質譜分析的制作方法

專利名稱：質譜分析的制作方法
質譜分析本發明涉及通過質譜法檢驗靶分析物，特別是生物分子，例如核酸和蛋白質的方 法。具體地說，本發明涉及利用同量異序質量標簽(isobaric mass labels)的多重串聯質 譜法。本發明還涉及檢驗一個或多個靶分析物的質譜裝置。本領域已知標記感興趣分子的各種方法，包括放射性原子、熒光染料、發光試劑、 電子捕獲試劑和光吸收染料。這標記系統各自具有的特征使其適于某些應用，而不適于其 它領域。最近，質譜法領域開發了檢測可切割地連接于它們相關的感興趣分子的標記物的 方法。對于諸如核酸分析等許多應用，可從間接標記測定分析物的結構。這對于應用質 譜法尤其有利，因為復雜的生物分子，例如DNA具有復雜的質譜且檢測靈敏度較低。間接 檢測意味著可利用相關標記分子鑒定原始分析物，其中為靈敏檢測和簡單質譜而設計標記 物。簡單質譜表示可利用多種標記物同時分析多個分析物。PCT/GB98/00127描述了共價連接于可切割標記物的核酸探針陣列，而所述標記 物可通過鑒定共價相連核酸探針的序列的質譜法來檢測。該申請的標記探針具有結構 Nu-L-M，其中Nu是共價連接于L (可切割接頭)的核酸，而L共價連接于M(質量標簽)。該 申請中優選的可切割接頭在質譜儀的離子源內切割。優選的質量標簽是取代的多-芳基 醚。該申請公開了各種電離方法和通過四極質量分析器、飛行時間(TOF)分析器和扇形磁 場分析器作為通過質譜法分析質量標簽的具體方法來分析。PCT/GB94/01675公開了可切割地連接于質量標簽分子的配體，特別是核酸。優選 的可切割接頭是光-可切割的。該申請公開了基體輔助激光解吸電離(MALDI)飛行時間 (TOF)質譜法作為通過質譜法檢驗質量標簽的具體方法。PCT/US97/22639公開了可釋放的不揮發質量標簽分子。在優選的實施方式中，這 些標記物包含聚合物，通常是可切割地連接于反應基團或配體，即探針的生物聚合物。優選 的可切割接頭看來是化學或酶學可切割的。該申請公開了 MALDI TOF質譜法作為通過質譜 法分析質量標簽的具體方法。PCT/US97/01070、PCT/US97/01046 和 PCT/US97/01304 公開了可切割地連接于質
量標簽分子的配體，特別是核酸。優選的可切割接頭看來是化學或光可切割的。該申請公 開了各種電離方法和通過四極質量分析器、TOF分析器和扇形磁場分析器作為通過質譜法 分析質量標簽的具體方法來分析。這些現有技術申請無一提及利用標記生物分子的串聯或連續質量分析。Gygi等(Nature Biotechnology 17 :994_999，“利用同位素編碼的親和力標簽定 量分析復雜蛋白質混合物(Quantitative analysis of complex proteinmixtures using isotope-coded affinity tags) ” 1999)公開了利用“同位素編碼的親和力標簽”從蛋白質 中捕獲肽以便作蛋白質表達分析。在該篇文章中，作者描述了利用與硫醇反應的生物素接 頭捕獲其中含半胱氨酸的肽。一種來源的蛋白質樣品與生物素接頭反應并用內肽酶切割。 然后利用親和素化珠分離含生物素化半胱氨酸的肽以便通過質譜法作后續分析。可用生物 素接頭標記一種樣品，而用氘化形式的生物素接頭標記第二樣品來定量比較兩種樣品。然后樣品中的各肽在質譜圖中表示為一對峰。質譜圖中對應于各標簽的諸峰的積分表明連接 于標簽的肽的相對表達水平。選擇反應監測(SRM)和多反應監測(MRM)提供了能有效濾出所需分析物外的所有 分子和污染物的高度選擇性串聯質譜法。如果分析在確定分析窗內易具有幾種同量異序物 質的復雜樣品，這是非常有利的。通常將在質譜儀第一階段(本文稱為Ql 四極1，但也等 于非-四極質譜儀，例如離子阱等中的各階段)的前體(親代離子)選擇與該前體離子斷 裂成許多片段組合起來，這些片段中的一個或數個特定片段在隨后的MS-檢測步驟中(通 常在四極3，Q3)選擇并在離子檢測器處檢測。該兩步選擇確保檢測所需分析物并降低任何 其它離子物質的強度。信噪比遠優于常規MS/MS實驗，該實驗在Ql中選擇一個質量窗，然 后在離子檢測器中檢測所有產生的片段。原則上，依據MS的該方法可提供分析物的絕對結 構特異性，與合適的穩定同位素標記內標(SIQ聯用后，其可絕對定量分析物濃度。在常規SRM/MRM型實驗中，利用穩定同位素標記的參比產生用于相對參比定量測 定分析物的分析物/參比配對。對于蛋白質分析，此類參比肽與待檢測分析物的不同之處 僅在于摻入了同位素，從而使其在質量上明顯不同于Ql選擇，但在化學組成和理化特性上 相同。在典型的實驗中，選擇分析物/參比配對，即在Ql中在所述兩種質量之間轉變質量 選擇通道(massselection channel)。隨后使所述兩種離子斷裂產生不同(特異性)的片 段質量。然后選擇一種或多種合適的片段質量，其中Q3濾器維持在所選片段離子的位置， 因此確保該離子轉移至質量分析器，并濾出其它離子種類。設計改進的質量標簽以便采用質譜法鑒定分析物的最近工作致力于在質譜圖中 更易鑒定(而非其它污染物)的質量標簽。WO 01/68664公開了兩種或更多種質量標簽的集合，該集合中的各標記物包含通 過可切割接頭連接于質量標準化部分的質量標記物部分，所述質量標記物部分耐受斷裂。 該集合中各標記物的合計質量(aggregate mass)可以相同或不同，該集合中各標記物的質 量標記物部分的質量可以相同或不同。在具有共同質量的質量標記物部分的集合中的任何 組標記物中，各標記物的合計質量不同于該組中的所有其它標記物，在具有共同合計質量 的集合中的任何組標記物中，各標記物具有質量不同于該組中所有其它質量標記物基團的 質量標記物部分，從而該集合中所有的質量標簽可通過質譜法彼此區分。該申請還公開了 分析方法，包括通過質譜法鑒定分析物特有的質量標簽或質量標簽組合來檢測分析物。可 采用串聯質譜法。具體地說，用于檢測質量標簽的質譜儀可以是三重四極質量分析器，其包 括第一分析器以選擇特定質量或質量范圍的離子、第二質量分析器以解離所選離子和第三 質量分析器以檢測得到的離子。WO 03/025576公開了兩種或更多種質量標簽的集合，該集合中的各標記物包含通 過至少一個酰胺鍵連接于質量標準化部分的質量標記物部分。該質量標記物部分包含氨基 酸和含氨基酸的質量標準化部分。對于W001/68664，該集合中各標記物的合計質量可以相 同或不同，該集合中各標記物的質量標記物部分的質量可以相同或不同，從而該集合中所 有質量標簽可通過質譜法彼此區分。對于WO 01/68664，該申請還公開了可包括串聯質譜法 的分析方法。該申請尤其涉及分析肽和含質量標準化部分及質量標記物部分的質量標簽， 所述質量標記物部分含至少一個氨基酸。W02007/0U849公開了具有通用化學式的質量標 簽和反應性質量標簽以便標記生物學分子并通過質譜法檢測。該發明的質量標簽和反應性質量標簽在質譜圖中清晰鑒定并易與分析物反應。對于WO 01/68664，該申請還公開了可包 括串聯質譜法的分析方法。在二十世紀90年代后期，同量異序質量標簽的開發使生物標志發現產生革命性 變革。在一次LC-MS/MS流程中能分析多種樣品(理論上無限數量)增加了處理量，同時降 低分析差異。因此，需要通過質譜法定量檢測和常規檢測各種樣品中的分析物的改進方法。雖然WO 01/68664、WO 03/02557和WO 2007/0U849提供的質量標簽能顯著改善 通過質譜法分析分析物的方法，但仍需要提供通過質譜法鑒定此類質量標簽來檢測分析物 的改進方法。具體地說，雖然這些新質量標簽和分析方法能同時和定量分析多種樣品而不 顯著增加質譜圖的復雜性，但采用已知的串聯質譜法分析同量異序質量標簽提供的復雜樣 品的結果可能不精確。本領域仍需要提供能在質譜儀中簡單鑒定質量標簽并靈敏定量測定 的改進分析方法。因此，本發明的目的是解決本領域中現有技術的問題并提供通過質譜法檢驗靶分 析物的方法。在第一方面，本發明提供檢驗靶分析物的方法，該方法包括(a)提供可包含靶分析物的多個樣品，其中各樣品用質量標簽或質量標簽的組合 作差異性標記，所述質量標簽來自質量標簽的集合，各質量標簽是包含質譜上不同的質量 標記物基團的同量異序質量標簽，從而可通過質譜法區分這些樣品；(b)混合所述多個標記樣品以產生分析混合物并將所述分析混合物引入質譜儀；(c)選擇具有該第一質荷比的離子，該第一質荷比等于用特定數量的質量標簽標 記的靶分析物的離子；(d)使該具有第一質荷比的離子斷裂成多個片段離子，其中所述多個片段離子的 一部分包含至少一個完整的質量標簽；(e)選擇具有第二質荷比的離子，該第二質荷比等于包含至少一個完整質量標簽 的靶分析物的片段的離子；(f)使具有該第二質荷比的離子斷裂成多個其它片段離子，其中所述其它片段離 子的一部分是所述質量標記物基團的離子；(g)產生在步驟(f)中產生的其它片段離子的質譜圖；和(h)由所述質譜圖測定各樣品中靶分析物的含量。