用于結(jié)合測(cè)定的多孔性固相和使用所述多孔性固相的結(jié)合測(cè)定法的制作方法

專利名稱：用于結(jié)合測(cè)定的多孔性固相和使用所述多孔性固相的結(jié)合測(cè)定法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改進(jìn)的用于結(jié)合測(cè)定的多孔性固相，其防止與結(jié)合測(cè)定法相關(guān)的測(cè)試 樣品的流動(dòng)行進(jìn)不良，靈敏度差和測(cè)量波形中的擾動(dòng)的問題，在所述結(jié)合測(cè)定法中多孔性 固相(例如，膜)用于檢測(cè)測(cè)試樣品組分。本發(fā)明還涉及使用所述多孔性固相的結(jié)合測(cè)定 法。更具體地，本發(fā)明提供了一種用于結(jié)合測(cè)定的多孔性固相(結(jié)合測(cè)定用多孔性固相)， 在所述多孔性固相中在加入測(cè)試樣品之前已經(jīng)結(jié)合了至少一種表面活性劑，所述至少一種 表面活性劑選自由下列各項(xiàng)組成的組(A)含糖表面活性劑，其包含由通式(I)顯示的化合 物，(B)含糖表面活性劑，其包含蔗糖脂肪酸酯，其中構(gòu)成脂肪酸具有5-14個(gè)碳原子，和(C) 類固醇表面活性劑，以及使用所述結(jié)合測(cè)定用多孔性固相的結(jié)合測(cè)定法。
背景技術(shù)：
當(dāng)進(jìn)行使用多孔性固相(例如，膜)檢測(cè)測(cè)試樣品組分的結(jié)合測(cè)定(例如，免疫色 譜法)時(shí)，可能由于各種原因發(fā)生多孔性固相中測(cè)試樣品的流動(dòng)行進(jìn)(flow progression) 不良。例如，當(dāng)測(cè)試樣品含有大于多孔性固相的孔隙的物質(zhì)(例如，血細(xì)胞)并且因此不能 容易地通過多孔性固相的孔隙移動(dòng)和/或經(jīng)過時(shí)，或當(dāng)已經(jīng)溶解在測(cè)試樣品中的組分在測(cè) 定期間變得不可溶并且堵塞所述多孔性固相時(shí)，可能發(fā)生測(cè)試樣品的流動(dòng)行進(jìn)不良。分析 物、游離的標(biāo)記抗體，和分析物與標(biāo)記抗體的復(fù)合物，以及包含在測(cè)試樣品中并且可能與檢 測(cè)試劑的標(biāo)志物質(zhì)具有類似活性的其他物質(zhì)(例如，氧化酶)，在正常情況下它們預(yù)期均能 全部自由地通過多孔性固相移動(dòng)/經(jīng)過，而在這些情況下，它們可能停止通過所述多孔性 固相移動(dòng)/經(jīng)過并且可能停留在多孔性固相中不合乎需要的位置中。結(jié)果，可能丟失正常 情況下與分析物的存在相關(guān)的預(yù)期信號(hào)強(qiáng)度，使得檢測(cè)變得困難(使得不可能進(jìn)行測(cè)定或 導(dǎo)致假陰性結(jié)果)，或可能發(fā)生干擾信號(hào)檢測(cè)的非特異性反應(yīng)(使得不可能進(jìn)行測(cè)定或?qū)?致假陽(yáng)性結(jié)果)，使得測(cè)試的可靠性或再現(xiàn)性可能下降。常規(guī)地，已經(jīng)通過在將測(cè)試樣品施加到多孔性固相之前，通過在特定條件下離心 或過濾或經(jīng)由沉淀、吸附或類似方法去除包含在測(cè)試樣品中的雜質(zhì)(例如，比多孔性固相 的孔隙大的物質(zhì)(例如，血細(xì)胞)或容易變得不溶的組分)來防止多孔性固相的堵塞。然 而，上述操作的每一種均是耗時(shí)的，并且在操作期間測(cè)試樣品的損失是不可避免的。而且， 這些操作需要額外的成本。如果測(cè)試樣品含有感染性病原微生物，進(jìn)行測(cè)試的人(例如，醫(yī) 生或研究人員)可能遭受感染的高風(fēng)險(xiǎn)。包括將表面活性劑加入至溫育媒介中的方法(例如，專利文件1)已經(jīng)被廣泛地用 于防止結(jié)合測(cè)定期間的非特異性干擾。然而，取決于加入的表面活性劑的類型，與固相載體 結(jié)合的俘獲試劑(例如，抗體)可能從載體上被去除，或固相載體和抗體之間的結(jié)合反應(yīng)可 能首先被妨礙，使得特異性信號(hào)可能大幅減少并且可能不能達(dá)到所需的檢測(cè)靈敏度。此外， 當(dāng)上述方法應(yīng)用于利用多孔性固相的結(jié)合測(cè)定中時(shí)，即使表面活性劑(例如，專利文件1中 公開的葡糖苷表面活性劑)不影響檢測(cè)靈敏度本身，但測(cè)定系統(tǒng)中測(cè)試樣品組分的絕對(duì)量可能由于測(cè)試樣品的稀釋而減少，使得可能不能有效地確保所需的檢測(cè)靈敏度。此外，專利 文件1僅針對(duì)防止非特異性干擾。在專利文件1中，沒有提到而且也沒有提示測(cè)試樣品的 流動(dòng)行進(jìn)不良，并且因此沒有將其作為待解決的課題而認(rèn)識(shí)到。在其中全血用作測(cè)試樣品的免疫測(cè)定中，如果血細(xì)胞分離墊設(shè)置在結(jié)合測(cè)定條 (strip)上的全血負(fù)載區(qū)域和多孔性固相(膜)之間，則采用離心對(duì)測(cè)試樣品的預(yù)處理可以 被省略。根據(jù)此方法，血細(xì)胞組分保留在分離墊中，并且防止其在短時(shí)期內(nèi)流入至多孔性固 相中，同時(shí)允許血漿組分在血細(xì)胞組分之前流入至免疫色譜膜中；因此，該測(cè)定不受血細(xì)胞 組分的存在的影響。然而，即使在這種情況下，由于除由雜質(zhì)的尺寸所導(dǎo)致的堵塞以外的原因仍然可 能發(fā)生樣品流動(dòng)行進(jìn)(移動(dòng)或經(jīng)過)不良。這些其他的原因的實(shí)例包括測(cè)試樣品的高粘度， 和測(cè)定期間多孔性固相的干燥。高粘度測(cè)試樣品(例如，含有大量固體組分諸如血細(xì)胞或 大量蛋白的測(cè)試樣品，或由于蒸發(fā)導(dǎo)致失水的測(cè)試樣品)固有地具有差的流動(dòng)性并且因此 花費(fèi)長(zhǎng)時(shí)間在多孔性固相中行進(jìn)，導(dǎo)致不均一的行進(jìn)并缺少測(cè)定再現(xiàn)性。常規(guī)地，當(dāng)含有固體組分或具有高粘度的測(cè)試樣品(例如，血液(全血)、血漿、血 清、唾液、痰或糞便)通過免疫色譜法測(cè)定時(shí)，必需預(yù)先用適當(dāng)?shù)南♂屢?溫育媒介)稀釋 測(cè)試樣品。磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或類似物用作稀釋液，并且牛血清白蛋白(BSA)或類似 物通常加入至稀釋液中以便改善測(cè)試樣品的可分散性。然而，市售的BSA可能含有雜質(zhì)諸 如免疫球蛋白，所述免疫球蛋白可能導(dǎo)致非特異性反應(yīng)。上面已經(jīng)提到了與稀釋液中包含 表面活性劑相關(guān)的問題。上面還提到了這樣的事實(shí)通過改變稀釋液的成分來解決所述問 題的任何嘗試仍將遭遇最根本的問題，即，由稀釋導(dǎo)致的測(cè)定中可用的分析物的量或濃度 的減小。已有報(bào)道(專利文件2、，當(dāng)用于色譜測(cè)定的多孔膜被層壓以增加其機(jī)械強(qiáng)度并且 用于防止在色譜測(cè)定期間流體的蒸發(fā)(干燥)時(shí)，該多孔膜可以由于層壓中使用的膠粘劑 組分的作用而變得不太親水，導(dǎo)致測(cè)試樣品的流動(dòng)行進(jìn)不良。專利文件2通過基于膠粘劑 組分的備選選擇以及在層壓之前用烷基磺酸表面活性劑處理膜來提高所述膜的親水性，解 決了此流動(dòng)行進(jìn)不良問題。然而，專利文件2沒有認(rèn)識(shí)到，或沒有提出關(guān)于與含有固體組分 或具有高粘度的測(cè)試樣品相關(guān)的流動(dòng)行進(jìn)不良的問題的解決方案。作為使用多孔膜作為固相載體的酶免疫測(cè)定中的組分，專利文件3公開了一種用 于酶免疫測(cè)定固相的洗滌溶液，其含有烷基葡糖苷表面活性劑或類固醇表面活性劑。專利 文件3中公開的洗滌溶液用于洗掉來自測(cè)試樣品的可能導(dǎo)致非特異性反應(yīng)的物質(zhì)，或游離 的標(biāo)志物質(zhì)的目的，它們?cè)谒鰷y(cè)試樣品或所述標(biāo)志物質(zhì)(能夠免疫結(jié)合測(cè)試樣品中的分 析物)加入至固相載體后均不能經(jīng)過/移動(dòng)通過所述多孔膜并且因此殘留在膜上。專利文 件3中公開的洗滌溶液與測(cè)試樣品分開地并在免疫反應(yīng)之后加入至固相載體中，用于去除 多孔膜上殘留的所述物質(zhì)。因此，其需要獨(dú)立于測(cè)試樣品的單獨(dú)的制備步驟和單獨(dú)的添加 步驟，使得測(cè)定步驟較為復(fù)雜。專利文件3的方法是在以下面的情況為前提設(shè)想的一些 物質(zhì)仍然殘留在膜上并且需要被洗掉，并且因此其根本不存在對(duì)首先防止膜堵塞的任何考 慮。因此測(cè)試樣品的流動(dòng)行進(jìn)不良不能被專利文件3中公開的方法改善，其是本發(fā)明所解 決的問題。流通測(cè)定法，諸如專利文件3中的實(shí)施例中所述的流通測(cè)定法，可以包括洗滌步驟。然而，當(dāng)一次測(cè)試許多測(cè)試樣品時(shí)，這種測(cè)定法可能需要輔助手段諸如加壓和抽吸(例 如，增加膜下方吸水墊的體積)以便在實(shí)用的時(shí)間范圍內(nèi)獲得可再現(xiàn)的結(jié)果，這使得就便 利性和成本而言該測(cè)定系統(tǒng)不太有利。已經(jīng)公開了涉及使用非離子型表面活性劑以洗滌固體基板(陣列)的方法(專利 文件4)，所述固體基板上固定有生理活性物質(zhì)。專利文件4公開了作為非離子型表面活性 劑的烷基葡糖苷表面活性劑。然而，專利文件4的發(fā)明涉及這樣一種陣列，其中所述陣列 (其上固定有蛋白或肽)用于檢測(cè)包含在由培養(yǎng)細(xì)胞制備的溶胞產(chǎn)物中的蛋白激酶活性， 并且其方法包括在檢測(cè)之前洗滌所述陣列以便防止溶胞產(chǎn)物組分被非特異性地吸附至陣 列基板的表面上。具體地，該方法包括將含有表面活性劑的洗滌溶液加入至陣列上，然后使 其從陣列中排出。因此，專利文件4的唯一目的是防止非特異性反應(yīng)，并且類似于上面討論 的專利文件1，專利文件4沒有提到也沒有提示測(cè)試樣品的流動(dòng)行進(jìn)不良的問題，也沒有將 此問題作為待解決的課題而認(rèn)識(shí)到。在免疫色譜法中，分析物與檢測(cè)試劑的復(fù)合物的檢測(cè)可以如下進(jìn)行測(cè)量反射光 的強(qiáng)度，并基于測(cè)量的強(qiáng)度計(jì)算吸光度(反射吸光度)。反射吸光度由在測(cè)量線處和其鄰近 區(qū)域處測(cè)量的反射光強(qiáng)度的比率計(jì)算，但在此步驟中，測(cè)量波形(譜型)可以有時(shí)顯示在上 游或下游側(cè)的測(cè)量線(在此檢測(cè)到復(fù)合物)附近處(尤其是下游側(cè))的擾動(dòng)，這歸因于其 中提高的反射光強(qiáng)度。當(dāng)測(cè)試樣品(試樣)中包含的分析物的濃度低時(shí)，在確定基線時(shí)此 測(cè)量波形的擾動(dòng)不能被忽視。因此，特異性信號(hào)(峰)的檢測(cè)精確度可能降低，并且可能使 得測(cè)量本身無法進(jìn)行。由于測(cè)量波形的這種擾動(dòng)不以固定的頻率或以固定的程度出現(xiàn)，因 此測(cè)定的再現(xiàn)性下降，并且在每次測(cè)量中可能必需對(duì)測(cè)量值進(jìn)行適當(dāng)?shù)男Ｕ?即，對(duì)測(cè)量 波形的評(píng)估)。在使用白色膜和光學(xué)檢測(cè)設(shè)備的常見免疫色譜法中，甚至用肉眼就可以將測(cè)量波 形的擾動(dòng)識(shí)別為下面的現(xiàn)象，其中膜上相應(yīng)的區(qū)域變得比周圍區(qū)域更白，如同被漂白一樣。現(xiàn)有技術(shù)沒有解決測(cè)量波形的擾動(dòng)問題，因此對(duì)此問題不存在已知的解決方案。引用的對(duì)比文件專利文件專利文件1 JP-A-H06-235730專利文件2 JP-A-H03-120468專利文件3 JP-A-H10-332697專利文件4 JP-A-2008-9290
