C2orf18作為癌癥治療和診斷的靶基因的制作方法
                            
            
                            
            文檔序號：5864057閱讀：643來源：國知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            專利名稱：C2orf18作為癌癥治療和診斷的靶基因的制作方法
            
技術領域：
            本發明涉及檢測和診斷癌癥(特別是胰腺癌)的存在或者發生癌癥的傾向 (predisposition)的方法。本發明還涉及治療和預防癌癥(特別是胰腺癌)的方法。特別 地，本發明涉及C2orfl8，一種在癌癥中被特異上調的基因，以及其作為癌癥治療靶標和 診斷標志的用途。
            
背景技術：
            癌癥是主要的死亡原因，全世界每年有數百萬人死于癌癥。特別地，胰腺癌是 惡性腫瘤中致死率最高的癌癥之一，患者的5年存活率為4%。每年有大約28000名患 者被診斷患有胰腺癌，并且幾乎所有患者均因病死亡(Greenlee，R.T.，etal.，(2001)CA Cancer J Clin, 51: 15-36)。這種惡性腫瘤的不良預后是由于其難以早期診斷和對現在 的治療方法響應差所導致的(Greenlee，R.T.，et al. (2001) CA Cancer J Clin, Ji: 15-36， Klinkenbijl, J.H., et al. (1999) Ann Surg，230  776-82; discussion 782-4.)。胰腺導管腺癌(PDAC)是西方國家中位列第四的癌癥致死原因，也是普通惡 性腫瘤中具有最高致死率的癌癥之一，患者的5年存活率僅為5% (DiMagno EP，et al.Gastroenterology. 1999 Dec ； 117(6)  1464-84.1, WrayCJ, etal.Gastroenterology.2005 May； 128(6)  1626-41.2)。2007年，美國預計有大約37,170名新患者被診斷患有胰 腺癌，并且接近 33,370 名將死于胰腺癌(JemalA，et al.CA Cancer J Clin.2007 Jan-Feb ； 57(1) : 43-66.3)。目前，PDAC唯一可治愈的方法是手術切除。然而，因為大多 數PDAC是在很晚期的階段才被診斷出來，所有在診斷出時只有15% -20%的患者可 進行手術切除。在接受了有治愈可能的手術的患者中，大多數患者最終會復發并死于 該疾病(WrayCJ，et al.Gastroenterology.2005 May ； 128 (6)  1626-41.2)。某些方法 結合手術和化療(包括吉西他汀或5-FU)，進行或不進行放射，能改善患者的生活質 量(DiMagno EP，et al.Gastroenterology.1999 Dec ； 117 (6)  1464-84.1，Wray CJ, etal. Gastroenterology.2005 May ； 128(6)  1626-41.2)。然而，這些治療對 PDAC 患者長期生 存的效果非常有限，因為PDAC的侵襲性極高，并且對化療有抵抗性。為了應對這種嚴峻的狀況，通過鑒定分子靶標開發PDAC的新型分子治療方 法是現在亟待解決的問題。前人已經使用了基因組范圍的cDNA陣列，結合使用激光 顯微解剖，獲得了用于檢測的純化癌細胞群體，生成了精細的PDAC細胞表達譜(見 Nakamura T，et al.0ncogene.2004 Mar25 ； 23(13)  2385-400，本文引用作為參考)。線粒體對于細胞生物能學至關重要，在決定細胞凋亡過程中發揮核心作用 (Taniuchi K，et al.Cancer Res.2005 Jan 1 ； 65(1)  105-12.)。癌相關的細胞代謝變化會影響線粒體功能(Warburg effect, Galluzzi L, et al.Oncogene.2006Aug 7 ； 25 (34) 4812-30.)，并可能參與癌的存活能力，特別是在低毒性條件下。而且，細胞凋亡失效已 經與線粒體外膜透化(permeabilization) (MOMP)被抑制聯系起來。在理論上，開發靶 定線粒體蛋白的特異治療干預方法是吸引人的(Taniuchi K，et al.Cancer Res.2005 Jan 1 ； 65(1)  105-12.)。許多實驗性的治療劑能夠直接靶定線粒體，從而誘導細胞凋亡。這 些試劑的實例包括被設計成模擬Bcl-2樣蛋白Bcl-2同源域3的試劑(Walensky LD, et al.Science.2004 Sep 3 ； 305(5689)  1466-70.),外周型苯并二氮卓受體配體(Decaudin D, etal.CancerRes.2002 Mar 1 ； 62(5)  1388-93.),和兩性陽離子(Ellerby HM，et al.Nat Med. 1999 Sep ； 5(9)  1032-8.)。這些MOMP誘導劑或促進劑能夠自身誘導細胞凋亡， 或者在聯合治療中促進細胞凋亡的誘發，從而克服任何針對DNA損傷劑的化療耐受性 (Taniuchi K, et al.Cancer Res.2005 Jan 1 ； 65(1)  105-12.)。本發明通過發現一種新的在胰腺癌細胞中特異上調的基因靶標，C2orfl8(染色 體2開放閱讀框18)，解決了本領域對改進胰腺癌診斷和治療的需求。發明的公開
            
發明概要 鑒于前述，本發明的一個目的是提供用于檢測、診斷、預后評估和/或治療癌 癥(特別是胰腺癌)的新方法。在完成本發明的過程中，通過微陣列分析鑒定了一個新基 因C2orfl8，其在胰腺癌細胞(特別地，PDAC細胞)中特異過表達，并且其在癌細胞中 的過表達被RT-PCR和免疫組織化學分析所證實。因為C2orfl8在成年正常器官中局限性 地表達，所以它可能是具有極小副作用的新型治療方法的合適而有前景的分子靶標。功 能上，通過SiRNA敲低胰腺癌細胞系中的內源C2orfl8可急劇抑制胰腺癌細胞的生長，表 明它在保持胰腺癌細胞生存能力中方面起著至關重要的作用。免疫細胞化學分析和細胞 分級分離(cell fractionation)隨后進行western印跡分析的結果顯示C2orfl8位于線粒體， 提示C2orfl8在癌細胞中可能參與細胞凋亡或能量內穩平衡。因此，本發明的一個目的是通過確定受試者來源生物樣品(例如活組織檢查)中 C2orfl8的表達水平來提供檢測或診斷對象體內癌癥、確定發生癌癥的傾向、和/或監視 癌癥(特別是胰腺癌)的治療過程的方法。C2orfl8的表達水平與正常對照水平相比增 力口，表明對象罹患或者具有發生癌癥(特別是PDAC)的危險。在本發明的方法中，可以 利用合適的探針檢測C2orfl8基因，或者可以利用抗_C2orfl8抗體檢測C2orfl8蛋白。本發明進一步提供了鑒定可抑制C2orfl8基因表達或其基因產物活性的作用劑的 方法。如在本文中將更詳細討論地，本發明涉及下述發現C2orfl8與ANT2之間的相互 作用，及該作用參與線粒體膜電位保持以及細胞凋亡。因此，本發明的一個目的是提供 鑒定可抑制C2orfl8與ANT2之間相互作用的作用劑的方法。本發明的一個進一步的目的 是提供鑒定用于治療或預防C2orfl8相關疾病，例如癌癥如胰腺癌，更特別地是PDAC， 的候選作用劑的方法，或者鑒定用于在這些疾病狀態下抑制細胞生長的候選作用劑的方 法。本發明的方法可以在體外或體內實施。C2orfl8基因的表達水平和/或其基因產物 的生物活性在存在測試劑時比不存在測試劑時降低，表明該測試劑是C2orfl8的抑制劑， 并可能用于抑制過表達C2orfl8的細胞(例如癌細胞如胰腺癌細胞，更特別地是PDAC)的生長。可以利用候選作用劑通過抑制癌癥生長來降低胰腺癌，特別是PDAC的癥狀。本發明的另外一個目的是提供通過施加可抑制C2orfl8基因表達和其基因產物即 C2orfl8蛋白的功能的作用劑來抑制過表達C2orfl8的癌性細胞生長的方法。優選地，該 作用劑是抑制性核酸(例如反義分子、核酶、雙鏈分子)。該作用劑還可以是用于提供 雙鏈分子的核酸分子或載體。通過向靶細胞內引入足以抑制C2orfl8基因表達的量的雙 鏈分子可以抑制該基因的表達。本發明還提供了用于抑制受試者體內過表達C2orfl8的 癌性細胞生長的方法，以及用于罹患癌癥(特別是胰腺癌)的受試者的治療或預防方法。 在另一個方面中，本發明涉及用于治療或預防癌癥(特別是胰腺癌)的藥物組合物，其包 括作為活性成分的雙鏈分子或編碼該雙鏈分子的載體，以及合適的可藥用載體。本發明 的雙鏈分子在引入細胞內時可抑制C2orfl8基因的表達，并抑制過表達C2orfl8的癌性細 胞的生長。例如，這些分子可以被設計成靶定與SEQIDNO  11的核苷酸殘基196-214 或核苷酸殘基574-592部分相應的序列。本發明的雙鏈分子包括有義鏈和反義鏈，其中 有義鏈包括含有靶序列的序列，并且其中反義鏈包括與有義鏈 互補的序列。分子的有義 鏈和反義鏈彼此雜交形成本發明的雙鏈分子。本發明進一步的目的是提供針對C2orfl8的抗體。該抗體用具有氨基酸序列 CRAAGQSDSSVDPQQPF (SEQ ID NO  5)和 / 或 AEESEQERLLGGTRTPINDAS (SEQ ID NO 6)的多肽作為抗原產生。這些抗體可用于診斷癌癥(特別是胰腺癌)的免疫 染色測定。在另一個方面中，本發明提供了用于檢測、診斷或預后癌癥(特別是胰腺 癌)的檢測試劑或試劑盒，其包括抗_C2orfl8抗體。在本發明中，具有氨基酸序列 CRAAGQSDSSVDPQQPF (SEQ ID NO  5)禾口 / 或 AEESEQERLLGGTRTPINDAS (SEQ ID NO 6)的肽特別適用于制備抗-C2orfl8抗體。因此，本發明的一個目的是提供這些肽 以及制備抗_C20rfl8抗體的方法。本領域的技術人員會理解，本發明的一個或多個方面可以滿足某些目的，而其 它一個或多個方面可以滿足某些其它的目的。每一個目的可能不在全部方面均同等地 適用于本發明的每一個方面。例如，前述的各個目的可以擇一地適用于本發明的每個方面。在聯系附圖和實施例閱讀下面的詳細說明時，本發明的這些和其它的目的和特 征將變得更加顯而易見。然而，應當理解，前面的本發明概要和后面的詳細說明僅僅提 出了優選的實施方案，并不對本發明或者本發明的可替換實施方案構成限制。特別地， 盡管本文中通過參考多個具體實施方案描述了本發明的，但是應當意識到，這些描述是 本發明的舉例說明，不應認為對本發明具有限制。本領域的技術人員可以進行各種修改 和應用，而不背離如附加權利要求所述的本發明的精神和范圍。類似地，本發明的其它 目的、特征、益處和優點可以從本概要和下面所述的某些實施方案變得顯而易見，并且 對本領域的技術人員而言也更容易顯見。通過上文并聯系附加實施例、數據、附圖和由 其獲得的所有合理推論，或者同時考慮本文引用的參考文獻，這些目的、特征、益處和 優點將變得顯而易見。
            