本發明方法利用同量異序標記的樣品，通過定量測定感興趣分子而克服了本領域 的局限性，其中該方法包括選擇預定質荷比的離子的兩步驟，其后各自是斷裂步驟。與常規 串聯質譜(MS/MQ實驗相比，采用此類方法提供高度選擇性，因此，最終步驟中產生的質譜 圖提供更精確的定量結果。在利用同量異序質量標簽的常規串聯質譜(MS/MS)中，首先選擇與標記靶分析物 的質量相等的離子。選擇后，使標記分析物的離子斷裂，然后鑒定對應于質量標簽的質量標 記物基團的諸峰。然而，所得圖譜常因具有與所選質荷比相同質荷比的污染物的共同洗脫 片段而不能精確定量測定分析物。該問題在分析蛋白質的復雜混合物時產生。在復雜混合 物中，不同肽或肽片段可具有與靶分析物相同的質量。這些污染肽不能通過MS/MS與靶分 析物相區分，因為它們在選擇步驟中作為母體離子質荷比而一起選擇。因此，使母體離子斷 裂以釋放質量標簽的質量標記物基團會提供選擇的所有肽的質量標記物基團的圖譜，包括具有與靶分析物相同質量的污染性肽。本發明因額外的選擇(步驟e)和斷裂(步驟f)步驟而克服了 MS/MS的該局限 性。在步驟e)中，選擇與包含至少一個完整質量標簽的靶分析物片段的所需離子相等的質 荷比確保除去質譜圖中在Ql中(步驟c)選擇的大多數(即使不是全部)污染性分子。在 步驟d)中斷裂成多個片段并且無一具有與步驟e)中所選第二質荷比相等的質荷比的污染 性肽會除去。因此，斷裂步驟f)釋放的質量標記物基團僅來自靶分析物，所得質譜圖提供 靶分析物的高度改進的精確定量測定結果。本發明方法尤其有利于分析復雜樣品，因為額 外的選擇性程度提高了特異性。本發明方法成功地在SRM (選擇反應監測一種分析物)或MRM(多反應監測多 種分析物)的高靈敏度和選擇性之間產生組合，在用于定量測定目的的最終分析步驟中復用。步驟(h)中測定的量可以是各樣品中靶分析物的相對量或各樣品中靶分析物的
絕對量。本發明的其它優點是能一起分析多個樣品。所述多個樣品可以是可包含靶分析物 的測試樣品。術語“測試樣品”指可能存在分析物的任何樣本。測試樣品可僅包含一種分析物。 或者，測試樣品可包含多種不同分析物。在本發明的一個實施方式中，一個樣品是測試樣品，一個樣品是校準樣品，其中所 述校準樣品包含靶分析物的一個或多個不同試樣，各試樣具有已知量的該分析物，其中所 述測試樣品和所述校準樣品的各試樣作差異性標記。當存在一種或多種校準樣品時，本發明方法中的步驟h)最好包括根據校準樣品 中一個或多個試樣中分析物的已知和測定量校準測試樣品中分析物的含量。在優選的實施 方式中，該方法包括將各試樣中分析物的含量與通過質譜法測定的各試樣中分析物的含量 作圖的步驟。該步驟可簡單地包括計算和技術人員熟知的實施此類計算的數學程序或算 法。然后通過質譜法檢測樣品中的含量，根據校準圖計算樣品中分析物的含量。就本發明而 言，述及“通過質譜法檢測的含量”通常是通過質譜法檢測的涉及分析物含量的離子豐度、 離子強度或其它信號。該實施方式提供獨立于外部獲得的校準值的更精確定量測定結果， 因而提供更穩定而可靠的分析。不同的試樣各自具有不同的已知量的分析物。術語“已知量”表示校準樣品的各 試樣中分析物的絕對量或定性量已知。絕對量表示已知的數量。這考慮了待測定測試樣品中分析物的絕對量。本文中定性量表示數量并非絕對知曉，但可能是具有特定狀態的對象，例如健康 或患病狀態對象中預計的數量范圍，或取決于所研究的測試樣品類型的一些其它預計范 圍。由于各試樣含有不同量的分析物，其是“不同的”。一般通過從標準樣品取得不同體積 來實現這點，對于取得不同體積將確保各試樣中以所需比例存在不同量而無需知曉絕對量 的定性量尤其是這樣。或者，各試樣分別制備而不從同一樣品中取得。在一個實施方式中， 各不同試樣具有相同體積，但包含不同量的分析物。該校準樣品或各校準樣品優選包含靶分析物的兩種或更多種不同試樣。利用靶分 析物的兩種或更多種不同試樣能構建各分析物的多點標準曲線而不會增加MS復雜性。利用步驟g)中產生的質譜圖定量測定分析物，可同時定量測定和鑒定樣品和校準樣品中的 分析物。或者，僅測定分析物的含量。該方法為在一次實驗中檢測最多10種、最多20種、 最多50種或更多種分析物提供手段。除一個或多個校準樣品外，本發明方法可包括分析多個測試樣品。在該實施方式 中，優選檢驗所述多個測試樣品各自的相同分析物。待檢驗的各測試樣品優選利用相同的 校準樣品。通常向不同的各測試樣品中加入包含分析物的一種或多種試樣的已知體積的相 同校準樣品。該方法尤其可用于涉及患者的多種樣品的臨床研究。如果制備大量校準樣品 并取得各部分，多個實驗室可利用相同的校準樣品，從而促進交叉研究和交叉實驗室比較。 可利用一種或多種同量異序質量標簽差異性標記各測試樣品并在步驟b)中與一個或多個 校準樣品混合，在步驟h)中同時測定各樣品中的分析物含量。或者，可用相同質量標簽標 記各測試樣品，各不同測試樣品重復步驟b)到h)。在一個實施方式中，本發明方法可用于檢驗多個不同靶分析物。在一個實施方式 中，該方法包括為各靶分析物重復步驟(C)到(h)的步驟。在其中一種樣品是測試樣品的 該實施方式中，可為各不同分析物提供校準樣品。各校準樣品包含靶分析物的一個或多個 不同試樣，其中所述測試樣品和各校準樣品的各試樣作差異性標記。在一個實施方式中，多 種分析物是在步驟(a)之前通過化學或酶學加工蛋白質或多肽產生的蛋白質或多肽的肽 片段。在具體實施方式
中，所述多種分析物是相同蛋白質或多肽的肽。現在，參考以下附圖更詳細地描述本發明圖Ia顯示用兩種質量標簽的集合中的不同同量異序質量標簽標記的肽VATVSLPR 的MS/MS圖譜，各標記物代表預定相對量的肽(質量為126 127的質量標記物基團之比 為2 1)，圖Ib顯示圖Ia的圖譜的放大部分，其顯示質量標記物基團的諸峰。圖加顯示

圖1所分析的標記肽VATVSLPR的bl_離子的MS/MS圖譜；圖2b顯示圖 2a的圖譜的放大部分，其顯示質量標記物基團的諸峰。圖3顯示用六種質量標簽的集合中的不同同量異序質量標簽標記的肽VAFSLR的 MS圖譜，各標記物代表預定相對量的肽(質量為126 127 128 129 130 131的 質量標記物基團之比為1:3:5:5:3:1)。圖4顯示圖3所分析的標記VAFSLR肽的MS/MS圖譜。圖fe顯示圖3所分析的標記VAFSLR肽的不同質量標記物基團的MS/MS圖譜；圖 5b顯示圖3所分析的標記VAFSLR肽的不同質量標記物基團的MS/MS/MS圖譜。圖6顯示用六種質量標簽的集合中的不同同量異序質量標簽標記的肽AVFSLR的 MS圖譜，各標記物代表預定相對量的肽(質量為126 127 128 129 130 131的 質量標記物基團之比為1 1 1 4 4 4)。圖7顯示圖6所分析的標記AVFSLR肽的MS/MS圖譜。圖fe顯示圖6所分析的標記AVFSLR肽的不同質量標記物基團的MS/MS圖譜；圖 8b顯示圖6所分析的標記AVFSLR肽的不同質量標記物基團的MS/MS/MS圖譜。圖9顯示用六種質量標簽的集合中的不同同量異序質量標簽標記的肽FAVSLR的 MS圖譜，各標記物代表預定相對量的肽(質量為126 127 128 129 130 131的 質量標記物基團之比為4 4 4 1 1 1)。圖10顯示圖9所分析的標記FAVSLR肽的MS/MS圖譜。
