用于病毒檢測的方法

專利名稱：用于病毒檢測的方法
技術領域：
本發明涉及在含病毒或病毒來源介質中病毒或病毒抗原的檢測和定量化，特別地 涉及在疫苗制造和工藝開發中病毒抗原濃度的確定。
背景技術：
流感病毒一般基于它們的核蛋白質和基質蛋白質抗原之間的抗原區別分為三個 類型A、B和C。流感A病毒以兩個主要表面糖蛋白血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)(其表 現為在病毒體的表面上的刺突)為基礎進一步分為亞型。宿主細胞的感染以病毒HA與細胞上的唾液酸結構(sialic structure)的結合 開始，使病毒顆粒粘附到細胞表面并且引起病毒攝取。RNA和病毒蛋白質被復制并且組合 成新病毒顆粒，其從細胞芽生。子代病毒顆粒通過在病毒上的酶NA分裂末端唾液酸殘基 (terminal sialic residue)而從細胞表面釋放。當前，有15個不同的HA亞型(H1-H15)和9個不同的NA亞型(N1-N9)。流感A病 毒的亞型根據它們的HA和NA表面蛋白質命名，例如HlNl、HlN2、H3N2、H5m。流感B病毒和 流感 A 的亞型進一步表征為菌株(strain)，例如 B Malaysia,H3N2 Heijing.HlNl Taiwan。HA和NA都攜帶抗原決定基(antigenic epitope)。提出的預防HA和NA的抗體減 小人和動物中傳染或疾病的風險。盡管第一個流感疫苗包含滅活或殺死的整體病毒顆粒， 商業上可用的流感疫苗通常是兩種類型，“裂解疫苗”和“亞單位疫苗”。裂解疫苗通過采用乙醚或洗滌劑的純化病毒顆粒的裂變(disintegration)并且 然后洗滌劑與大塊病毒脂質材料的去除來制備。裂解疫苗由此基本包含與整體病毒疫苗相 同的成分并且處于相同的比例。在另一方面，在亞單位疫苗中，表面糖蛋白HA和NA分別純 化然后組合成疫苗。流感病毒可以采用兩個不同的方式改變，通過“抗原性漂移”和通過“抗原性轉 換”。抗原性漂移產生可能不被身體的免疫系統認出的新病毒菌株，而抗原性轉換是流感A 病毒中的突然重大變化，導致新血凝素和神經氨酸酶蛋白質并且產生新流感A亞型。在大 多數年份中，流感疫苗中的三個病毒菌株中的一個或兩個被更新以跟上正傳播的流感病毒 的變化。流感病毒通常是多價的(multivalent、polyvalent)，即，疫苗從相同種類的病毒 的一個或多個菌株的培養來制備。當前，流感A/H1N1、A/H3N2和流感B菌株典型地包括在 每年的流感疫苗中。疫苗預防流感的效力主要由免疫原HA在疫苗中的量決定。疫苗中的HA濃度典型 地通過單徑向免疫擴散(SRID)測定確定。在SRID中，流感病毒粒子由洗滌劑破裂，并且 跟從整個病毒或純化病毒抗原擴散進入包含特定抗血凝素(抗HA)抗體的瓊脂糖凝膠中。 該所得的抗原/抗體反應或區域(通過染色可見)直接與在制備中的HA抗原的數量成比 例。然而，SRID測定具有許多缺點。除具有高檢測極限(大約20yg/ml)與高變動(大約 10%)外，它是費力的并且具有低處理能力。盡管存在它的短處，然而，SRID仍然是由歐洲藥典和WHO推薦并且由流感疫苗評價的監管機構批準的方法。由于該方法差的精確度，疫 苗劑量通常由制造商“過量灌裝”。用于流感病毒定量化的其他方法包括反相高效液相色譜法(RP-HPLC)。并且基于生物傳感器的方法已經開發用于包括流感病毒的病毒的檢測。EP0276142 Al公開用于在涂敷金的衍射光柵上使用表面等離子體振子共振(SPR) 檢測流感A病毒的方法。對于流感A病毒的分離決定子(determinant)的單克隆抗體固定 在金表面上，并且施加并且培養病毒。對于流感A病毒決定子的單克隆抗體然后用該表面 培養，并且當第二抗體結合到流感病毒顆粒時獲得的增強響應被檢測。JP30M467A公開通過壓電振動器測量病毒濃度，其中壓電振動器的電極涂有對病 毒的表面抗原的抗體。當抗原結合到電極時，振動器的振動頻率變得更低。Shofield, D. J.和 Dimmock，N. J.，J. Virol. Methods 62 (1996) 33-42 公開用于流 感病毒檢測的SI^R生物傳感器儀器的使用。