            

            
在考慮下文的附圖簡述和本發明的詳細說明及其優選實施方案時，技術人員將對本發明的各個方面和應用顯而 易見[圖1]“C2orfl8在PDAC細胞中的過表達”部分(A)顯示了在顯微解剖的PDAC 細胞(1-9)中C2orfl8和TUBA的mRNA表達的RT-PCR結果，并與同樣被顯微解剖的 正常胰腺導管上皮細胞(NPD)和成人生命器官(vitalorgans)相比較。Pane 正常胰腺， BM骨髓。部分(B)顯示了 Northern印跡分析的結果，其顯示C2orfl8在前列腺、甲狀 腺、腎上腺組織中微弱表達，在幾乎所有胰腺癌細胞系中高表達，但在生命器官中的表 達非常有限。部分(C)顯示了 Western印跡分析的結果，其使用從兩只家兔血清純化出 的抗_C2orfl8抗體(批號192和批號193)檢測PDAC細胞系中的內源C2orfl8。PDAC 細胞系中PAPM的表達高于正常細胞系(NIH3T3，HEK-293,和C0S7)。beta-肌動蛋 白作為上樣對照。部分(D)顯示了使用抗-C2orfl8抗體的免疫組織化學研究結果，其中 在PDAC細胞中觀察到了強烈染色(Clx200，C2x400, C3x400)。在PDAC細胞的細胞 質內觀察到了 C2orfl8的強陽性染色。在正常胰腺組織中，腺泡細胞和正常導管上皮細 胞沒有顯示染色(N，x400)。[圖2]“ C2orfl8-siRNA對PDAC細胞生長的影響”部分(A)顯示了 siRNA 對PDAC細胞系MIA_PaCa2 (左)禾Π Panc-I (右)內C2orfl8的敲低效果。對用每種針 對C2orfl8的siRNA-表達載體(#196，#574，和#3254)和作為陰性對照載體的siEGFP 進行半定量RT-PCR，結果#196和#574確認了敲低效果，而siEGFP和#3254則沒有。 beta2-MG用于定量RNA。部分(B)顯示了分別用標示的針對C2orfl8的siRNA-表 達載體(#196，#574，和#3254)和陰性對照載體(siEGFP)轉染的MIA-PaCa2 (左)和 Panc-I (右)細胞的集落形成測定。細胞與遺傳霉素溫育14天然后用0.1%結晶紫染色以 顯現。部分(C)顯示了分別用標示的針對C2orfl8的siRNA-表達載體(#196，#574，和 #3254)和陰性對照載體(siEGFP)轉染的MIA_PaCa2 (左)禾Π Panc-I (右)細胞的MTT 測定結果。與遺傳霉素溫育14天后，將每個平均值與指示SD (標準偏差)的誤差線一 起繪圖。Y軸上的ABS表示490nm的吸光度，630nm吸光度作為參比，吸光度用酶標儀 (microplate reader)測量。這些實驗重復實施三次。**表示P值< 0.01 (Students' t_檢 驗)。[圖3]“C2orfl8在PDAC細胞內的定位”部分(A)顯示了使用抗_C2orfl8的免疫 細胞化學分析的結果，其中陽性信號(綠色)在PDAC細胞細胞質中呈囊泡模式(vesicular pattern)(左上圖)被檢測到。這些抗_C2orfl8抗體信號(綠色)與MitoTracker信號(紅 色右上圖)部分重合。這些抗-C2orfl8抗體信號在用siRNA敲低C2orfl8后消失(右 下圖)，而它們在用對照siRNA(siEGFP)處理的細胞質內仍保持呈囊泡模式(左下圖)。 部分(B)顯示了用抗-C2orfl8抗體的Western印跡分析結果，其證明C2orfl8定位于細胞 質，并且僅存在于線粒體組分中。使用抗線粒體內膜蛋白(mitofilin)抗體檢測線粒體組 分。部分(C)顯示了免疫沉淀測定及隨后的質譜結果，其中ANT2被鑒定為與C2orfl8 相互作用的蛋白的候選物。用C2orfl8-HA表達載體和/或ANT2-Flag表達載體共轉染 COS7細胞。含有C2orfl8-HA或ANT2_Flag的蛋白復合體分別被抗-HA抗體(左圖) 或抗-Flag抗體(右圖)從細胞提取物中免疫沉淀下來。使用抗-Flag抗體進行Western 印跡表明，當兩種表達載體共轉染時，ANT2-Flag與C2orfl8-HA免疫共沉淀(左圖箭頭 所示)。使用抗-HA抗體的Western印跡表明，當兩種表達載體共轉染時，C2orfl8_HA與ANT2-Flag免疫共沉淀(右圖箭頭所示)。[圖4]“C2orfl8/ANT2BP參與線粒體膜電位(Apsim)和細胞凋亡”部分(A) 顯示了轉染研究的結果，其中PDAC細胞KLM-I用ANT2 siRNA、C2orfl8/ANT2BP siRNA、或siEGFP (作為對照)轉染，并在轉染48h后收集。使用抗_C2orfl8/ANT2BP 抗體的Western印跡分析確認了 C2orfl8/ANT2BPsiRNA對KLM-1細胞的敲低效果。部 分 (B)顯示了熒光測定的結果，其中細胞用若丹明123和PI溫育，通過FACS分析測量熒 光。X-軸上的若丹明123 (Rhl23)強度反映了 Apsi m，X軸上的PI (碘化丙錠)滲透性 反映了死細胞細胞膜的破壞。低水平的RM23強度和陰性PI滲透性指示早期凋亡細胞， 其中線粒體Apsim降低但細胞凋亡沒有完全完成，而低水平的Rhl23強度和陽性PI滲 透性指示死細胞。與對照相比(siEGFP，19% ),當ANTBP2 (25 % )或ANT2 (26 % )被 敲低時，低Apsim和陰性PI滲透性的細胞數目顯示增加。部分(C)顯示了 TUNEL測 定的結果，證明與siEGFP轉染的細胞相比，敲低Panc-I細胞中的C2orfl8可增加凋亡細 胞的數目(TUNEL陽性細胞用綠色指示)。制備用DNase I處理的透化細胞作為TUNEL 測定的陽性對照。圖(D)顯示了通過流式細胞儀計數的TUNEL陽性細胞的數目。在柱 狀圖中，X-軸反映了 TUNEL-陽性細胞的綠色信號的強度。在柱狀圖上向右偏移表明 與SiRGFP轉染的細胞相比，敲低C2orfl8可增加TUNEL陽性細胞的數目。發明的公開盡管與這里所介紹的相似或等價的方法和材料也可用于實施或檢測本發明的實 施方案，但是現在介紹的是優選的方法和材料。然而，應當理解，本發明并不僅限于這 里所介紹的特定的方法學和實驗方案，因為這些可以根據常規的實驗和優化加以改變。 還應當理解，說明書中使用的術語只是出于介紹特定的版本或實施方案的目的，并不意 圖限制本發明的范圍。除非特別定義，否則這里使用的所有技術和科學術語均具有與本發明所屬領域 普通技術人員所共同理解的相同的意思。然而，在出現矛盾時，以本說明書包括定義為 準。因此，在本發明的內容中，適用如下的定義。其他的定義視情況散在于下文中。^X除非特別指出，否則這里使用的詞語“一”、“一個”和“該”的意思是“至 少一個”。如這里所使用的，術語“生物體”是指任何由至少一個細胞構成的活的實體。 活的生物體可以簡單到例如單個真核細胞，或者復雜到哺乳動物，例如人類。如這里所使用的，術語“生物樣品”是指整個生物體或其組織、細胞或組成部 分(例如體液，包括但不僅限于，血液、黏液、淋巴液、滑液、腦脊液、唾液、羊水、 臍帶血(amniotic cord blood)、尿液、陰道分泌物和精液)的子集(subset)。術語“生物 樣品”進一步指從整個生物體或其細胞、組織或組成部分的子集制備的勻漿、裂解物、 提取物、細胞培養物或組織培養物，或其級分或部分。最后，“生物樣品”指含有細胞 組分(例如蛋白質或多核苷酸)的介質，例如生物體已在其中繁殖的營養湯或凝膠。在本發明的內容中，受試者來源的樣品可以是從測試受試者，例如已知或懷疑 患有癌癥(更具體地說，胰腺癌)的受試者獲得的任何組織。更具體地，組織可以是來 自胰腺癌或PDAC的上皮細胞。
            