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題本發(fā)明的目的是提供一種結(jié)合測(cè)定用多孔性固相，其使得在加入測(cè)試樣品(例 如，全血)后在不需要對(duì)樣品預(yù)處理(例如，離心)或額外的操作的條件下能夠快速地、方 便地、準(zhǔn)確地和低成本地分析所述測(cè)試樣品，以及使用所述多孔性固相的結(jié)合測(cè)定法。解決問題的手段本發(fā)明人對(duì)于如何防止下列的問題已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究多孔性固相中測(cè)試樣 品的流動(dòng)行進(jìn)不良、靈敏度差、再現(xiàn)性差和與使用多孔性固相(例如，膜)檢測(cè)測(cè)試樣品組分的結(jié)合測(cè)定法相關(guān)的測(cè)量波形的擾動(dòng)，并且已經(jīng)完成了本發(fā)明。具體地，本發(fā)明提供一種結(jié)合測(cè)定用多孔性固相，在所述多孔性固相中在加入測(cè) 試樣品之前已經(jīng)結(jié)合了至少一種表面活性劑，所述至少一種表面活性劑選自由下列各項(xiàng)組 成的組(A)含糖表面活性劑，其包含由通式(I)顯示的化合物，(B)含糖表面活性劑，其包 含蔗糖脂肪酸酯，其中構(gòu)成脂肪酸具有5-14個(gè)碳原子，和(C)類固醇表面活性劑。本發(fā)明 還提供使用所述結(jié)合測(cè)定用多孔性固相的結(jié)合測(cè)定法。細(xì)節(jié)在下面[1]_[24]中給出。[1] 一種用于結(jié)合測(cè)定的多孔性固相，其中在加入測(cè)試樣品之前已經(jīng)結(jié)合了至少 一種表面活性劑，所述至少一種表面活性劑選自由下列各項(xiàng)組成的組(A)含糖表面活性劑，其包含由下列通式(I)顯示的化合物，R1-(G)x (I)其中R1代表取代的或未取代的具有5-10個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，G代表由具 有5或6個(gè)碳原子的還原糖衍生的殘基，并且χ是1-3的數(shù)，其表示所述還原糖的縮合度， 且R1和G經(jīng)由氧原子或硫原子通過醚鍵連接，(B)含糖表面活性劑，其包含蔗糖脂肪酸酯，其中構(gòu)成脂肪酸具有5-14個(gè)碳原子， 和(C)類固醇表面活性劑。[2]根據(jù)[1]所述的用于結(jié)合測(cè)定的多孔性固相，其中所述含糖表面活性劑㈧是 正辛基-β -D-葡糖苷和/或正庚基-β -D-硫代葡糖苷。[3]根據(jù)[1]所述的用于結(jié)合測(cè)定的多孔性固相，其中所述含糖表面活性劑⑶是 蔗糖單己酸酯和/或蔗糖單月桂酸酯。[4]根據(jù)[1]所述的用于結(jié)合測(cè)定的多孔性固相，其中所述類固醇表面活性劑(C) 是膽酸鈉和/或3-[(3-膽酰胺丙基)二甲基氨基]-2-羥基丙磺酸(CHAPS)。[5]根據(jù)[1]44]中任一項(xiàng)所述的用于結(jié)合測(cè)定的多孔性固相，其中所述結(jié)合測(cè) 定法是免疫測(cè)定法。[6]根據(jù)[1]_[5]中任一項(xiàng)所述的用于結(jié)合測(cè)定的多孔性固相，其中所述結(jié)合測(cè) 定法是側(cè)流形式、浸漬片(dipstick)形式、或流通形式膜測(cè)定法。[7]根據(jù)[1]- ]中任一項(xiàng)所述的用于結(jié)合測(cè)定的多孔性固相，其中俘獲試劑固 定在所述多孔性固相上。[8]根據(jù)[7]所述的用于結(jié)合測(cè)定的多孔性固相，其中所述俘獲試劑是抗體、特異 性俘獲物質(zhì)或抗原。[9] 一種結(jié)合測(cè)定條，其包含根據(jù)[1]_[8]中任一項(xiàng)所述的多孔性固相。[10]根據(jù)[9]所述的結(jié)合測(cè)定條，其還包含綴合物釋放墊，所述綴合物釋放墊包 含檢測(cè)試劑。[11]根據(jù)[10]所述的結(jié)合測(cè)定條，其中所述檢測(cè)試劑是標(biāo)記的抗體、標(biāo)記的特異 性俘獲物質(zhì)或標(biāo)記的抗原。[12]根據(jù)[11]所述的結(jié)合測(cè)定條，其中所述標(biāo)記包括粒徑不同的兩種類型的膠 體金。[13]根據(jù)[10]_[12]中任一項(xiàng)所述的結(jié)合測(cè)定條，其中所述綴合物釋放墊包含氨基酸。
[14]根據(jù)[9]所述的結(jié)合測(cè)定條，其還包含樣品墊和/或血細(xì)胞分離墊。[15]根據(jù)[14]所述的結(jié)合測(cè)定條，其中所述樣品墊包含抗凝劑。[16] 一種用于側(cè)流形式結(jié)合測(cè)定法的結(jié)合測(cè)定條，其包括(1)樣品墊；(2)綴合物釋放墊，其包含檢測(cè)試劑并且放置在所述樣品墊下方且與所述樣品墊 接觸；(3)血細(xì)胞分離墊，其放置在所述綴合物釋放墊和下述多孔性固相(4)之間；和(4)多孔性固相，其上固定有俘獲試劑，其中所述多孔性固相是[1]_[8]中任一項(xiàng) 所述的用于結(jié)合測(cè)定的多孔性固相。[17] 一種裝置，其包括[9]_[16]中任一項(xiàng)所述的結(jié)合測(cè)定條。[18] 一種結(jié)合測(cè)定法，其通過使用根據(jù)[1]_[8]中任一項(xiàng)所述的多孔性固相來實(shí) 施。[19] 一種結(jié)合測(cè)定法，其通過使用根據(jù)[9]_[16]中任一項(xiàng)所述的結(jié)合測(cè)定條來 實(shí)施。[20] 一種結(jié)合測(cè)定法，其測(cè)試檢測(cè)試劑和分析物的復(fù)合物的存在，所述復(fù)合物在 測(cè)試樣品通過根據(jù)[1]所述的多孔性固相移動(dòng)和/或經(jīng)過時(shí)形成，所述分析物來自于所述 測(cè)試樣品并且被固定在所述多孔性固相上的俘獲試劑俘獲。[21]根據(jù)[18]_[20]中任一項(xiàng)所述的結(jié)合測(cè)定法，其中所述測(cè)試樣品是全血。[22] 一種在側(cè)流形式或浸漬片形式結(jié)合測(cè)定中防止測(cè)試樣品的流動(dòng)行進(jìn)不良的 方法，所述方法包括使用用于結(jié)合測(cè)定的多孔性固相，在所述多孔性固相中在加入所述測(cè) 試樣品之前已經(jīng)結(jié)合了至少一種表面活性劑，所述至少一種表面活性劑選自由下列各項(xiàng)組 成的組(A)含糖表面活性劑，其包含由下列通式(I)顯示的化合物，R1-(G)x (I)其中R1代表取代的或未取代的具有5-10個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，G代表由具 有5或6個(gè)碳原子的還原糖衍生的殘基，并且χ是1-3的數(shù)，其表示所述還原糖的縮合度， 且R1和G經(jīng)由氧原子或硫原子通過醚鍵連接，(B)含糖表面活性劑，其包含蔗糖脂肪酸酯，其中構(gòu)成脂肪酸具有5-14個(gè)碳原子， 和(C)類固醇表面活性劑。[23]根據(jù)[22]所述的方法，其中所述測(cè)試樣品具有50%或更高的Ht值。[24] 一種在側(cè)流形式或浸漬片形式結(jié)合測(cè)定法中防止測(cè)試樣品的測(cè)量波形中的 擾動(dòng)的方法，所述方法包括使用用于結(jié)合測(cè)定的多孔性固相，在所述多孔性固相中在加入 所述測(cè)試樣品之前已經(jīng)結(jié)合了至少一種表面活性劑，所述至少一種表面活性劑選自由下列 各項(xiàng)組成的組(A)含糖表面活性劑，其包含由下列通式(I)顯示的化合物，R1-(G)x (I)其中R1代表取代的或未取代的具有5-10個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，G代表由具 有5或6個(gè)碳原子的還原糖衍生的殘基，并且χ是1-3的數(shù)，其表示所述還原糖的縮合度，且R1和G經(jīng)由氧原子或硫原子通過醚鍵連接，(B)含糖表面活性劑，其包含蔗糖脂肪酸酯，其中構(gòu)成脂肪酸具有5-14個(gè)碳原子， 和(C)類固醇表面活性劑。發(fā)明的效果本發(fā)明提供一種新型的結(jié)合測(cè)定用多孔性固相，其用于其中通過使用多孔性固 相進(jìn)行測(cè)試樣品組分的檢測(cè)的結(jié)合測(cè)定，所述多孔性固相在加入所述測(cè)試樣品前包括至少 一種表面活性劑，所述至少一種表面活性劑選自由下列各項(xiàng)組成的組(A)含糖表面活性 劑，其包含由通式(I)顯示的化合物，(B)含糖表面活性劑，其包含蔗糖脂肪酸酯，其中構(gòu)成 脂肪酸具有5-14個(gè)碳原子，和(C)類固醇表面活性劑，以及；使用所述多孔性固相的新型 結(jié)合測(cè)定法。根據(jù)本發(fā)明，有可能進(jìn)行具有優(yōu)異的再現(xiàn)性的結(jié)合測(cè)定，其中防止了多孔性固 相中測(cè)試樣品的流動(dòng)行進(jìn)不良，并且具體地，防止了假陰性和假陽(yáng)性，否則在含有固體組分 或具有高粘度的測(cè)試樣品中將看到所述假陰性和假陽(yáng)性。由于在加入測(cè)試樣品后不需要預(yù) 處理測(cè)試樣品(包括制備稀釋液或洗滌溶液)，也不需要洗滌步驟，因此操作是簡(jiǎn)單和方便 的。此外，本發(fā)明能夠獲得極佳的測(cè)定性能，其特征是高靈敏度并缺少測(cè)量波形中的擾動(dòng)。附圖簡(jiǎn)要說明

圖1顯示結(jié)合測(cè)定條(測(cè)試條)的示意性結(jié)構(gòu)圖。圖2顯示其中具有高Ht值的模型全血用作測(cè)試樣品的測(cè)試的結(jié)果，該測(cè)試驗(yàn)證本 發(fā)明防止測(cè)試樣品的流動(dòng)行進(jìn)不良的效果(實(shí)施例3)。圖3顯示其中具有高Ht值的模型全血用作測(cè)試樣品的測(cè)試的結(jié)果，該測(cè)試驗(yàn)證就 測(cè)量的再現(xiàn)性而言本發(fā)明防止測(cè)試樣品的流動(dòng)行進(jìn)不良的效果(實(shí)施例4)。圖4顯示其中具有高Ht值的模型全血用作測(cè)試樣品并且每種表面活性劑的濃度 發(fā)生變化的測(cè)試的結(jié)果，該測(cè)試驗(yàn)證就測(cè)量的再現(xiàn)性而言本發(fā)明防止測(cè)試樣品的流動(dòng)行進(jìn) 不良的效果(實(shí)施例5)。圖5顯示包含對(duì)照線的測(cè)試條(實(shí)施例6)的示意性結(jié)構(gòu)圖。圖6顯示其中濃縮血漿用作測(cè)試樣品的測(cè)試的結(jié)果，該測(cè)試驗(yàn)證就測(cè)量的再現(xiàn)性 而言，本發(fā)明改善測(cè)試線處測(cè)試樣品的流動(dòng)行進(jìn)不良的效果(實(shí)施例7)。圖7顯示其中濃縮血漿用作測(cè)試樣品的測(cè)試的結(jié)果，該測(cè)試驗(yàn)證就測(cè)量的再現(xiàn)性 而言，本發(fā)明防止對(duì)照線處測(cè)試樣品的流動(dòng)行進(jìn)不良的效果(實(shí)施例7)。圖8顯示其中濃縮血漿用作測(cè)試樣品的測(cè)試的結(jié)果，該測(cè)試驗(yàn)證就測(cè)量的再現(xiàn)性 而言，本發(fā)明防止測(cè)試線處測(cè)試樣品的流動(dòng)行進(jìn)不良的效果(實(shí)施例9)。圖9顯示其中濃縮血漿用作測(cè)試樣品的測(cè)試的結(jié)果，該測(cè)試驗(yàn)證就測(cè)量的再現(xiàn)性 而言，本發(fā)明防止對(duì)照線處測(cè)試樣品的流動(dòng)行進(jìn)不良的效果(實(shí)施例9)。圖10顯示其中與本發(fā)明的多孔性固相一起使用兩種類型的粒徑不同的膠體金的 測(cè)試結(jié)果，該測(cè)試驗(yàn)證本發(fā)明防止測(cè)試樣品的流動(dòng)行進(jìn)不良的效果(實(shí)施例10)。圖11顯示其中具有高Ht值的模型全血用作測(cè)試樣品并且膽酸鈉的濃度發(fā)生變化 的測(cè)試的結(jié)果，該測(cè)試驗(yàn)證就測(cè)定再現(xiàn)性而言本發(fā)明防止測(cè)試樣品的流動(dòng)行進(jìn)不良的效果 (實(shí)施例11)。圖12顯示其中濃縮血漿用作測(cè)試樣品并且多孔性固相用本發(fā)明的表面活性劑或其他表面活性劑預(yù)處理的測(cè)試的結(jié)果，該測(cè)試驗(yàn)證使用每種表面活性劑是否存在防止測(cè)量 波形中的擾動(dòng)的效果(實(shí)施例12)。圖13顯示其中濃縮血漿用作測(cè)試樣品并且多孔性固相用本發(fā)明的表面活性劑或 其他表面活性劑預(yù)處理的測(cè)試的結(jié)果，該測(cè)試驗(yàn)證是否可以改善靈敏度/再現(xiàn)性(實(shí)施例 12)。圖14顯示其中濃縮血漿用作測(cè)試樣品并且本發(fā)明的表面活性劑和其他表面活性 劑以與本發(fā)明的方法不同的方式使用以測(cè)試是否可以防止測(cè)量波形中的擾動(dòng)的測(cè)試的結(jié) 果(實(shí)施例13)。