的表面視圖。圖4A顯示在PBP2A的晶體結構內的SEQ ID NO 5的鏈視圖。圖4B顯示在PBP2A的晶體結構內的SEQ ID NO 5的表面視圖。圖5A顯示在PBP2A的晶體結構內的SEQ ID NO 8的鏈視圖。圖5B顯示在PBP2A的晶體結構內的SEQ ID NO 8的表面視圖。圖6A顯示在PBP2A的晶體結構內的SEQ ID NO 12的鏈視圖。圖6B顯示在PBP2A的晶體結構內的SEQ ID NO 12的表面視圖。圖7A顯示在PBP2A的晶體結構內的SEQ ID NO 13的鏈視圖。圖7B顯示在PBP2A的晶體結構內的SEQ ID NO 13的表面視圖。發明詳述本文描述的發明提供了能夠結合微生物的分子印跡聚合物(MIP)和利用這些MIP 檢測微生物的方法。另外，本發明提供了用于檢測、鑒定和/或定量生物樣品中的微生物的 方法和試劑盒，所述生物樣品包括但不限于組織、組織提取物和生物流體。本發明的MIP 可用于鑒定和/或定量靶表面上和液體樣品中的微生物。期望本發明的MIP可用于任何地 點的生物體檢測，例如，在家、診所、醫生辦公室、醫院床邊、工廠或現場。這些方法可用于檢 測各種生物樣品、環境樣品和工業樣品中的微生物而不需要復雜的樣品制備程序，并因此 也適合甚至現場條件下被未受訓練的人員使用。此外，本發明提供了利用MIP診斷與微生 物相關的感染的方法。本發明的MIP可以根據本領域熟練技術人員已知的任何技術使用微生物或其部 分作為模板分子來制備。這些方法包括共價印跡(Wulff，1982，Pure & Appl. Chem. ,54, 2093-210 ，通過共價印跡單體被共價連接至模板并使用交聯劑聚合。隨后，模板從聚合 物上裂解，留下模板特異性結合腔。可選地，可以使用非共價印跡方法，諸如由美國專利第 5，110，833號公開的方法，該專利部分通過引用特定地并入本文，從而單體通過非共價力與 靶分子相互作用，然后單體通過交聯劑相連以便在移除靶分子后形成靶特異性結合位點。 可以使用這些方法的組合和變更來構建薄的分子印跡膜(film)和膜(membrane) (Hong等 人，1998 Chem. Mater. , 10,1029-1033)；在固體支持體表面上的印跡(Blanco_L0pez等人， 2004, Anal. Bioanal. Chem. , 378,1922-1928 ；Sulitzky C.等人，2002 Macromolecules, 35,79-91)；和微球(Ye 等人，2000，Macromolecules，33，8239-824 。此外，用于制備 MIP 的方法描述在美國專利第 4，406，792,4, 415，655,4, 532，232,4, 935，365,4, 960，762、 5，015，576,5, 208，155,5, 310，648,5, 321，102,5, 372，719,5, 786，428,6, 063，637 和 6，593，142號中，所有文獻的公開制備MIP的方法的部分均通過引用特定地并入本文。例如，分子印跡包括制造模板分子的聚合物鑄模(polymer cast)，其中模板包括 但不限于表位。制造聚合物鑄模的方法包括溶解模板分子以印跡在適合的溶劑中。正常情 況下，將包含共聚單體、交聯單體和聚合引發劑的印跡組合物添加到包含期望的模板的溶 劑中。然后將輻射(光化學或離子化)或熱能應用到包含印跡組合物和模板的反應混合物， 以驅動聚合過程，最終導致固體聚合物的形成。可以使用常規聚合物加工技術加工得到的聚合物，假定這些方法不改變分子印跡位點的結構。使用從聚合物解離模板分子的適當方 法提取印跡分子。模板分子從聚合物解離的細節取決于靶分子與聚合物結合位點之間的化 學相互作用的性質。從模板分子解離的聚合物擁有對這種模板分子的結構特性和電子特性 優化的結合位點。優選地，模板分子被印跡的條件與大分子被捕獲的條件相似或相同。例如，如果大 分子在變性條件下被捕獲，那么模板分子應該在相同的變性條件下被印跡。類似地，如果大 分子在天然條件下被捕獲，那么模板分子應該在相同的天然條件下被印跡。天然條件和變 性條件是本領域技術人員公知的。可以用來制造根據本發明的印跡組合物的許多熱敏性 化合物是本領域已知的，并且包括，例如且不限于，水凝膠諸如瓊脂糖、明膠、可塑性塑料等 等。其他適合的水凝膠的實例描述于美國專利第6，018，033號、美國專利第5，277，915號、 美國專利第4，024，073號和美國專利第4，452，892號中，所有文獻的涉及印跡的部分均通 過引用并入本文。可以用于制備本發明的聚合物的單體的適合的非限制性實例包括甲基丙烯酸甲 酯、其他甲基丙烯酸烷基酯(alkyl methacrylates)、丙烯酸烷基酯(alkylacrylates)、烯 丙基(ally)或芳基丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯、氰基丙烯酸酯、苯乙烯、α -甲基苯乙烯、乙 烯基酯(包括醋酸乙烯酯)、氯乙烯、甲基乙烯基酮、偏二氯乙烯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、 丙烯腈、甲基丙烯腈、乙二醇二丙烯酸酯、季戊四醇二甲基丙烯酸酯、季戊四醇二丙烯酸酯、 N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺、Ν，Ν'-亞乙基雙丙烯酰胺和N，N' -(1，2_ 二羥亞乙基)雙丙 烯酰胺。