術語“分離的”和“ 純化的”在本文中關于某種物質(例如多肽、抗體、多核 苷酸等)使用時，是指該物質基本上不含至少一種在其天然來源中本來會有的物質。因 此，“分離的”或“純化的”抗體是指這樣的抗體，其基本上不含(freeof)來自該蛋白 質(抗體)所來源的細胞或組織的細胞材料，例如碳水化合物、脂質或其它污染蛋白質， 或者當其為化學合成時，基本上不含化學前體或其它化學劑。術語“基本上不含細胞材 料”包括這樣的多肽制備物，其中該多肽是從細胞分離或在細胞中重組產生的，而與該 細胞的其它細胞組分是分開的。因此，基本上不含細胞材料的多肽包括如下的多肽制備 物，其具有少于大約30%，20%, 10%, 5%, 2%或(重量比)的異源蛋白質(在這 里也稱作“污染蛋白質”)。當多肽為重組產生時，還優選基本上不含培養介質，其包括 如下的多肽制備物，其含有的培養介質少于蛋白制備物體積的大約20%，10%或5%。 當多肽為化學合成產生時，優選其基本上不含化學前體或其它化學劑，包括這樣的多肽 制備物其具有的參與該蛋白質合成的化學前體或其它化學劑少于蛋白質制備物量的大 約30%，20%, 10%, 5%, 2%或(干重)。特定蛋白制備物含有分離或純化多肽可 以例如這樣來證明對該蛋白制備物進行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳并 對凝膠進行考馬斯亮藍染色等后顯示單條條帶。在優選實施方案中，本發明的抗體是分 離的或純化的。“分離的”或“純化的”核酸分子，例如CDNA分子，可以是基本上不含其它 細胞材料的，或者當其為通過重組技術產生時，基本上不含培養介質，或者當其為化學 合成時，基本上不含化學前體或其它化學劑。在優選實施方案中，編碼本發明抗體的核 酸分子是分離的或純化的。術語“多肽”、“肽”和“蛋白質”在這里可以互換使用，用于指示氨基酸殘 基的聚合體。該術語適用于如下氨基酸聚合體，其中一個或多個氨基酸殘基是被修飾的 殘基，或者非天然存在的殘基，例如相應的天然存在的氨基酸以及天然存在的氨基酸聚 合體的人工化學模擬物。術語“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及與天然存在的氨基酸具 有相似功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼子編碼的 氨基酸，以及在細胞內翻譯后被修飾的氨基酸(例如羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和ο-磷 酸絲氨酸)。詞組“氨基酸類似物”是指具有與天然存在氨基酸相同的基本化學結構(α 碳與一個氫、一個羧基、一個氨基和一個R基團連接)，但具有經過修飾的R基團或經過 修飾的骨架的化合物(例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍)。詞 組“氨基酸模擬物”是指這樣的化合物，其具有與一般氨基酸不同的結構，但發揮與一 般氨基酸相似的功能。在這里，氨基酸可以用它們公知的三字母符號表示，或者用IUPAC-IUB生物化 學命名委員會推薦的單字母符號表示。在本發明的內容中，術語“數個”，例如用于氨基酸添加、刪除和/或替換 時，意思是3-7個、優選地3-5個，更優選地3-4個，甚至更優選地3個氨基酸殘基。除非另外具體指出，術語“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核苷酸”、“核酸” 和“核酸分子”可以互換使用，并且與氨基酸相似，可以用它們普遍接受的單字母編碼 表示。與氨基酸相似，它們涵蓋天然存在的和非天然存在的核酸聚合物。多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸、核酸或核酸分子可以由DNA、RNA或其組合構成。在本發明的內容中，詞組“對照水平”是指在對照樣品中檢測到的基因或蛋白 質表達水平，并且可以包括(a)正常對照水平或(b)癌癥特異性對照水平，更具體地說， 胰腺癌特異性對照水平。對照水平可以是來自單個參考群體的單一表達模式，或者由多 個表達模式構成。詞組“正常對照水平”是指在正常、健康個體中或者在已知沒有罹患 癌癥(例如胰腺癌如PDAC)的個體群體中檢測到的基因表達水平。正常個體是沒有癌 癥(例如胰腺癌如PDAC)的臨床癥狀的個體。另一方面，“胰腺癌(PC)對照水平”或
            
“PDAC對照水平”分別是指在罹患胰腺癌(PC)和胰腺導管腺癌(PDAC)的群體中發現  的基因表達水平。測試樣品與PC或PDAC對照之間C2orfl8表達水平相似分別表示對象(獲得測 試樣品的對象)罹患或者具有發生PC或PDAC的危險。根據本發明，當基因的表達水 平比對照水平增加到至少1.1倍，優選地超過1.5倍，優選地超過2.0倍，優選地超過5.0 倍，優選地超過10.0倍或者更多倍時，認為特定基因的表達水平“增加”。類似地，當 基因的表達水平比對照水平降低至少1.1倍，優選地超過1.5倍，優選地超過2.0倍，優 選地超過5.0倍，優選地超過10.0倍或者更多倍時，認為特定基因的表達水平“降低”。 C2orfl8基因表達可以通過例如RT-PCR或Northern印跡分析確定受試者組織樣品的 C2orfl8 mRNA,或者通過例如對受試者組織樣品進行免疫組織化學分析檢測由C2orfl8 編碼的蛋白質，來加以確定。C2orfl8 基因和 C2orfl8 蛋白本發明部分地基于如下的發現，即與非癌組織相比，編碼C2orfl8的基因在 PDAC中過表達。C2orfl8在這里還被稱作PAMP(胰腺癌線粒體蛋白)。本發明涉及 C2orfl8基因和由其編碼的C2orfl8蛋白，以及它們在胰腺癌診斷和治療中的用途。鑒定的C2orfl8的cDNA長度為3912個核苷酸。C2orfl8的核酸和多肽序列分別 如SEQ ID NO: 11和12所示。這些序列數據還可以通過如下的登錄號獲得。C20RF18/ C2orfl8/ANT2BP  ΝΜ_017877在本發明的內容中，功能等價物也被看作是“C2orfl8多肽”。這里，蛋白 的“功能等價物”是指具有與蛋白相同生物活性的多肽。也就是，任何保留C2orfl8 蛋白生物能力的多肽在本發明中均可用作這種功能等價物。在本發明的內容中，優選 地，C2orfl8功能等價物所保留的生物能力是與天然C2orfl8蛋白相關的促進細胞增 殖活性。生物樣品的促細胞增殖活性可以通過檢測增殖速度或者通過測量細胞周期 或集落形成能力來加以確定。這些活性可以用傳統技術和標準測定方法常規地進行 測定，例如可以使用能夠從ATCC (Manassas，VA)獲得的MTT細胞增殖測定或來自 Lonza(BaselSwitzerland)的 ViaLight  Assay。同樣感興趣的是天然 C2orfl8 蛋白結合 ANT2的能力。功能等價物的實例包括在天然存在的C2orfl8蛋白氨基酸序列中替換、刪除、添 加或插入了一個或多個氨基酸的多肽。或者，所述多肽可以包括如下的氨基酸序列，其 與各自蛋白的序列具有至少大約80%同源性(也稱作序列同一性)，更優選地至少大約 90%-95%同源性，甚至更優選地99%同源性。在其它實施方案中，多肽可以由這樣的 多核苷酸編碼，其在嚴格條件下可以和天然存在的C2orfl8基因核苷酸序列雜交。
            