用于捕獲流感病毒的單克隆抗體偶聯于涂有羧 化葡聚糖的傳感器芯片。流感病毒然后注入儀器流動系統以接觸該傳感器芯片，并且監測 與固定抗體的結合親和力。Boltovets, P. M 等，J. Virol. Methods 121 (2004) 101-106 公開使用表面等離子體 振子共振(SPR)通過檢測在預培養步驟期間形成的病毒抗原和抗體之間的復合物與具有 固定蛋白質A的SI^R傳感器表面的結合來檢測植物病毒。Jie Xu 等，Analytical and Bioanalytical Chemistry 389,4(2007)1193-1199 公開用于檢測禽流感的干涉生物傳感器免疫測定。整個病毒顆粒由在波導表面上的抗原 特定(血凝素)抗體(多克隆和單克隆兩者)捕獲，并且測量由該結合引起的屈光變化 (refraction change)。測試了三個流感病毒亞型(兩個H7和一個H8)。然而，所有這些其他方法都苦于相當大的缺點。因此需要有用于在粗制的以及在 純化樣本中準確確定流感病毒的濃度(具體地HA濃度)的改進的方法和手段。

發明內容
本發明的一個目的是提供用于檢測和定量化病毒(特別是流感病毒)的方法，其 沒有現有技術方法的缺點，并且其特別具有高精確度、高檢測范圍，并且比標準SRID測定 更不費力。本發明的另一個目的是提供適合在疫苗生產中定量化在過程樣本和最終疫苗樣 本兩者中的病毒或病毒抗原的方法。這些目的以及其他目的和優勢用根據權利要求1的方法獲得。根據本發明的方法基于生物傳感器技術和抑制型測定形式的使用。大體上，確定病毒或病毒抗原在樣本中的濃度的方法包括步驟提供具有固定到其的病毒抗原或病毒抗原類似物的傳感器表面，將該樣本與已知量的對該病毒抗原的抗體混合以獲得對該抗原的抗體在樣本混 合物中的預定(總)濃度，將樣本混合物與傳感器表面接觸以將混合物中的自由抗體結合到傳感器表面，測量傳感器表面對自由抗體結合的響應，以及從校準曲線確定病毒或抗原在樣本中的濃度，該校準曲線通過測量對于混合物所獲得的響應來準備，該混合物包含預定濃度抗體和不同濃度病毒或病毒抗原。優選的，用中間再生在傳感器表面上執行多個分析循環，并且對每個分析循環計 算虛擬校準曲線。這通過下列完成使用循環數作為2L和響應作為I將曲線中的已知濃度中的每個擬合到雙指數方 程，使用這些方程用于計算每個循環的虛擬校準曲線，以及從該特定循環的虛擬校準曲線確定病毒或抗原在樣本中的濃度。病毒抗原可以是內部抗原，或優選地病毒的表面抗原。可選地，病毒抗原是整個病 毒顆粒。病毒抗原類似物可例如是合成肽。優選地，樣本包含多個不同的病毒或病毒類型，其由該方法同時確定。如本文使用的術語“抗體”指免疫球蛋白，其可以是天然的或部分或完全合成地產 生并且還包括活性片段，其包括Fab抗原結合片段、單價片段和二價片段。該術語還涵蓋具 有與免疫球蛋白結合域同源(homologous)的結合域的任何蛋白質。這樣的蛋白質可以從 天然源得到，或部分或完全合成地產生。示范性抗體是免疫球蛋白同型抗原和Fab、Fab\ F(ab，)2、scFv、Fv、dAb 禾口 Fd 片段。典型地，抗體是病毒或病毒抗原的血清。在一個實施例中，傳感器芯片具有多個感測區域，并且對于相應病毒或病毒類型 特定的病毒抗原或類似物固定在分離的感測區域上。樣本與固定量的對一個病毒的抗體混 合，混合物然后僅與具有對該抗體特定的抗原的感測區域接觸，或(假如該抗體不與其他 抗原或類似物交叉反應)與所有感測區域接觸，并且檢測響應。這對其他抗體和感測區域 連續地重復。在另一個實施例中，傳感器芯片具有單個感測區域，或僅使用具有多個感測表面 的傳感器芯片的單個感測區域。在該情況下，病毒抗原或類似物共同固定在單個感測區域 上，樣本與固定量的相應抗體混合(一次一個)，并且相應混合物與該感測區域連續地接 觸。然而，在優選實施例中，假如抗體是選擇性的，其缺乏對其他病毒或抗原的交叉反 應性，所有不同的抗體與樣本混合，其然后與具有多個感測區域(每個具有相應固定的病 毒抗原或類似物)的傳感器芯片接觸，并且檢測不同感測區域的響應。傳感器表面可備選 地包括固定到相同感測區域的相應抗原的混合。這樣，在樣本中的所有病毒或病毒抗原可 在單個分析循環中檢測。