取決于所用的單體的選擇，聚合物顆粒將具有多種物理特性和機械特性，諸如疏水 性/親水性、機械強度以及在存在溶劑時易于溶脹或耐溶脹。本發明的MIP可以采用多種不同的形式。例如，它們可以處于個體的珠、圓盤、橢 圓或其他規則或不規則形狀的形式(總稱為“珠(bead)”)，或處于片(sheet)的形式。每 個珠或片可以包含單個模板分子的印跡腔，或者它們可以包含兩個或多個相同或不同模板 分子的印跡腔。在一個實施方案中，MIP包含排列成陣列或其他型式的多個不同模板分子 的印跡腔，以使得在該陣列或型式內的印跡腔的相對位置與其身份相關，即用于產生印跡 腔的模板分子的身份。取決于應用，陣列內的每個位置或地址可以包含單個模板分子的印 跡腔或多個不同模板分子的印跡腔。此外，取決于應用，整個陣列或型式可以包括獨有的印 跡腔或者可以包括多余印跡腔。在一個實施方案中，本發明提供了制造包括印跡組合物的基質材料的方法。這些 基質材料包括但不限于能夠經歷從流體狀態到半固體或固體狀態的物理改變的物質。在流 體狀態中，基質材料的顆粒容易在它們自身之間移動，并且材料保持很少或無定界的形式。 處于流體狀態的基質材料可以與其他化合物(包括模板分子)混合。在半固態或固態中， 基質材料能夠形成并保留與模板分子的形狀互補的腔。這些基質材料的實例包括熱敏水凝 膠諸如瓊脂糖、聚合物諸如丙烯酰胺、以及交聯的聚合物。在本發明的一個實施方案中，MIP能夠通過結合與微生物相關的大分子來結合微 生物。一般而言，MIP能夠特異性結合大分子的全部或部分，包括但不限于與微生物有關的 表位。在此所述的發明的模板分子可以選自由以下組成的組微生物的全部或部分、與 微生物相關的大分子或其部分、以及其類似物。模板分子對應的部分可以是大分子的內部部分和/或外部部分、和/或大分子的末端部分。可選地，該部分可以是大分子的側基或修 飾，諸如糖蛋白大分子的多糖基團或其部分。可以使用本文描述的發明的印跡組合物捕獲、檢測、鑒定和/或定量的微生物包 括但不限于任何類型的原核生物、真核生物、病毒和朊病毒。這些微生物的實例包括但不 限于細菌、藻類、真菌、酵母、支原體、古細菌(archeabacteria)、分枝桿菌、寄生蟲和原生 動物。在一個實施方案中，本發明的MIP和方法可用于檢測耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌 (MRSA)。靶分子可以選自微生物獨有的蛋白、肽或糖蛋白。例如，非洲錐蟲病是由布氏錐蟲 (trypanosoma brucei)引起的，布氏錐蟲是在非洲引起人昏睡病和動物那加那病的寄生蟲 原生生物物種。這種專性寄生蟲具有兩個宿主昆蟲載體和哺乳動物宿主。因為在這些宿 主之間的大的差異，錐蟲在其生命周期中經歷復雜變化以有助于其在昆蟲消化道和哺乳動 物血流中生存。它的特征也在于獨特的且著名的可變表面糖蛋白(VSG)包被以逃避宿主免 疫系統。VSG基因在序列水平上具有極大變異性。然而，為了它們滿足屏蔽功能，不同的VSG 具有高度保守的結構特征。VSG由大約300到350個氨基酸的高度可變的N端結構域和大 約100個氨基酸的更為保守的C端結構域組成。C端結構域形成4個α螺旋的結構束，而 N端結構域形成這些螺旋周圍的‘孔環’。這種孔環的三級結構在不同的VSG之間十分保守 (盡管在氨基酸序列上具有廣泛變異)，使得不同的VSG形成屏蔽錐蟲表面所需的物理屏 障。在本發明的一個實施方案中，MIP能夠結合保守孔環的表位和/或其他保守的氨基酸 序列。與可以使用本發明的印跡組合物檢測、鑒定和/或定量的微生物相關的大分子包 括任何類型的大分子，可以根據本文教導的原理從這些大分子設計和構建模板分子。幾乎 任何類型的大分子都可以使用本發明的方法和組合物檢測、鑒定和/或定量。非限制性實 例包括多糖、蛋白、糖蛋白、肽聚糖、脂蛋白、肽、多肽和多核苷酸以及其他對本領域技術人 員而言明顯的大分子靶。一般來說，模板分子對應的大分子的結構單位在大分子的一級結構內是連續的。 如果本領域技術人員能夠鑒定大分子一級結構中的一個末端或多個末端，那么優選的模 板分子對應于包括大分子的末端的模板。可選地，模板分子對應的大分子的部分大小可以 表示為整個大分子的大小的分數。例如，模板分子能夠對應于由整個大分子結構的到 5%、1%到 10%、1%至到 15%、1%到 20%、1%到 25%、1%到 30%、1%到 35%、1%到 40%,
到 50%、1%到60%、1%到 70%、1%到80%、1%到90%、1%到95%或1%到99%組成 的大分子的部分。優選地，模板分子具有對應于大分子的一級結構的連續部分的一級結構。如果大分子是多肽，則模板分子能夠對應于由選自該多肽或其類似物的一級序列 的氨基酸序列組成的多肽的部分。例如，多肽的部分可以由來自多肽的一級結構的一系列 氨基酸組成，所述多肽的一級結構由1到50個氨基酸、2到40個氨基酸、3到30個氨基酸、 3到15個氨基酸、3到10個氨基酸、4到10個氨基酸、4到9個氨基酸、4到8個氨基酸、4 到7個氨基酸、或5到7個氨基酸組成。優選的大分子的部分是由來自多肽的一級結構的 氨基酸的連續序列組成的那些。如果大分子是多核苷酸，則模板分子可以是具有選自該多核苷酸或其類似物的一 級序列的核苷酸序列的寡核苷酸。如果多核苷酸具有η個核苷酸，那么所選的核苷酸序列 可以具有1到(η-1)個核苷酸的長度。