圖15顯示其中濃縮血漿用作測(cè)試樣品并且本發(fā)明的表面活性劑和其他表面活性 劑以與本發(fā)明的方法不同的方式使用以測(cè)試是否可以改善靈敏度/再現(xiàn)性的測(cè)試的結(jié)果 (實(shí)施例13)。圖16顯示其中從健康人采集的全血用作測(cè)試樣品并且將各種抗凝劑加入至樣品 墊以驗(yàn)證就測(cè)量再現(xiàn)性而言防止測(cè)試樣品的流動(dòng)行進(jìn)不良的效果的測(cè)試的結(jié)果(實(shí)施例 14)。圖17顯示其中從健康人采集的血漿用作測(cè)試樣品并且將各種氨基酸加入至綴 合物釋放墊以驗(yàn)證就測(cè)量再現(xiàn)性而言防止測(cè)試樣品的流動(dòng)行進(jìn)不良的效果的測(cè)試的結(jié)果 (實(shí)施例15)。本發(fā)明的最佳實(shí)施方式本文使用的術(shù)語(yǔ)“測(cè)試樣品”是指血液(全血)、血清、血漿、淋巴、尿液、糞便、腹 水、胸腔積液、組織/細(xì)胞，和類似物。本文使用的術(shù)語(yǔ)“測(cè)試樣品”包括通過離心、過濾、 純化或類似方法從全血或類似物中分離/分餾的測(cè)試樣品組分，用有機(jī)溶劑或類似物提取 的測(cè)試樣品組分，用表面活性劑或類似物溶解的測(cè)試樣品組分，用緩沖液或類似物稀釋的 測(cè)試樣品組分，通過化學(xué)反應(yīng)或類似反應(yīng)改性/改變的測(cè)試樣品組分，等等，它們可以進(jìn) 行使用根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合測(cè)定用多孔型固相的測(cè)定。本發(fā)明的測(cè)試樣品在其加入時(shí)為液 體(流體)，并且在根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合測(cè)定用多孔性固相中行進(jìn)。本發(fā)明的測(cè)試樣品還可 以包括諸如植物、河水和土壤的物質(zhì)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“行進(jìn)(progression)”包括“移動(dòng) (migration) ”和“經(jīng)過(passage) ”，“移動(dòng)”是指當(dāng)多孔性固相以其最大表面面向上放置時(shí) 液體在水平方向上的流動(dòng)(即，在多孔性固相的縱向上(lengthwise)流動(dòng))，“經(jīng)過”是指 當(dāng)多孔性固相以其最大表面面向上放置時(shí)液體在垂直方向上的流動(dòng)(即，液體跨多孔性固 相的厚度的流動(dòng))。下面描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，其中全血主要用作測(cè)試樣品的實(shí)例。本文使用的術(shù)語(yǔ)“測(cè)試樣品組分”是指包含在測(cè)試樣品中的組分。測(cè)試樣品組分的 具體實(shí)例包括凝固或纖維蛋白溶解標(biāo)志物諸如纖維蛋白降解物(例如，D- 二聚體)，可溶 性纖維蛋白，TAT (凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物)，和PIC (纖溶酶-纖溶酶抑制物復(fù)合物)；心 血管相關(guān)標(biāo)志物諸如氧化LDL和BNP (腦鈉肽)；代謝相關(guān)標(biāo)志物諸如脂連蛋白，腫瘤標(biāo)志 物諸如CEA(癌胚抗原)，AFP( α -甲胎蛋白)，CA19-9，CA125，和PSA(前列腺特異性抗原)； 炎癥相關(guān)標(biāo)志物諸如CRP (C-反應(yīng)蛋白)，IgA，IgGjP IgM ；傳染病相關(guān)標(biāo)志物諸如流行性 感冒，HIV (人免疫缺陷病毒)，HBV (乙型肝炎病毒)，HCV (丙型肝炎病毒)，弓形蟲屬，衣原 體和梅毒；變態(tài)反應(yīng)特異性IgE (免疫球蛋白E)，激素，藥物，涉及單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的核酸鏈和其片段，以及所述核酸鏈的互補(bǔ)鏈。術(shù)語(yǔ)“測(cè)試樣品組分”在本文中還可以稱為 “分析物”。本發(fā)明防止含有固體組分或具有高粘度的測(cè)試樣品在多孔性固相中的流動(dòng)行進(jìn) 不良的有利效果可以最有益于例如，含有高比例的血細(xì)胞和少于正常量的血漿并具有高血 細(xì)胞比容(Ht)值的全血樣品(稱為“高Ht值樣品”)，或由于高蛋白含量或其他原因而缺 少流動(dòng)性的測(cè)試樣品(稱為“高粘度測(cè)試樣品”)。這些測(cè)試樣品具有低含水(液體)量。 高Ht值樣品的實(shí)例包括具有50%或更高的Ht值的樣品，該Ht值超過標(biāo)準(zhǔn)范圍。例如，高 Ht值可能是由于由一些疾病導(dǎo)致的紅細(xì)胞增加，或脫水導(dǎo)致的每單位全血量中血漿體積的 異常降低所引起的。在采集后或在結(jié)合測(cè)定開始后，由于一種原因或另一種原因，經(jīng)受水蒸 發(fā)且已經(jīng)干燥/濃縮的測(cè)試樣品也可以受益于本發(fā)明。本文使用的術(shù)語(yǔ)“俘獲試劑”是指與測(cè)試樣品組分特異性結(jié)合并與其形成復(fù)合物 的試劑，并且其可以包括針對(duì)抗原的抗體，“特異性俘獲物質(zhì)”，以及針對(duì)抗體的抗原。術(shù)語(yǔ) “特異性俘獲物質(zhì)”包括配體的受體，核酸鏈的互補(bǔ)鏈或適體，特定含糖物質(zhì)的凝集素，和類 似物。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易地理解，取決于待測(cè)分析物的選擇，測(cè)定系統(tǒng)的設(shè)計(jì)，等， 如在一種情況下被識(shí)別為本發(fā)明的測(cè)試樣品組分(例如，針對(duì)抗體的抗原)在另一種情況 下可能變成本發(fā)明的俘獲試劑。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還將容易地理解俘獲試劑可以是任何 類型只要其可以與測(cè)試樣品組分形成復(fù)合物，并且其可以是整個(gè)物質(zhì)或其功能片段。例如， 如果俘獲試劑是抗體，其可以是多克隆抗體，單克隆抗體，其功能片段(例如，F(xiàn)ab, Fab', F(ab，)2，和 Fv)，等等。本文使用的術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)試劑”與術(shù)語(yǔ)“綴合物”是同義詞，并且是指用檢測(cè)標(biāo)志物標(biāo) 記的俘獲試劑，或與標(biāo)記的分析物具有相同特性的物質(zhì)，或在結(jié)合測(cè)定中與標(biāo)記的分析物 等效的物質(zhì)。檢測(cè)試劑的具體實(shí)例包括標(biāo)記的抗體，標(biāo)記的特異性俘獲物質(zhì)，標(biāo)記的抗原， 和類似物。已知標(biāo)志物的實(shí)例包括可視化微粒諸如金屬膠體顆粒(例如，膠體金)和有色的 膠乳顆粒，酶諸如辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，和β -D-半乳糖苷酶，放射性同位素諸如 碘-125 (125I)，發(fā)光物質(zhì)諸如acridinium化合物和魯米諾(luminal)，熒光物質(zhì)諸如異硫氰 酸熒光素和銪(III)螯合物，和類似物。抗體或類似物可以通過任何已知的標(biāo)記方法(即， 引入和結(jié)合標(biāo)志物質(zhì)的方法)標(biāo)記，而沒有限制。本文使用的術(shù)語(yǔ)“樣品墊”是指接受可能含有測(cè)試樣品組分(分析物)的測(cè)試樣品 的部件，并且其包括可以以墊的形式吸收液體測(cè)試樣品并且允許液體和測(cè)試樣品組分經(jīng)過 的任何物質(zhì)或形狀。適合于樣品墊的材料的具體實(shí)例包括，但不限于，玻璃纖維，丙烯酸纖 維，親水的聚乙烯材料，干紙，紙漿，織物，和類似物。優(yōu)選使用玻璃纖維墊(由Lydall制造) 作為樣品墊。所述樣品墊可以作為樣品墊本身起作用，或可以另外地賦予綴合物釋放墊或 血細(xì)胞分離墊的功能，所述綴合物釋放墊或血細(xì)胞分離墊通常從樣品墊接收測(cè)試樣品。樣品墊可以包含通常在結(jié)合測(cè)定中使用的封閉試劑或類似物以便防止或抑制結(jié) 合測(cè)定用多孔性固相內(nèi)的非特異性反應(yīng)(吸附)。這樣的試劑的實(shí)例包括HeteroBlock(由 Omega Biologicals, Inc.制造的“500-11-001”)和類似物。此外，樣品墊可以包含一種 或多種抗凝劑，例如，以便防止血液凝固并抑制在測(cè)定期間由于血液凝固引起的非特異性 反應(yīng)(特別地，在分析物到達(dá)多孔性固相之前)。作為抗凝劑，可以使用肝素，檸檬酸，氟化 鈉(NaF)，或螯合劑(或其鹽或水合物)，只要它不損害本發(fā)明的效果。螯合劑的實(shí)例包括EDTA, CyDTA, DTPA，和類似物。本文使用的“綴合物釋放墊”是指含有與測(cè)試樣品組分特異性反應(yīng)的檢測(cè)試劑的 部件，并且當(dāng)測(cè)試樣品經(jīng)過所述綴合物釋放墊時(shí)所述綴合物釋放墊允許檢測(cè)試劑和測(cè)試樣 品組分通過特異性反應(yīng)形成復(fù)合物。綴合物釋放墊本身可以靠近多孔性固相放置。備選地， 綴合物釋放墊可以放置為在一側(cè)與樣品墊接觸，并且還在另一側(cè)與血細(xì)胞分離墊(下述) 接觸，使得其接收通過毛細(xì)流動(dòng)已經(jīng)經(jīng)過樣品墊的測(cè)試樣品并且然后還通過毛細(xì)流動(dòng)將所 述測(cè)試樣品運(yùn)送至血細(xì)胞分離墊。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易地理解樣品墊、綴合物釋放 墊和血細(xì)胞分離墊的一種或多種的選擇，以及選擇的部件如何相對(duì)于用于結(jié)合測(cè)定的多孔 性固相放置，可以根據(jù)情況而變化，這取決于測(cè)試條設(shè)計(jì)的預(yù)期目的等。適合于綴合物釋放墊的材料的實(shí)例包括，但不限于，紙，纖維素混合物，硝化纖維 素，聚酯，丙烯腈共聚物，玻璃纖維，非織造纖維(例如，人造絲)。優(yōu)選使用玻璃纖維墊(由 Pall Corporation制造的“No. 8964”)作為綴合物釋放墊。綴合物釋放墊可以包含“對(duì)照試劑”以確保測(cè)定的可靠性，諸如不與測(cè)試樣品組分 反應(yīng)的標(biāo)志物標(biāo)記的抗體，和用標(biāo)志物標(biāo)記的高抗原性蛋白(例如，匙孔血藍(lán)蛋白(KLH))。 對(duì)照試劑可以是預(yù)期不存在于測(cè)試樣品中的任何組分(物質(zhì))，并且其與對(duì)照俘獲試劑(下 述)適當(dāng)?shù)亟M合。綴合物釋放墊還可以包含穩(wěn)定劑、增溶劑和類似物質(zhì)的一種或多種，使得 所述檢測(cè)試劑(和任選地對(duì)照試劑)保持穩(wěn)定的狀態(tài)并且在與測(cè)試樣品接觸時(shí)迅速和有效 地溶解和流態(tài)化，從而促進(jìn)檢測(cè)試劑和測(cè)試樣品中可能包含的分析物之間的特異性反應(yīng)。 穩(wěn)定劑和增溶劑的實(shí)例包括牛血清白蛋白(BSA)，蔗糖，酪蛋白，氨基酸和類似物。氨基酸優(yōu) 選是甘氨酸或絲氨酸。本文使用的術(shù)語(yǔ)“血細(xì)胞分離墊”是指靠近所述綴合物釋放墊放置的部件使得所 述血細(xì)胞分離墊接收通過毛細(xì)流動(dòng)已經(jīng)經(jīng)過所述綴合物釋放墊的測(cè)試樣品，并且然后通過 毛細(xì)流動(dòng)將所述測(cè)試樣品運(yùn)送至多孔性固相，所述多孔性固相放置為與血細(xì)胞分離墊的另 一側(cè)接觸。血細(xì)胞分離墊由親水性和吸附性材料形成，所述材料具有過濾掉測(cè)試樣品中包含 的細(xì)胞組分部分的固有能力，并且，如果所述測(cè)試樣品是全血，則其可以將其中包含的細(xì)胞 組分的部分與血漿或血清分離。即使所述測(cè)試樣品不含有細(xì)胞組分，其可能含有比血細(xì)胞 分離墊的孔隙大的固體組分，其可以與細(xì)胞組分相同的方式分離。因此，本領(lǐng)域普通技術(shù)人 員將容易地理解血細(xì)胞分離墊可以用來不僅分離血細(xì)胞，而且可以分離測(cè)試樣品中通常包 含的固體組分。