圖Ila顯示圖9所分析的標記FAVSLR肽的不同質量標記物基團的MS/MS圖譜；圖 lib顯示圖9所分析的標記FAVSLR肽的不同質量標記物基團的MS/MS/MS圖譜。圖12顯示用六種質量標簽的集合中的不同同量異序質量標簽標記的肽LAFSVR的 MS圖譜，各標記物代表預定相對量的肽(質量為126 127 128 129 130 131的 質量標記物基團之比為5 3 1 1 3 5)。圖13顯示圖12所分析的標記LAFSVR肽的MS/MS圖譜。圖14a顯示圖12所分析的標記LAFSVR肽的不同質量標記物基團的MS/MS圖譜； 圖14b顯示圖12所分析的標記LAFSVR肽的不同質量標記物基團的MS/MS/MS圖譜。圖15顯示用六種質量標簽的集合中的不同同量異序質量標簽各自標記的肽 VAFSLR和LAFSVR的混合物的MS圖譜，各標記物代表預定相對量的肽(肽VAFSLR 質量為 126 127 128 129 130 131 的質量標記物基團之比為 1:3:5:5:3:1; 和肽LAFSVR 質量為126 127 128 129 130 131的質量標記物基團之比為 5 · 3 · 1 · 1 · 3 · 5) ο圖16顯示圖15所分析的標記VAFSLR和LAFSVR肽的混合物的MS/MS圖譜。圖17顯示圖15所分析的標記VAFSLR和LAFSVR肽的混合物的不同質量標記物基 團的MS/MS圖譜。圖18a顯示圖15所分析的標記VAFSLR的bl_離子的不同質量標記物基團的MS/ MS/MS圖譜；圖18b顯示圖15所分析的標記LAFSVR的bl_離子的不同質量標記物基團的 MS/MS/MS 圖譜。圖19顯示用六種質量標簽的集合中的不同同量異序質量標簽各自標記的肽 AVFSLR和FAVSLR和混合物的MS圖譜，各標記物代表預定相對量的肽(肽AVFSLR 質量為 126 127 128 129 130 131 的質量標記物基團之比為 1 :1:1:4:4:4; 和肽FAVSLR 質量為126 127 128 129 130 131的質量標記物基團之比為 4:4:4:1:1:1)。圖20顯示圖19所分析的標記AVFSLR和FAVSLR肽的混合物的MS/MS圖譜。圖21顯示圖19所分析的標記AVFSLR和FAVSLR肽的混合物的不同質量標記物基 團的MS/MS圖譜。圖2 顯示圖19所分析的標記AVFSLR的bl_離子的不同質量標記物基團的MS/ MS/MS圖譜；圖22b顯示圖19所分析的標記FAVSLR的bl_離子的不同質量標記物基團的 MS/MS/MS 圖譜。圖23顯示標記肽AEFAEVSK的MS/MS圖譜和用于標記該肽的質量標簽(TMTO)的 結構。該肽在N-末端和賴氨酸處標記。顯示了該質量標簽斷裂產生的離子。圖24顯示用兩種質量標簽的集合(包含TMT2-U6和TMT2-127的TMT 二聚體) 標記的肽VLEPTLK的MS/MS圖譜和用于標記該肽的質量標簽的結構。該肽在N-末端和賴 氨酸處標記。顯示了該質量標簽斷裂產生的離子。圖2 顯示用質量標簽TMT-O標記的血清白蛋白LVNEVTEFAK的肽的MS/MS圖譜， 圖2 顯示用質量標簽TMT六聚體(sixplex)標記的血清白蛋白LVNEVTEFAK的肽的MS/MS 圖譜。圖25a和25b的肽在N-末端和賴氨酸處標記。圖2 和25b的標記肽之間顯示有 IODa的質量差異。
圖26a顯示圖25a的MS/MS圖譜的放大部分，其顯示y3離子片段，圖26b顯示圖 25b的MS/MS圖譜的放大部分，其顯示y3離子片段。y3離子片段保留賴氨酸殘基上的一個 完整質量標簽，從而在圖26a和26b的兩種標記片段離子之間產生5湯姆森(Thomson) (Th， 質荷比的單位)的m/z差異。圖27a顯示圖25a的MS/MS圖譜的放大部分，其顯示y5離子片段，圖27b顯示圖 25b的MS/MS圖譜的放大部分，其顯示y5離子片段。y5片段離子保留賴氨酸殘基上的一個 完整質量標簽，從而在圖27a和27b的兩種標記片段離子之間產生5湯姆森(Th，質荷比的 單位)的m/z差異。圖28a顯示圖25a的MS/MS圖譜的放大部分，其顯示b7離子片段，圖28b顯示圖 25b的MS/MS圖譜的放大部分，其顯示b7離子片段。b7片段離子保留N-末端上的一個完 整質量標簽，從而在圖28a和^b的兩種標記片段離子之間產生5湯姆森(Th，質荷比的單 位)的m/z差異。圖^a顯示用TMT 0 (TMT zero)和TMT六聚體標記的肽LVTDLTK的MS圖譜。該 肽在N-末端和賴氨酸處作標記，從而在標記的肽TMT 0和TMT六聚體之間產生IODa的質 量差異。在雙荷電前體離子之間觀察到5Th的質量差異。圖29b顯示用TMT 0和TMT六聚體標記的肽HPDYSVVLLLR的MS圖譜。該肽在N-末 端作標記，從而在標記的肽TMT 0和TMT六聚體之間產生5Da的質量差異。在三荷電前體 離子之間觀察到1. 67Th的質量差異。圖30顯示用質量標簽TMT-O和質量標簽TMT六聚體(TMT6-127)標記的10種血 漿肽的MRM離子色譜。圖31a_d顯示用ΤΜΤ-0和TMT六聚體(TMT6-127)標記的血漿肽K的MRM離子色 譜。以不同比例混合TMT-標記的血漿樣品。圖32顯示肽K的TMT 0 =TMT六聚體(如圖31a_31d所示)的預計比例和觀察比 例的關系圖。分析一式三份進行。圖33顯示QitTof 儀器的示意圖。圖:34a、34b和3 顯示能進行MS/MS/MS的質譜儀的其它配置。術語“分析物”不作特別限定，可采用本發明方法檢驗所提供的任何類型分子，該 分子可用質譜法分析并能用含質譜學不同的質量標記物基團的同量異序質量標簽標記。分 析物包括氨基酸、肽、多肽、蛋白質、糖蛋白、脂蛋白、核酸、多核苷酸、寡核苷酸、DNA、RNA、 肽-核酸、糖、淀粉和復雜的碳水化合物、脂肪和復雜的脂質、聚合物和有機小分子，例如藥 物和藥物樣分子或其片段。分析物優選肽、蛋白質、核苷酸或核酸。對于本發明，術語分析物應與術語生物分子同義。對于本發明，術語“蛋白質”應包括含有兩個或更多個氨基酸的任何分子，包括二 肽、三肽、肽、多肽和蛋白質。對于本發明，術語“核酸”應包括含有兩個或更多個核苷酸堿基的任何分子，包括 二核苷酸、三核苷酸、寡核苷酸、脫氧核糖核酸、核糖核酸和肽核酸。表述“六聚體串聯質量標簽(TMT)集合”指六個同量異序質量標簽的集合，其 中各標記物包含質譜學不同的質量標記物基團。六聚體串聯質量標簽的集合的例子是 TMT6-128, TMT6-129, TMT6-130, TMT6_131，其中“6”代表該集合中標記物的數量，“TMT”后的數字U8-131代表質量標記物基團的質量。二聚體串聯質量標簽的集合同樣指兩個同量異 序質量標簽的集合。二聚體串聯質量標簽的集合的例子是TMT2-I^和TMT2-127，其中“2” 代表該集合中標記物的數量，“TMT”后的數字1 和127代表質量標記物基團的質量。五 聚體串聯質量標簽的集合指五個同量異序質量標簽的集合。本發明的術語“MS”指質譜方法，包括產生樣品的離子和產生這些離子的質譜圖。本發明的術語“MS/MS”指本發明方法，包括選擇特定質荷比的離子，使所選離子斷 裂，例如通過碰撞誘導解離(CID)并產生片段離子的質譜圖。本發明的術語“MS/MS/MS”指本發明方法，包括步驟(a)-(h)。對于本發明，術語“質譜法”應包括能進行斷裂分析的任何類型的質譜法。適用于 本發明的質譜儀包括能進行MS/MS/MS的含任何形式分析器的儀器。在一個實施方式中，在質譜儀的不同四極中進行本發明方法的步驟(c)-(g)。在該 實施方式中，選擇具有第一質荷比的離子的步驟c)在串聯儀器的第一質譜分析器Oil)中 進行。然后將選擇的離子引入單獨的碰撞室(Q2)，它們在其中與氣體或固體表面碰撞從而 在步驟d)中產生多個片段離子。然后將步驟d)的碰撞產物引入第三質量分析器(Q3)，其 中在步驟e)中選擇第二質荷比的離子(MS/MS離子)。然后將步驟e)的所選離子引入單獨 的碰撞室(Q4)，它們在其中與氣體或固體表面碰撞從而在步驟f)中產生多個其它片段離 子。將步驟f)的其它片段離子引入步驟g)中串聯儀器的其它質量分析器0^5)以檢測碰撞 產物。典型的串聯儀器包括5個四極質譜儀、串聯扇形儀器(tandem sector instrument) 和四極飛行時間(TOF)質譜儀。或者，本發明方法的步驟(c)-(g)在質譜儀的同一區域中順序進行。例如，這可在 離子阱和傅里葉變換離子回旋共振(FT-ICR)質譜儀中實現。可聯用常規3D離子阱，混合幾何儀器，例如四極離子阱與TOF分析器以及較大的 足跡四扇形儀器實施本發明的MS/MS/MS實驗。Wu Z.，Bordas-Nagy J.和 Fenselau C. (1991) “三重質譜法(MS/MS/MS)與 四-扇形串聯質譜儀中的浮動碰撞室(Triple mass spectrometry (MS/MS/MS) with a floated collision cell in a four-sector tandem massspectrometer)，，Organic Mass Spectrometry 26，10，908-911描述了用串聯雙聚焦質譜儀上的第三無場區中的電 浮動碰撞室進行MS/MS/MS實驗的方法。該實驗利用JEOL JMS-HXl 10/HX110四-扇形質 譜儀進行，雖然該方法包括校準所有加速電壓(accelerating voltages)下的磁體校準 (magnetcalibration)，但其通常適用于任何碰撞室電壓值。四極離子阱(QIT)是累積和儲存離子的有效手段。聯用QIT與TOF質譜儀提供單 用QIT或TOF質譜儀所不具有的能力。Syagen 早已將這些裝置組合入稱為QitTofTM的一