可選地，所選的序列能夠包含1到50個核苷酸、2到40個核苷酸、3到30個核苷酸、3到15個核苷酸、3到10個核苷酸、4到10個核苷酸、4到9 個核苷酸、4到8個核苷酸、4到7個核苷酸、或5到7個核苷酸。優選地，所選的序列是來 自多核苷酸的一級序列的核苷酸的連續序列。將理解如本文所用，表述“大分子”并非旨在將對可以用本文描述的方法的MIP鑒 定的分子進行具體的大小限制。相反，大分子包括這樣的分子它們包括多個結構部分或其 類似物以使得與這些結構部分中的至少一個相對應的模板分子可以用于制備能夠結合該 大分子的分子印跡。在本發明的一個實施方案中，與結構部分中的至少兩個對應的模板分 子可以用于制備能夠結合大分子的分子印跡。在本發明的一個實施方案中，與結構部分中 的至少三個對應的模板分子可以用于制備能夠結合大分子的分子印跡。在本發明的一個實 施方案中，與結構部分中的至少四個對應的模板分子可以用于制備能夠結合大分子的分子 印跡。所謂“類似物”表示不同于參考分子但在結構上、功能上和/或化學上與參考分子 相關的分子。類似物可以保留參考分子本質的特性、功能或結構。最優選地，類似物保留參 考分子的至少一種生物功能。一般而言，差異是有限的，這樣使得參考分子與類似物的結構 或序列在總體上相似。例如，肽類似物和它的參考肽的差異可能在于處于任何組合的氨基 酸序列的一個或多個置換、添加和/或缺失。類似物的其他實例包括與本文舉例的肽相比 具有較小氨基酸差異的肽。具體而言，包含保守的氨基酸取代(即那些發生在側鏈相近的 氨基酸家族內的氨基酸取代)的肽構成類似物。置換或插入的氨基酸殘基可能是或者可能 不是由遺傳密碼編碼的氨基酸殘基。肽或多肽的類似物可以是天然存在的，諸如等位基因 變體，或者它可以是還未發現天然存在的變體。通過直接合成、通過修飾或通過誘變技術可 以制造肽的非天然存在的類似物。包括大分子的結構部分的身份取決于大分子的性質并且可能包括大分子的一級 結構、二級結構和/或三級結構的區域。例如，對于多肽大分子而言，結構部分可以是構 成多肽的個體氨基酸，或者可選地，如果多肽具有幾個結構域，則結構部分可以是個體結構 域。例如，多肽可以被視為由以上描述的個體氨基酸或結構域和/或糖或寡糖結構部分構 成；多核苷酸大分子可以被視為由個體核苷酸結構部分構成。根據本發明的大分子可以源 自實際上任何來源。它們可以從天然來源諸如生物樣品或合成來源獲得。生物膜(biofilm)是由外泌多糖(EPS)基質結合在一起的細菌聚集物，所述外泌 多糖基質是由分泌的蛋白和/或多糖聚合物構成。在感染期間，生物膜基質充當避風港，保 護細菌細胞免受抗生素、免疫細胞和抗微生物因子。在一些實施方案中，MIP以與細菌相關 的多糖和/或蛋白為靶。這些多糖和/或蛋白可以是生物膜或細菌本身的部分(例如，許 多細菌具有多糖包被)。每個細菌物種的生物膜的組成被認為是獨有的。例如，組成EPS的化學物質、多 糖、蛋白等等對于個體細菌而言是不同的。因此，以細菌生物膜的獨有組分為靶的MIP可能 允許細菌的物種特異性檢測。由細菌展示的細胞表面多糖和/或蛋白可能對于每個細菌物 種而言也是獨有的。例如，金黃色葡萄球菌(S. aureus)具有用于結合纖連蛋白的獨有的 細胞表面纖連蛋白結合蛋白(FnBP) ο例如，由M. Huesca等人，Infection & Immunity，卷 68:3，第 1156-1163 頁(2000 年 3 月)和 Q. Sun 等人，Infection & Immunity，卷 652，第 537-543頁(1997年2月)公開了金黃色葡萄球菌!^BP的多種表位。以金黃色葡萄球菌FnBP的這些表位為靶的MIP可以用于金黃色葡萄球菌的物種特異性檢測。細菌上的細胞表面蛋白還包括許多細胞表面粘附分子，這些粘附分子介導細菌與 生物膜基質的粘附。例如， ^ηΒΡ是細菌最初附著于宿主所需的MSCRAMM蛋白(識別粘附基 質分子的微生物表面組分)家族的一員，提供了建立感染的關鍵步驟。這一家族的成員的 其他實例包括金黃色葡萄球菌的聚集因子A(ClfA)和表皮葡萄球菌(S^pidermidis)的 SdrG蛋白。在一些實施方案中，MIP可能以細菌產生的內生孢子上的大分子為靶。例如，艱 難梭菌(C. difficile)是已知產生內生孢子的細菌物種。內生孢子是由某些細菌產生的確 保細菌存活通過環境應力期的堅固的休眠結構。因此它們對紫外線和、輻射、干燥、溶菌 酶、溫度、饑餓和化學消毒劑耐受。內生孢子通常見于土壤和水中，在那里它們可能存活較 長時間。因此，本文描述的發明的MIP可以用于檢測和/或鑒定各種環境中的細菌，包括以 浮游方式存在的細菌、其生物膜和/或其內生孢子。細菌的浮游形式是當細菌在液體基質 中漂浮或游動時的細菌形式。多種類型的細菌可以通過本發明的MIP檢測。這些細菌包括 金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)、腸球菌(Enterococcus)物種、耐 萬古霉素的腸球菌(VRE)、艱難梭菌(C. difficile)、銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)和大腸 桿菌(E. coli)。本發明的一個實施方案提供了利用MRSA細菌和/或生物膜的全部或部分作為模 板分子制造對MRSA特異的MIP的方法。