本發明的多肽可以在氨基酸序列、分子量、等電點、是否存在糖鏈、或者形式上有差異，這取決于用于產生它的細胞或宿主或者所用的純化方法。然而，只要它與本 發明的人類C2orfl8蛋白具有等價的功能，它就處于本發明的范圍內。詞組“嚴格(雜交)條件”是指如下的條件，在該條件下核酸分子與其靶序 列雜交，典型地在復雜的核酸混合物中，但不會與其它序列發生可檢測的雜交。嚴 格條件是序列依賴的，在不同的環境下會不同。較長的序列在更高的溫度下特異雜 交。 在 Tijssen, Techniques in Biochemistry and MolecularBiology—Hybridization with Nucleic Probes, " Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)中有關于核酸雜交的詳盡指導。一般地，嚴格條件選擇為在限定的離子 強度pH下，比特定序列的熔點(Tm)低大約5-10°C。Tm是在平衡狀態下有50%的與靶 標互補的探針與靶序列雜交的溫度(在限定的離子強度、pH和核酸濃度)(因為靶序列過 量存在，所以在Tm下，平衡時有50%的探針占據)。嚴格條件還可以通過添加去穩定劑 如甲酰胺加以實現。為了選擇性或特異性雜交，陽性信號至少是背景的2倍，優選地是 背景雜交的10倍。嚴格雜交條件的實例包括如下50%甲酰胺，5xSSC，和1%SDS， 在42攝氏度溫育，或者5xSSC，1% SDS,在65攝氏度溫育，用0.& SSC和0.1 % SDS 在50攝氏度清洗。在本發明的內容中，用于分離編碼與人類C2orfl8蛋白功能等價的多肽的DNA 的雜交條件可以由本領域技術人員常規地進行選擇。例如，雜交可以如下地實施，使 用“Rapid-hyb緩沖液“(Amersham LIFE SCIENCE)在68°C實施預雜交30分鐘或者更 長，添加標記探針，并在68°C溫育1小時或者更長時間。隨后的清洗步驟可以在例如低 嚴格條件下實施。低嚴格條件的實例可以包括42攝氏度，&SSC，0.1% SDS,優選地 50攝氏度，&SSC，0.1% SDS0高嚴格條件經常被優選地使用。高嚴格條件的實例可 以包括在室溫下用2x SSC，0.01% SDS清洗三次，每次20分鐘，然后在37攝氏度用Ix SSC, 0.1% SDS清洗三次，每次20分鐘，在50攝氏度用Ix SSC，0.1% SDS清洗兩次， 每次20分鐘。然而，多種因素，例如溫度和鹽濃度，會影響雜交的嚴格性，本領域的技 術人員能夠適當地選擇這些因素以獲得所需的嚴格度。一般地，已知修飾蛋白質中的一個或多個氨基酸不會影響蛋白的功能。實際 上，突變的或經修飾的蛋白質，具有通過對某氨基酸序列進行替換、刪除、插入和/或 添加一個或多個氨基酸殘基而進行修飾的氨基酸序列的蛋白質，已知可以保留原始的 生物活性(Mark et al.，Proc Natl Acad Sci USA 81  5662-6 (1984) ； Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10  6487-500 (1982) ； Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79  6409-13(1982))。因此，本領域的技術人員會認識到，對氨基酸序列進行的 改變單個氨基酸或少量氨基酸的單獨添加、刪除、插入或替換，或那些被視為“保守修 飾”的修飾(其中蛋白質改變所產生的蛋白具有相似的功能)，是本發明內容可以接受 的。只要蛋白質保持該活性，則氨基酸突變的數目沒有特定限制。然而，一般優選 地改變氨基酸序列的5%或者更少。因此，在一個優選實施方案中，在這樣的突變體中被 突變的氨基酸的數目一般是30個氨基酸或者更少，優選地20個氨基酸或者更少，更優選 地10個氨基酸或者更少，更優選地6個氨基酸或者更少，甚至更優選地3個氨基酸或者更少被突變的氨基酸殘基優選地被突變成不同的氨基酸，但氨基酸側鏈的性質保守 (這個過程稱作保守氨基酸替換)。氨基酸側鏈的性質的實例是疏水氨基酸(A，I，L， M，F，P, W，Y，V),親水氨基酸(R，D，N，C，E，Q, G，H, K，S，T)，和共 同具有如下官能團或性質的側鏈脂肪族側鏈(G，A，V，L，I，P)；含羥基側鏈(S， T，Y)；含硫原子側鏈(C，M)；含羧酸和酰胺側鏈(D，N，E，Q)；含堿基側鏈(R， K，H)；和含芳香族側鏈(H，F，Y，W)。提供功能相似氨基酸的保守替換表是本領域 眾所周知的。例如，下面的8組，每一個所含的氨基酸彼此是保守替換的1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；
            
 
            
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；5)異亮氨酸⑴，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(見例如 Creighton，Proteins 1984)。這些保守修飾的多肽包含在在本發明的內容中，只要它們保留天然C2orfl8蛋白 的生物活性，就把它們視為“C2orfl8多肽”。然而，本發明并不僅限于此，C2orfl8多 肽可以包括非保守修飾，只要保留C2orfl8蛋白的至少一種生物活性即可(例如促進細胞 增殖)。而且，被修飾的蛋白質不排除多態性變異體、種間同源物和由這些蛋白的等位基 因編碼的蛋白。而且，本發明的C2orfl8基因包括如下的多核苷酸，其編碼C2orfl8蛋白的功能 等價物。除了雜交之外，基因擴增方法，例如聚合酶鏈式反應(PCR)方法，也可用于分 離編碼與C2orfl8蛋白功能等價的多肽，其使用根據蛋白編碼DNA (SEQ ID NO: 11)的 序列信息合成的引物。分別與人類C2orfl8基因和蛋白功能等價的多核苷酸和多肽通常 與原始的核苷酸或其氨基酸序列具有高同源性。“高同源性”典型地是指同源性為40% 或者更高，優選地60%或者更高，更優選地80%或者更高，甚至更優選地90%-95% 或者更高。特定多核苷酸或多肽的同源性可以通過如下的算法加以確定“Wilbur andLipman, Proc Natl Acad Sci USA 80  726-30 (1983)“。^^ 本發明還提供了針對C2orfl8的抗體，或這些抗體的免疫活性片段。這些抗體 可用于檢測C2orfl8的特異表達。在本發明的內容中，使用特異針對C2orfl8的多克隆 抗體進行免疫組織化學分析確證了其在胰腺癌細胞內的過表達，而在正常成人生命器官 (心臟、肺、腎臟、肝臟和腦)中則沒有或者僅有非常有限的表達。因此，本發明的抗 體可用于檢測來自受試者的組織活檢中的C2orfl8蛋白，診斷C2orfl8相關疾病，例如 胰腺癌如PDAC，和治療這些疾病。而且，本發明的抗體可用作對C2orfl8進行功能分 析的有用的工具。本發明的抗體可以通過使用具有在CRAAGQSDSSVDPQQPF(SEQID NO  5)禾口 / 或 AEESEQERLLGGTRTPINDAS (SEQ ID NO  6)中提出的氨基酸序列 的C2orfl8片段加以制備。因此，本發明包括如下的抗體，其可識別由氨基酸序列CRAAGQSDSSVDPQQPF (SEQ ID NO  5)和 / 或 AEESEQERLLGGTRTPINDAS (SEQ ID
            
NO 6)構成的表位。更具體地，在優選實施方案中，本發明的抗體可識別或結合包含 氨基酸序列SEQ ID NO  5或SEQ ID NO  6的多肽。這里使用的術語“抗體”涵蓋天然存在的抗體以及非天然存在的抗體，包括例 如單鏈抗體、嵌合、雙功能和人源化抗體，及其抗原結合片段(例如Fab'，F(ab' )2， Fab, Fv 和 rlgG)。另見 Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (PierceChemical Co., Rockford, IL)。 另見例如 Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W.H.Freeman & Co., NewY0rk(1998)。這些非天然存在抗體可以用固相肽合成法構建，可以重組產生或者可 以通過例如篩選由可變重鏈和可變輕鏈構成的重組庫加以獲得，如Huse et al.，Science 246 1275-81(1989)所述，本文引用其內容作為參考。這些和其它制作例如嵌合、 人源化、CDR-移植(grafted)、單鏈和雙功能抗體是本領域技術人員所熟知的(Winter and Harris, Immunol.Today 14  243-6(1993) ； Wardetal., Nature 341  544-6(1989)； Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York, 1988 ； Hilyard et al.， Protein Engineering  A practical approach (IRL Press 1992)； Borrebaeck, Antibody Engineering, 2d ed. (Oxford University Press 1995),本文弓 I用上述每 一篇文獻的內容作為參考。術語“抗體”同時包括多克隆和單克隆抗體。該術語還包括遺傳工程化的形 式，例如嵌合抗體(例如人源化鼠抗體)和異源綴合物(heteroconjugate)抗體(例如雙 特異性抗體)。該術語還指示重組單鏈Fv片段(scFv)。術語抗體還包括雙價或雙特異 性分子、雙抗體(diabodies)、三抗體(triabodies)和四抗體(tetrabodies)。雙價和雙特異 性分子在例如下列文獻中有公開Kostelny et al.(1992)J Immunol 148  1547，Pack and Pluckthun (1992) Biochemistry 31  1579，Holliger et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA.90  6444，Graber et al.( 1994) JImmunol : 5368，Zhu et al. (1997) Protein Sci 6 : 781，Huet al. (1997) Cancer Res.56  3055，Adams et al. (1993) Cancer Res.53  4026，和 McCartney, et al. (1995) Protein Eng.8 : 301。典型地，抗體具有重鏈和輕鏈。每個重鏈和輕鏈包含一個恒定區和一個可變區 (這些區域也稱作“結構域”)。輕鏈和重鏈可變區含有4個“框架”區，這四個區之間 被三個超變區隔斷，這些超變區也稱作“互補決定區”或“CDR”。框架區和CDR的 范圍已被鑒定。不同輕鏈或重鏈框架區的序列在同一物種內相對保守。抗體的框架區， 即構成輕鏈和重鏈的各框架區的集合，幫助CDR在三維空間中定位和對齊。CDR主要負責對抗原的表位的結合。每條鏈的CDR典型地稱作CDRl，CDR2 和CDR3(從N端開始依次編號)，通常還用特定CDR所在的鏈來標識。因此，VH CDR3 位于其所在的抗體的重鏈的可變域中，而VL CDRl是來自其所在的抗體的輕鏈可變域的 CDRl。所謂“VH”是指抗體免疫球蛋白重鏈(包括Fv，scFv或Fab的重鏈)的可變 區。所謂“VL”是指免疫球蛋白輕鏈(包括Fv，scFv, dsFv或Fab的輕鏈)的可變 區，。詞組“單鏈Fv”或“scFv”是指如下的抗體，其中傳統雙鏈抗體的重鏈和輕鏈 的可變域被連接形成一條鏈。典型地，在兩條鏈之間插入接頭肽，以便允許適當地折疊和產生活性結合位點。“嵌合抗體”是這樣的免疫球蛋白分子，其中(a)恒定區或其一部分被改變、替換或交換，從而使抗原結合位點(可變區)與不同的或改變的類型、效應器功能和/或物 種的恒定區連接，或者與可為嵌合抗體提供新的性質的完全不同的分子例如酶、毒素、 激素、生長因子、藥物等連接；或(b)可變區或其一部分被改變、替換或交換，使得可 變區具有不同的或改變的抗原特異性。“人源化抗體”是這樣的免疫球蛋白分子，其含有極少的來自非人類免疫球 蛋白的序列。人源化抗體包括人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體互補決定區 (CDR)的殘基被來自非人類物種(供體抗體)例如小鼠、大鼠或家兔的具有期望特異 性、親和性和能力的CDR的殘基替換。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv框架殘基 被相應的非人類殘基替換。人源化抗體也可以包括在受體抗體和引入的CDR或框架 序列中均不存在的殘基。一般地，人源化抗體包括基本上全部的至少一個，典型地兩 個，可變域，其中全部或基本上全部的相應于非類人免疫球蛋白的CDR區以及全部或 者基本上全部的框架(FR)區是人類免疫球蛋白的共有序列。人源化抗體優選地還包括 至少一部分免疫球蛋白恒定區(Fe)，典型地是人免疫球蛋白(Jones etal.，Nature321  522-5(1986) ； Riechmann et al.，Nature 332  323-7(1988)；和 Presta，Curr.Op.Struct. Biol.2  593-6(1992))。人源化可以基本上按照Winter及其同事的方法實施(Jones et al., Nature 321  522-5(1986) ； Riechmann et al.，Nature332  323-7(1988) ； Verhoeyen etal., Science 239  1534-6(1988))，用嚙齒動物的一個或多個CDR序列替換人抗體的相 應序列。因此，這些人源化抗體是嵌合抗體(美國專利No.4,816,567)，其中完整人類可 變域的很少一部分被來自非人類物種的相應序列替換。術語“表位”、“抗原性”和“決定簇”是指抗原上抗體所結合的位點。表 位可以由毗鄰的氨基酸形成，也可以由非毗鄰的氨基酸通過蛋白質的三級折疊并列在一 起而形成。由連續氨基酸形成的表位通常在暴露于變性劑時被保留，而由三級折疊形成 的表位通常在用變性劑處理時喪失。表位典型地包括至少3個，更通常地，至少5個或 8-10個處于獨特的空間構型的氨基酸。確定表位空間構型的方法包括例如X-射線晶體 學禾口 2 維核磁共振。見例如 Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66, Glenn E.Morris, Ed(1996)。術語“非抗體結合蛋白”或“非抗體配體”或“抗原結合蛋白”可互換使用， 用于表示使用免疫球蛋白骨架的抗體模擬物，包括adnectin、avimer,單鏈多肽結合分子 和抗體樣結合肽模擬物，如下文中將更詳細討論的。已經開發出了其它的以和抗體相似的方式靶定和結合靶標的化合物。這些“抗 體模擬物”中的一些使用非免疫球蛋白骨架作為抗體可變區的替代性蛋白框架。例如，Ladner等(美國專利No.5,260,203)介紹了單多肽鏈結合分子，其具有與 聚集的而在分子水平上分離的抗體輕鏈可變區和重鏈可變區相似的結合特異性。單鏈結 合分子同時包含抗體重鏈和輕鏈可變區的抗原結合位點，二者由肽接頭連接，并折疊成 與包含兩個肽的抗體相似的結構。單鏈結合分子與傳統的抗體相比具有多種優勢，包括 尺寸更小、穩定性更高和更容易修飾。Ku 等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92 (14)  6552-6556(1995))公開了 一種基于色素b562的抗體替代物。Ku等(1995)生成了一個文庫，其中細胞色素b562的兩個環被隨機 化，并被選擇結合牛血清白蛋白。單獨的突變體被發現可以和抗BSA抗體相似地選擇性 結合BSAoLipovsek等(美國專利Nos.6,818,418和7,115,396)公開了一種抗體模擬物，其
            