在要定量化的樣本中的病毒或病毒抗原優選地是不同的流感病毒類型或其的抗 原，優選地血凝素。固定的血凝素可以是流感病毒類型或亞型的若干菌株的屬或從流感病毒類型或 亞型的至少2個不同菌株得到。一般，在生物傳感器測定中，當分析物(這里是樣本中的自由抗體)已經結合到在 傳感器表面上的固定配體(這里是病毒抗原或類似物)時，結合的抗體通過合適的流體處 理而釋放以準備用于與新樣本接觸的表面，稱為再生的過程。通常，傳感器表面可以經受相 當大量的分析循環。然而，許多配體(例如病毒抗原)常常具有差的穩定性，其使表面的分 析物結合能力隨循環數而減小，并且可妨礙配體對于定量目的的使用。盡管結合能力上的較少減小常常可以通過頻繁校準補償，這顯著減小處理能力。本發明的方法因此包括規格化步驟，其中每個分析循環使用虛擬校準曲線評價 (即每個循環獲得唯一的校準曲線)，從而最小化在漂移期間頻繁校準的需要并且顯著提高定量測量的質量。本發明的更完整理解以及其的另外的特征和優勢將通過參考下列詳細說明和圖獲得。


圖1是在樣本中具有不同的病毒濃度的三個情況(a-c)的在傳感器表面上抑制型 病毒測定的示意圖示；圖2是與圖1相似的示意圖示，其中三個不同的病毒抗原固定到傳感器表面上相 應分開的點，以及對于每個抗原特定的三個不同的抗體用于定量化；圖3是示出在傳感器表面上具有固定流感病毒抗原的抑制型測定中測量的相對 響應/穩定性與不同流感病毒/抗血清混合物的濃度的關系的圖。圖4是示出對于多個不同的流感病毒抗血清(influenza virus anti-sera)與具 有固定流感病毒抗原的傳感器表面的結合的所測量的相對響應與分析循環數的關系的圖。圖5是示出在具有固定病毒抗原的傳感器表面上運行的抑制型測定中對于在四 個普通校準的病毒對照樣本的七個濃度的基于作為1的循環數和作為I的測量響應的擬合 規格化曲線的圖。這些規格化曲線用于每個循環的虛擬濃度的預測。這些虛擬濃度然后用 于使用虛擬濃度作為1和已知濃度作為I的循環特定校準曲線的構建。圖6是示出在具有固定病毒抗原的傳感器表面上運行的抑制型測定中對于以不 同循環數、采用四個普通校準的兩個不同的對照樣本濃度的所計算的濃度與分析循環數的 關系的圖。圖7是示出每個循環的虛擬校準曲線(根據圖5)應用于如在圖6中對于兩個對 照樣本濃度的相同原始數據的圖。圖8是與圖7相似的圖，示出對照樣本的測量的結合數據和由虛擬校準曲線對每 個循環規格化的對應數據。圖9A-C示出在用于同時檢測三個不同病毒類型的測定中準備的校準曲線。
具體實施例方式如上文提到的，本發明涉及使用生物傳感器技術和抑制型測定形式的樣本介質中 的至少一個病毒或病毒抗原的檢測和定量化的方法。首先，關于生物傳感器技術，生物傳感器大體上限定為使用與固態物理化學換能 器直接結合的用于分子識別的部件(例如具有固定抗體的層)，或具有與該換能器結合的 可移動載體珠/顆粒的裝置。盡管這樣的傳感器典型地基于檢測固定層的質量、折射率或 厚度的變化的無標記技術，也存在依賴于一些種類的標記的生物傳感器。用于本發明的目 的的典型傳感器包括但不限于質量檢測方法，例如光學方法和壓電或聲波方法，其包括例 如表面聲波(SAW)和石英晶體微天平OiCM)方法。代表性的光學檢測方法包括檢測質量表 面濃度的那些方法，例如反射光學方法等，其包括外部和內部反射方法，其可以是角度、波長、偏振或相位分辨型的，例如隱失波橢圓光度法(evanescent wave ellipsometry)和隱 失波光譜學(EWS，或內部反射光譜學)(其兩個都可包括通過表面等離體振子共振(SPR)的 隱失場增強)、布儒斯特角屈光計檢查法(Brewster angle refractometry)、臨界角屈光計 檢查法、受抑全反射(FTR)、散射全內反射(STIR)(其可包括散射增強標記)、光學波導傳感 器、外部反射成像、基于隱失波成像(例如臨界角分辨成像、布儒斯特角分辨成像、SPR角分 辨成像等)。此外，可能提到基于例如表面增強拉曼光譜學(SERS)、表面增強共振拉曼光譜 學(SERRQ、隱失波熒光(TIRF)和磷光的光度測定和成像/顯微術方法(“本身”或與反射 方法結合)，以及波導干涉儀、波導泄漏模式光譜學、反射干涉光譜學(RIfS)、透射干涉量 度法、全息光譜學和原子力顯微術(AFR)。