在一個實施方案中，本發明的方法包括制造對MRSA細菌和/或生物膜特異的MIP， 包括產生對應于與MRSA細菌和/或生物膜相關的大分子的全部或部分的模板并利用這種 模板制造MIP。在一個實施方案中，本發明提供了鑒定MRSA細菌和/或生物膜的方法，所述方法 包括利用能夠結合PBP2a的全部或部分的MIP。在另一個實施方案中，本發明提供了鑒定MRSA細菌和/生物膜的方法，所述方法 包括利用能夠結合選自由以下組成的組的氨基酸序列的MIP :SEQ ID NO=USEQ ID NO :2、 SEQ ID NO 3, SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO :9,SEQ ID NO :10,SEQ ID N0:11、SEQ ID NO :12,SEQ ID NO :13,SEQ ID NO :14 禾口 /或它們的片段。類似地，可以利用與各種微生物有關的如以上所述的各種大分子作為產生MIP的 模板來鑒定和/或檢測所述微生物。大分子的非限制性實例包括用于檢測病毒的衣殼蛋白 或被膜蛋白以及用于檢測寄生蟲的表面外殼糖蛋白。可選地，本發明的MIP與轉導元件相偶聯，以響應于MIP與所述模板或靶分子的結
合產生可測量的信號。轉導元件的適合的實例包括但不限于HABA[2G’-羥基偶氮苯)_苯甲酸]、染料、 熒光劑、熒光染料、放射性標記、磁性顆粒、金屬顆粒、有色顆粒、金屬溶膠、酶底物、酶、化學 發光物、光敏劑和可懸浮顆粒。 在一些實施方案中，可檢測信號可能是可見物質，諸如有色乳膠珠，或者它可以參 與借以產生有色產物的反應。反應產物在用裸眼觀察時可能是可見的，或者例如在暴露于 專門的光源諸如紫外光時可能是清楚的。
模板或靶分子的濃度可以由與轉導元件相關的可檢測信號的量指示。另外，經由MIP的靶檢測可以以多種途徑發信號。在一些情況下，檢測信號可以被 目測(例如，發光或顏色變化)。利用MIP提供顏色改變反應的一種這樣的技術在George Μ· Murray 博士的名為"Molecularly Imprinted Polymer Sensor Aerosol (分子印跡聚合 物傳感器氣溶膠)”的文件中被解釋，該文獻通過引用整體并入本文。使用卟啉與MIP引起 電磁輻射的吸收/發射的變化的技術在美國專利第6，872，786號中被解釋，該文獻描述使 用卟啉與MIP的技術的部分通過引用并入本文。在靶檢測時使用MIP產生發光的一些技 術在以下文獻中被解釋美國專利第6，749，811號，該文獻描述使用MIP的靶檢測的部分 通過引用并入本文；A. L. Jenkins等人，Anal. Chem.，卷71 2，第373-378頁(1999)；以及 B. R-Arnold 等人，Johns Hopkins APL Technical Digest，卷 20 2，第 190-198 頁(1999)。 可以對任何前述技術進行改變以用于本發明的MIP。例如，根據本發明的一個方面的MIP可以通過以下步驟制備(A)提供可聚合的 卟啉衍生物與模板分子的反應產物；(B)使步驟(A)的反應產物與單體和交聯劑共聚來形 成聚合物；以及(C)從該聚合物移除模板分子以提供分子印跡聚合物，所述分子印跡聚合 物表現出對模板分子的選擇性結合親和力并且在與靶分子結合時經歷電磁輻射的吸收和/ 或發射上的可檢測的變化。用于制備MIP的聚合反應混合物因此組成了步驟(A)的反應產 物、一種或多種可聚合的單體、對聚合物終產物賦予足夠堅硬的結構的有效量的一種或多 種交聯劑、惰性溶劑以及自由基或其他適當的引發劑。單體和交聯劑的混合物可用在聚合 方法中。根據所選擇的可聚合的卟啉、單體和交聯劑的特定性質/反應性以及特定的傳感 器應用和聚合物/傳感器最終被采用的環境，可聚合的卟啉、單體和交聯劑的量可以廣泛 地改變。可以改變每種反應物的相對量以達到在聚合物支持結構中的卟啉的期望濃度。可 以改變聚合的溶劑、溫度和手段以獲得具有最佳物理特征或化學特征例如孔隙率、穩定性 和親水性的聚合物材料。溶劑的選擇也可以基于其溶解反應混合物的所有各種組分的能 力。此外，根據本文描述的發明的另一個實施方案，MIP包括含鑭系元素的聚合結構， 所述結構表現出對被本文描述的發明的傳感器裝置或試劑盒檢測的靶的選擇性結合特點。 聚合步驟包括使螯合的鑭系元素模板絡合物與一種或多種交聯的單體以及任選的一種或 多種另外的基質單體共聚來形成聚合物結構。能夠在溶液中離解形成鑭系元素離子的廣泛 范圍的鑭系元素金屬鹽中的任何一種及其兩種或多種的組合適合于在本文描述的發明中 使用。適合的鑭系元素鹽的實例包括但不限于鑭(La)、鈰(Ce)、鐠(ft·)、釹(Nd)、钷(Pm)、 釤(Sm)、銪(Eu)、釓(Gd)、鋱(Th)、鏑(Dy)、鈥(Ho)、鉺(Er)、銩(Tm)、鐿( )和镥(Lu)的 鹵化物、硝酸鹽、高氯酸鹽以及類似物。MIP可以用作通過使這些分子與MIP鑭系元素結合 位點締合來選擇性捕獲靶的光學傳感器裝置的部分。這些MIP充當發光源，可以對發光進 行分析來確定溶液中靶的量。可以根據本文描述的發明使用廣泛范圍的適合檢測器的任 何一種。適合的檢測器的非限制性實例包括分光光度計，分光儀(氣體分光儀或質量分光 儀)，光電倍增管，配備CCD照相機的單色儀、濾波器、裸眼，以上兩種或多種的組合，以及類 似檢測器。本文描述的發明另外呈現了形成基于位點選擇性標簽和模板的分子印跡聚合物 (SSTT-MIP)的可靠的化學傳感器平臺的方法。