特征是纖連蛋白或纖連蛋白樣蛋白骨架和至少一個可變環。這些基于纖連蛋白的抗體模擬物名為Adnectin，顯示許多與天然或工程化抗體相同的特性，包括對任何靶定配體的 高親和性和特異性。任何用于發展新的或改良的結合蛋白質的技術均可用于這些抗體模 擬物。這些基于纖連蛋白的抗體模擬物的結構域IgG重鏈可變區的結構相似。因此， 這些模擬物顯示的抗原結合性質在本質和親和力方面與天然抗體相似。而且，這些基于 纖連蛋白的抗體模擬物與抗體或抗體片段相比顯示某些優點。例如，這些抗體模擬物的 天然折疊穩定性不依賴于二硫鍵，因此它們在通常會破壞抗體的條件下保持穩定。此 夕卜，因為這些基于纖連蛋白的抗體模擬物的結構域IgG重鏈相似，所以環隨機化和改組 (shuffling)的過程可以在體外進行，這與抗體的體內親和力成熟過程相似。Beste 等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96 (5)  1898-1903(1999))公開了一種基于脂 籠蛋白骨架的抗體模擬物(Anticalin )。脂籠蛋白由一個β _折疊桶構成，蛋白質末端 具有四個超變環。BeSte(1999)對環進行隨機突變并選擇其對例如熒光素的結合。這些 變異體對熒光素顯示特異的結合，一個變異體與熒光素的結合顯示與抗-熒光素抗體相 似。進一步的分析顯示，所有的隨機位置均可變，表明Anticalin 適合于用作抗體的替 代物。Anticalins 是小的單鏈肽，典型地為160-180個殘基，與抗體相比具有多種優
            
勢，包括生產成本更低、保存穩定性更高和免疫反應更小。Hamilton等(美國專利No.5,770,380)公開了一種合成抗體模擬物，其使用剛性 的杯芳烴(calixarene)非肽有機骨架，與用作結合位點的多個可變肽環連接。所有肽環 相對于彼此均從杯芳烴的同一幾何側面伸出。由于這種幾何構型，這有的環均可用于結 合，從而增加了與配體的結合親和性。然而，與其它抗體模擬物相比，基于杯芳烴的抗 體模擬物并不完全由肽構成，因此它更不容易被蛋白酶攻擊。骨架也不是完全由肽、 DNA或RNA構成，意味著這種抗體模擬物在極端環境條件下相對穩定，并具有長的生命 期。而且，因為基于杯芳烴的抗體模擬物相對小，因此產生免疫響應的可能性降低。Murali 等(Cell.Mol.Biol.49 (2)  209-216(2003))討論了一種用于將抗體減小成 更小的肽模擬物(peptidomimetics)的方法，他們稱作“抗體樣結合肽模擬物”(ABiP)， 其也可以作為抗體的替代物。Silverman 等(Nat.Biotechnol. (2005)，23: 1556-1561)討論了由具有多個結構域
            
的單鏈多肽構成的融合蛋白質，稱作"avimers"。avimer是通過體外外顯子改組和噬 菌體展示從人類細胞外受體結構域發展而來的一類結合蛋白，其對靶分子的親和性和特 異性與抗體在一定程度上相似。所得的多結構域蛋白可以包括多個獨立的結合結構域， 與單表位結合蛋白相比，可表現出提高的親和性(在某些情況下達到亞納摩爾)和特異 性。其它關于構建和使用avimer的方法的細節在例如如下美國專利申請公開中有公開 Nos.20040175756, 20050048512， 20050053973， 20050089932 和 20050221384。
            