種儀器，其是提供QIT MS的MSn優點與TOFMS的高速數據收集速度的首個市售可得儀器。 QitTof 儀器的構造示于圖33。Shimadzu隨后也開發了 LCMS-QIT-T0F系統。圖；34所示 示意圖說明QitTof 儀器的幾何構造。與其它儀器相比，QitTof 幾何構造尤其有優勢。與正交-提取TOF MS相比， QitTof 構造可能具有更高的離子傳輸效率并能進行有效的MSn操作。由于離子被脈沖出 而非掃出QIT，QIT因較高的重復率而產生動態范圍較高和離子阱性能較高的質量-選擇性 噴射(mass-selective ejection)。TOF提供多通道質量檢測的優點，從而能有效收集所有離子。利用TOF分析器還實現了更好的離子質量精度。幾種其它儀器幾何構造考慮可用于本發明的MS3實驗，將來可能的選擇示于圖34。 在本階段難以評估各設計的性能，需要進一步研究。圖34A描述了具有三個掃描四極和兩 個碰撞室的五-四極配置。離子倍增檢測器通常與四極質量分析器聯用。圖34B描述了具 有正交反射TOF(orthogonalreflectron T0F)作為終末期分析器的雙重掃描四極。圖;MC 描述了具有定時離子門的三重階段TOF儀器，從而允許用戶規定質量范圍的離子進入第一 (級)兩個雙線性TOF分析器。本發明可采用基體輔助激光解吸/電離(MALDI)技術。MALDI需要生物分子溶液 包埋在摩爾過量的光可激發的“基體”中。應用合適頻率的激光導致基體激活，進而造成基 體與其包埋的生物分子一起快速蒸發。質子從酸性基體向生物分子轉移產生該生物分子的 質子化形式，可通過正離子質譜法，特別是飛行時間(TOF)質譜法檢測。通過MALDI TOF也 可能進行負離子質譜法。該技術賦予離子顯著量的平動能，但盡管如此其不傾向于誘導過 度斷裂。可采用激光能量和用于加速來源中離子的勢差施加時間來控制該技術的斷裂。該 技術因其質量范圍大、其圖譜中主要是單電荷離子以及能同時分析多種肽而特別優選。本 發明可采用T0F/T0F技術。光可激發的基體包含“染料”，即，該化合物強烈吸收特定頻率的光并優選不通過 熒光或磷光放出能量而是經熱，即，通過震動模式消散該能量。正是激光激發導致的基體震 動使得染料的快速升華，同時將包埋的分析物帶入氣相。雖然MALDI技術可用于本發明，但本發明不限于該類技術，如果需要，技術 人員可將本領域常見的其它技術用于本發明。例如，可采用電噴霧或納米電噴霧 (nanoelectrospray) ^ °本發明方法可在步驟(a)之前包括用一個或多個同量異序質量標簽差異性標記 各樣品和校準樣品各試樣(有一種或多種校準樣品存在時)的其它步驟。在有一個或多個 校準樣品存在的實施方式中，該方法在步驟(a)之前還包括混合差異性標記的試樣以產生 校準樣品的其它步驟。可將靶分析物連接于一個質量標簽、兩個質量標簽或多于兩個質量標簽。靶分析 物或其片段優選連接于兩個同量異序質量標簽。靶分析物各端連接有至少一個質量標簽也 是優選的。這在靶分析物是蛋白質或核酸時尤其優選。可在合適條件下標記樣品以控制有多少標記物連接于靶分析物。例如，可將過量 標記物加入樣品以確保最大量的標記物連接于各分析物。當將質量標簽連接于核酸或蛋白 質分析物各端是有利之時最好這樣。或者，可控制質量標簽的反應活性基團和/或標記條 件以將質量標簽連接于分析物的優選端，例如蛋白質的C-末端或N-末端。如果靶分析物是蛋白質或肽，優選用質量標簽標記各靶分析物的N-末端和C-末 端。各分析物的賴氨酸的氨基-末端胺基團和C-末端ε-胺基團優選各包含質量標簽。圖 25a和圖26b所示的肽(LVNEVTEFAK)連接于兩個標記物，其中一個連接于N-末端亮氨酸， 一個標記物連接于C-末端賴氨酸。在本發明方法中，步驟C)中選擇第一質荷比等于用特定數量質量標簽標記的靶 分析物離子的離子。各樣品中該標記的靶分析物因具有相同的質量而在步驟c)中選擇。在一個實施方式中，所述第一質荷比等于用特定數量質量標簽標記的靶分析物的未斷裂母體離子的質荷比。或者，所述第一質荷比等于用特定數量質量標簽標記的靶分析 物的片段離子的質荷比。步驟c)選擇的具體質荷比取決于靶分析物和連接于該靶分析物的標記物數量。 技術人員不難為步驟c)選擇合適的第一質荷比。步驟c)中選擇的離子優選具有2+或更 高的電荷狀態。當對，例如包含組分，如蛋白質的混合物的樣品實施本發明方法時，多個蛋白質或 蛋白質片段可具有相同質量，因此在步驟c)中可選擇具有相同質量的多個不同離子。步驟c)后，具有第一質荷比的所選離子在步驟d)中斷裂成多個片段離子，其中該 多個片段離子的一部分包含至少一個完整的質量標簽。該多個片段離子的一部分包含至少一個完整的質量標簽表示大于0%的片段離子 包含至少一個完整的質量標簽。步驟d)中提供的這些片段中的該部分足以使得質量報道 基團在步驟g)產生的質譜圖中檢測。本發明人發現用同量異序質量標簽片段標記的分析物在步驟d)中斷裂從而產生 包含至少一個完整質量標簽的片段離子。這是本發明的重要發現，因為能作進一步的選擇 步驟以先除去污染物，再切割標記的靶分析物的質量報道基團。這提供精確的定量結果。本 發明人發現靶分析器最好連接于兩個或更多各質量標簽以確保步驟d)后至少一個質量標 簽是完整的。當靶分析物是肽時，肽主要斷裂成y_和b_離子系列，其中也可見其它形式，包括 a-系列、C-系列、χ-系列和ζ-系列。可在步驟d)中選擇斷裂條件以控制所產生的片段離 子類型。斷裂條件的選擇最好能確保b-和y-離子是最主要的片段離子。宜選擇很低的碰 撞能量以防止連續斷裂。例如，可利用離子阱以確保不發生連續斷裂。斷裂通常由碰撞誘導解離(CID)、表面誘導解離(SID)、電子俘獲解離(EOT)、電子 轉移解離(ETD)或快速原子轟擊。電子俘獲解離(ECD)是斷裂多荷電(質子化)肽或蛋白質離子一個串聯質譜分 析(結構闡明)的方法。在該方法中，多質子化的肽或蛋白質局限于傅里葉變換離子回旋 共振(FT-ICR)質譜儀的彭寧阱(Perming trap)中并接觸具有近熱能量(near-thermal energy)的電子。質子化肽俘獲熱電子(thermalelectron)是放熱的( 6eV;leV = 1.60hl(T19J)，并通過非遍歷過程(即，不涉及分子內震動能量再分配的過程)導致肽骨架 斷裂。[M+nH]n++e_ — [ [M+nH] ‘1)+]* —片段此外，可用低能電子中和一個或多個蛋白質陽離子以特異性切割鍵從而形成C、ζ 產物，相比之下，b、y產物由例如碰撞激活解離(CAD ；也稱為碰撞誘導解離，CID)等其它技 術形成。由于引入RF 3D四極離子阱OiIT)、四極飛行時間(TOF)或RF線性2D四極離子阱 (QLT)儀器的RF場的熱電子僅能在毫秒范圍維持它們的熱能且不為這些裝置所捕獲，因此 E⑶是僅單用于FTICR(最昂貴的一類MS儀器)的技術。電子轉移解離(ETD)是斷裂多質子化肽或蛋白質離子以供串聯質譜分析(結構闡 明)的方法。與電子俘獲解離(ECD)相似，ETD通過將電子轉移給陽離子(例如，多荷電肽 或蛋白質)以誘導它們斷裂。與ECD相反，ETD不為此目的利用游離電子，而是利用自由基 負離子(例如，具有顯著低電子親和力的蒽或偶氮苯陰離子以用作電子供體)。