在本方法中使用的SSTT-MIP策略提供了形成具有對分析物特異的模板位點且報告分子也能夠與之相連的MIP。以這種方式，分析物檢 測能夠以與對這種定位沒有任何規定的方法相比更高的效率進行。對于本發明，預期改善 了諸如信號背景比和信噪比的測量特點。本發明還提供了分子印跡聚合物平臺，其中對于特定靶分子形成了模板位點。在 一個實施方案中，可以提供聚合物平臺，其中模板位點具有與該位點的反應基團鍵連的至 少一個報告分子。在一個實施方案中，聚合物平臺包括干凝膠和氣凝膠。由Bright等人在 美國公開號2005/0227258中描述了開發用于檢測廣泛范圍的靶的傳感器的方法，該文獻 描述特定靶分子的模板位點的開發的部分通過引用并入本文。例如，選擇模板以使得該模板與聚合物平臺形成鍵，該鍵的數目超出結合的靶將 形成的鍵的數目。模板可以具有至少一個另外的反應基團以便能夠在相對于預定靶的另外 位點結合聚合物基質。在一個實施方案中，模板上連接模板與聚合物平臺的反應基團的數 目比對應靶上的反應基團數目多出至少一個。模板的移除在聚合物平臺內產生腔。暴露在 每個模板位點的是負責靶識別的反應基團。然而，由于上面提及的另外的反應基團的緣故， 當模板從腔裂解時，腔含有超過結合靶所需的基團的一個或多個反應基團。額外的基團用 來與報告分子成鍵。一旦報告分子在模板位點被結合，可以測量來自結合靶的MIP的吸光 度/發光，并且報告子的UV、可見的或頂吸光度/發光特性(例如，吸收光譜、激發光譜和 發射光譜、激發態的發光壽命和/或發光偏振)的變化指示在模板位點靶的存在。在吸光 度/發光上的總變化一般與樣品中靶分子的濃度成比例。本發明的MIP可以被用于診斷感染微生物的受試者，包括使從所述受試者獲得的 生物樣品接觸一種或多種MIP，并且檢測和/或鑒定所述生物樣品中所述微生物的存在。診 斷方法包括測量從所述患者獲得的生物樣品或生物流體中的所述微生物的全部或部分、或 與所述微生物相關的大分子的全部或部分的水平。本發明的MIP也可以被用于確定受試者中與微生物相關的感染的發生、進展或退 行，其中通過使從受治療者獲得的生物樣品接觸一種或多種MIP，對所述生物樣品進行所述 微生物的全部或部分、或與所述微生物相關的大分子的全部或部分的篩選。如本文所用，短語“生物樣品”包括從受試者獲得的并且在本發明的程序中有用的 多種樣品類型。生物樣品可以包括但不限于固體組織樣品、液體組織樣品、生物流體、抽吸 物、細胞和細胞片段。生物樣品的具體實例包括但不限于通過手術移除獲得的固體組織樣 品、病理學樣本、存檔樣品、或活檢樣本、組織培養物或自其獲取的細胞及該細胞的子代、以 及由這些來源的任何一種制備的切片或涂片。生物樣品的非限制性實例包括從乳房組織、 淋巴結和乳房腫瘤獲得的樣品。生物樣品還包括從脊椎動物身體獲取的任何材料，包括但 不限于血液、腦脊液、血清、血漿、尿、乳頭抽吸物、細針抽吸物、組織灌洗液諸如乳管灌洗 液(ductal lavage)、唾液、痰、腹水液、肝、腎、乳房、骨、骨髓、睪丸、腦、卵巢、皮膚、肺、前列 腺、甲狀腺、胰、宮頸、胃、腸、結腸直腸、腦、膀胱、結腸、鼻孔、子宮、精液、淋巴、陰道混合物 (vaginal pool)、滑液、脊髓液、頭和頸、鼻咽腫瘤、羊膜液、母乳、肺痰或肺表面活性物、尿、 糞便和其他生物起源的液體樣品。可以提供如本文描述的發明中的MIP以在多種介質、傳感器、裝置或產品中使用。 例如，本發明的MIP可以被包含在溶液中。像這樣，可以將溶液噴灑到物品上檢測靶微生 物，例如細菌、其生物膜和/或其內生孢子。在一些實施方案中，溶液還可以包含抗微生物劑(例如，抗生素)。可以在各種物品上檢測微生物，諸如醫院的環境表面、運動設備或醫療 裝置。基于MIP的傳感器的一些實例描述在美國專利第5，587，273,6, 680，210,6, 833，274、 6，967，103,6, 749，811和6，461，873號中；該文獻描述基于MIP的傳感器的部分通過引用 特定地并入本文。在醫院，微生物從環境表面轉移至患者大部分是通過手同表面接觸。盡管手部衛 生對于使傳遞的影響最小化是重要的，適當清潔和消毒環境表面是減少環境表面對健康護 理相關感染的發生率的潛在貢獻的基本措施。因此，在此描述的發明的MIP產品包括但不 限于用設計為檢測微生物的MIP的溶液浸漬的擦手物(hand-wipe)，如果微生物存在于臨 床工作人員的手上，擦手物可以通過改變顏色幫助確定他們的手沒有微生物；可以用在高 觸摸區域(例如，床欄桿、門把手、計算機鍵盤等等)中的溶液的噴霧。這些MIP產品可以 用來顯示清潔工作的效果。這些MIP產品可能在疫情調查中也是有價值的。例如，通過能 夠區分不同的微生物，例如MRSA、VRE、大腸桿菌等等，有可能追蹤微生物傳播的途徑。同樣， 這些MIP產品可以用作培訓醫務人員的教育工具。本文描述的發明還提供了包含用于特異性檢測、鑒定和/或定量微生物的以上所 述的MIP的試劑盒。這些試劑盒包括但不限于具有與移動固相材料或固定固相材料諸如 乳膠珠、玻璃纖維、玻璃珠、纖維素條或硝化纖維素膜相連的一種或多種MIP的浸漬片、側 流、流通(flow-through)和遷移裝置，如在美國專利第 3，802，842,3, 915，639,4, 059，407、 4，373，932,4,689，309,4,703，017 號；4，743，560,4,770，853,5,073，484,5,075，078 ； 5，096，837,5, 229，073,5, 354，692,7, 109，042 號、WO 88/08534 和 WO 08/007359 中描述的， 這些文獻描述上述試劑盒和裝置的構建和功能的部分通過引用并入本文。諸如由Hochstrasser (美國專利第4，059，407號)公開的浸漬片裝置被設計為浸 沒在流體生物樣品中并給出對該流體中的靶的半定量估計。浸漬片實質上是側流裝置，其 應用方法涉及將該裝置浸沒在液體樣品中。在浸漬片裝置領域同樣感興趣的是美國專利第 3，802，842,3, 915，639 和 4，689，309 號。側流裝置(參見美國專利第5，075，078 ；5, 096，837 ；5, 354，692 和 5，229，073 號)