基于SPR以及包括QCM的其他檢測技術的生物傳感器系統例如是商業上可獲得 的，兩者例如具有一個或多個流動池(flow cell)的流通系統和如基于試管的系統。具有 多個感測表面和流動系統的示范性SPR-生物傳感器包括Biacore 系統(GE Healthcare, 烏普薩拉，瑞典)和I^roteOn XPR36系統(Bio-Rad實驗室)。這些系統準許實時監測結合 的配體和感興趣的分析物之間的表面結合相互作用。在該上下文中，“配體”是具有對給定 分析物的已知或未知親和力的分子并且包括固定在表面上的任何捕獲或捕捉試劑，而“分 析物”包括與其的任何特定結合搭配物。關于sra生物傳感器，SPR的現象是眾所周知的。可以說當光在某些條件下在不 同折射率的兩個介質之間的界面處反射時SPR出現，并且該界面涂敷有金屬膜，典型地銀 或金。在Biacore 系統中，介質是樣本和傳感器芯片的玻璃，其通過微流體流動系統與樣 本接觸。金屬膜是在芯片表面上的薄金層。SI^R使反射光的強度在特定反射角處降低。該 最小反射光強度的角度隨反射光的相反側(在Biacore 系統中的樣本側)上的表面附近 的折射率而變化。來自該系統的輸出是“傳感圖”，其是檢測器響應作為時間的函數的圖。Biacore 儀器和SI3R現象的技術方面的詳細論述可在美國專利號5，313，264中 找到。關于生物傳感器感測表面的基質涂層的更詳細信息在例如美國專利號5，242, 828和 5，436，161中給出。另外，與Biacore 儀器連同使用的生物傳感器芯片的技術方面的詳細 論述可在美國專利號5，492，840中找到。上文提到的美國專利的全部內容通過引用結合于 此。盡管在接著的示例中，本發明在SI^R光譜學(更具體地Biacore 系統)的上下文 中說明，要理解本發明不限于該檢測方法。相反，可采用任何基于親和力的檢測方法，其中 分析物結合到固定在感測表面上的配體，假如可以測量在感測表面處的變化，其是分析物 與其上的固定配體的結合的定量指示。現在說明檢測和定量化測定。一般，在抑制型測定(也叫做溶液競爭)中，已知數 量的檢測分子(這里是抗體)與樣本(這里是病毒)混合，并且測量自由檢測分子在混合 物中的數量。更具體地，在本生物傳感器上下文中用于濃度測量的抑制型測定可典型地包 括下列步驟1.作為配體，分析物或其衍生物附著到傳感器表面。2.恒定濃度(其可以是已知或未知的)的檢測分子添加到不同濃度的校準物溶液 (分析物)。3.該混合物與傳感器表面接觸(在流動系統中在表面上注入)并且測量響應。
4.計算校準曲線。5.然后通過將樣本(分析物)與恒定濃度的檢測分子混合進行測量，樣本與傳感 器表面接觸(在流動系統中在表面上注入)并且測量響應。6.該校準曲線用于計算樣本中的分析物濃度。自由檢測分子的數量與分析物在樣 本中的濃度逆相關。7.表面再生并且可以注入新樣本。在本發明的方法中，配體是病毒抗原，優選地表面抗原(或可選地整個病毒)，而 分析物是該抗原的抗體。該抗體可以是多克隆的(例如血清)或單克隆的。由于抑制型測 定形式，避免大病毒顆粒到表面的擴散影響。為了沒有任何對其限制的說明的目的，本發明將在下面關于確定至少一個流感病 毒在樣本中的濃度并且更特別地在三價流感疫苗中的三個不同病毒類型的血凝素(HA)的 濃度描述。參照在附圖中的圖1至9。如在圖Ia中示意描繪的，由標號1標明的純化病毒HA固定在生物傳感器傳感器 表面2上。使病毒顆粒3和含抗血清的抗體4的混合物作為液流在傳感器表面2上通過。 如在圖Ia中圖示的，抗體4可以結合到病毒顆粒或結合到固定的HA抗原或在溶液中是自 由的。結合到傳感器表面增加來自傳感器表面的響應信號。圖Ib圖示當在樣本中沒有病毒存在時的情況。最大數量的抗體4然后結合到在 傳感器表面上的HA抗原1，導致高響應信號。在圖Ic中，在另一方面，高濃度的病毒顆粒3導致低量自由抗體4，并且因此測量 到低響應信號。從而，在樣本中病毒的濃度越高，到表面HA的結合抗體的數量越低，導致較 低的響應水平。如果傳感器表面具有或能夠提供多個分離的感測區域或“點”，例如三個或更多 等，例如如在圖2中示意圖示的可固定三個不同HA的，其中對于病毒類型/亞型A/Hmi、A/ H3N2和B (其典型地使用在當前流感疫苗中)特定的HA固定到在傳感器表面上的相應點。