[M+nH]n++A_ — [ [M+nH] (n_1)+] *+A —片段電子轉移后，ETD導致與ECD相似的斷裂模式，即，形成所謂的c和ζ離子。根據電 子轉移的不同方式，可利用不示于ECD的各種“低成本”質譜儀，例如四極離子阱(QIT)或RF 線性2D四極離子阱(QLT)儀器來實施ETD。合適的參考文獻參見John Ε. P. Syka, Joshua J. Coon, Melanie J. Schroeder, Jeffrey Shabanowitz 禾口 Donald F. Hunt, PNAS, 101 卷，26 號，第 9528-9533 頁。雖然斷裂方法不作特別限定，但最優選的實施方式是通過碰撞誘導解離進行斷 m農。在一個實施方式中，本發明方法在步驟d)之后包括產生步驟(d)的多個片段離子 的質譜圖的其它步驟。可利用步驟d)后產生的質譜圖，通過鑒定該質譜圖中靶分析物的一 個或多個特征性片段離子來鑒定該靶分析物。圖譜中產生的片段離子可用于數據庫檢索， 特別是用于肽分析物以測定該分析物的身份。步驟(d)中的斷裂可從質量標簽上切割一部分質量標記物基團，如果產生，可在 質譜圖中觀察到代表質量標記物基團的諸峰。然而，如果用該質譜圖檢測樣品中靶分析物 的含量，會因步驟(d)中存在標記的污染物而產生不精確的結果。在步驟d)中斷裂后，在步驟e)中選擇第二質荷比等于捕獲至少一個完整質量標 簽的靶分析物的片段離子的離子。如上所述，當樣品是復雜混合物時，步驟C)可選擇大量離子，包括靶分析物和具 有相同質量的其它污染性離子。因此，對與步驟c)中選擇的離子相連的質量標簽的質量標 記物基團作分析提供的定量結果不能精確代表靶分析物的含量。為克服該局限性，步驟e) 提供對有待進一步分析的靶分析物作進一步選擇的步驟。質荷比等于包含至少一個完整質 量標簽的靶分析物的片段離子確保質譜圖中除去了步驟c)中選擇的污染性分子。在步驟(e)中，第二質荷比優選等于包含至少一個完整質量標簽的靶分析物的片 段離子，該片段離子是該靶分析物獨有的。步驟(e)中選擇的第二質荷比可以是步驟d)中產生的任何合適片段離子，所述片 段離子包含至少一個完整質量標簽。第二質荷比可以等于a_系列離子、b_系列離子、C-系列離子、X-系列離子、y_系 列離子或ζ-系列離子。可根據各離子的產生量選擇在步驟e)中選擇的離子類型。例如， 可將肽主要斷裂成b-系列離子，bl離子可以是最主要的離子。最主要的離子確保在步驟 h)的質譜圖中產生質量報道基團的良好信號。還可根據所需的選擇性程度選擇步驟e)中所選的離子類型。步驟e)中所選的較 大片段離子提供更好的靶分析物選擇性。例如，選擇bl離子可區分在N-末端具有不同氨 基酸的肽。然而，如果需要更高的選擇性來區分具有相同bl離子的肽，可選擇較大的離子， 例如1^2或b3離子。如果步驟d)中的斷裂產生具有相同質量的不同系列離子，也最好選擇 較大的離子。可為本發明方法個別確定步驟e)中所選離子的最近類型以，例如利用MS-數據結 果或計算機方法。在本發明的一個實施方式中，在步驟e)中選擇第二質荷比，例如bl離子或yl離 子，對所選片段離子實施步驟f)到h)。然后可重復步驟e)到h)，在步驟e)中選擇的第二質荷比確保選擇較大的離子，例如或y2。然后可比較較大離子的結果與較小離子的結果 作為檢查手段以確保該結果精確反映樣品中靶分析物的含量。所述第二質荷比宜等于包含完整質量標簽的y_系列離子。例如，y_系列離子可 以是yl離子、12離子、y3離子等，只要該離子包含至少一個完整的質量標簽。在其它優選的實施方式中，所述第二質荷比等于包含完整質量標簽的b_系列離 子。例如，所述b-系列離子可以是bl離子、1^2離子、b3離子等，只要該離子包含至少一個 完整的質量標簽。與在步驟(C)中選擇的第一質荷比相比，諸如y_系列離子或b_系列離子等離子 優選具有較高的質荷比。步驟e)中選擇的離子的電荷狀態比步驟(c)中選擇的離子的電 荷狀態小一，但與在步驟(c)中選擇的離子的電荷狀態相比，具有較高的質荷比。這確保選 擇的離子出現在質譜圖中非常干凈的部分而沒有任何污染離子，從而提供優秀的信噪比。可根據步驟e)中優選的片段離子控制與靶分析物相連的質量標簽的數量和定 位。例如，當分析物是肽并且優選b-系列離子時，可控制標記以確保該肽在N-末端連接于 質量標簽。如果優選y_系列離子，可控制標記以確保該肽在C-末端連接于質量標簽。優選在步驟e)中選擇b_系列離子并重復在步驟e)中選擇y_系列離子的方法。 在該實施方式中，可控制標記以確保該肽在C-末端和N-末端連接于質量標簽。例如，如果 靶分析物是肽并且賴氨酸的氨基-末端胺官能團和C-末端ε -胺官能團連接于質量標簽， 產生的I—離子在賴氨酸上具有一個完整的質量標簽，或者產生的b-離子具有一個完整的 N-末端質量標簽。斷裂步驟d)可產生假y_離子，其代表失去一個質量標記物基團加上，例如鄰近羰 基的全長肽，電荷狀態表現為-1。這些離子不可用于步驟e)中的選擇，因為它們可含有m/ ζ和電荷狀態與也僅喪失一個質量報道基團的靶分析物相同的污染物，如果分析物僅連接 于一個質量標簽，則該離子不會產生包含完整質量標簽的片段。在步驟e)中選擇具有第二質荷比的離子后，在步驟f)中將這些離子斷裂成多個 其它片段離子，其中所述其它片段離子的一部分是質量標記物基團的離子。由于步驟e)中的選擇使得靶分析物的離子通過進一步分析，從斷裂步驟f)釋放 的質量標記物基團僅來自靶分析物，得到的質譜圖提供靶分析物的精確定量結果。所述其它離子的一部分是質量標記物基團的離子表示高于0%的片段離子是質量 標記物基團的離子。所述其它片段離子的質譜圖在步驟g)中產生，因此，質量標記物基團 的離子部分足以從質譜圖中測定各樣品中靶分析物的含量。可通過以上步驟d)所述的任何方法進行步驟f)中的斷裂。與步驟d)中所用能 量相比，斷裂步驟f)中所用的能量最好較高以確保切割其余質量標簽的質量標記物基團。 步驟f)中優選利用碰撞室而非離子阱，因為該步驟中最好產生連續斷裂。在一個實施方式中，本發明方法在步驟(f)后包括選擇質荷比范圍等于質量報道 基團的質荷比范圍的離子的其它步驟。該第三選擇步驟確保僅有質量報道基團的離子進入 步驟g)中產生的質譜圖，藉此除去任何污染物。在步驟f)中斷裂后，在步驟g)中產生所述其它片段離子的質譜圖。在步驟h)中，從步驟g)中產生的質譜圖測定各樣品中靶分析物的含量。該步驟 優選包括鑒定對應于質譜圖中質量標簽的質量標記物基團的片段離子并根據該質譜圖中它們的質量標記物基團的量來測定各樣品中分析物的含量。在分析一個或多個校準樣品的 實施方式中，步驟h)包括根據相關質譜圖中質量標記物基團的量，相對于同一質譜圖中校 準樣品各試樣的質量標記物基團的量來測定測試樣品中分析物的量。如上所述，分析物的 測定量可以是分析物的絕對量或定性量。測試樣品可來自天然來源或可合成產生。合成樣品的例子是重組蛋白的混合物。 在一個實施方式中，測試樣品是復雜的混合物，例如來自植物或動物的樣品。在優選的實施 方式中，樣品來自人。本發明檢驗的測試樣品的例子包括哺乳動物組織、液體，例如血液、血漿、血清、 腦脊液、滑膜液、眼水(ocular fluid)、尿液、淚水和淚小管滲出液，肺抽吸物，包括支氣管 肺泡灌洗液，唾液、痰、母乳、乳頭抽吸物、精液、灌洗液、細胞提取物、細胞系和亞細胞細胞 器，組織，例如實體器官組織，衍生自哺乳動物、魚、禽類、昆蟲、環節動物、原生動物和細菌 的細胞培養上清液或制品，組織培養提取物、植物組織、植物液體、植物細胞培養提取物、細 菌、病毒、真菌、發酵肉湯培養液、食物、藥物和任何中間產物。在優選的實施方式中，測試樣品是血液的血漿。在特別優選的實施方式中，測試樣 品是貧化血漿(cbpleted plasma)。該血漿經純化除去了大多數豐富的血漿蛋白質，例如白 蛋白，從而降低樣品中的蛋白質負載，從而減少樣品中的分析物數量和總蛋白含量。待檢驗樣品的校準樣品可以是天然樣品，例如體液或組織提取物，或可以是合成 的。校準樣品可包含重組表達的蛋白質、合成制備的肽或寡核苷酸。此外，可通過重組蛋白 表達以串聯順序產生許多不同的肽。歐洲專利申請EP 1736480公開的方法產生多種參比 肽作為串聯重組蛋白質從而類似于AQUA方法的方式用于多反應監測實驗。按照本發明的 任何方面，此類產生方法可與同量異序質量標簽聯用以提供校準樣品。校準樣品可以是待檢驗樣品的標準化形式。校準樣品可包含待檢驗樣品的所有組 分，但其含量是特定的。例如，校準樣品可包含以下物質的標準化制品哺乳動物組織、液 體，例如血液、血漿、血清、腦脊液、滑膜液、眼水、尿液、淚水和淚小管滲出液，肺抽吸物，包 括支氣管肺泡灌洗液，唾液、痰、母乳、乳頭抽吸物、精液、灌洗液、細胞提取物、細胞系和亞 細胞細胞器，組織，例如實體器官組織，衍生自哺乳動物、魚、禽類、昆蟲、環節動物、原生動 物和細菌的細胞培養上清液或制品，組織培養提取物、植物組織、植物液體、植物細胞培養 提取物、細菌、病毒、真菌、發酵肉湯培養液、食物、藥物和任何中間產物。如果感興趣的分析 物是蛋白質，由于校準樣品中的所有蛋白質均作標記，可利用此類樣品的完整蛋白質組作 為研究樣品的所有蛋白質的參比。或者，校準樣品可僅包含樣品中待檢驗的分析物，而不含樣品中的任何其它組分。 