一般包括含有相關的特異性試劑的多孔基質，上述多孔基質在固體條諸如塑料上分層。代 替使樣品垂直吸上“浸漬片”，側流形式允許樣品通過毛細管作用側向流過多孔的固相材 料，經過一種或多種與靶(如果它在樣品中存在的話)相互作用的試劑。可視信號(由有 色珠、酶促反應或其他形成顏色的反應產生)指示靶的存在。在流通類型裝置中，應用的測試樣品流過多孔材料，使樣品中的靶接觸包含在該 多孔材料中的特異性試劑，最終在該多孔材料上產生可視信號，該可視信號提供了樣品中 存在靶的指示。在遷移測定裝置中，無需添加外部試劑的測試結果的可視檢測是通過加入與有色 標記偶聯的試劑(即結合物)實現的，從而允許對測定結果的可視檢測而無需添加其他物 質。這些標記包括但不限于金溶膠顆粒、染料溶膠顆粒和染色膠乳。在一個實施方案中， 在此描述的發明的診斷測試裝置包括用于樣品和結合的試劑的兩種不同途徑。本發明的一個實施方案提供了定量色譜測試條。該裝置包括這樣的條通過毛細 管作用使樣品溶液移動至包含試劑的條中的區域，這些試劑在靶的存在下產生可檢測的信 號。
本發明的另一個實施方案公開了包含固體支持體的色譜測試條，所述固體支持體 具有允許在多種免疫測定中有用的毛細管流的兩個部分。第一部分包括可移動的示蹤物并 且第二部分包括能夠結合靶的固定的結合物(binder)。試劑浸漬的測試條已被用在各種特異性結合測定中。樣品被應用到測試條的一 個部分上并遷移通過多孔條材料，在某些情況下遷移借助于洗脫溶劑諸如水。樣品前進進 入或通過檢測區，在檢測區固定了所檢驗的靶的特異性結合試劑。樣品中存在的靶然后陷 入在檢測區域中。通常通過使用在測試條中摻入或隨后應用的標記試劑來確定結合的靶的 量。多種標記，諸如放射性標記、生色團、有色顆粒(金、膠乳)、酶和熒光標記可以用在這些 測定中。在大多數情況下，檢測結合劑是分析物特異性抗體。此外，在一個實施方案中，本發明涉及包含能夠運送液體樣品通過其中的固體支 持體的診斷裝置，樣品是通過毛細管作用沿著或通過固體支持體在液體路徑中可移動的。 支持體包括(a)限定的樣品應用區，該區用于應用樣品到裝置并且使樣品接觸固體支持 體；(b)樣品應用區下游的限定的MIP-結合物區域，該MIP-結合物區域包含在樣品流動路 徑上固定于固體支持體的靶特異性MIP。MIP具有以干燥狀態的可釋放的靶類似物報告子 結合物飽和的靶特異性結合位點。靶對靶特異性MIP的結合位點的親和力比靶類似物報 告子結合物對靶特異性MIP的結合位點的親和力大。MIP當與包含靶的液體樣品接觸時能 夠結合靶并以與特異性靶的濃度直接成比例的量替換靶類似物報告子結合物，促使被替 換的靶類似物報告子結合物在液體流路徑中向下游流動；(C)MIP結合物區下游的限定的 結果區，該結果區包含在樣品的流動路徑上固定于固體支持體的靶類似物報告子結合物 結合元件。當包含靶的液體樣品在流動路徑區流動時，報告子結合物結合元件能夠結合從 MIP-結合物區域替換的靶類似物報告子結合物，以提供指示樣品中的靶的存在或濃度的 可檢測信號。任選地，固體支持體還包括用于在確定測試的樣品中靶的存在或半定量中建 立參考點的參考區，其中參考區不能通過特異性結合來捕獲所述樣品中的任何化合物。支 持體還可以任選地包括陽性對照區，所述陽性對照區包括用于產生陽性對照的手段，陽性 對照證實靶類似物報告子結合物的正確流動以及與結果區的結合，從而確定測試正在進 行。另外，支持體可以任選地包括吸收區，所述吸收區包含當其和固體支持體潮濕時處于與 固體支持體的流體連通的吸收材料墊，該墊具有足以吸收過量液體的孔隙率和容量。在一個實施方案中，本文描述的傳感器裝置包括分子印跡聚合物，所述分子印跡 聚合物包含螯合的鑭系元素，能夠結合待檢測的靶，并且與以下可操作地相關聯用于產生 分子印跡聚合物的螯合鑭系元素的激發能量的光源，其中激發能量的至少一部分是吸收的 分子印跡聚合物；以及用于檢測激發時由螯合的鑭系元素產生的發光能量的檢測器。應理解，鑒于本文包含的教導內容，本發明的教導內容應用于具體的問題或環境 將在本領域普通技術人員的能力之內。通過以下非限制性實例對本發明進行更完全地展
7J\ ο