如將在下文證明的，不同病毒抗血清到HA的結合是選擇性的，即在不同的病毒類 型或亞型之間沒有交叉反應性。由于該選擇性，在樣本中的兩個或更多不同的病毒成分 (例如多價疫苗)可同時確定。現在將描述應用于包含三個上文提到的病毒類型/亞型A/Hmi、A/H3N2和B的樣 本的本發明的示范性方法實施例。來自三個不同病毒類型的HA固定在傳感器表面上的三個不同點上。然后執行校準過程。由每個病毒類型的固定濃度的標準抗血清構成的校準物與包 含要測量的濃度范圍的不同已知濃度的病毒(或病毒抗原)混合。該校準物然后注入(分 別或所有三個類型一起)在傳感器表面點上并且測量響應。然后從測量結果計算校準曲 線。病毒HA的樣本含量的測量然后通過將每個病毒與固定濃度的抗血清混合(一次 一個，或優選地與所有三個抗血清)執行。該樣本在傳感器表面上注入并且測量自由抗血 清濃度。校準曲線用于樣本中病毒抗原濃度的計算。然后再生表面(即，結合抗體通過使表面與合適的再生溶液接觸而從固定HA分 離)，并且新的樣本可以在表面上通過。
通過如上文優選的使樣本與所有三個抗血清混合并且在所有三個點上注入樣本， 來自三個不同的病毒類型/亞型的HA的濃度可以在單個分析循環中分析。因此可開發可 以同時測量多價(例如三價的)流感疫苗的所有病毒成分的測定。如將在下文示出的，已經發現在流感病毒亞型的不同菌株對該亞型的菌株的血凝 素之間有可觀的交叉反應性。因此可能可以開發常見病毒菌株中每個的一般測定。這樣的 測定從而可以具有用于測量在流感疫苗中的病毒抗原含量的一般用途(不考慮其病毒菌 株的每年變化的組合)。在上文描述的測定中，高質量分析結果的前提是固定在傳感器表面上的配體(HA) 的恒定結合能力和在表面上注入的校準物的高穩定性。一般，結合能力的較少減小常常可 以通過頻繁校準補償。然而，頻繁校準減小了處理能力并且由于試劑消耗而增加成本。根據本發明，已經想出其中每個分析循環使用“虛擬”校準曲線評價的方法，從而 最小化在漂移期間頻繁校準的需要并且顯著提高使用生物傳感器系統(例如上文提到的 Biacore 系統等)定量測量的質量。盡管該方法基本上一般可應用于任何配體，并且可在 各種不同測定形式中使用，其除其他之外包括直接結合測定、抑制測定和夾心測定，該方法 在本病毒檢測上下文中具有特定關聯，因為像HA的病毒抗原通常顯出引起在傳感器表面 上漂移的顯著不穩定性。當傳感器表面的結合能力減小時，對照物的測量/計算的濃度作為在新的校準運 行執行前執行的分析循環的數目(或循環數)的函數而增加，因為在抑制型測定形式中校 準曲線將結合能力減小解釋為樣本中HA濃度增加。該漂移隨分析循環增加的數目而增加， 并且常常是指數的。在本方法中，分析循環包括在具有固定HA的傳感器表面上使病毒和檢 測抗體的混合物通過，然后使表面再生以使它為下一個分析循環準備的步驟。根據本發明，新的校準例程可以采用不同的方式設計。在一個變化形式中，來自校準運行的原始數據用于每個分析循環的虛擬濃度的預 測，后跟循環特定校準曲線的計算和樣本/對照物的濃度預測。在另一個變化形式中，校準方程對真實校準中的每個來計算，后跟每個分析循環 的特定校準系數的預測。這些系數然后用于樣本和對照物的濃度預測。上文提到的第一個方法將在示例4和5中更詳細地描述，以及第二變化形式在下 文示例6中。用于執行例如多價流感疫苗的分析的本發明的方法的測定套件可包括目標流感 病毒類型/亞型的血凝素(或血凝素類似物)、病毒類型/亞型的標準血清和病毒標準，并 且可選地還有傳感器芯片。在下列示例中，本發明的各種方面為了說明和非限制的目的更具體地公開。示例儀器使用BiaCOreTMT100(GE Healthcare，烏普薩拉，瑞典)。該儀器(其基于在傳感器 芯片上的金表面處的表面等離體振子共振(SPR)檢測)使用微流體系統(集成微流體控盒 (cartridge)-IFC)用于使樣本并且使緩沖液一個接一個或連續地通過四個分別檢測的流 動池(叫做Fcl至Fc4)。該IFC通過在Biacore T100儀器內的對接機構被壓入與傳感器 芯片接觸。