可制備并外源性同量異序標記包含一種或多種分析物的校準樣品，將其加入含有分析物的 復雜混合物中。例如，如果樣品是血漿樣品，但僅要檢驗該血漿樣品中特定的蛋白質，可制 備包含重組形式蛋白質的不同試樣的校準樣品。在其它方法中，校準樣品的各試樣中分析物的絕對量未知。在該實施方式中，校準 樣品的各試樣中分析物的含量是已知的定性量。校準步驟包括根據校準樣品的試樣中分析 物的定性量和測定量來校準測試樣品中分析物的含量。在特定的實施方式中，定性量是具 有特定狀態，例如健康或患病狀態的對象中分析物含量的預計范圍。提供此類校準樣品以 便相對定量的試驗的適用范圍很廣，包括生物標記發現、工業微生物、藥物和食品制造以及人和獸醫學疾病的診斷和控制。分析復雜的生物學樣品，例如血液血漿時，常可用相對定量實驗。在具體的實施方 式中，將大量的完整人血液血漿分成數份(即，四份)試樣，各用不同的同量異序質量標簽 標記。例如，一種可利用TMT六聚體以產生血液血漿的四份標記試樣。可利用TMT6-128、 TMT6-129、TMT6-130、TMT6_131作標記。用該同量異序質量標簽的另一種不同形式，即 TMT6-126標記血液血漿研究的所有各份樣品。現在可利用血液血漿的試樣產生校準曲線， 例如以0. 5-1-2-5 μ L比例混合四份試樣產生校準樣品，然后加入1 μ L研究樣品。通過混 合樣品與包含四種差異性標記的試樣的校準樣品，實際上，用此材料進行的所有實驗會產 生多組5標志-離子-4個來自校準樣品，1個來自測試樣品。因此，4-點校準曲線中可利 用完整的蛋白質組。如果給該研究的所有測試樣品摻加相同量的校準樣品，可能相對定量 所有研究樣品。由于多個實驗室可利用校準樣品，交叉研究和交叉實驗室比較是可能的。雖然分析物的絕對量可能未知，但可從校準曲線計算含量的變化百分比。可根據 應用調節校準曲線的比例和幅度。在優選的實施方式中，選擇校準樣品的各不同試樣中分析物的含量以反映測試樣 品中分析物的已知或懷疑的變化。在還要進一步的優選實施方式中，所提供試樣包含的分 析物量對應于健康或患病對象的測試樣品中發現的分析物的已知或懷疑含量范圍的上限 和下限，及任選的中間點。由于各分析物獨立于樣品中所有其它分析物定量，制備濃度彼此極為不同的多組 校準樣品的可能的，從而提高該實驗的動態范圍。還可能制備各分析物的多個參比生物分 子，其中各生物分子的含量范圍重疊以便延伸給定分析物的標準曲線的總范圍。例如，根據 在串聯質譜儀中的性能，可選擇靶蛋白的許多不同胰蛋白酶肽以便用作參比標準。可根據 對應于質譜圖中肽的離子的離子強度或根據對應于肽的離子在圖譜中出現的區域的信噪 比選擇參比肽。或者，可選擇參比肽以避免具有同量異序物質的肽。尤其宜選擇蛋白型肽， 即，僅在特定蛋白質中存在的肽。如果用同量異序質量標簽的六聚體集合的最多5個不同成員獨立標記各標準肽， 可將這些成員以不同比例混合以提供5-點標準曲線。可利用相同的同量異序質量標簽來 標記第二、第三、第四或更多的標準肽，各肽可以不同比例混合以涵蓋與同一分析物的其它 參比肽各自涵蓋所不同的濃度范圍。產生衍生自靶蛋白的各肽的不同校準曲線，各校準曲線涵蓋不同濃度范圍。然后 從其各自的校準曲線測定各肽的濃度，該濃度可向回與靶蛋白的濃度關聯。對于一些校準 曲線，測試樣品中肽的含量可落在校準曲線的中部，從而精確測定其在樣品中的實際含量。 對于涵蓋不同濃度范圍的其它校準曲線，測試樣品中肽的含量可落在校準曲線范圍外。我 們可利用各自衍生自單一感興趣分析物的多種肽來產生與同一分析物相關的多條校準曲 線，然后選擇最精確的校準曲線以便從一種或多種肽的濃度測定測試樣品中分析物的濃 度。以此方式可涵蓋較寬的動態范圍而不損害試驗靈敏度。校準樣品可包含常規量的分析物。校準樣品中分析物的含量可表明植物、動物或 優選人是健康的。或者，校準樣品包含的分析物的含量可表明有特定疾病存在和/或其階 段。在進一步的實施方式中，校準樣品包含的分析物的含量可表明治療效力和/或毒性。制 備具有特定性質，例如疾病的存在和/或階段、對治療的反應和/或毒性的已知標記的標準
22組。可從患有充分表征的疾病的患者制備包含同量異序質量標簽標記的體液或組織提取物 的校準樣品，所述疾病包括但不限于腫瘤、神經變性、心血管、腎臟、肝臟、呼吸、代謝、炎性 和感染性疾病。將已知量的此類樣品加入多份測試樣品，該方式可根據共同校準樣品的離 子強度標準化質譜圖中一系列分析離子強度，從而在不同分析之間作更精確的比較，降低 研究的分析差異性。以冠心病藥物為例，合成產生從胰蛋白酶消化已知心臟病標記，例如肌紅蛋白、肌 鈣蛋白-I、CK-MB, BNP, pro-BNP和NT-pro_BNP獲得的一系列肽，分成三份試樣。各參比 肽的各試樣用，例如此類同量異序質量標簽的集合的三種同量異序質量標簽之一標記，其 中質譜法檢測到該集合中的所有標簽基本上具有相同的合計質量，在質譜儀中經碰撞誘導 解離后該集合中各標簽釋放質量獨特的質量標志離子。然后將已知濃度的各獨特的參比 肽-質量標簽分子加入運載體溶液，例如質譜-相容緩沖液，從而同一參比肽的三種差異性 標記試樣的濃度不同，該不同橫跨患有心臟病的患者中母體蛋白質的正常生物學濃度。將 規定體積比的得到的參比肽組加入已用與標記參比肽相同的同量異序質量標簽集合中的 第四同量異序質量標簽標記的測試樣品。然后對摻加的樣品進行串聯質譜法，其中以直接 模式進行全譜掃描從而僅鑒定具有各同量異序標記參比肽相關的特征性保留時間和質量 的那些前體離子。對于各選擇離子，質譜圖將含有衍生自高、中和低濃度參比肽和測試樣品 的標志離子。從參比肽標志離子強度不難構建簡單的標準曲線，可根據校準曲線讀數測試樣品 中同一肽的第四標志離子。這表示可在一次實驗中測定多種生物學相關蛋白質的絕對濃 度。技術人員可知道制備參比肽的不同蛋白質的數量無需具體限定，可以是1-100，最優選 1-50的范圍。類似地，代表性肽的數量可以是1-20、優選1-10、更優選1-5和最優選1_3的 范圍。技術人員會知曉上述例子是通用例子，其中描述的原理可適用于任何疾病的已知標 志并適用于疾病診斷、監測疾病進展或監測患者對治療的反應。其它應用在于這些校準樣品在時程實驗中的應用。如果不同試樣(四)來自四個 不同時間點，例如零時、1小時、8小時和M小時，可在某實驗(小鼠和人中的藥物攻擊，誘 導大腸桿菌和酵母菌發酵)中，對于慢性疾病的產生或治療反應還在數周和數月也可在較 長時間尺度上建立關于時程的樣品“狀態”。技術人員應知道同量異序質量標簽的性質不作具體限制。本領域已知各種合適 的同量異序治療標記物，例如在WO 01/68664(通過引用納入本文)和WO 03/025576 (通 過引用納入本文)中公開的串聯治療標簽(Thompson等，2003，Anal. Chem. 75 (8) 1895-1904(通過引用納入本文))、在US68M981(通過引用納入本文)中公開的iPROT 標簽禾口 iTRAQ 標簽(Pappin 等，2004，Methods in Clinical Proteomics Manuscript M400129-MCP200(通過引用納入本文))。任何這些同量異序治療標記物適于制備樣品和校 準樣品及實施本發明方法。雖然本發明所用質量標簽的結構未作具體限定，只要它們是同量異序的并具有質 譜學上不同的質量標記物基團(部分)，但在優選的實施方式中，質量標簽包含以下結構X-L-M其中X是質量標記物部分，L是可切割的接頭，M是質量標準化部分。L可以是單 鍵，或X的一部分或M的一部分。這些質量標簽可以連接于測試或校準樣品中分析物的任何點，例如通過M、L或X。它們優選通過M相連，例如標記物可包含以下結構(X-L-M)-。這通常經由在質量標簽中包含反應活性官能團使之能結合分析物得到實現，例 如X-L-M-反應活性官能團。當標記物包含反應活性官能團時，這些標記物稱為反應活性質量標簽。將質量標簽連接于分析物的反應活性官能團不作具體限定，可包含任何合適的反 應活性基團。本文所用的術語質量標簽應指適于標記分析物以便測定的部分。術語標記物是術 語標簽的同義詞。本文所用的術語質量標記物部分應指有待通過質譜法檢測的部分。術語質量標記 物部分是術語質量標記物基團或術語報道基團的同義詞。本發明質量標記物部分的各組分 優選耐受斷裂，從而可通過引入易于為以下方式打斷的連接鍵來控制標志斷裂的位點碰 撞誘導解離(CID)、表面誘導解離、電子俘獲解離(ECD)、電子轉移解離(ETD)或快速原子轟 擊。