實施例實施例1如在圖1中所展示的那樣，本文描述的發明的MIP可以通過產生靶分子的部分的 模板并在這種模板的存在下聚合功能單體來制造。功能單體能夠結合模板分子上的活性位點，然后在過量交聯劑的存在下聚合。雖然聚合可在模板分子的存在下實施，隨后模板分子 的移除可以留下具有與模板分子的官能團互補的官能團的形狀和排列的腔。因此，得到的 MIP能夠展現緊密地再結合模板分子的能力和選擇性。實施例2圖2A和2B展示了利用本發明的MIP檢測細菌的示意圖。在鑒定與細菌相關的獨 有的大分子后，可以產生包含一個或多個表位的大分子的部分的模板。功能單體可以在模 板分子的存在下聚合以使得單體結合模板分子上的活性位點，單體可以在過量交聯劑的存 在下被進一步聚合。隨后模板分子的移除(圖2A)能夠留下具有與微生物獨有的大分子的 部分的官能團互補的官能團的形狀和排列的腔。得到的印跡聚合物可因此表現出緊密結合 與微生物相關的大分子的部分的能力和選擇性，并鑒定所述微生物(圖2B)。實施例3利用MIP檢測耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)本發明的一個實施方案包括利用產生的結合PBP2A的MIP檢測MRSA。特 別地，可以利用與PBP2A內的不同氨基酸序列對應的表位氨基酸序列作為模板分 子來產生MIP。例如，模板分子可以被設計成包含氨基酸序列(請參見以下表1) MKKIKIVPLILIVVVVGFGIYFYAS(SEQ ID NO 1) ；KKIKIVPL(SEQ ID NO 2) ；KIKIVPLI(SEQ ID NO 3) ；QNWVQDDTF(SEQ ID NO 4) ； KEYKGYKDDAVIGK(SEQ ID NO 5) ； EYKGYKDD(SEQ ID NO: 6) ；YKGYKDDA(SEQ ID NO 7) ；DKKEPLLNKFQITTS(SEQ ID NO 8) ；KEPLLNKF(SEQ ID NO: 9) ；EPLLNKFQ(SEQ ID NO :10) ；PLLNKFQI(SEQ ID NO :11) ；GYNVTRYEVVN(SEQ ID NO :12)； GVGEDIPSDYPFYNAQILD (SEQ ID NO 13) ；DYPFYNAQ (SEQ ID NO :14)和 / 或它們的片段，它們 唯一地提供具有對PBP2A的特異性的表面印跡。利用這些氨基酸序列作模板產生的MIP可 以用于檢測和鑒定MRSA細菌和/或生物膜。在本說明書中提及的所有的出版物、專利和專利申請都指示本發明所屬領域的技 術人員的技術水平，并且都通過引用并入本文至如同具體且單獨地指明每個個體出版物、 專利或專利申請通過弓I用并入的程度。可以做出修改而不背離本發明的基本精神。因此，本領域的技術人員將理解在所 附權利要求的范圍之內，可以不同于本文具體描述來實施本發明。
權利要求
1.一種分子印跡聚合物(MIP)，所述分子印跡聚合物能夠結合與耐甲氧西林的金黃色 葡萄球菌(S. aureus) (MRSA)相關的大分子的全部或部分。
2.如權利要求1所述的MIP，其中所述大分子是青霉素結合蛋白2a(PBP2a)。
3.如權利要求1所述的MIP，其中大分子的所述部分選自由以下組成的組SEQID NO 1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、 SEQ ID NO 8,SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10,SEQ ID NO =IUSEQ ID NO 12,SEQ ID N0:13、 SEQ ID NO 14以及它們的片段。
4.如權利要求1所述的MIP，其中所述MIP包含轉導元件，以響應于MRSA與所述MIP 的結合而產生可測量的信號。
5.如權利要求2所述的MIP，其中PBPh與所述MIP的結合產生檢測信號。
6.如權利要求5所述的MIP，其中選自由以下組成的組的大分子的所述部分的結合產 生檢測信號SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6,SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10,SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14 以及它們的片段。
7.一種檢測生物樣品中的MRSA的方法，所述方法包括使所述生物樣品接觸能夠結合與耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)相關的大分子 的全部或部分的MIP。
8.如權利要求7所述的方法，其中所述大分子是青霉素結合蛋白M(PBPh)。
9.如權利要求7所述的方法，其中大分子的所述部分選自由以下組成的組SEQID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO :8, SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO :14以及它們的片段。
10.一種檢測生物樣品中的MRSA生物膜的方法，所述方法包括使所述生物樣品接觸能夠結合與耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)或所述生物膜 相關的大分子的全部或部分的MIP。
11.如權利要求10所述的方法，其中所述大分子是青霉素結合蛋白2a(PBP2a)。
12.如權利要求10所述的方法，其中大分子的所述部分選自由以下組成的組SEQID NO =USEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO :8, SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO :14以及它們的片段。