適合于血細(xì)胞分離墊的材料的實(shí)例包括，但不限于，吸水或不吸水的纖維性或非 纖維性基質(zhì)諸如親水無機(jī)粉末(例如，硅膠，氧化鋁，和硅藻土)；海綿材料；粘土材料；布 料；親水天然聚合物材料諸如纖維素材料(特別是纖維素多孔珠)和含纖維紙(特別是濾 紙或色譜紙)；和合成的或改性的天然聚合物諸如醋酸纖維素，聚氯乙烯，聚丙烯酰胺，聚 丙烯酸酯，聚氨酯，交聯(lián)葡聚糖，瓊脂糖和其他交聯(lián)的或非交聯(lián)的不溶于水的親水聚合物。 適合于血細(xì)胞分離墊的材料的更多實(shí)例包括，但不限于，纖維性或非纖維性基質(zhì)諸如玻璃 纖維基質(zhì)；和合成聚合物諸如聚丙烯，聚乙烯，尼龍，聚偏氟乙烯和聚砜。多孔硬塑料也可以 用作用于血細(xì)胞分離墊的材料，只要其可以分離包含在全血中的血細(xì)胞組分，并且具有足 夠的孔隙率從而允許血漿或血清經(jīng)過多孔性固相并與其接觸。優(yōu)選使用聚砜墊(由I^llCorporation制造的“BTS-SP300”)作為血細(xì)胞分離墊。本文使用的術(shù)語(yǔ)“吸收體”是指吸收液體部件，所述吸收液體部件吸收已經(jīng)通過結(jié) 合測(cè)定用多孔型固相的俘獲試劑負(fù)載區(qū)域移動(dòng)/經(jīng)過的測(cè)試樣品以控制測(cè)試樣品的流動(dòng) 行進(jìn)。例如，在側(cè)流或浸漬片形式中，吸收體可以設(shè)置在測(cè)試條的下游端上，并且在流通形 式中，吸收體可以設(shè)置在其上固定有俘獲試劑的膜的下方。吸收體的實(shí)例包括，但不限于， 濾紙。優(yōu)選使用由Whatman制造的740-E濾紙。本文使用的術(shù)語(yǔ)“多孔性固相”是指通常用于結(jié)合測(cè)定的多孔膜。測(cè)試樣品的流動(dòng) 行進(jìn)發(fā)生在多孔性固相中，并且測(cè)試樣品組分的檢測(cè)最終在其中進(jìn)行。用于多孔性固相的 材料不受限制，并且例如，多孔性固相可以由聚乙烯、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯、尼龍、玻璃、 多糖(例如，纖維素或纖維素衍生物)、陶瓷或類似物產(chǎn)生。具體實(shí)例包括獲自Millipore， Toyo Roshi JPWhatman的玻璃纖維濾紙和纖維素濾紙。俘獲試劑固定在多孔性固相上。俘獲試劑可以通過任何方法固定在多孔性固相 上，只要俘獲試劑經(jīng)由物理吸附、化學(xué)鍵合或類似作用直接或間接地固定在多孔性固相上。 例如，抗體或抗原可以通過將含有抗體或抗原的溶液涂覆或“點(diǎn)印(spotting) ”在膜上，并 且然后將所述膜干燥而吸附或固定在膜上。上面結(jié)合綴合物釋放墊而提及的“對(duì)照俘獲試 劑”也可以通過類似的方法固定在多孔性固相上。對(duì)照俘獲試劑是用于確保測(cè)定的可靠性 的試劑。例如，如果標(biāo)記抗體來自小鼠，則例如抗小鼠抗體(可以酌情選擇抗小鼠特異性的 類型)可以是對(duì)照俘獲試劑。如果綴合物釋放墊包含對(duì)照試劑諸如標(biāo)記的KLH，則抗-KLH抗 體或類似物可以用作對(duì)照俘獲試劑。對(duì)照俘獲試劑固定在多孔性固相上的位置可以根據(jù)測(cè) 定系統(tǒng)的設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)剡x擇。例如，當(dāng)使用側(cè)流或浸漬片形式和標(biāo)記的小鼠來源抗體，并且抗 小鼠抗體用作對(duì)照俘獲試劑時(shí)，抗小鼠抗體正常情況下固定在用于測(cè)試樣品組分的俘獲試 劑的下游側(cè)。當(dāng)使用流通形式時(shí)，抗小鼠抗體正常情況下固定在離用于測(cè)試樣品組分的俘 獲試劑的固定位置適當(dāng)?shù)木嚯x處(或如果檢測(cè)多個(gè)測(cè)試樣品組分，則以合適的間隔固定)。 總之，用于固定對(duì)照俘獲試劑的最適位置可以通過考慮測(cè)定系統(tǒng)的設(shè)計(jì)以及對(duì)照試劑和對(duì) 照俘獲試劑的組合來選擇。本文使用的術(shù)語(yǔ)“測(cè)試條”是指其中結(jié)合測(cè)定用多孔性固相根據(jù)情況安裝有樣品 墊、綴合物釋放墊、血細(xì)胞分離墊和吸收體中的至少一種的產(chǎn)品。假設(shè)測(cè)定不涉及測(cè)試樣品 的稀釋且沒有加入測(cè)試樣品以外的額外步驟，則測(cè)試條可以至少包括安裝有綴合物釋放墊 的結(jié)合測(cè)定用多孔性固相。該測(cè)試條通常形成在固相支持物諸如粘性塑料板上。固相支持 物，以及膠粘劑組分應(yīng)該由不妨礙測(cè)試樣品的毛細(xì)流動(dòng)的材料制成。多孔性固相可以被層 壓以增加其機(jī)械強(qiáng)度并防止測(cè)定期間的水蒸發(fā)(干燥)(參見專利文件幻。當(dāng)聚酯膜或類 似物在多孔性固相的上側(cè)成層使得所述多孔性固相被覆蓋在層狀體中時(shí)，可以觀察到對(duì)測(cè) 試樣品的流動(dòng)行進(jìn)的有利效果，諸如改善的流動(dòng)行進(jìn)速度。該測(cè)試條可以安裝在容器(外 殼)中或裝配在容器(外殼)上，所述容器(外殼)適合于所述測(cè)試條的尺寸、測(cè)試樣品的 加入方式和位置、俘獲試劑的固定位置、信號(hào)檢測(cè)方法等等。這樣的產(chǎn)品稱為“裝置”?？梢栽诒景l(fā)明中使用的表面活性劑之一為(A)含糖表面活性劑，其包含由下列通 式(I)顯示的化合物，R1-(G)x (I)其中R1代表取代的或未取代的具有5-10個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，G代表由具有5或6個(gè)碳原子的還原糖衍生的殘基，并且χ是1-3的數(shù)，其表示所述還原糖的縮合度， 且R1和G經(jīng)由氧原子或硫原子通過醚鍵連接?？梢杂糜诒景l(fā)明中的具有5-10個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基的實(shí)例包括，但不限 于，戊基、3-甲基丁基、己基、甲基戊基、庚基、4-甲基己基、5-甲基己基、4-乙基戊基、辛基、 6-甲基庚基、5-甲基庚基、5，5_ 二甲基己基、壬基、癸基和類似基團(tuán)。烷基可以用任何取代 基取代，只要該取代不損害本發(fā)明的效果。取代基的實(shí)例包括鹵素原子(例如，氯原子、氟 原子和碘原子)、羥基和類似基團(tuán)。優(yōu)選的R1是具有7或8個(gè)碳原子的直鏈烷基(正庚基 或正辛基)。具有5或6個(gè)碳原子的還原糖的實(shí)例包括葡萄糖、半乳糖和果糖。還原糖可以是 α-形式或形式，但優(yōu)選形式。還原糖可以與相同的或不同的還原糖形成縮合物。 縮合物的具體實(shí)例包括麥芽糖(兩個(gè)葡萄糖分子的縮合物)、蔗糖(一個(gè)葡萄糖分子和一個(gè) 果糖分子的縮合物)等。χ是1-3的數(shù)，其表示還原糖的縮合度。需注意χ是平均值，其可 以通過質(zhì)子NMR測(cè)定。χ優(yōu)選為1-2。R1和G經(jīng)由氧原子或硫原子通過醚鍵連接以形成糖苷鍵或硫代糖苷鍵。這樣的結(jié) 構(gòu)的具體實(shí)例是經(jīng)由連接在葡萄糖的5位碳處的氧原子或硫原子通過醚鍵連接的R1和葡 萄糖。由通式⑴顯示的化合物的具體實(shí)例包括烷基葡糖苷衍生物諸如正庚 基-β -D-葡糖苷(正庚基-β -D-吡喃葡糖苷)，正辛基-β -D-葡糖苷(正辛基-β -D-吡 喃葡糖苷)，正壬基-β -D-吡喃麥芽糖苷，正癸基-β -D-吡喃葡糖苷，和正癸基-β -D-吡 喃麥芽糖苷；烷基硫代葡糖苷衍生物諸如正庚基-β -D-硫代葡糖苷(正庚基-β -D-硫 代吡喃葡糖苷)，正辛基-β-D-硫代葡糖苷(正辛基-D-硫代吡喃葡糖苷)，正壬 基-β -D-硫代吡喃麥芽糖苷，辛基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷，和正十二基-β -D-麥芽糖 苷；和類似物。在這些化合物中，特別優(yōu)選正辛基-D-葡糖苷或正庚基-D-硫代葡 糖苷用于防止測(cè)試樣品的流動(dòng)行進(jìn)不良和用于改進(jìn)測(cè)定的靈敏度。為了防止測(cè)量波形的擾 動(dòng)，優(yōu)選正辛基-β -D-葡糖苷，正庚基-β -D-硫代葡糖苷或正十二基-β -D-麥芽糖苷?？梢杂糜诒景l(fā)明中的另一種表面活性劑是(B)含糖表面活性劑，其包含蔗糖脂肪 酸酯，其中構(gòu)成脂肪酸具有5-14個(gè)碳原子。具有5-14個(gè)碳原子的脂肪酸的實(shí)例包括戊酸(pentanoic acid)(戊酸(valeric acid)),己酸(hexanoic acid)(己酸(caproic acid)),庚酸(heptanoic acid)(庚酸 (enanthic acid)),辛酸(octanoic acid)(辛酸(caprylic acid)),壬酸(nonanoic acid) (壬酸(pelargonic acid)),癸酸(decanoic acid)(癸酸(capric acid)),十 二燒酸 (dodecanoic acid)(月桂酸(lauric acid)),禾口十四燒酸(tetradecanoic acid)(肉豆 蔻酸(myristic acid))。在這些脂肪酸中，優(yōu)選具有6或12個(gè)碳原子的脂肪酸(即，己酸 (hexanoic acid)(己酸(caproic acid))或十二燒酸(dodecanoic acid)(月桂酸(lauric acid))) 0經(jīng)由酯鍵與一個(gè)蔗糖分子連接的脂肪酸分子的數(shù)目可以為，例如，1-3。優(yōu)選使用 其中一個(gè)脂肪酸分子與一個(gè)蔗糖分子經(jīng)由酯鍵連接的蔗糖脂肪酸酯。這樣的化合物的具體 實(shí)例包括蔗糖單己酸酯和蔗糖單月桂酸酯。在如本文使用的“含糖表面活性劑”的上下文中，術(shù)語(yǔ)“含糖”是指選自由㈧通式(I)顯示的化合物和(B)蔗糖脂肪酸酯組成的組的表面活性劑在其結(jié)構(gòu)中含有糖結(jié)構(gòu)部分 或糖衍生的結(jié)構(gòu)部分，其中在所述蔗糖脂肪酸酯中構(gòu)成脂肪酸具有5-14個(gè)碳原子?？梢杂糜诒景l(fā)明中的另一種表面活性劑還有(C)類固醇表面活性劑.本文使用的術(shù)語(yǔ)“類固醇表面活性劑”是指離子型或非離子型表面活性劑，其中疏 水基團(tuán)具有類固醇主鏈。類固醇表面活性劑的具體實(shí)例包括膽酸鹽，脫氧膽酸鹽，去氫膽酸 鹽，?；悄懰猁}，甘膽酸鹽，3-[(3-膽酰胺丙基)二甲基氨基]丙磺酸，3-[(3-膽酰胺丙基) 二甲基氨基]-2-羥基丙磺酸(CHAPQ，N，N-雙(3-D-葡萄糖酰氨基丙基)膽酰胺，類固醇 皂苷(例如，洋地黃皂苷)，和類似物。在這些表面活性劑中，膽酸鈉，CHAPS，和類似物優(yōu)選 用于防止測(cè)試樣品的流動(dòng)行進(jìn)不良和用于改進(jìn)測(cè)定的靈敏度。為了防止測(cè)量波形的擾動(dòng)， 優(yōu)選膽酸鈉，CHAPS，或洋地黃皂苷。上面提及的表面活性劑可以單獨(dú)或組合使用。這些表面活性劑正常地以 0. 001-2.0% (w/v)的濃度使用。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將能夠考慮要進(jìn)行的結(jié)合測(cè)定中除 表面活性劑之外其他組分/元素的存在，膜的材料，和類似因素，通過試驗(yàn)確定表面活性劑 的最適濃度，從而使本發(fā)明的效果最大化。例如，表面活性劑的濃度優(yōu)選為0. 001-0. 5%，更 優(yōu)選0. 01-0. 5%,和還更優(yōu)選0. 01-0. 1 %的范圍。本發(fā)明的表面活性劑以溶液的形式使用。例如，可以通過將多孔性固相浸漬在表 面活性劑溶液中，然后將所述多孔性固相干燥，從而在加入測(cè)試樣品之前將所述表面活性 劑結(jié)合至多孔性固相中。在其中將表面活性劑結(jié)合至多孔性固相中的根據(jù)本發(fā)明的方法中，測(cè)試樣品不需 要預(yù)處理，并且排除了由于測(cè)試樣品的稀釋而引起的檢測(cè)靈敏度的降低。而且，如果提供綴 合物釋放墊，將不需要在加入測(cè)試樣品后加入檢測(cè)試劑的額外步驟。因此，可以容易地進(jìn)行 結(jié)合測(cè)定。在常規(guī)方法中進(jìn)行的測(cè)試樣品的預(yù)處理將使得測(cè)定結(jié)果取決于洗滌溶液的加入 時(shí)機(jī)或其他因素而變化。然而，使用本發(fā)明的預(yù)先包含表面活性劑的多孔性固相，不僅消除 了進(jìn)行預(yù)處理的麻煩，而且消除了對(duì)使用者的熟練度的要求(就調(diào)節(jié)洗滌溶液的時(shí)間等而 言)，從而改善了測(cè)定的精確度。洗滌溶液的加入時(shí)機(jī)需要根據(jù)測(cè)試條的批次間變化來進(jìn)一 步進(jìn)行調(diào)節(jié)，但如上所討論地，此問題在本發(fā)明中問題較小。為了使本發(fā)明的效果最大化并提供最實(shí)用的實(shí)施方案，重要的是將表面活性劑固 定在多孔性固相上并且將其在使用前轉(zhuǎn)變?yōu)楦稍餇顟B(tài)。在側(cè)流或浸漬片形式的情況下，本 發(fā)明的表面活性劑需要至少固定在多孔性固相的測(cè)試樣品移動(dòng)區(qū)域中。多孔性固相的測(cè)試 樣品移動(dòng)區(qū)域在引入測(cè)試樣品的部分處開始(直接引入或通過綴合物釋放墊或類似物引 入)，包括測(cè)試樣品的移動(dòng)路徑，并且在其中固定俘獲試劑的部分處終止。然而，優(yōu)選表面活 性劑的固定延伸至多孔性固相的端部。此外，重要的是將表面活性劑均勻地固定在測(cè)試樣 品的移動(dòng)區(qū)域內(nèi)，使得所述測(cè)試樣品可以均勻地移動(dòng)。如上所述，根據(jù)本發(fā)明的用于結(jié)合測(cè) 定的多孔性固相使得測(cè)試樣品(甚至高粘度的測(cè)試樣品)有序地行進(jìn)(移動(dòng)/經(jīng)過)，并且 因此使得測(cè)定具有優(yōu)異的再現(xiàn)性，其中檢測(cè)靈敏度不受損害。需注意的是上面提到的表面 活性劑的濃度主要預(yù)期用于上面提到的通過浸漬將表面活性劑結(jié)合在多孔性固相中的方 法。因此，如果采用不同的方法以將表面活性劑結(jié)合在多孔性固相中，例如，將表面活性劑 噴霧至多孔性固相上或多孔性固相材料本身的改性/加工，則可以對(duì)該方法確定適當(dāng)?shù)谋?面活性劑濃度，其中在浸漬法中獲得的結(jié)果用作參考點(diǎn)。