在最優選的實施方式中，不難通過CID斷裂所述連接鍵。本文所用的術語質量標準化部分應指無需通過質譜法檢測的部分，但其存在確保 質量標簽具有所需合計質量。質量標準化部分不作具體限定，僅用于改變質量標簽的總質量。在優選的實施方式中，質量標簽的合計分子量是600道爾頓或低一些，更優選500 道爾頓或低一些，還要優選400道爾頓或低一些，最優選300-400道爾頓。質量標簽的特別 優選的分子量是324、338、339和380道爾頓。這些優選的實施方式尤其有利，因為質量標 簽體積小意味著用質量標簽標記時待檢測肽的體積增加最少。在優選的實施方式中，質量標記物部分的分子量是300道爾頓或低一些，優選250 道爾頓或低一些，更優選100-250道爾頓，最優選100-200道爾頓。這些優選的實施方式尤 其有利，因為質量標記物部分體積小意味著其在質譜圖的沉默區產生峰，從而易在質譜圖 中鑒別質量標志，還能靈敏地定量。質量標記物部分的特別優選的分子量是125、1沈、153和IM道爾頓，或者其中一 個或多個或所有的12C原子被13C原子取代的重量，例如未取代的質量標記物部分的重量 是125，其用1、2、3、4、5和6個13C原子分別相應取代的質量是126、127、128、129、130和 131道爾頓，和/或一個或多個或所有的14N原子被15N原子取代。本文所用的術語質譜圖的沉默區應指質譜圖中與存在標記肽斷裂產生的片段相 關各峰造成的背景“噪聲”低的區域。因此，術語沉默區應指質譜圖中待檢測肽相關各峰造 成的“背景”低的區域。對于肽或蛋白質，質譜圖的沉默區低于200道爾頓。本發明人還發現上述反應活性質量標簽易與蛋白質快速反應以形成標記的蛋白 質。本發明采用兩種或更多種質量標簽的集合。這些集合中標記物是具有不同質量的 質量標志的同量異序質量標簽。因此，該集合中各標記物如上所述，其中各質量標準化部分 確保質量標簽具有所需合計質量，其中該集合包含具有質量標記物部分的質量標簽，各質 量標記物部分具有不同于該集合中所有其它質量標記物基團的質量，該集合中各標記物具有共同的合計質量；其中質譜學顯示該集合中所有質量標簽彼此不同。術語“同量異序”表示質譜法測定質量標簽具有基本上相同的合計質量。同量異 序質量標簽的平均分子量通常落在彼此士0. 5Da的范圍內。術語“標記物”應是術語“標 簽”的同義詞。就本發明而言，技術人員應知道術語“質量標記物部分”和術語“報道基團” 可互換使用。集合中標記物的數量不作特別限定，只要該集合包含多個標記物即可。然而，如果 集合包括兩個或多個、三個或更多個、四個或更多個或五個或更多個標記物是優選的，更優 選六個或更多個標記物，最優選八個或更多個標記物。本文的術語合計質量指質量標簽的總質量，S卩，質量標記物部分、可切割接頭、質 量標準化部分和質量標簽的任何其它組分的質量之和。該集合中各質量標簽的質量標準化部分的質量不同。各質量標簽中質量標準化部 分的質量等于共同的合計質量減去該質量標簽中具體質量標記物部分的質量再減去可切 割接頭的質量。質譜學顯示集合中所有質量標簽彼此不同。因此，質譜儀可區分質量標簽，即，衍 生自質量標簽的各峰可以清楚地彼此分開。質量標記物基團之間的質量差異表示質譜儀可 區分衍生自不同質量標簽或質量標記物基團的離子。本發明還可采用包含上述兩個或更多個質量標簽集合的質量標簽陣列，其中該陣 列中任一集合的各質量標簽的合計質量不同于各其它集合中各質量標簽的合計質量。 在優選的本發明實施方式中，質量標簽的陣列優選在化學上均相同(在化學上基 本相同)。術語“化學上基本相同”表示質量標簽具有相同的化學結構，在該結構中可引入 特定同位素取代或者可連接特定取代基。在進一步優選的本發明實施方式中，質量標簽可包含靈敏度增強基團。所述質量 標簽優選具有以下形式靈敏度增強基團-X-L-M-反應活性官能團。在該例子中，靈敏度增強基團通常連接于質量標記物部分，因為打算增加該部分 在質譜儀中的檢測靈敏度。顯示有反應活性官能團存在并連接于與靈敏度增強基團不同的 部分。然而，無需以此方式限定質量標簽，在一些情況中，靈敏度增強基團可連接于與反應 活性官能團相同的部分。現在更詳細地描述本發明中用于標記分析物的質量標簽的優選結構。在優選的實施方式中，X是包含以下基團的質量標記物部分
權利要求
1.一種檢驗靶分析物的方法，該方法包括(a)提供可包含靶分析物的多個樣品，其中各樣品用質量標簽或質量標簽的組合作差 異性標記，所述質量標簽來自質量標簽的集合，各質量標簽是包含質譜上不同的質量標記 物基團的同量異序質量標簽，從而可通過質譜法區分這些樣品；(b)混合所述多個標記樣品以產生分析混合物并將所述分析混合物引入質譜儀；(c)選擇具有第一質荷比的離子，該第一質荷比等于用特定數量的質量標簽標記的靶 分析物的離子；(d)使具有該第一質荷比的離子斷裂成多個片段離子，其中所述多個片段離子的一部 分包含至少一個完整的質量標簽；(e)選擇具有第二質荷比的離子，該第二質荷比等于包含至少一個完整質量標簽的靶 分析物的片段的離子；(f)使具有該第二質荷比的離子斷裂成多個其它片段離子，其中所述其它片段離子的 一部分是所述質量標記物基團的離子；(g)產生在步驟(f)中產生的其它片段離子的質譜圖；和(h)由所述質譜圖測定各樣品中靶分析物的含量量。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，一個樣品是測試樣品，一個樣品是校準樣 品，其中所述校準樣品包含靶分析物的一個或多個不同試樣，各試樣具有已知量的該分析 物，其中所述測試樣品和所述校準樣品的各試樣作差異性標記。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述多個樣品可包含多個不同靶分析物，所 述方法包括為各靶分析物重復步驟(c)到(h)的步驟。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，一個樣品是測試樣品并提供各不同分析物 的校準樣品，其中各校準樣品包含靶分析物的一個或多個不同試樣，其中所述測試樣品和 各校準樣品的各試樣作差異性標記。
5.如權利要求2或權利要求4所述的方法，其特征在于，所述校準樣品或各校準樣品包 含所述靶分析物的兩個或更多個不同試樣。
6.如權利要求2-5中任一項所述的方法，其特征在于，為分析物檢驗多個測試樣品。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，為同一分析物檢驗所述多個測試樣品的每 一個。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，用一個或多個所述同量異序質量標簽差異 性標記各測試樣品。
9.如權利要求2-8中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法包括在步驟(a)之前用 一個或多個同量異序質量標簽差異性標記各測試樣品和校準樣品各試樣的其它步驟。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，在步驟(a)之前還包括混合差異性標記的 試樣以產生校準樣品的其它步驟。
11.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述多個樣品是測試樣品。
12.如以上權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，步驟(h)中測定的量是各樣品 中靶分析物的相對量。
13.如權利要求1-11中任一項所述的方法，其特征在于，步驟(h)中測定的量是各樣品 中靶分析物的絕對量。
14.如以上權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法在步驟(d)之后包括 產生步驟(d)的多個片段離子的質譜圖的其它步驟。
15.如權利要求14所述的方法，其特征在于，通過鑒定該質譜圖中靶分析物的一個或 多個特征性片段離子來測定該靶分析物的身份。
16.如以上權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法在步驟(f)后包括選 擇質荷比范圍等于質量標記物基團的質荷比范圍的離子的其它步驟。
17.如以上權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，在步驟(c)中，所述第一質荷 比等于用特定數量質量標簽標記的靶分析物的未斷裂母體離子的質荷比。