出了非免疫球蛋白 蛋白框架之外，還已經用如下化合物模擬了抗體性質，包括 RNA分子和非天然寡聚體(例如蛋白酶抑制劑、苯二氮雜卓、嘌呤衍生物和β-轉角模 擬物)，所有這些均適用于本發明。雙鏈分子本發明還涉及令人驚訝的發現，即抑制C2orfl8的表達可有效抑制癌細胞(包括 胰腺癌所涉及的癌細胞)的細胞生長。本申請書中描述的本發明即部分地基于本發現。如這里所使用的，術語“雙鏈分子”是指可抑制靶基因表達的核酸分子，包括 例如短干擾RNA(siRNA ；例如雙鏈核糖核酸(dsRNA)或小發夾RNA(shRNA))和短干 擾DNA/RNA (siD/R-NA ；例如雙鏈DNA和RNA嵌合體(dsD/R-NA)或小發夾DNA禾口 RNA嵌合體(shD/R-NA))。如這里所使用的，術語“dsRNA”是指兩個彼此具有互補 序列的RNA分子的構建體，它們通過互補序列退火形成雙鏈RNA分子。雙鏈的核苷酸 序列可以不僅包括從靶基因序列蛋白編碼序列選出的“有義”或“反義” RNA，還可以 包括具有從靶基因非編碼區選出的核苷酸序列的RNA分子。如這里所使用的，術語“shRNA”是指具有莖環結構的siRNA，其具有彼此互 補第一和第二區域，即有義鏈和反義鏈。第一和第二區互補程度和取向足以使得兩個區 域之間發生堿基配對，第一和第二區通過環區連接，所述環是由于環區內核苷酸(或核 苷酸模擬物)之間缺乏堿基配對而形成的。ShRNA的環區是有義鏈和反義鏈之間的單鏈 區，可以稱作“間插單鏈”。如這里所使用的，術語“siD/R-NA”是指由RNA和DNA 二者構成的雙鏈多核 苷酸分子，包括RNA和DNA的雜交體和嵌合體，可阻止靶mRNA的翻譯。這里，雜交 體是指如下的分子，其中由DNA構成的多核苷酸和由RNA構成的多核苷酸彼此雜交形成 雙鏈分子；而嵌合體是指構成該雙鏈分子的一條或兩條鏈可以包含RNA和DNA。使用 將siD/R-NA引入到細胞內的標準技術。siD/R-NA包括有義核酸序列(也稱作“有義 鏈”)、反義核酸序列(也稱作“反義鏈”)或兩者。siD/R-NA可以被構建成使得單個 轉錄本同時具有來自靶基因有義和互補的反義核酸序列，例如發夾。siD/R-NA可以是 dsD/R-NA 或 shD/R-NA。如這里所使用的，術語“dsD/R-NA”是指彼此具有互補序列的兩個分子的構 建體，它們通過互補序列退火在一起形成雙鏈多核苷酸分子。兩條鏈的核苷酸序列可以 不僅包括從靶基因序列的蛋白編碼序列選出的“有義”或“反義”核苷酸序列，還包括 具有從靶基因非編碼區域選出的核苷酸序列的多核苷酸。構成dsD/R-NA的兩個分子中 的一個或兩個由RNA和DNA 二者構成(嵌合分子)，或者，一個分子由RNA構成，另 一個由DNA構成(雜合雙鏈)。如這里所使用的，術語“shD/R-NA”是指具有莖環結構的siD/R-NA，其具 有彼此互補的第一區和第二區，即有義鏈和反義鏈。第一和第二區互補和定位的程度充 分，從而在區域之間發生堿基配對，第一和第二區通過環區連接，環得自于于環區內核 苷酸(或核苷酸模擬物)之間缺乏堿基配對。shD/R-NA的環區是有義鏈和反義鏈之間 的單鏈區，可以稱作“間插單鏈”。本發明的雙鏈分子可以含有一個或多個經過修飾的核苷酸和/或非磷酸二酯 連接。本領域眾所周知的化學修飾均能夠增加雙鏈分子的穩定性、可用性和/或細胞攝取。技術人員知道可引入到本發明分子的其他類型的化學修飾(W003/070744 ； W02005/045037)。在一個實施方案中，修飾可用于提供更高的對降解的耐受力或 更高的吸收。這些修飾的實例包括硫代磷酸酯連接、2’ -O-甲基核糖核苷酸(特 別是在雙鏈分子的有義鏈上)、2’ -脫氧-氟核糖核苷酸、2’ _脫氧核糖核苷 酸、“通用堿基”(universal base)核苷酸、5' -C-甲基核苷酸和倒置脫氧堿基摻入 (US20060122137)。在另一個實施方案中，可以使用修飾提高雙鏈分子的穩定性或增加靶定效率。修飾包括雙鏈分子兩條互補鏈之間的化學交聯、雙鏈分子3’或5’端的化學修飾、糖 修飾、核堿基修飾和/或骨架修飾、2-氟修飾的核糖核苷酸和2’ -脫氧核糖核苷酸 (W02004/029212)。在另一個實施方案中，可以使用修飾來增加或降低對靶mRNA和/ 或互補雙鏈分子鏈中互補核苷酸的親和性(W02005/044976)。例如，未修飾的嘧啶核苷 酸可以被2-硫、5-炔基、5-炔基或5-丙炔基嘧啶代替。此外，未修飾的嘌呤可以被 7-脫氮(deza)、7-烷基或7-烯基嘌呤代替。在另一個實施方案中，當雙鏈分子是具有 3’ _突出端(overhang)的雙鏈分子時，3’ -端突出端核苷酸可以被脫氧核糖核苷酸代替 (Elbashir SM et al.，Genes Dev 2001 Jan 15，15 (2)  188-200)。關于進一步的細節，可 見出版文獻例如US20060234970。本發明并不僅限于這些實施例，任何已知的化學修飾 均可用于本發明的雙鏈分子，只要所得的分子保留抑制靶基因表達的能力即可。而且，本發明的雙鏈分子可以同時包括DNA和RNA，例如dsD/R_NA或shD/ R-NA。具體地，由DNA鏈和RNA鏈形成的雜合多核苷酸或DNA-RNA嵌合體多核苷酸 顯示更高的穩定性。可以形成DNA和RNA的混合，即由DNA鏈(多核苷酸)和RNA 鏈(多核苷酸)構成的雜合型雙鏈分子、在任何一條或兩條單鏈(多核苷酸)上同時具有 DNA和RNA的嵌合型雙鏈分子、或類似物，以提高雙鏈分子的穩定性。由DNA鏈和 RNA鏈形成的雜合體可以是有義鏈為DNA而反義鏈為RNA的雜合體，或者相反，只要 它在引入到表達靶基因的細胞內時具有抑制靶基因表達的活性即可。優選地，有義鏈多 核苷酸是DNA，反義鏈多核苷酸是RNA。此外，嵌合型雙鏈分子也可以是兩條有義和反 義鏈均由DNA和RNA構成，或者有義鏈和反義鏈的任何一個由DNA和RNA構成，只 要它在引入到表達靶基因的細胞內時具有抑制靶基因表達的活性即可。為了提高雙鏈分子的穩定性，分子優選地含有盡可能多的DNA，而為了誘導靶 基因表達的抑制，分子需要在一定范圍內是RNA，以誘導充分的表達抑制。作為嵌合型 雙鏈分子的優選實例，雙鏈分子的上游部分區域(即有義或反義鏈內位于靶序列或其互 補序列側翼的區域)是RNA。優選地，上游部分區域是指有義鏈的5’側(5’端)和 反義鏈的3’側(3’端)。也就是說，在優選實施方案中，反義鏈3’端側翼的區域， 或者有義鏈5’端側翼的區域和反義鏈3，端側翼的區域均由RNA構成。例如，本發明 嵌合型或雜合型雙鏈分子包括如下組合。5, -[—DNA—]-3,3' -(RNA)-[DNA]-5'反義鏈，有義鏈5'- (RNA)-[DNA]-3'3' -(RNA)-[DNA]-5'反義鏈，禾口有義鏈5'- (RNA)-[DNA]-3'
            
3' -(---RNA---)-5'反義鏈.上游部分區域優選地是由9-13個核苷酸構成的域，從雙鏈分子有義鏈或反義鏈內的靶序列或與之互補序列的末端開始計數。而且，這些嵌合型雙鏈分子的優選實 例包括這樣的雙鏈分子具有長度為19-21個核苷酸的有義鏈，其中多核苷酸的至少上 游半區(有義鏈的5’側區和反義鏈的3’側區)是RNA，另一個半區是DNA。在這 種嵌合型雙鏈分子中，當整個反義鏈都是RNA時，抑制靶基因表達的效果會大大提高 (US20050004064)。在本發明中，雙鏈分子可以形成發夾，例如短發夾RNA(ShRNA)和由DNA和 RNA構成的短發夾(shD/R-NA)。shRNA或shD/R_NA是一段RNA序列或RNA和DNA 的混合物，形成緊固的發夾轉角，可通過RNA干擾沉默基因表達。shRNA或shD/R-NA 包括位于單條鏈上的有義靶序列和反義靶序列，其中二者被環序列分開。一般地，發夾 結構被細胞機構切割成dsRNA或dsD/R-NA，dsRNA或dsD/R-NA隨后與RNA誘導的 沉默復合體(RISC)結合。該復合體結合并切割與dsRNA或dsD/R-NA的靶序列匹配的 mRNAo針對C2orfl8基因的雙鏈分子(例如"C2orfl8 siRNA")可用于降低該基因的表 達水平。這里，術語“siRNA”是指可阻止靶mRNA翻譯的雙鏈RNA分子。在本發明 的內容中，雙鏈分子由針對C2orfl8基因的有義核酸序列和反義核酸序列構成。該雙鏈分 子被構建成同時包含靶序列的有義和互補反義序列。雙鏈分子可以是dsRNA，shRNA, dsD/RNA 或 shD/RNA。針對C2orfl8基因的雙鏈分子與mRNA的靶區域雜交，即與通常為單鏈mRNA 轉錄本在相應于靶序列的區域結合，藉此干擾mRNA的翻譯，最終降低或抑制由基因編 碼的多肽的產生(表達)。因此，本發明的雙鏈分子可以按照其在嚴格條件下與C2orfl8 基因mRNA特異雜交的能力加以定義。在本發明的內容中，雙鏈分子的長度優選地小于500個，200個， 100個，50個，或25個核苷酸。更優選地，雙鏈分子的長度為19-25個核苷 酸。C2orfl8雙鏈分子的靶核酸序列的實例包括相應于C2orfl8靶序列的寡核 苷酸序列，例如 5 ‘ -GGAGCACAGCTTCCAGCAT-3 ‘ (SEQ ID NO  7)或 5' -GCACGACAGTCAGCACAAG-3‘ (SEQ ID NO  8)。因此，舉例而言，本發明提 供了具有由SEQ ID NO 7或8構成的寡核苷酸序列的雙鏈分子。在雙鏈分子的RNA區 域，靶序列中的核苷酸"t"應當用"U"代替。為了提高雙鏈分子的抑制活性，可以在 反義鏈的3’端添加核苷酸〃 u〃。添加的〃 u〃的數目至少為2個，一般為2-10個， 優選地為2-5個。所添加的”U"在雙鏈分子反義鏈的3’端形成單鏈。由任意核苷酸序列構成的環序列可以位于有義和反義序列之間，以便形成發夾 環結構。因此，本發明還提供了具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]-3'的雙鏈分子，其中[A] 是這樣的寡核苷酸序列，其對應于與C2orfl8基因的mRNA或cDNA的靶序列特異性雜交 的序列。在優選實施方案中，[A]是相應于C2orfl8基因的靶序列的寡核苷酸序列；[B] 是由大約3個到大約23個核苷酸構成的核苷酸序列，[A']是由[A]的互補序列構成的寡 核苷酸序列。[A]區與[A’ ]區雜交，然后形成由[B]區構成的環。環序列的長度優選地 是3-23個核苷酸。環序列可以例如從如下序列構成的組中選出(http://www.ambion.com/techlib/tb/tb 506 .html)  CCC，CCACC，或 CCACACC  JacqueJMetal., Nature 2002， 418  435-8.UUCG  LeeNSetal.，Nature Biotechnology 2002，20: 500-5 ； Fruscoloni P etal.，Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100(4)  1639-44。UUCAAGAGA  Dykxhoorn DM et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology2003, 4  457-67。' UUCAAGAGA(DNA 中的〃 ttcaagaga")‘是特別合適的環序列。而且，由23個核苷酸構成的環序列也提供活性siRNA(Jacque J-M et al., Nature 2002， 418  435-8)。適用于本發明內容的發夾雙鏈分子的實例包括5 ‘ -GGAGCACAGCUUCCAGCAU-[B]-AUGCUGGAAGCUGUGCUCC
            