表述“將表面活性劑固定在多孔性固相上并將其在使用前轉(zhuǎn)變?yōu)楦稍餇顟B(tài)”是指 其中表面活性劑結(jié)合在多孔性固相中并且不容易從多孔性固相上脫離或脫落的狀態(tài)；其不 一定需要物理吸附或化學(xué)鍵合。因此，固定，可以通過將多孔性固相浸漬在表面活性劑溶液 中并且然后將所述多孔性固相干燥來實(shí)現(xiàn)，如該詞在此上下文中所意指的那樣。簡(jiǎn)言之，如 果多孔性固相在測(cè)定之前以某種方式以干燥狀態(tài)保持表面活性劑就足夠了。上述的本發(fā)明的表面活性劑溶液除了表面活性劑以外，還可以包含在結(jié)合測(cè)定中 通常用作封閉溶液、洗滌溶液或稀釋劑的組分的緩沖液，諸如磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液和 Good's緩沖液。緩沖溶液的pH不受限制，但優(yōu)選在5-9的范圍內(nèi)。此外，通常加入至緩沖 液中的其他組分，諸如鹽(例如，氯化鈉)和防腐劑，可以加入至表面活性劑溶液中。此外，上述的本發(fā)明的表面活性劑溶液除了本發(fā)明的表面活性劑以外，還可以包 含通常用于結(jié)合測(cè)定中的其他表面活性劑(例如，聚氧乙烯非離子型表面活性劑諸如聚氧 乙烯失水山梨糖醇單月桂酸酯或聚氧乙烯單-對(duì)異辛基苯基醚)，所述其他表面活性劑在 此技術(shù)領(lǐng)域中通常使用的濃度下不干擾測(cè)定系統(tǒng)。下面通過將免疫測(cè)定作為實(shí)例描述利用根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合測(cè)定用多孔性固相的 結(jié)合測(cè)定法。測(cè)試樣品施加至結(jié)合測(cè)定條上，所述結(jié)合測(cè)定條包括接收測(cè)試樣品的樣品墊、 包含標(biāo)記的抗體(作為檢測(cè)試劑)的綴合物釋放墊、用于分離細(xì)胞組分的血細(xì)胞分離墊和 包含表面活性劑的本發(fā)明的多孔性固相，抗體(作為俘獲試劑)固定在所述多孔性固相上。 當(dāng)測(cè)試樣品經(jīng)過綴合物釋放墊時(shí)，標(biāo)記的抗體與測(cè)試樣品組分(分析物)反應(yīng)形成特異性 復(fù)合物。該復(fù)合物通過毛細(xì)管作用通過膜行進(jìn)(移動(dòng)/經(jīng)過)，并且測(cè)量來自已經(jīng)被固定在 膜上的抗體俘獲的特異性復(fù)合物內(nèi)的標(biāo)志物的信號(hào)。在根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合測(cè)定法中，由于 表面活性劑被干燥并且預(yù)先固定在多孔性固相的測(cè)試樣品移動(dòng)區(qū)域上，因此測(cè)試樣品顯示 優(yōu)異的流動(dòng)性并且可以通過多孔性固相均勻地移動(dòng)，即使當(dāng)所述測(cè)試樣品含有固體組分或 是高度粘性時(shí)。此外，在根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合測(cè)定中可以減小含有俘獲試劑的線的周圍區(qū)域 變白(在上游側(cè)或下游側(cè))的現(xiàn)象的頻率。這樣的免疫測(cè)定的具體實(shí)例包括“流通形式”免疫測(cè)定，“浸漬片形式”免疫測(cè)定， 和“側(cè)流形式”免疫測(cè)定。在“側(cè)流形式”中，液體測(cè)試樣品逐滴加入至裝置中并且在水平方向上通過已經(jīng)施 加了俘獲試劑的多孔性固相行進(jìn)(移動(dòng))，所述俘獲試劑可以特異性地結(jié)合測(cè)試樣品組分 (分析物)。特異性結(jié)合分析物的檢測(cè)試劑，分析物本身以及固定在多孔性固相上的俘獲 試劑一起在多孔性固相上形成三元復(fù)合物，并且然后檢測(cè)或定量包含在檢測(cè)試劑中的標(biāo)志 物。“流通形式”與側(cè)流形式具有相同的測(cè)定原理，但與側(cè)流形式的不同之處在于液體測(cè)試 樣品在垂直方向上通過多孔性固相行進(jìn)(經(jīng)過)。“浸漬片形式”與上述兩種形式的不同之處在于測(cè)試條的一部分浸泡在預(yù)定量的 液體測(cè)試樣品中。在此，當(dāng)測(cè)試樣品沿多孔性固相上升時(shí)實(shí)現(xiàn)測(cè)試樣品的行進(jìn)(移動(dòng))。在本發(fā)明的多孔性固相中實(shí)現(xiàn)的防止測(cè)試樣品的流動(dòng)行進(jìn)不良的有益效果在測(cè) 試樣品運(yùn)行的行進(jìn)距離越長(zhǎng)時(shí)越好。換句話說，當(dāng)本發(fā)明與“側(cè)流形式”或“浸漬片形式”組 合使用時(shí)可以以優(yōu)異的再現(xiàn)性進(jìn)行結(jié)合測(cè)定，在“側(cè)流形式”或“浸漬片形式”中測(cè)試樣品 沿著多孔性固相的最長(zhǎng)側(cè)移動(dòng)。由于包含表面活性劑的根據(jù)本發(fā)明的多孔性固相抑制測(cè)試 樣品的流動(dòng)行進(jìn)不良，因此其有效用于不包括洗滌步驟的結(jié)合測(cè)定中，并且其特別適合于側(cè)流或浸漬片形式結(jié)合測(cè)定。包含表面活性劑的本發(fā)明的多孔性固相、綴合物釋放墊等可以根據(jù)需要通過修改 /改變下面實(shí)施例中所述的方法來產(chǎn)生。在測(cè)定期間可以以任意順序進(jìn)行涉及測(cè)試樣品和 標(biāo)志物的反應(yīng)，只要可以利用根據(jù)本發(fā)明的用于結(jié)合測(cè)定的多孔性固相?？梢愿鶕?jù)公知方 法測(cè)量來自標(biāo)志物的信號(hào)。例如，當(dāng)使用膠體金作為標(biāo)志物時(shí)，可以測(cè)量反射光的吸光度或 強(qiáng)度。當(dāng)使用放射性同位素作為標(biāo)志物時(shí)，可以使用計(jì)數(shù)器來計(jì)數(shù)輻射劑量。
實(shí)施例下面通過實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。然而，本發(fā)明不限于下面的實(shí)施例。比較例1 使用常規(guī)結(jié)合測(cè)定用多孔性固相的免疫色譜裝置的制造(1)膠體金標(biāo)記的抗-D 二聚體抗體(抗-DD抗體綴合物)的制備IOml含有92. 4 μ g/ml抗-D 二聚體單克隆抗體(抗-DD抗體)的2mmol/l硼酸鹽 緩沖溶液(PH 8. 0)加入至200ml含有膠體金(10D/ml)(粒徑40nm)的碳酸鉀緩沖溶液(pH 8. 0)中。該混合物在室溫下攪拌10分鐘。向膠體金-抗-DD抗體混合物中加入20mll0% 牛血清白蛋白(BSA)水溶液后，混合物繼續(xù)攪拌5分鐘，并在10°C下離心(10，OOOrpm) 45分 鐘以獲得沉淀物(綴合物)。綴合物用綴合物稀釋緩沖液(由Scripps制造)稀釋(懸浮 在其中)至170D/ml。在524nm(即，膠體金的最大吸收波長(zhǎng))下測(cè)量吸光度。(2)綴合物釋放墊的制備(1)中制備的綴合物與1.33%酪蛋白和4%蔗糖溶液(pH 7.5)混合以制備綴 合物溶液GOD/ml)。玻璃纖維墊(寬度13. Omm,長(zhǎng)度254mm，厚度0. 56mm)(由I^all Corporation制造的“No. 8964”)浸漬以1. 2體積(相對(duì)于墊的體積)的綴合物溶液。該 墊在烘箱中在70°C下干燥30分鐘以獲得綴合物釋放墊。(3)其上固定有抗-DD抗體的膜(用于結(jié)合測(cè)定的多孔性固相)的制備通過使用免疫色譜分配器“XYD050” (由BI0D0T制造)，將含有l(wèi)mg/ml抗-DD抗 體和2. 5%蔗糖的lOmmol/1磷酸鹽緩沖溶液(pH 7. 2)的“線”畫在(1 μ 1/cm)硝化纖維素 膜(短邊25mm，長(zhǎng)邊254mm，厚度0. 235mm)(由Millipore制造的“HFM0”)上，沿膜的 長(zhǎng)邊離長(zhǎng)邊的邊緣Ilmm的位置處。該膜在烘箱中在70°C下干燥45分鐘以獲得其上固定有 抗-DD抗體的膜。(4)樣品墊的制備玻璃纖維墊(短邊16mm，長(zhǎng)邊254mm，厚度0. 55mm)(由Lydall制造)浸漬 以1. 15體積(相對(duì)于墊的體積)的樣品墊浸漬溶液(含有25mmol/l NaCl，0.5%蔗糖 和 0.25mg/ml HETERO BLOCK (由 Omega Biologicals 制造的 “500-11-001”)的 20mmol/l Tris-HCl緩沖液(pH 7. 2))0該墊在烘箱中在70°C下干燥45分鐘以獲得樣品墊。(5)結(jié)合測(cè)定條(測(cè)試條)的制備其上已經(jīng)固定有抗-DD抗體的上述膜(d)粘合至粘性塑料板(g)。血細(xì)胞分離墊 (c)(由Mil Corporation制造的“BTS-SP300”)放置在與已經(jīng)施加了抗-DD抗體(e)的 一側(cè)相對(duì)的膜的一端處。吸收體(f)(由Whatman制造的“740-E”)放置在膜的另一端處， 即已經(jīng)施加了抗-DD抗體的同一側(cè)。放置在O)中制備的綴合物釋放墊(b)以疊蓋血細(xì)胞 分離墊，并放置(4)中制備的樣品墊(a)以疊蓋綴合物釋放墊。最后，聚酯膜(h)層壓在頂部以覆蓋多孔性固相和吸收體。將得到的結(jié)構(gòu)切成6mm的寬度以獲得測(cè)試條，在所述結(jié)構(gòu) 中這些部件彼此成層。測(cè)試條的寬度為6mm且長(zhǎng)度為70mm。測(cè)試條安裝在塑料外殼(未顯 示在圖1中)中/裝配在其上，所述塑料外殼為此目的專門設(shè)計(jì)并且具有樣品添加窗和檢 測(cè)窗，從而獲得免疫色譜裝置。圖1是測(cè)試條的示意性結(jié)構(gòu)圖。實(shí)施例1 使用根據(jù)本發(fā)明的測(cè)試條的免疫色譜裝置的制造(1)其上固定有抗-DD抗體的本發(fā)明的膜(用于結(jié)合測(cè)定的多孔性固相)的制備硝化纖維素膜(由Millipore制造的“HFM0”)浸泡在含有0. 05% (w/v)濃度的 表1中所示的本發(fā)明表面活性劑的lOmmol/1磷酸鹽緩沖液(pH 7. 2)中，并在室溫下振蕩 30分鐘。去除過量液體后，將膜在烘箱中在37°C下干燥1小時(shí)。然后得到的含有表面活性 劑的膜以與比較例1的步驟C3)中相同的方式加工以獲得其上固定有抗-DD抗體的本發(fā)明 的膜。(2)本發(fā)明的免疫色譜裝置的制造本發(fā)明的測(cè)試裝置以與比較例1的步驟(5)中相同的方式，使用比較例1的步驟 (2)中制備的綴合物釋放墊，比較例1的步驟中制備的樣品墊，和上面提到的其上固定 有抗-DD抗體的本發(fā)明的膜制造。實(shí)施例2 驗(yàn)證由根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合測(cè)定用多孔性固相所顯示的防止測(cè)試樣品的 流動(dòng)行進(jìn)不良的效果[1](1)具有高Ht值的模型全血的制備將全血離心獲得血細(xì)胞層。由相同全血獲得的血漿加入至血細(xì)胞層以獲得具有 70%的Ht值的模型全血。(2)測(cè)試方法100 μ 1模型全血施加至在實(shí)施例1中制造的根據(jù)本發(fā)明的裝置的測(cè)試條的樣品 墊，并且在15分鐘后，用肉眼檢查來源于綴合物并指示行進(jìn)液體的邊緣的紫紅色線是否到 達(dá)位于測(cè)試條的一端的吸收體。如果紫紅色線已經(jīng)到達(dá)位于測(cè)試條一端的吸收體，則判斷 所述多孔性固相已經(jīng)防止了測(cè)試樣品的流動(dòng)行進(jìn)不良。結(jié)果顯示在表1中。在相關(guān)的注釋 中，在其中綴合物直接施加至比較例1的膜上的測(cè)試中，是否存在粘性塑料板對(duì)測(cè)試樣品 的流動(dòng)行進(jìn)速率不造成可觀察到的差異。表 1