13.一種診斷感染MRSA的患者的方法，所述方法包括使從所述患者獲得的生物樣品接觸一種或多種MIP并且檢測所述生物樣品中MRSA的 存在，其中所述一種或多種MIP能夠結合與MRSA相關的大分子的全部或部分。
14.如權利要求13所述的方法，其中所述大分子是青霉素結合蛋白2a(PBP2a)。
15.如權利要求13所述的方法，其中大分子的所述部分選自由以下組成的組SEQID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO :8, SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO :14以及它們的片段。
16.一種分子印跡聚合物(MIP)，所述分子印跡聚合物能夠結合微生物。
17.如權利要求16所述的MIP，其中所述微生物選自由以下組成的組原核生物、真核 生物、病毒和朊病毒。
18.如權利要求16所述的MIP，其中所述MIP能夠結合所述微生物獨有的大分子的全 部或部分。
19.如權利要求18所述的MIP，所述MIP能夠特異性結合所述大分子的表位。
20.如權利要求18所述的MIP，其中所述大分子選自由以下組成的組外泌多糖、多糖、 蛋白、糖蛋白、肽聚糖、脂蛋白、肽、多肽和多核苷酸。
21.如權利要求16所述的MIP，其中所述MIP包含一種或多種轉導元件，以響應于MIP 與所述微生物的結合而產生可測量的信號。
22.如權利要求21所述的MIP，其中所述信號選自由以下組成的組比色信號、熒光信 號、放射性信號和酶信號。
23.一種檢測或鑒定微生物的方法，所述方法包括使一種或多種分子印跡聚合物(MIP)接觸所述微生物。
24.如權利要求23所述的方法，其中所述微生物選自由以下組成的組原核生物、真核 生物、病毒和朊病毒。
25.如權利要求23所述的方法，所述方法包括鑒定所述微生物獨有的大分子的全部或 部分。
26.如權利要求25所述的方法，其中所述MIP特異性結合所述大分子的表位。
27.如權利要求25所述的方法，其中所述大分子選自由以下組成的組外泌多糖、多 糖、蛋白、糖蛋白、肽聚糖、脂蛋白、肽、多肽和多核苷酸。
28.如權利要求23所述的方法，其中所述MIP包含一種或多種轉導元件，以響應于MIP 與所述微生物的結合而產生可測量的信號。
29.如權利要求觀所述的方法，其中所述信號選自由以下組成的組比色信號、熒光信 號、放射性信號和酶信號。
30.一種診斷感染微生物的患者的方法，所述方法包括使從所述患者獲得的生物樣品接觸一種或多種分子印跡聚合物(MIP)并且檢測所述 生物樣品中所述微生物的存在。
31.如權利要求30所述的方法，其中所述微生物選自由以下組成的組原核生物、真核 生物、病毒和朊病毒。
32.如權利要求30所述的方法，所述方法包括鑒定所述微生物獨有的大分子的全部或 部分。
33.如權利要求32所述的方法，其中所述MIP特異性結合所述大分子的表位。
34.如權利要求32所述的方法，其中所述大分子選自由以下組成的組外泌多糖、多 糖、蛋白、糖蛋白、肽聚糖、脂蛋白、肽、多肽和多核苷酸。
35.如權利要求30所述的方法，其中所述生物樣品選自由以下組成的組生物流體、組 織提取物或組織。
36.如權利要求35所述的方法，其中所述生物流體選自由以下組成的組血液，腦脊 液，血清，血漿，尿，乳頭抽吸物，細針抽吸物，組織灌洗液，唾液，痰，腹水液，精液，淋巴，陰 道混合物，滑液，脊髓液，羊膜液，母乳，肺痰或肺表面活性物，尿，糞便，從以下任何部位收集的流體肝、腎、乳房、骨、骨髓、睪丸、腦、卵巢、皮膚、肺、前列腺、甲狀腺、胰、宮頸、胃、腸、 結腸直腸、腦、膀胱、結腸、鼻孔和子宮、頭和頸、鼻咽腫瘤，以及其他生物起源的液體樣品。
37.如權利要求30所述的方法，其中所述MIP包含一種或多種轉導元件，以響應于MIP 與所述微生物的結合而產生可測量的信號。
38.如權利要求37所述的方法，其中所述信號選自由以下組成的組比色信號、熒光信 號、放射性信號和酶信號。
39.一種試劑盒，所述試劑盒包含用于檢測或鑒定微生物的MIP。
40.如權利要求39所述的試劑盒，其中所述微生物選自由以下組成的組原核生物、真 核生物、病毒和朊病毒。
41.如權利要求39所述的試劑盒，所述MIP能夠鑒定所述微生物獨有的大分子的全部 或部分。
42.如權利要求41所述的試劑盒，其中所述MIP特異性結合所述大分子的表位。
43.如權利要求39所述的試劑盒，其中所述MIP包含一種或多種轉導元件，以響應于 MIP與所述微生物的結合而產生可測量的信號。
44.如權利要求43所述的方法，其中所述信號選自由以下組成的組比色信號、熒光信 號、放射性信號和酶信號。
全文摘要
本文描述的發明提供了能夠結合微生物的分子印跡聚合物(MIP)和利用分子印跡聚合物(MIP)檢測和/或鑒定微生物的方法。本發明的微生物包括原核生物、真核生物、病毒和朊病毒。本發明的方法包括檢測與微生物有關的大分子的全部或部分，包括表位。本發明的大分子包括與所述微生物相關的多糖、蛋白、糖蛋白、肽聚糖、脂蛋白、肽、多肽和多核苷酸。本發明還提供了利用MIP診斷感染微生物的受試者的方法，另外還有診斷試劑盒。
文檔編號G01N33/68GK102105493SQ200980129629
公開日2011年6月22日 申請日期2009年6月26日 優先權日2008年6月27日
發明者羅伯特·L·瓊斯 申請人:哥倫比亞生物系統公司