Series CM5 (GE Healthcare，烏普薩拉，瑞典)用作傳感器芯片，其具有涂敷 金(大約50nm)表面，其具有羧甲基改性葡聚糖聚合物的共價鍵聯的水凝膠基質(大約 IOOnm)。來自該儀器的輸出是“傳感圖”，其是檢測器響應(采用“共振單位”RU測量)作 為時間的函數的圖。1000RU的增加對應于在傳感器表面上大約lng/mm2的質量增加。示例1 流感病毒 A/H3N2/Wyoming (懷俄明州)、A/H3N2/New York 和 B/.Tilin 的 測定材料血凝素(HA)A/H3N2/，Wyoming/3/2003、Wisconsin和 New York 來自美國梅里登 Protein Sciences 公司。HA A/H1N1, New Caledonia/20/99 來自以色列 ProsPec，Rehovot0HB/Jilin來自美國圣地亞哥Gen Way Biotech公司。血清以及病毒菌株來自英國哈福德郡的波特斯巴NIBSC-國家生物學標準和管制 所。測定和樣本緩沖液HBS_EP+，GEHealthcare。表面活性劑P20:GE Healthcare。TffeHA(H3N2,H1N1和B)固定到在Biacore T100的三個相應流動池中的CM5傳感器， 其使用如下胺偶聯(amine coupling)H3N2/Wyoming 和 Wisconsin 在 IOmM 磷酸鹽緩沖液中 10μ g/ml，pH7. 0,0. 05% 表 面活性劑P20，7分鐘。H3N2/New York 在IOmM馬來酸鹽緩沖液中10 μ g/ml, pH6. 5,0. 05%表面活性劑 P20，7分鐘。B/Jilin:在IOmM馬來酸鹽緩沖液中5 μ g/ml, pH6. 5，0. 05 %表面活性劑P20， 20-30分鐘。固定水平是 5000-10000RU。基于SRID滴定、使用稀釋因子來稀釋對相應病毒菌株的血清，如供應商所建議的 那樣，例如對于SRID的7μ 1血清稀釋到Iml對應于Biacore Τ100中的χ200稀釋。(進行 稀釋以獲得大約500-1500RU)，注入時間是5分鐘。執行三到十次具有血清的啟動循環。校準曲線用病毒抗原(HA)準備，首先如由供應商推薦的在MQ中稀釋(HA然后采 用等分試樣保持冷凍)，然后在血清中進一步稀釋到典型地0. 1-15 μ g/ml。標準和樣本具有400s注入時間。采用20-50mM HCl，0. 05%表面活性劑P20，30s (后跟30s穩定化)來執行再生。示例2 相同病毒亞型的不同菌株的檢測的通用性H3N2菌株Wyoming HA固定到CM5傳感器芯片并且表面與不同的病毒/抗血清 組合接觸來自Wyoming的病毒/抗血清(W/W)；來自New York的病毒/抗血清(N. Y. / N. Y.) ；Wyoming 病毒和來自 New York 的血清(W/N. Y.) ；New York 病毒和來自 Wyoming 的 血清(N. Y./W)。運行關于相應組合的校準曲線。結果在圖3中示出。從圖中，在不同病毒菌株之間存在交叉反應性是清楚的。Wyoming HA和病毒/抗血清因此可以用于New York 菌株的定量分析，并且反之亦然。3 杭血清到不同、流感病毒類型/亞型HA的結合的詵擇十牛對流感病毒A/H3N2、A HlNl和B的不同菌株的27個不同的抗血清在固定的H3N2 Wyoming HA上注入并且檢測其結合。結果以及使用的菌株的列表在圖4中指示。如從圖明 顯的，所有H3N2抗血清結合具有高于100RU的信號，而所有Hmi和B抗血清具有低于50RU 的信號。這指示若干病毒菌株可同時定量化并且H3N2的測量需要一個或僅少數HA的。示例4 虛擬校準過稈許多測定循環(大約100個)在Biacore TlOO和CM5傳感器芯片上運行，在此期間 四個普通校準用對照樣本的七個不同濃度執行(0. 156,0. 31,0. 625、1. 25,2. 5、5和10 μ g/ ml) ο 函數 I(I) = a*exp(-b*i)+c*exp(_d*i)+e (使用循環數作為 1，響應作為 χ 和 a、b、c、 d以及e作為擬合參數)對七個不同濃度中的每個來擬合。該結果在圖5中示出，其中頂 部曲線代表對照物的最低濃度(即，最高響應-抑制測定)并且底部曲線代表最高(即最 低響應)。