本發(fā)明的表面 活性劑的名稱表面活性劑類別效果實(shí)施例1-1正辛基-β-D-葡 糖苷烷基葡糖苷O實(shí)施例1-2正庚基-β-D-硫 代葡糖苷烷基葡糖苷〇實(shí)施例1-3蔗糖單己酸酯蔗糖脂肪酸酯〇比較例1無表面活性劑無表面活性劑X
(3)測(cè)試結(jié)果在比較例1的測(cè)試條中，紫紅色線沒有到達(dá)抗-DD抗體線。另一方面，在包含正辛 基-β -D-葡糖苷，正庚基-β -D-硫代葡糖苷或蔗糖單己酸酯的本發(fā)明的測(cè)試條中，證實(shí)紫 紅色線已經(jīng)移動(dòng)至位于測(cè)試條的一端的吸收體。從上面判斷正辛基-β -D-葡糖苷，正庚基-β -D-硫代葡糖苷，和蔗糖單己酸酯各 自具有防止用于結(jié)合測(cè)定的多孔性固相中測(cè)試樣品的流動(dòng)行進(jìn)不良的效果(在表1的“效 果”欄中標(biāo)記為“〇”)。實(shí)施例3 驗(yàn)證由根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合測(cè)定用多孔性固相所顯示的防止測(cè)試樣品的 流動(dòng)行進(jìn)不良的效果[2](1)含有純化的D 二聚體(DD)的具有高Ht值的模型全血(DD模型全血)的制備全血離心獲得血細(xì)胞層。含有純化的DD和獲自相同全血的血漿的lOmmol/1 Tris-HCl緩沖液(pH 8. 0)加入至血細(xì)胞層，從而獲得在重配后含有終濃度為1. 0 μ g/ml的 DD和Ht值為70%的的模型全血。(2)測(cè)試方法100 μ 1 DD模型全血施加至實(shí)施例1中制造的包含本發(fā)明的結(jié)合測(cè)定用多孔性固 相(包含正辛基-D-葡糖苷)的免疫色譜裝置的樣品墊，并且以1分鐘間隔(在加入樣 品后從1分鐘-15分鐘)通過使用免疫色譜讀數(shù)器“ ICA-1000”由Hamamatsu Photonics K. K.制造)測(cè)量測(cè)試裝置的檢測(cè)窗中反射吸光度(此后，在實(shí)施例中稱為“吸光度”)的變 化。在所有實(shí)施例中使用相同的裝置測(cè)量吸光度。(3)測(cè)試結(jié)果在包含本發(fā)明的結(jié)合測(cè)定用多孔性固相的測(cè)試條中，在加入DD模型全血后10分 鐘觀察到吸光度增加，并且吸光度繼續(xù)線性增加直至加入DD模型全血后15分鐘。在兩次 測(cè)量中觀察到幾乎相同的結(jié)果(圖2中的“實(shí)施例”)。在包含比較例1的結(jié)合測(cè)定用多孔 性固相的測(cè)試條中，在第一次測(cè)量中直至加入DD模型全血后14分鐘才觀察到吸光度增加， 并且在加入DD模型全血后15分鐘時(shí)吸光度的增加低于在加入DD模型全血后10分鐘時(shí)在 本發(fā)明的測(cè)試條中觀察到的吸光度增加。在第二次測(cè)量中，在加入DD模型全血后11分鐘 時(shí)觀察到吸光度的增加。然而，在加入DD模型全血后15分鐘時(shí)測(cè)量的吸光度低于本發(fā)明 的測(cè)試條中獲得的吸光度(圖2中的“比較例”)。因此證實(shí)本發(fā)明的測(cè)試條可以以優(yōu)異的再現(xiàn)性進(jìn)行測(cè)定，即使是當(dāng)具有非常低的 流體含量的全血(例如，具有70%的Ht值)用作測(cè)試樣品時(shí)，并且證實(shí)本發(fā)明具有防止結(jié) 合測(cè)定用多孔性固相中測(cè)試樣品的流動(dòng)行進(jìn)不良的顯著效果。實(shí)施例4 驗(yàn)證由根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合測(cè)定用多孔性固相所顯示的防止測(cè)試樣品的 流動(dòng)行進(jìn)不良的效果[3](I)DD模型全血的制備DD模型全血以與實(shí)施例3相同的方式制備。(2)根據(jù)本發(fā)明的免疫色譜裝置的制造使用正辛基- β -D-葡糖苷、正庚基-D-硫代葡糖苷或蔗糖單月桂酸酯作為表 面活性劑以與實(shí)施例1中相同的方式制備免疫色譜裝置。(3)測(cè)試方法
100 μ 1 DD模型全血施加至上面O)中制造的本發(fā)明的免疫色譜裝置的樣品墊， 并且15分鐘后，測(cè)量測(cè)試裝置的檢測(cè)窗中的吸光度(n = 5)。計(jì)算測(cè)量值的CV(% )，并且 與包含具有常規(guī)結(jié)合測(cè)定用多孔性固相的測(cè)試條的免疫色譜裝置中獲得的CV進(jìn)行比較。(4)測(cè)試結(jié)果根據(jù)本發(fā)明的測(cè)試條與常規(guī)測(cè)試條相比顯示顯著較低的CV(% )(參見圖幻。因 此證實(shí)本發(fā)明的結(jié)合測(cè)定用多孔性固相的使用能夠以優(yōu)異的再現(xiàn)性測(cè)定甚至那些具有極 高Ht值的測(cè)試樣品，并且證實(shí)本發(fā)明防止結(jié)合測(cè)定用多孔性固相中測(cè)試樣品的流動(dòng)行進(jìn) 不良，并且能夠進(jìn)行精確的測(cè)量。實(shí)施例5 驗(yàn)證由根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合測(cè)定用多孔性固相所顯示的防止測(cè)試樣品的 流動(dòng)行進(jìn)不良的效果W](1)含有純化的D 二聚體(DD)的具有高Ht值的模型全血(DD模型全血)的制備全血離心獲得血細(xì)胞層。含有純化的DD和獲自相同全血的血漿的lOmmol/1 Tris-HCl緩沖液(pH 8. 0)加入至血細(xì)胞層，從而獲得含有終濃度為1. 0 μ g/ml的DD和Ht 值為62%的模型全血。(2)其上固定有抗-DD抗體的膜(結(jié)合測(cè)定用多孔性固相)的制備以與實(shí)施例1的步驟(1)中相同的方式制備其上固定有抗-DD抗體的膜(結(jié)合測(cè) 定用多孔性固相)，不同之處在于加入至lOmmol/1磷酸鹽緩沖液(pH 7. 2)中的表面活性劑 濃度為 0,0. 01，0. 05，0. 075，或 0. 10% (w/v)。(3)測(cè)試方法使用實(shí)施例4的步驟(3)中所述的測(cè)試方法。計(jì)算測(cè)量值的CV(% )以確定最適 濃度范圍。(4)測(cè)試結(jié)果如圖4中所示，各種表面活性劑的使用與常規(guī)方法相比在每個(gè)測(cè)試濃度下均確保 優(yōu)異的再現(xiàn)性。當(dāng)CV值等于或小于15% (即，使用常規(guī)方法獲得的值的一半)時(shí)，判斷表 面活性劑的使用是有效的。在本實(shí)施例中使用的每種表面活性劑在0.01-0. 10%的濃度范 圍內(nèi)得到的CV值均小于15%。由此證實(shí)這些表面活性劑的每一種與常規(guī)方法相比均提供 令人滿意的效果。實(shí)施例6 包含對(duì)照線的免疫色譜裝置的制造(1)用于對(duì)照線的膠體金標(biāo)記的KLH(KLH綴合物)的制備其中已經(jīng)溶解了 KLH粉末(620 μ g/ml)的IOml 2mmol/l磷酸鹽緩沖液(pH 6. 1) 加入至200ml含有10D/ml膠體金(粒徑40nm)的碳酸鉀緩沖液(pH 8. 0)中。該混合物 在室溫下攪拌10分鐘。將20ml 10%牛血清白蛋白(BSA)水溶液加入至膠體金-KLH混合 物中后，將該混合物攪拌5分鐘，并在10°C下離心(10，OOOrpm)45分鐘以獲得沉淀物(綴 合物)。綴合物用綴合物稀釋緩沖液(由Scripps制造)稀釋(懸浮在其中)至170D/ml。 在531nm(即，膠體金的最大吸收波長(zhǎng))下測(cè)量吸光度。(2)綴合物釋放墊的制備在比較例1的步驟(1)中制備的抗-DD抗體綴合物和上面步驟(1)中制備的KLH 綴合物與1.33%酪蛋白和4%蔗糖溶液(pH 7.5)混合以制備其中綴合物的濃度分別為 40D/ml和4. 50D/ml的綴合物溶液。玻璃纖維墊(寬度13. Omm,長(zhǎng)度254mm，厚度0. 56mm)(由Pall Corporation制造的“No. 8964”)浸漬以1. 2體積(相對(duì)于該墊的體積)的綴合 物溶液。該墊在烘箱中在70°C下干燥30分鐘以獲得綴合物釋放墊。(3)其上固定有抗-DD抗體和抗-KLH多克隆抗體的膜(結(jié)合測(cè)定用多孔性固相) 的制備硝化纖維素膜浸泡在含有如實(shí)施例1的步驟(1)中的具體濃度的本發(fā)明表面活性 劑的lOmmol/1磷酸鹽緩沖液(pH 7. 2)中，并在室溫下振蕩30分鐘。去除過量液體后，將膜 在烘箱中在37°C下干燥1小時(shí)。通過使用免疫色譜分配器“XYD050” (由BIODOT制造)， 將含有l(wèi)mg/ml抗-DD抗體和2. 5%蔗糖的10mmol/l磷酸鹽緩沖溶液(pH 7. 2)的“線”， 和含有0. 5mg/ml抗-KLH多克隆抗體和2. 5%蔗糖的lOmmol/1磷酸鹽緩沖溶液(pH7. 2) 的“線”分別畫在(1 μ 1/cm)硝化纖維素膜(短邊25mm，長(zhǎng)邊254mm，厚度0. 235mm)(由 Millipore制造的“HFM0”)上，沿膜的長(zhǎng)邊離長(zhǎng)邊的一端Ilmm和離相同的一端15mm的位 置處。該膜在烘箱中在70°C下干燥45分鐘以獲得其上固定有抗-DD抗體的膜。(4)樣品墊的制備樣品墊以與比較例1的步驟⑷中相同的方式制備。(5)免疫色譜裝置的制造以與比較例1的步驟(5)中相同的方式，使用上面(2)中制備的綴合物釋放墊、上 面(3)中制備的膜和上面中制備的樣品墊制備包含對(duì)照線的測(cè)試條和免疫色譜裝置。 圖5是該測(cè)試條的示意性結(jié)構(gòu)圖。在下面的實(shí)施例7和9中，術(shù)語(yǔ)“測(cè)試線”是指當(dāng)測(cè)試樣品到達(dá)膜(d)上固定抗-DD 抗體(e)的位置處時(shí)檢測(cè)到的線(其在圖5中出現(xiàn)在(e)中)，并且術(shù)語(yǔ)“對(duì)照線”是指當(dāng) 測(cè)試樣品到達(dá)所述膜上固定對(duì)照俘獲試劑(抗-KLH多克隆抗體)的位置時(shí)檢測(cè)到的線(其 在圖5中出現(xiàn)在(j)中)。實(shí)施例7 驗(yàn)證由根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合測(cè)定用多孔性固相所顯示的防止測(cè)試樣品的 流動(dòng)行進(jìn)不良的效果[5](1)含純化的D 二聚體(DD)的濃縮血漿(DD濃縮血漿)的制備從健康人采集的凍干血漿(0. 5ml)溶解在0. 25ml純水中以制備2倍濃縮血漿。含 有純化的DD的lOmmol/1 Tris HCl緩沖液(pH 8. 0)加入至濃縮血漿中以制備DD終濃度 為1. 0 μ g/ml的DD濃縮血漿。(2)測(cè)試方法100 μ 1 DD濃縮血漿施加至實(shí)施例6中制造的免疫色譜裝置的樣品墊，并且15分 鐘后，測(cè)量測(cè)試裝置的檢測(cè)窗中的吸光度(n = 5)。計(jì)算測(cè)量值的CV(% )，并且與用常規(guī) 免疫色譜裝置(即，除不包括根據(jù)本發(fā)明的表面活性劑以外與實(shí)施例6的免疫色譜裝置相 同)獲得的CV(%)進(jìn)行比較。(3)測(cè)試結(jié)果圖6顯示測(cè)試線處的檢測(cè)結(jié)果，且圖7顯示在對(duì)照線處的檢測(cè)結(jié)果。與常規(guī)免 疫色譜裝置中測(cè)量到的CU0A )相比，每種根據(jù)本發(fā)明的表面活性劑的使用均產(chǎn)生較低的 CV(%)0在常規(guī)方法中在對(duì)照線處的檢測(cè)再現(xiàn)性差，因?yàn)樾羞M(jìn)的測(cè)試樣品的邊緣沒有到達(dá) 測(cè)試線。然而，當(dāng)使用本發(fā)明的結(jié)合測(cè)定用多孔性固相時(shí)由于防止了測(cè)試樣品的流動(dòng)行進(jìn) 不良，極大地改善了再現(xiàn)性。因此證實(shí)本發(fā)明的結(jié)合測(cè)定用多孔性固相能夠以優(yōu)異的再現(xiàn)性測(cè)定兩倍濃縮血漿測(cè)試樣品，并且證實(shí)本發(fā)明防止結(jié)合測(cè)定用多孔性固相中測(cè)試樣品的 流動(dòng)行進(jìn)不良，并且能夠進(jìn)行精確的測(cè)量。實(shí)施例8 驗(yàn)證由根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合測(cè)定用多孔性固相所顯示的防止測(cè)試樣品的 流動(dòng)行進(jìn)不良的效果W](1)材料和測(cè)試方法使用實(shí)施例2中所述的相同材料和測(cè)試方法，不同之處在于使用膽酸鈉或CHAPS 作為表面活性劑。表2