18.如權利要求1-16中任一項所述的方法，其特征在于，在步驟(c)中，所述第一質荷 比等于用特定數量質量標簽標記的靶分析物的片段離子的質荷比。
19.如以上權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，在步驟(e)中，所述第二質荷 比等于包含至少一個完整質量標簽的靶分析物的片段離子，該片段離子是該靶分析物獨有 的。
20.如以上權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，在步驟(e)中，所述第二質荷 比是包含完整質量標簽的一個y_系列離子的質荷比。
21.如權利要求1-19中任一項所述的方法，其特征在于，在步驟(e)中，所述第二質荷 比是包含完整質量標簽的一個b-系列離子的質荷比。
22.如權利要求20或權利要求21所述的方法，其特征在于，與在步驟(c)中選擇的第 一質荷比相比，所述y_系列離子或b-系列離子具有較高的質荷比。
23.如以上權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述靶分析物選自蛋白質、多 肽、肽、氨基酸或核酸、或它們的片段。
24.如以上權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，在質譜儀的不同四極中進行步 驟(c)-(g)。
25.如權利要求1-23中任一項所述的方法，其特征在于，在質譜儀的同一區域中順序 進行步驟(c)-(g)。
26.如以上權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述樣品之一包含含有觸發 分析物的觸發試樣，所述方法在步驟(b)之后和步驟(c)之前包括檢測質荷比等于所述觸 發分析物質荷比的離子的其它步驟，其中檢測到質荷比等于所述觸發分析物質荷比的離子 時，步驟(c)啟動。
27.如權利要求沈所述的方法，其特征在于，用同量異序質量標簽標記所述觸發試樣 中的觸發分析物。
28.如權利要求沈所述的方法，其特征在于，用化學上相同但同位素不同并且質量與 所述樣品中其它分析物的同量異序質量標簽不同的質量標簽標記所述觸發試樣中的觸發 分析物。
29.如以上權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述質量標簽包含以下結構X-L-M式中，χ是包含以下基團的質量標記物部分
30.如權利要求四所述的方法，其特征在于，將所述質量標記物部分連接于所述質量 標準化部分的所述可切割接頭是可通過碰撞切割的接頭。
31.如權利要求30所述的方法，其特征在于，所述接頭可利用質譜法通過CID、ETD、E⑶ 或SID切割。
32.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述標記步驟包括將所述分析物與反應活 性質量標簽反應的步驟，其中所述反應活性質量標簽包含質量標簽和反應活性官能團。
33.如權利要求32所述的方法，其特征在于，所述反應活性官能團能與多肽上的任何 氨基反應，包括親核試劑或親電試劑。
34.如權利要求32或權利要求33所述的方法，其特征在于，所述質量標簽是標記和通 過質譜法檢測多肽的反應活性質量標簽，其中所述質量標簽包含將所述質量標簽連接于多 肽的反應活性官能團，所述反應活性官能團包含以下基團
35.如權利要求四-34中任一項所述的方法，其特征在于，所述質量標簽是來自兩種或 更多種質量標簽的集合的質量標簽，其中各質量標準化部分確保所述質量標簽具有所需合 計質量，其中該集合包含具有質量標記物部分的質量標簽，各質量標記物部分具有不同于 該集合中所有其它質量標記物基團的質量，該集合中各標記物具有共同的合計質量；其中 質譜學顯示該集合中所有質量標簽彼此不同。
36.如權利要求35所述的方法，其特征在于，所述集合中的各質量標簽具有選自以下 的質量調節部分(a)位于質量標記物部分內和/或質量標準化部分內的同位素取代基，和(b)與質量標記物部分和/或質量標準化部分相連的取代基原子或基團。
37.如權利要求36所述的方法，其特征在于，所述質量調節部分選自鹵素原子取代 基、甲基取代基和、？N、18o或13C同位素取代基。
38.如權利要求37所述的方法，其特征在于，所述質量調節部分是1N或13C,該集合包 含具有以下結構的兩種質量標簽
39.如權利要求37所述的方法，其特征在于，所述質量調節部分是1N和13C,該集合包 含具有以下結構的五種質量標簽
40.如權利要求37所述的方法，其特征在于，所述質量調節部分是1N和13C,該集合包 含具有以下結構的六種質量標簽CN 102077092 A權利要求書5/7頁
41.一種檢驗一種或多種靶分析物的質譜裝置，其中所述裝置包括(i)引入可包含一種或多種靶分析物的兩個或更多個樣品的器件，其中各樣品用質量 標簽或質量標簽的組合作差異性標記，其中各質量標簽是包含質譜上不同質量標記物基團 的同量異序質量標簽；( )選擇具有第一質荷比的離子的器件，所述第一質荷比等于用特定數量的所述質量 標簽標記的靶分析物；(iii)將具有所述第一質荷比的離子斷裂成多個片段離子的器件，其中所述多個片段 離子的一部分包含至少一個完整的質量標簽；(iv)選擇具有第二質荷比的離子的器件，所述第二質荷比等于包含至少一個完整質量 標簽的靶分析物的片段；(ν)將具有所述第二質荷比的離子斷裂成多個其它片段離子的器件，其中所述其它片 段離子的一部分是所述質量標簽的質量標記物基團的離子；和(vi)適于選擇質荷比范圍等于所述質量標記物基團的質荷比范圍的離子并適于產生 所述質量標記物基團的質譜圖的器件。
42.如權利要求41所述的裝置，其特征在于，適于選擇所述質量標記物基團的離子的 所述器件選擇15Th范圍的質荷比。
43.如權利要求42所述的裝置，其特征在于，適于選擇所述質量標記物基團的離子的 所述器件選擇8Th范圍的質荷比。
44.如權利要求43所述的裝置，其特征在于，所述8Th范圍是1M-131道爾頓。
45.如權利要求41-44中任一項所述的裝置，其特征在于，選擇具有第一質荷比的離子 的器件僅適于選擇50道爾頓范圍的離子。
46.如權利要求41-45中任一項所述的裝置，其特征在于，選擇具有第二質荷比的離子 的器件僅適于選擇50道爾頓范圍的離子。
47.如權利要求41-46中任一項所述的裝置，其特征在于，所述裝置包括產生第一質荷 比離子的多個片段離子的質譜圖的其它器件。
48.如權利要求41-47中任一項所述的裝置，其特征在于，所述第一質荷比等于用特定 數量質量標簽標記的靶分析物的未斷裂母體離子的質荷比。
49.如權利要求41-47中任一項所述的裝置，其特征在于，所述第一質荷比等于用特定 數量質量標簽標記的靶分析物的片段離子的質荷比。
50.如權利要求41-49中任一項所述的裝置，其特征在于，器件(ii)、(iii)、(iv)、(ν) 和(vi)在質譜儀中是不同的四極。
51.如權利要求41-49中任一項所述的裝置，其特征在于，器件(ii)、(iii)、(iv)、(ν) 和(vi)在質譜儀的單區域或多個區域中。
全文摘要
一種檢驗靶分析物的方法，該方法包括(a)提供可包含靶分析物的多個樣品，其中各樣品用質量標簽或質量標簽的組合作差異性標記，所述質量標簽來自質量標簽的集合，各質量標簽是包含質譜上不同的質量標記物基團的同量異序質量標簽，從而可通過質譜法區分這些樣品；(b)混合所述多個標記樣品以產生分析混合物并將所述分析混合物引入質譜儀；(c)選擇具有第一質荷比的離子，該第一質荷比等于用特定數量的質量標簽標記的靶分析物的離子；(d)使具有該第一質荷比的離子斷裂成多個片段離子，其中所述多個片段離子的一部分包含至少一個完整的質量標簽；(e)選擇具有第二質荷比的離子，該第二質荷比等于包含至少一個完整質量標簽的靶分析物的片段的離子；(f)使具有該第二質荷比的離子斷裂成多個其它片段離子，其中所述其它片段離子的一部分是所述質量標記物基團的離子；(g)產生在步驟(f)中產生的其它片段離子的質譜圖；和(h)由所述質譜圖測定各樣品中靶分析物的含量。
文檔編號G01N33/68GK102077092SQ200980126034
公開日2011年5月25日 申請日期2009年5月18日 優先權日2008年5月23日
發明者C·鮑曼, H·拜爾斯, M·沃德, P·舒爾茨納皮 申請人:電泳有限公司