方程然后用于每個循環的虛擬響應的計算。這些響應然后用于每個循環的校準 曲線的計算，這些用于在確切該循環運行的樣本和對照物的預測，如下文參照圖6和7描述 的。圖6圖示在2個對照物(1. 0 μ g/ml和0. 5 μ g/ml)的計算濃度上的漂移。運行很 多測定循環并且四個中間校準在由雙虛線箭頭指示的循環數處執行。在每個校準后的3 (2) 個對照物的濃度針對前面最靠近的校準曲線計算。如由虛線箭頭指示的，隨與校準的距離 增加，在計算的濃度方面存在系統性增加。該計算濃度的增加是由于來自對照樣本的減小 的信號。這進而由于表面的結合能力作為循環數的函數的減小引起，校準曲線將其解釋為 增加的濃度。該結合能力的減小在圖3和圖4中也是可見的。上文描述的虛擬校準方法到圖6中的原始數據的應用給出在圖7中示出的0.5和 1.0 μ g/ml對照物的濃度估計，這在對照樣本濃度預測方面具有可重復性的相當大的提高。示例5 通過虛擬校準程序使結合數據規格化HA 重組蛋白質 HB/Jilin、Hmi/New Caledonia 和 H3N2/Wyoming 被固定。獲得校 準曲線。稀釋樣本并且測量和重新計算在0.5-15 μ g/ml之間的濃度。為了避免響應漂移， 結果使用在上文的示例4中概述的規格化程序規格化，每個循環獲得唯一的校準曲線。圖 8示出在對照樣本(5 μ g/ml的B/JiangSu/l(V2003)規格化之前和之后的結果，給出250RU 的響應，CV = 1. 2%。示例6 三個不同病毒類型的同時檢測三個流動池固定有三個不同的重組流感病毒HA蛋白質H1N1/New Caledonia, H3N2/ffisconsin 和 B/Jilin。來自三個流感菌株(HINl/NewCaledonia、H3N2/Wisconsin 和 B/Malaysia)的病 毒標準被稀釋并且混合在一起，使得每個標準的最終濃度是16μ g/ml。校準曲線然后做成 是從 16 μ g/ml 到 0. 5 μ g/ml 的 2 倍連續稀釋 Q-fold serial dilution)。要分析的三個疫苗(H1N1、H3N2和B)被稀釋8、16、32和64倍。三個血清(來自NIBSC 的 HINl/New Caledonia,H3N2/ffisconsin 和 B/Malaysia) 被稀釋到給出500-700RU響應的濃度并且混合在一起。
與ag先前混合最后稀釋HINl/New Caledonia 60x 稀釋180xH3N2/ffisconsin70x 稀釋210xB/Malaysia20x 稀釋60x要分析疫苗，標準和疫苗的復制品使用在“方法建立器(Method Builder) ”中創建 的方法首先與血清溶液混合并且然后允許流過所有流動池。來自“方法建立器”的一般方法啟動(7個循環，緩沖液代替樣本，接著再生，2小時)校準曲線1(14個循環)樣本(12個循環)校準曲線2(14個循環)樣本(12個循環)校準曲線3(14個循環)。結果然后關于三個校準曲線規格化。這通過執行校準曲線到四參數回歸曲線(方 程1)(其常規與Biacore 系統一起用于確定濃度)的四參數擬合來進行以確定四個系數
權利要求
1.一種確定病毒或其抗原在樣本中的濃度的方法，包括步驟提供具有固定到其的病毒抗原或病毒抗原類似物的傳感器表面，將所述樣本與已知量的對所述病毒抗原的抗體混合以獲得在所述樣本混合物中的預 定濃度的對所述抗原的抗體，將所述樣本混合物與所述傳感器表面接觸以將所述混合物中的自由抗體結合到所述 傳感器表面，測量所述傳感器表面對自由抗體結合的響應，以及從校準曲線確定病毒或抗原在樣本中的濃度，該校準曲線通過測量對于混合物所獲得 的響應來準備，該混合物包含預定濃度抗體和不同濃度病毒或病毒抗原。
2.如權利要求1所述的方法，其中多個分析循環采用中間再生來在所述傳感器表面上 執行，并且對每個分析循環計算虛擬校準曲線。
3.如權利要求2所述的方法，其中計算校準曲線包括使用循環數作為1和響應作為I將所述曲線中的已知濃度中的每個擬合到雙指數方程，使用這些方程用于計算每個循環的虛擬校準曲線以及，從該特定循環的虛擬校準曲線確定所述病毒或抗原在所述樣本中的濃度。