本發(fā)明的表面 活性劑的名稱表面活性劑類別效果實(shí)施例膽酸鈉類固醇〇實(shí)施例CHAPS類固醇〇比較例無表面活性劑無表面活性劑X⑵測(cè)試結(jié)果包含膽酸鈉的本發(fā)明的測(cè)試條允許紫紅色線到達(dá)位于測(cè)試條的一端處的吸收體， 與實(shí)施例2中顯示的表面活性劑類似。因此，判斷膽酸鈉和CHAPS有效地防止結(jié)合測(cè)定用多孔性固相中測(cè)試樣品的流動(dòng) 行進(jìn)不良(在表2的“效果”欄中標(biāo)記為“〇”)。實(shí)施例9 驗(yàn)證由根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合測(cè)定用多孔性固相所顯示的防止測(cè)試樣品的 流動(dòng)行進(jìn)不良的效果[7](1)材料和測(cè)試方法使用實(shí)施例4中所述的相同材料和測(cè)試方法，不同之處在于使用膽酸鈉或CHAPS 作為表面活性劑。(2)測(cè)試結(jié)果圖8顯示測(cè)試線處的檢測(cè)結(jié)果，且圖9顯示對(duì)照線處的檢測(cè)結(jié)果。與常規(guī)測(cè)試條 相比，用膽酸鈉或CHAPS處理的根據(jù)本發(fā)明的測(cè)試條在測(cè)試線以及對(duì)照線處顯示顯著較低 的CV(%)(參見圖8和9)。對(duì)于對(duì)照線處的檢測(cè)，常規(guī)方法中的CV(%)十分高。這是因 為測(cè)試樣品由于流動(dòng)行進(jìn)不良而沒有到達(dá)對(duì)照線。因此證實(shí)具有高Ht值的測(cè)試樣品也可 以以優(yōu)異的再現(xiàn)性使用膽酸鈉或CHAPS來測(cè)定。實(shí)施例10 粒徑不同的兩種類型的膠體金的使用(1)加入60nm膠體金標(biāo)記的抗-D 二聚體抗體IOml含有46. 2 μ g/ml抗-D 二聚體單克隆抗體(抗-DD抗體)的2mmol/l硼酸 鹽緩沖液(pH 8. 0)加入至含有10D/ml膠體金(粒徑60nm)的200ml碳酸鉀緩沖液(pH 8.0)。將該混合物在室溫下攪拌10分鐘。加入IOml 10%牛血清白蛋白(BSA)水溶液后， 膠體金-抗DD抗體混合物攪拌5分鐘，并且在10°C下離心(10，OOOrpm)45分鐘以獲得沉 淀物(綴合物)。綴合物用綴合物稀釋緩沖液(由Scripps制造)稀釋(懸浮在其中)至170D/ml。在531nm( S卩，膠體金的最大吸收波長(zhǎng))下測(cè)量吸光度。(2)綴合物釋放墊的制備40nm膠體金標(biāo)記的抗-DD抗體和60nm膠體金標(biāo)記的DD抗體與1. 33%酪蛋白和 4%蔗糖溶液(pH 7. 5)混合以制備綴合物溶液，在所述綴合物溶液中每種抗體調(diào)節(jié)至40D/ ml ο玻璃纖維墊(寬度13.0_，長(zhǎng)度254mm，厚度0.56mm)(由I^all Corporation制造的 "No. 8964”)浸漬以1. 2體積(相對(duì)于墊的體積)的綴合物溶液。該墊在烘箱中在70°C下 干燥30分鐘以獲得綴合物釋放墊。(3)根據(jù)本發(fā)明的免疫色譜裝置的制造以與實(shí)施例1中相同的方式制造免疫色譜裝置，不同之處在于使用上面(2)中制 備的綴合物釋放墊。正庚基-D-硫代葡糖苷用作表面活性劑。(3)含純化的D 二聚體(DD)的具有高Ht值的模型全血(DD模型全血)的制備全血離心獲得血細(xì)胞層。含有純化的DD和獲自相同全血的血漿的lOmmol/1 Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)加入至血細(xì)胞層，從而獲得Ht值為60%的的模型全血。DD濃度 調(diào)節(jié)為 0,3. 0，或 15μ g/ml。(4)測(cè)試結(jié)果在其中使用粒徑不同的兩種類型的膠體金的測(cè)定系統(tǒng)中，與常規(guī)方法(其中使用 單一粒徑的膠體金)相比，使用本發(fā)明的多孔性固相改善了檢測(cè)靈敏度，并且能夠以更加 定量的方式分析含有高濃度分析物的測(cè)試樣品(圖10)。實(shí)施例11 驗(yàn)證由根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合測(cè)定用多孔性固相所顯示的防止測(cè)試樣品 的流動(dòng)行進(jìn)不良的效果[8](1)含純化的D 二聚體(DD)的具有高Ht值的模型全血(DD模型全血)的制備全血離心獲得血細(xì)胞層。含有純化的DD和獲自相同全血的血漿的lOmmol/1 Tris-HCl緩沖液(pH 8. 0)加入至血細(xì)胞層，從而獲得含有終濃度為1. 0 μ g/ml的DD且Ht 值為60%的模型全血。(2)其上固定有抗-DD抗體的膜(結(jié)合測(cè)定用多孔性固相)的制備以與實(shí)施例1的步驟(1)中相同的方式制備其上固定有抗-DD抗體的膜(結(jié)合測(cè) 定用多孔性固相)，不同之處在于使用膽酸鈉作為表面活性劑并且加入至lOmmol/1磷酸鹽 緩沖液(pH 7.2)中的表面活性劑濃度為0，0.01，0.05，0.075，0. 1或0.5% (w/v) 0(3)測(cè)試方法使用實(shí)施例4的步驟(3)中所述的測(cè)試方法。計(jì)算測(cè)量值的CV(% )以確定最適 濃度范圍。(4)測(cè)試結(jié)果如圖11中所示，與常規(guī)方法相比，每個(gè)測(cè)試濃度的表面活性劑的使用均提供優(yōu)異 的再現(xiàn)性。當(dāng)CV值等于或小于10% (即，使用常規(guī)方法獲得的值的一半)時(shí)，判斷表面活 性劑的使用是有效的。在本實(shí)施例中使用的表面活性劑在0. 01-0. 5%的濃度范圍內(nèi)得到的 CV值均小于10%。由此證實(shí)與常規(guī)方法相比表面活性劑的使用提供令人滿意的效果。實(shí)施例12 比較使用本發(fā)明的表面活性劑和使用其他表面活性劑預(yù)處理結(jié)合測(cè) 定用多孔性固相所獲得的防止測(cè)量波形中的擾動(dòng)的效果(1)含純化的D 二聚體(DD)的濃縮血漿(DD濃縮血漿)的制備
從健康人采集的凍干血漿(0. 5ml)溶解在0. 25ml純水中以制備2倍濃縮血漿。含 有純化的DD的lOmmol/1 Tris HCl緩沖液(pH 8. 0)加入至所述濃縮血漿中以制備DD終 濃度為1. 0 μ g/ml的DD濃縮血漿。(2)免疫色譜裝置的制造以與實(shí)施例6的步驟(3)相同的方式制備其上固定有抗-DD抗體和抗-KLH多 克隆抗體的膜，不同之處在于在lOmmol/1磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)中使用0.05%正庚 基-β-D-硫代葡糖苷，0.05% Tween 20，或0.05% TritonX-IOO作為表面活性劑。使用所 述膜以與實(shí)施例6的步驟( 相同的方式制造免疫色譜裝置。(3)測(cè)試方法120 μ 1 DD濃縮血漿施加至上面O)中制備的免疫色譜裝置的樣品墊，并且15分 鐘后，測(cè)量測(cè)試裝置的檢測(cè)窗中的吸光度(n =幻。在每次測(cè)量中檢查測(cè)量波形的形狀。本發(fā)明的免疫色譜裝置(正庚基-D-硫代葡糖苷預(yù)處理)與包含不浸漬表面 活性劑的硝化纖維素膜的免疫色譜裝置(常規(guī)方法)，以及其中用于浸漬固相的表面活性 劑為iTriton Χ-100或Tween 20的免疫色譜裝置(Triton X-100預(yù)處理或Tween 20預(yù)處 理)進(jìn)行比較。(4)測(cè)試結(jié)果圖12顯示在不同試驗(yàn)條件下的測(cè)量波形的形狀。圖的左側(cè)是上游側(cè)，右側(cè)是下游 側(cè)，且向下的峰代表信號(hào)。首先出現(xiàn)的峰對(duì)應(yīng)于測(cè)試線，且隨后出現(xiàn)的峰對(duì)應(yīng)于對(duì)照線。由 于反射吸光度由峰處和峰周圍的反射光強(qiáng)度之間的比率來計(jì)算，因此峰周圍的反射光強(qiáng)度 的變化影響測(cè)量的精確度。因此，如果峰周圍的反射光強(qiáng)度不發(fā)生變化則是理想的。如圖12中所示，在(a)常規(guī)方法，(c)Triton X-100預(yù)處理和(d)Tween 20預(yù)處 理中的波形中在峰周圍觀察到反射光強(qiáng)度的上升改變。特別地，在用Tween 20預(yù)處理的多 孔性固相中觀察到反射光強(qiáng)度的劇烈改變(圖12中的(d))。然而，在用根據(jù)本發(fā)明的表面活性劑預(yù)處理的多孔性固相中，沒有觀察到峰周圍 反射光強(qiáng)度的改變(圖12中的(b))。圖13顯示在測(cè)試線處反應(yīng)吸光度的分布。當(dāng)使用采用根據(jù)本發(fā)明的表面活性劑 預(yù)處理的多孔性固相時(shí)，測(cè)量的反射吸光度值的差異很小(即，再現(xiàn)性優(yōu)異)，并且靈敏度 高。另一方面，在其他條件下測(cè)量值的差異很大。特別地，當(dāng)使用Tween 20時(shí)，有時(shí)甚至不 能計(jì)算反射吸光度(即，不可能進(jìn)行測(cè)量)。實(shí)施例13 在將表面活性劑結(jié)合至多孔性固相的不同方法之間比較防止測(cè)量波 形中的擾動(dòng)的效果(1)含純化的D 二聚體(DD)的濃縮血漿(DD濃縮血漿)的制備以與實(shí)施例12相同的方式制備DD濃縮血漿。(2)固相洗滌溶液的制備正庚基-β -D-硫代葡糖苷，Tween 20，或Triton X-100加入至10mmol/l磷酸鹽 緩沖液(pH 7. 2)(終濃度0. 05% (w/v))以制備固相洗滌溶液。(3)測(cè)試方法120 μ 1 DD濃縮血漿施加至根據(jù)本發(fā)明的測(cè)試條或由常規(guī)方法制備的測(cè)試條的樣 品墊。在加入DD濃縮血漿后15分鐘測(cè)量本發(fā)明的測(cè)試裝置的檢測(cè)窗中的吸光度。對(duì)于常規(guī)方法的測(cè)試裝置，在加入DD濃縮血漿后5分鐘加入50 μ 1固相洗滌溶液，并且在加入DD 濃縮血漿后15分鐘測(cè)量檢測(cè)窗中的吸光度。(4)測(cè)試結(jié)果當(dāng)本發(fā)明的表面活性劑以固相洗滌溶液的形式加入至多孔性固相中時(shí)，不防止測(cè) 量波形的擾動(dòng)(圖14(c)中的箭頭)。同樣，當(dāng)使用(b)常規(guī)方法，(d)含有Triton X-100 的固相洗滌溶液，或(e)含有Tween 20的固相洗滌溶液時(shí)，也不防止測(cè)量波形的擾動(dòng)(圖 14)。相反，當(dāng)用根據(jù)本發(fā)明的表面活性劑預(yù)處理多孔性固相時(shí)，沒有觀察到峰周圍反 射光強(qiáng)度的變化(圖14(a))。圖15顯示測(cè)試線處反射吸光度的分布。當(dāng)使用采用根據(jù)本發(fā)明的表面活性劑預(yù) 處理的多孔性固相時(shí)，測(cè)量的反射吸光度值的差異很小(即，再現(xiàn)性優(yōu)異)，并且靈敏度高。 另一方面，在其他條件下測(cè)量值的差異很大。由此證實(shí)根據(jù)本發(fā)明的多孔性固相不僅可以防止測(cè)試樣品的流動(dòng)行進(jìn)不良，而且 可以防止測(cè)量波形中的擾動(dòng)，并且能夠以與常規(guī)方法或使用固相洗滌溶液相比更高的靈敏 度和更高的再現(xiàn)性進(jìn)行測(cè)定(圖15)。實(shí)施例14 驗(yàn)證與抗凝劑加入至樣品墊相關(guān)的改善再現(xiàn)性的效果(1)含純化的D 二聚體(DD)的全血(DD全血)的制備含有純化的DD的10mmol/l Tris HCl緩沖液(pH 8. 0)加入至采集自健康人的全 血中以制備DD終濃度為1. 0 μ g/ml的DD全血。(2)使用含有抗凝劑的樣品墊制造免疫色譜裝置以與比較例1相同的方式制造免疫色譜裝置，不同之處在于樣品墊浸漬以加入了 抗凝劑的樣品墊浸漬溶液?？鼓齽┑念愋秃徒K濃度如下。EDTA-2Na (EDTA 1 或 5mmo 1/1)二亞乙基三胺-N，N，N，，N”，N”-五乙酸(DTPA =Immo 1/1)反式-1，2-二氨基環(huán)己烷-N，N，N，，N，_四乙酸(CyDTA =Immo 1/1)(3)測(cè)試方法120 μ 1 DD全血施加至已經(jīng)用抗凝劑處理的免疫色譜裝置的樣品墊，并在15分鐘 后，測(cè)量測(cè)試裝置的檢測(cè)窗中的吸光度。(4)測(cè)試結(jié)果當(dāng)使用包含用抗凝劑處理的樣品墊的測(cè)試條時(shí)，與包含未用抗凝劑處理的樣品墊 的測(cè)試條相比，無論使用哪種類型抗凝劑，再現(xiàn)性均提高(圖16)。實(shí)施例15 驗(yàn)證與氨基酸加入至綴合物釋放墊相關(guān)的改善再現(xiàn)性的效果(1)含純化的D 二聚體(DD)的血漿(DD血漿)的制備含有純化的DD的10mmol/l Tris HCl緩沖液(pH 8. 0)加入至采集自健康人的血 漿中以制備DD終濃度為1. 0 μ g/ml的DD血漿。(2)氨基酸加入至綴合物釋放墊以與比較例相同的方式制造免疫色譜裝置，不同之處在于用已經(jīng)加入氨基酸的綴 合物溶液制備綴合物釋放墊。加入的氨基酸為絲氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或丙氨酸。 在每種情形中氨基酸的終濃度均為lOmmol/1。