-3'(用于SEQ ID NO  7的靶序列)；和5 ‘ -GCACGACAGUCAGCACAAG-[B]-CUUGUGCUGACUGUCGUGC-3 ‘(
            
用于SEQ ID NO: 8的靶序列)。具體地，下面的雙鏈分子[lh[13]包含在本發明中[1]包括有義鏈和反義鏈的雙鏈分子，其中有義鏈包含相應于由SEQ ID NO: 7或8構成的靶序列的核苷酸序列，并且其中反義鏈包括與所述有義鏈互補的核苷酸序 列，其中所述有義鏈和所述反義鏈彼此雜交形成所述雙鏈分子，并且其中所述雙鏈分子 在被弓丨入到表達C2orfl8基因的細胞內時可抑制該基因的表達。[2][1]的雙鏈分子，其中所述靶序列包括來自由SEQ ID NO: 11構成的核苷酸序 列的大約19-大約25個連續的核苷酸。[3][2]的雙鏈分子，其中所述雙鏈分子是包括通過單鏈核苷酸序列連接起來的有 義鏈和反義鏈的單核苷酸轉錄本。[4][3]的雙鏈分子，其具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]-3'，其中[A]是包含相應 于SEQID NO: 7或8的序列的寡核苷酸的有義鏈，[B]是由大約3個-大約23個核苷酸 構成的核苷酸序列，[A']是包含相應于[A]序列的互補序列的寡核苷酸的反義鏈。[5][3]的雙鏈分子，其具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]-3'，其中[A]是相應于由作 為靶序列的由SEQIDNO : 7或8構成的序列的核糖核苷酸序列，[B]是由大約3個到大 約23個核苷酸構成的核苷酸序列，[A']是由[A]的互補序列構成的核糖核苷酸序列。[6][1]_[5]的雙鏈分子，其包含RNA。[7][1]-[5]的雙鏈分子，其包含DNA和RNA。[8][7]的雙鏈分子，其是DNA多核苷酸和RNA多核苷酸的雜合體。[9][8]的雙鏈分子，其中有義鏈和反義鏈分別由DNA和RNA構成。[10][7]的雙鏈分子，其是DNA和RNA的嵌合體。[11][10]的雙鏈分子，其中有義鏈中靶序列的5’端區域，和/或反義鏈中靶序 列的互補序列的3’端區域由RNA構成。[12][11]的雙鏈分子，其中RNA區域由9_13個核苷酸構成。[13][1]_[5]的雙鏈分子，其含有3’突出端。本發明的雙鏈分子在下文中將更加詳細地進行描述。合適的雙鏈分子的寡核苷酸序列可以用從Ambion網址可得的計算機設計程序加以設計(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)。該計算機程序根據如
            
下方案選擇用于雙鏈分子合成的核苷酸序列。靶位點選擇1.從目標轉錄本的AUG起始密碼子開始，向下游掃描AA雙核苷酸序列。記 錄每一個AA的出現和其3’毗鄰的19個核苷酸作為潛在靶位點。Tuschl等Genes Cev 1999，13(24)  3191-7不推薦針對5’和3’非翻譯區(UTRs)和靠近起始密碼子的區 域(75個核苷酸內)設計靶序列，因為這里可能富含調節性蛋白的結合位點。UTR結合 蛋白和/或翻譯起始復合體可能干擾內切核酸酶復合體的結合。2.比較潛在靶位點與人類基因組數據庫，并排除任何與其它編碼序列具有顯著 同源性的靶序列。同源性搜索可以用BLSAST實施(Altschul SF et al.，Nucleic Acids Res 1997，25: 3389-402 ； J Mol Biol 1990，215  403-10.)，其可以在NCBI服務器上找到 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。3.選擇合格的靶序列進行合成。在Ambion，優選地可以沿著基因的長度選擇多 個靶序列以進行評估。可以使用將雙鏈分子引入到細胞內的標準技術。例如，可以將C2orfl8的雙鏈 分子以能夠與mRNA轉錄本結合的形式直接引入到細胞內。在這些實施方案中，本發明 的雙鏈分子通常如上文所述的反義分子那樣被修飾。其它的修飾也是可能的，例如已顯 示膽固醇偶聯的雙鏈分子可提高藥理性質(Songet al.，Nature Med 2003，9  347-51)。可選擇地，編碼雙鏈分子的DNA可以被攜帶在載體(下文也稱作'SiRNA載 體')內。這些載體可以通過將靶C2orfl8基因序列克隆到具有操作連接的調節序列(例 如來自小核RNA (snRNA) U6的RNA聚合酶III轉錄單位或人類Hl RNA啟動子)的表達 載體內來制備，調節序列以如下的方式位于序列的側翼，其允許兩條鏈表達(通過DNA 分子的轉錄)(Lee NSetal.，NatureBiotechnology 2002, 20:500-5)。例如，與 C2orfl8 基因mRNA反義的RNA分子被第一啟動子(例如被克隆的DNA的3’ 一側的啟動子序 列)轉錄，而C2orfl8基因mRNA有義鏈的RNA分子由第二啟動子(例如被克隆的DNA 的5’ 一側的啟動子序列)轉錄。有義鏈和反義鏈在體內雜交而產生雙鏈分子構建體， 用于沉默C2orfl8基因的表達。或者，可利用兩個構建體產生單鏈構建體的有義和反義 鏈。在這種情況下，具有二級結構(例如發夾)的構建體作為單個轉錄本被產生，該轉 錄本同時包括靶基因的有義和互補反義序列。具體地，本發明提供了載體，其具有含有義鏈核酸和反義鏈核酸的多核苷酸的 組合中的任一個或兩個，其中所述有義鏈核酸包括SEQ ID NOs: 7或8的核苷酸序列， 并且其中反義鏈包括與所述有義鏈互補的核苷酸序列，其中所述有義鏈和所述反義鏈的 轉錄本彼此雜交，形成所述雙鏈分子，并且其中所述載體在引入到表達C2orfl8基因的細 胞內時可抑制所述基因的表達。 或者，本發明提供了載體，其具有含有義鏈核酸和反義鏈核酸的多核苷酸的組 合中的任一個，其中所述有義鏈核酸包括SEQ ID NOs: 7或8的核苷酸序列，并且其中 反義鏈核酸包括與所述有義鏈互補的核苷酸序列，其中所述有義鏈和所述反義鏈的轉錄 本彼此雜交，形成雙鏈分子，并且其中所述載體在被引入到表達C2orfl8基因的細胞內時 可抑制所述基因的表達。優選地，多核苷酸是長度為大約19-25個核苷酸的寡核苷酸(例如來自SEQID NO: 11的核苷酸序列的連續核苷酸)。更優選地，多核苷酸的組合包括 具有通過單鏈核苷酸序列連接的有義鏈和反義鏈的單核苷酸轉錄本。更優選地，多核苷 酸的組合具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]-3'，其中[A]是具有SEQ IDNO  7或8的核苷 酸序列；[B]為由大約3-大約23個核苷酸構成的核苷酸序列；[A']包括與[A]互補的 核苷酸序列。
            