4.如權利要求1、2或3所述的方法，其中確定至少兩個、優選地至少三個不同的病毒或 病毒抗原在樣本中的濃度，并且其中樣本和對相應病毒抗原具有選擇性的抗體的混合物在 單獨分析循環中連續地與傳感器表面接觸，所述傳感器表面具有一個不同的固定到其的抗 原或類似物。
5.如權利要求1、2或3所述的方法，其中確定至少兩個、優選地至少三個不同的病毒或 抗原在樣本中的濃度，并且其中樣本和對相應病毒抗原具有選擇性的抗體的混合物與具有 分離的感測區域的傳感器表面接觸，所述感測區域具有固定到其的相應抗原或類似物。
6.如權利要求1、2或3所述的方法，其中確定至少兩個、優選地至少三個不同的病毒或 抗原在樣本中的濃度，并且其中樣本和對相應病毒抗原具有選擇性的抗體的混合物與傳感 器表面接觸，所述傳感器表面包括固定到相同感測區域的相應抗原的混合。
7.如權利要求1、2或3所述的方法，其中確定至少兩個、優選地至少三個不同的病毒或 病毒抗原在樣本中的濃度，并且其中樣本和對相應病毒抗原具有選擇性的抗體的混合物在 單個分析循環中與具有分離的感測區域的傳感器表面接觸，所述感測區域具有固定到其的 相應抗原或類似物。
8.如權利要求1至7中任一項所述的方法，其中對所述病毒的抗體包括對所述病毒或 病毒抗原的血清。
9.如權利要求1至8中任一項所述的方法，其中所述病毒是流感病毒。
10.如權利要求4至9中任一項所述的方法，其中所述不同的病毒從流感病毒類型和亞 型選擇。
11.如權利要求1至10中任一項所述的方法，其中所述病毒抗原包括血凝素。
12.如權利要求1至11中任一項所述的方法，其中所述樣本從流感疫苗生產得到。
13.如權利要求12所述的方法，其中所述樣本從多價流感疫苗得到。
14.如權利要求11至13中任一項所述的方法，其中所述固定的血凝素是流感病毒類型或亞型的多個不同菌株的屬。
15.如權利要求11至13中任一項所述的方法，其中所述固定的血凝素從流感病毒類型 或亞型的至少2個不同菌株得到。
16.如權利要求13、14或15所述的方法，其中所述多價流感疫苗是三價的并且從流感 A/H1NUA/H3N2和β菌株得到。
17.如權利要求1至16中任一項所述的方法，其中在所述傳感器表面上的結合相互作 用通過質量感測、優選地隱失波感測、特別地表面等離子體振子共振(SPR)來檢測。
18.一種確定病毒或病毒抗原在多價流感疫苗中的含量的方法，包括步驟將每個病毒類型或亞型的血凝素固定在生物傳感器感測表面的相應分開的感測區域上，將所述疫苗的樣本與對所述疫苗中的所述病毒類型或亞型中的每個的固定濃度的抗 血清混合，在單個分析循環中，使所述混合物與所述傳感器表面接觸以使自由抗血清結合到相應 感測區域并且測量在每個感測區域處對所述結合的響應，以及從對于不同的病毒類型或亞型的校準曲線確定每個病毒類型或亞型或其抗原在所述 樣本中的含量。
19.如權利要求18所述的方法，其中校準曲線的準備包括步驟a)通過對于所述不同的病毒類型或亞型，將對每個病毒類型或亞型的固定濃度的標準 抗血清與預定量病毒或病毒抗原進行混合來準備校準物混合物，b)使所述傳感器表面與所述混合物接觸以使自由抗血清結合到相應感測區域并且測 量在每個感測區域處的響應，c)對包含對于所述不同的病毒類型或亞型的不同量病毒或病毒抗原的混合物重復步 驟a)和b)，以及d)計算每個病毒類型或亞型的校準曲線。
全文摘要
一種確定病毒或其抗原在樣本中的濃度的方法，包括步驟提供具有固定到其的病毒抗原或病毒抗原類似物的傳感器表面，將該樣本與已知量的對該病毒抗原的抗體進行混合以獲得對該抗原的抗體在該樣本混合物中的預定濃度，將該樣本混合物與該傳感器表面接觸以將在該混合物中的自由抗體結合到該傳感器表面，測量該傳感器表面對自由抗體結合的響應，以及從通過測量包含該預定濃度抗體和不同濃度病毒的混合物所獲得的響應而準備的校準曲線來確定該病毒或抗原在該樣本中的濃度。
文檔編號G01N33/543GK102046815SQ200980121159
公開日2011年5月4日 申請日期2009年6月1日 優先權日2008年6月2日
發明者A·弗羅斯特爾-卡爾森, A·拉森, M·哈馬萊南, P·博格 申請人:通用電氣健康護理生物科學股份公司