(3)測(cè)試方法120 μ 1 DD血漿施加至具有含氨基酸的綴合物釋放墊的免疫色譜裝置的樣品墊， 并在15分鐘后，測(cè)量測(cè)試裝置的檢測(cè)窗中的吸光度。(4)測(cè)試結(jié)果當(dāng)氨基酸加入至綴合物釋放墊時(shí)再現(xiàn)性提高。特別地，當(dāng)加入絲氨酸或甘氨酸時(shí) 再現(xiàn)性顯著地提高(圖17)。為了總結(jié)實(shí)施例的結(jié)果，從測(cè)試結(jié)果得出結(jié)論，使用采用根據(jù)本發(fā)明的表面活性 劑處理的結(jié)合測(cè)定用多孔性固相能夠使甚至高粘度的測(cè)試樣品在多孔性固相中適當(dāng)?shù)亓?動(dòng)/行進(jìn)，抑制測(cè)量波形中的擾動(dòng)，并且能夠以高靈敏度和優(yōu)異的再現(xiàn)性進(jìn)行測(cè)定。還可以 通過將本發(fā)明的結(jié)合測(cè)定用多孔性固相與用抗凝劑處理的樣品墊和/或用氨基酸處理的 綴合物釋放墊組合來進(jìn)一步提高再現(xiàn)性。工業(yè)應(yīng)用性根據(jù)本發(fā)明，通過在其中允許測(cè)試樣品流動(dòng)/行進(jìn)的結(jié)合測(cè)定用多孔性固相中使 用選自下面(A)-(C)的一種或多種表面活性劑(A)含糖表面活性劑，其包含由通式(I)顯 示的化合物，(B)含糖表面活性劑，其包含蔗糖脂肪酸酯，其中構(gòu)成脂肪酸具有5-14個(gè)碳原 子，和(C)類固醇表面活性劑，能夠使甚至高粘度測(cè)試樣品在多孔性固相中適當(dāng)?shù)亓鲃?dòng)/行 進(jìn)，和以優(yōu)異的再現(xiàn)性進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)防止假陰性和假陽(yáng)性成為可能。符號(hào)說明
(a)樣品墊
(b)綴合物釋放墊
(C)血細(xì)胞分離墊
(d)多孔性固相(膜)
(e)俘獲試劑(抗體)
(f)吸收體
(g)粘性塑料板
(h)聚酯膜
(j)對(duì)照俘獲試劑。
權(quán)利要求
1.一種用于結(jié)合測(cè)定的多孔性固相，其中在加入測(cè)試樣品之前已經(jīng)結(jié)合了至少一種表 面活性劑，所述至少一種表面活性劑選自由下列各項(xiàng)組成的組(A)含糖表面活性劑，其包含由下列通式(I)顯示的化合物， R1-(G)x (I)其中R1代表取代的或未取代的具有5-10個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，G代表由具有5 或6個(gè)碳原子的還原糖衍生的殘基，并且χ是1-3的數(shù)，其表示所述還原糖的縮合度，且R1 和G經(jīng)由氧原子或硫原子通過醚鍵連接，(B)含糖表面活性劑，其包含蔗糖脂肪酸酯，其中構(gòu)成脂肪酸具有5-14個(gè)碳原子，和(C)類固醇表面活性劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于結(jié)合測(cè)定的多孔性固相，其中所述含糖表面活性劑(A) 是正辛基-β -D-葡糖苷和/或正庚基-β -D-硫代葡糖苷。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于結(jié)合測(cè)定的多孔性固相，其中所述含糖表面活性劑(B) 是蔗糖單己酸酯和/或蔗糖單月桂酸酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于結(jié)合測(cè)定的多孔性固相，其中所述類固醇表面活性劑 (C)是膽酸鈉和/或3-[(3-膽酰胺丙基)二甲基氨基]-2-羥基丙磺酸(CHAPS)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的用于結(jié)合測(cè)定的多孔性固相，其中所述結(jié)合測(cè)定 是免疫測(cè)定。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的用于結(jié)合測(cè)定的多孔性固相，其中所述結(jié)合測(cè)定 是側(cè)流形式、浸漬片形式、或流通形式膜測(cè)定。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的用于結(jié)合測(cè)定的多孔性固相，其中俘獲試劑固定 在所述多孔性固相上。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于結(jié)合測(cè)定的多孔性固相，其中所述俘獲試劑是抗體、特 異性俘獲物質(zhì)或抗原。
9.一種結(jié)合測(cè)定條，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的用于結(jié)合測(cè)定的多孔性 固相。
10.根據(jù)權(quán)利要求10所述的結(jié)合測(cè)定條，其還包含綴合物釋放墊，所述綴合物釋放墊 包含檢測(cè)試劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的結(jié)合測(cè)定條，其中所述檢測(cè)試劑是標(biāo)記的抗體、標(biāo)記的特 異性俘獲物質(zhì)或標(biāo)記的抗原。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的結(jié)合測(cè)定條，其中所述標(biāo)記包括粒徑不同的兩種類型的膠體金。
13.根據(jù)權(quán)利要求10-13中任一項(xiàng)所述的結(jié)合測(cè)定條，其中所述綴合物釋放墊包含氨基酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求8所述的結(jié)合測(cè)定條，其還包含樣品墊和/或血細(xì)胞分離墊。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的結(jié)合測(cè)定條，其中所述樣品墊包含抗凝劑。
16.一種用于側(cè)流形式結(jié)合測(cè)定的結(jié)合測(cè)定條，其包括(1)樣品墊；(2)綴合物釋放墊，其包含檢測(cè)試劑并且放置在所述樣品墊下方且與所述樣品墊接觸；(3)血細(xì)胞分離墊，其放置在所述綴合物釋放墊和多孔性固相之間；和(4)多孔性固相，俘獲試劑固定在所述多孔性固相上，其中所述多孔性固相是根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的用于結(jié)合測(cè)定的多孔性固相。
17.一種裝置，其包括根據(jù)權(quán)利要求9-16中任一項(xiàng)所述的結(jié)合測(cè)定條。
18.—種結(jié)合測(cè)定法，其包括使用根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的用于結(jié)合測(cè)定的 多孔性固相。
19.一種結(jié)合測(cè)定法，其包括使用根據(jù)權(quán)利要求9-16中任一項(xiàng)所述的結(jié)合測(cè)定條。
20.一種結(jié)合測(cè)定法，其包括測(cè)試檢測(cè)試劑和分析物的復(fù)合物的存在，其中所述復(fù)合物 在測(cè)試樣品通過根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔性固相移動(dòng)和/或經(jīng)過時(shí)形成，所述分析物來 自于所述測(cè)試樣品并且被固定在所述多孔性固相上的俘獲試劑俘獲。
21.根據(jù)權(quán)利要求18-20中任一項(xiàng)所述的結(jié)合測(cè)定法，其中所述測(cè)試樣品是全血。
22.—種在側(cè)流形式或浸漬片形式結(jié)合測(cè)定法中防止測(cè)試樣品的流動(dòng)行進(jìn)不良的方 法，所述方法包括使用用于結(jié)合測(cè)定的多孔性固相，在所述多孔性固相中在加入所述測(cè)試 樣品之前已經(jīng)結(jié)合了至少一種表面活性劑，所述至少一種表面活性劑選自由下列各項(xiàng)組成 的組(A)含糖表面活性劑，其包含由下列通式(I)顯示的化合物，R1-(G)x (I)其中R1代表取代的或未取代的具有5-10個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，G代表由具有5 或6個(gè)碳原子的還原糖衍生的殘基，并且χ是1-3的數(shù)，其表示所述還原糖的縮合度，且R1 和G經(jīng)由氧原子或硫原子通過醚鍵連接，(B)含糖表面活性劑，其包含蔗糖脂肪酸酯，其中構(gòu)成脂肪酸具有5-14個(gè)碳原子，和(C)類固醇表面活性劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述測(cè)試樣品具有50%或更高的Ht值。
24.一種在側(cè)流形式或浸漬片形式結(jié)合測(cè)定法中防止測(cè)試樣品的測(cè)量波形中的擾動(dòng)的 方法，所述方法包括使用用于結(jié)合測(cè)定的多孔性固相，在所述多孔性固相中在加入所述測(cè) 試樣品之前已經(jīng)結(jié)合了至少一種表面活性劑，所述至少一種表面活性劑選自由下列各項(xiàng)組 成的組(A)含糖表面活性劑，其包含由下列通式(I)顯示的化合物，R1-(G)x (I)其中R1代表取代的或未取代的具有5-10個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，G代表由具有5 或6個(gè)碳原子的還原糖衍生的殘基，并且χ是1-3的數(shù)，其表示所述還原糖的縮合度，且R1 和G經(jīng)由氧原子或硫原子通過醚鍵連接，(B)含糖表面活性劑，其包含蔗糖脂肪酸酯，其中構(gòu)成脂肪酸具有5-14個(gè)碳原子，和(C)類固醇表面活性劑。
全文摘要
公開了一種用于結(jié)合測(cè)定法的多孔性固相，其能夠使測(cè)試樣品諸如全血在不需要預(yù)處理的條件下快速地、方便地、準(zhǔn)確地和低成本地分析，以及使用所述多孔性固相的結(jié)合測(cè)定法。在加入測(cè)試樣品之前，至少一種表面活性劑結(jié)合到用于結(jié)合測(cè)定的多孔性固相中，所述至少一種表面活性劑選自由下列各項(xiàng)組成的組(A)含糖表面活性劑，其包含由通式(I)代表的化合物，(B)含糖表面活性劑，其包含蔗糖脂肪酸酯，其中構(gòu)成脂肪酸具有5-14個(gè)碳原子，和(C)類固醇表面活性劑。
文檔編號(hào)G01N33/543GK102077091SQ20098012512
公開日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2009年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日
發(fā)明者丹野真志, 吉水美和子, 近藤萬友美 申請(qǐng)人:積水醫(yī)療株式會(huì)社