為了將雙鏈分子載體引入到細胞內，可以使用轉染增強劑。FuGENE6(R0Che diagnostics), Lipofectamine 2000 (Invitrogen) , Oligofectamine (Invitrogen), 禾口 Nucleofector (Wako pure Chemical)可用作轉染增強劑。檢測或診斷胰腺癌的方法在胰腺癌中被活化的數十個基因中，本發明著眼于一個新基因 C2orfl8 (GenBank 登錄號No.NM_017877)，其編碼一個多次跨膜蛋白質。在本文中它 可以和"ANT2BP" (ANT2-結合蛋白)和"PAMP“(胰腺癌線粒體蛋白)互換使用。 RT-PCR、northern印跡、以及使用特異針對C2orfl8的多克隆抗體的免疫組織化學分析證 實，它在胰腺癌細胞中過表達，在正常成人生命器官(心臟、肺、腎臟、肝臟和腦)中不 表達或非常有限地表達。因此，本發明的提供一種檢測、診斷和/或確定受試者體內癌癥(例如胰腺癌) 的存在或發生傾向的方法，該方法確定受試者來源生物樣品(例如組織樣品)中C2orfl8 的表達水平。C2orfl8的表達水平與正常對照水平相比的改變，例如增加，表明受試者罹 患或者具有發生癌癥(例如胰腺癌)的危險。本發明涉及確定(例如測量)C2orfl8基因的表達水平。使用由GenBank 數據 庫中已知序列記錄所提供的信息，可以用本領域普通技術人員眾所周知的技術檢測和測 量C2orfl8基因。例如，序列數據庫記錄內相應于C2orfl8基因的序列可用于構建探針， 用來檢測C2orfl8基因的相應RNA序列，例如在Northern印跡雜交分析中。探針典型地 包含C2orfl8序列的至少10個、至少20個、至少50個、至少100個或者至少200個核苷 酸。作為另一個實例，可使用序列構建引物來特異擴增C2orfl8核酸，例如在基于擴增 的檢測方法(如基于反轉錄的聚合酶鏈式反應)中。作為另一個實例，針對C2orfl8的 抗體，例如抗_C20rfl8多克隆抗體或抗-C2orfl8單克隆抗體可用來進行免疫測定，例如 免疫組織化學分析、western印跡分析或ELISA等。而且，C2orfl8基因的轉錄產物可以通過基于擴增的檢測方法(例如RT-PCR)用 引物進行定量。這些引物還可以根據基因的可得序列信息加以制備。例如，在實施例中 使用的引物(SEQ ID NOs: 3和4)可用于通過RT-PCR進行檢測，但本發明并不僅限于 此。或者，可以檢測翻譯產物用于本發明的診斷。例如，可以確定C2orfl8蛋白的 量。用于確定作為翻譯產物的蛋白質的量的方法包括使用特異識別該蛋白質的抗體或抗 體模擬物的免疫測定方法。抗體可以是單克隆或多克隆的。而且，抗體的任何片段或修 飾(例如嵌合抗體，scFv，Fab, F(ab' )2，Fv等)均可用于檢測，只要該片段保留與 C2orfl8蛋白的結合能力即可。制備這些類型抗體用于檢測蛋白的方法是本領域眾所周知 的，并且本發明可以采用任何方法制備這些抗體和其等價物。作為另一種基于其翻譯產物檢測C2orfl8基因表達水平的方法，可以用針對C2orfl8蛋白的抗體或抗體模擬物通過免疫組織化學分析觀察染色的強度。也就是，觀察 到強染色表明蛋白的存在量增加，同時C2orfl8基因的表達水平高。而且，翻譯產物可以根據其生物學活性加以檢測。具體地說，在本文中， C2orfl8蛋白被證實參與癌細胞的增殖。因此，C2orfl8蛋白的細胞增殖活性可用作生物 樣品中存在C2orfl8蛋白的指征。 然后，將C2orfl8基因在測試細胞群體(例如來自受試者的組織樣品)中的表達 水平與參考細胞群體中該基因的表達水平進行比較。參考細胞群體包括一個或多個所比 較的參數已知的細胞，例如胰腺癌細胞，正常的胰腺細胞或正常的胰腺導管上皮細胞。測試細胞群體與參考細胞群體相比的基因表達水平是否指示癌癥(例如胰腺癌) 或者其傾向，取決于參考細胞群體的組成。例如，如果參考細胞群體由正常細胞(非癌 癥)構成，則測試細胞群體和參考細胞群體的基因表達水平的相似性表示測試細胞群體 不是癌癥或者沒有其危險。相反，如果參考細胞群體是由癌細胞構成的，則測試細胞群 體與參考細胞群體之間基因表達的相似性表示測試細胞群體含有癌細胞。如果C2orfl8基因在測試細胞群體中的表達水平與參考細胞群體中C2orfl8基因 的表達水平相比偏離超過1.1倍、超過1.5倍、超過2.0倍、超過5.0倍、超過10.0倍或更 多倍，則C2orfl8基因在測試細胞群體中的表達水平被認為“改變”或“不同”。測試細胞群體和參考細胞群體之間的差異基因表達可以相對于對照核酸(例如 管家基因)加以標準化。例如，對照核酸是已知不會因細胞的癌癥或非癌癥狀態而改變 的核酸。可利用對照核酸的表達水平來將測試和對照細胞群體內的信號水平標準化。對 照基因的實例包括，但不僅限于，例如β-肌動蛋白、3-磷酸甘油醛脫氫酶和核糖體蛋 白Ρ1。測試細胞群體可以和多個參考細胞群體進行比較。多個參考細胞群體中的各個 群體的已知參數可以是不同的。因此，測試細胞群體可以和已知含有例如胰腺癌細胞的 第一參考細胞群體比較，以及和已知為正常細胞(例如不含胰腺癌細胞)的第二參考細胞 群體比較。測試細胞群體可以包括來自已知含有或者疑似含有癌細胞的受試者的組織或 細胞樣品。測試細胞群體可以從組織活檢獲得，例如身體組織或體液，例如生物液(例如 血液、痰、唾液)。例如，測試細胞群體可以是從疑似患有癌癥(例如胰腺癌)的受試者 獲得的胰腺組織純化的。優選地，測試細胞群體包括上皮細胞。上皮細胞優選地來自已 知是或疑似是癌(例如胰腺癌)的組織。參考細胞群體中的細胞優選地來自和測試細胞群體相似的組織類型。任選地， 參考細胞群體是細胞系，例如胰腺癌細胞系或PDAC細胞系(即陽性對照)或正常非癌細 胞系(即陰性對照)。或者，對照細胞群體可以來自被測試的參數或條件已知的細胞的分 子信息數據庫。被診斷的受試者優選地是哺乳動物。哺乳動物實例包括，但不僅限于，人類、 非人靈長動物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬或牛。或者，根據本發明，可以提供用于檢查受試者狀況的中間結果。這些中間結果 可以和額外的信息組合，以幫助醫生、護士或其它從業人員確定受試者是否罹患癌癥、 例如胰腺癌。
            
或者，本發明還可用于檢測受試者來源組織中的癌性細胞，為醫生提供有用的 信息，以確定受試者是否罹患癌癥，例如胰腺癌。因此，本發明涉及確定(例如測量) 受試者來源樣品(例如胰腺組織樣品)中C2orfl8的水平。在本發明中，用于診斷癌癥 (例如胰腺癌)的方法也包括用于測試或檢測癌癥(例如胰腺癌)的方法。或者，在本發 明中，診斷癌癥還代表顯示受試者中癌癥的疑似、危險或可能性。監視和評估癌癥治療的效力C2orfl8基因在正常和癌性細胞之間差異表達，因此允許對癌癥治療的過程進行 監視，其中上述用于診斷癌癥的方法可適用于監視和評估治療對癌癥(例如胰腺癌)的效 力。具體地，治療對癌癥的效力可以通過確定來自接受治療的受試者的細胞中C2orfl8基 因的表達水平進行評估。如果期望，在不同的時間點，治療前、治療中和/或治療后， 從受試者獲得測試細胞群體。C2orfl8基因的 表達水平可以例如按照上述的方法加以確 定。在本發明的內容中，優選地使用沒有暴露于目標治療的細胞內的C2orfl8基因表達 作為對照水平，與檢測到的表達水平相比較。如果C2orfl8基因的表達水平與從正常細胞或含有非癌細胞(例如非胰腺癌細 胞)的細胞群體確定的對照水平進行比較，則表達水平相似表明目標治療是有效的，表 達水平不同表明治療的臨床結果或預后不利。另一方面，如果比較是針對從癌細胞或含 有癌細胞(例如胰腺癌細胞)的細胞群體確定的對照水平，則表達水平不同表明是有效的 治療，而表達水平相似表明臨床結果或預后不利。而且，可以根據本發明的方法比較C2orfl8基因在治療之前和之后的表達水平， 以評估治療的效力。具體地，將治療后來自受試者的生物樣品中檢測到的表達水平(即 治療后水平)與來自同一受試者的在治療開始前獲得的生物樣品中檢測到的表達水平(即 治療前水平)進行比較。治療后水平與治療前水平相比降低，表明目標治療是有效的， 而治療后水平與治療前水平相比增加或相似則表明臨床結果或預后不利。如這里所使用的，術語“有效”是指治療導致受試者體內被病理上調基因的表 達降低，被病理下調基因的表達增加或者癌的大小、普遍性或轉移潛力降低。當預防性 地應用感興趣的治療時，“有效”是指治療可延緩或防止腫瘤的形成，或者延緩、防止 或減輕該疾病的至少一種臨床癥狀。受試者體內腫瘤狀況的評估可以用標準臨床規程實 施。此外，治療的有效性可以聯合任何已知的用于診斷癌癥的方法加以確定。癌癥 可以通過例如鑒定癥狀性異常，例如體重減輕、腹痛、背痛、食欲不振、惡心、嘔吐和 全身性不適、虛弱和黃疸，來加以診斷。用于檢測、診斷或確定胰腺癌的試劑盒和試劑劑本發明提供了用于檢測、診斷或確定癌癥的試劑盒。優選地，所述癌癥是胰腺 癌，更優選地是PDAC。具體地，試劑盒包括至少一種用于檢測受試者來源生物樣品中 C2orfl8的表達水平的試劑，該試劑可以從下組中選出(a)用于檢測C2orfl8 mRNA的試劑；(b)用于檢測C2orfl8蛋白的試劑；和(c)用于檢測C2orfl8生物活性的試劑。用于檢測C2orfl8 mRNA的合適試劑包括特異結合或鑒定C2orfl8mRNA的核酸，例如具有C20rfl8mRNA的一部分的互補序列的寡核苷酸。這些類型的寡核苷酸的 實例是對C2orfl8 mRNA特異的引物和探針。這些類型的寡核苷酸可以根據本領域眾所 周知的方法加以制備。如果需要，用于檢測C2orfl8 mRNA的試劑可以固定在固體基質上。另一方面，用于檢測C2orfl8蛋白的合適試劑包括針對C2orfl8蛋白的抗體。 抗體可以是單克隆或多克隆的。而且，抗體的任何片段或修飾(例如嵌合抗體，scFv， Fab, F(ab' )2，Fv等)均可用作所述試劑，只要該片段保留與C2orfl8蛋白的結合能力 即可。制備這些類型的用于檢測蛋白質的抗體的方法是本領域眾所周知的，本發明可以 采用任何方法制備這些抗體或其等價物。而且，可以通過直接連接或間接標記技術用信 號發生分子對抗體進行標記。用于標記抗體和檢測抗體與其靶標的結合的標記和方法是 本領域眾所周知的，本發明可以采用任何標記和方法。而且，生物活性可以通過例如測量由于在生物樣品內表達的C2orfl8蛋白所導致 的促細胞增殖活性(cell proliferating activity)加以確定。例如，將細胞在受試者來源生物
            
樣品的存在下培養，然后通過檢測增殖速度或者通過測量細胞周期或集落形成能力，可 以確定生物樣品的促細胞增殖活性。而且，試劑盒可以包含用于結合針對C2orfl8基因的探針或針對C2orfl8蛋白 的抗體的 固體基質和試劑，用于培養細胞的介質和容器，陽性和陰性對照試劑，和用于 檢測針對C2orfl8蛋白的抗體的第二抗體。例如，從具有良好預后和不良預后的受試者 獲得的組織樣品可以用作有用的對照試劑。本發明的試劑盒可以進一步包括其它在商業 和用戶角度看理想的材料，包括緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭、針筒和帶有使用說明的 藥品說明書(package insert)(例如文字、磁帶、CD-ROM等)。這些試劑等可以保存在 具有標簽的容器內。合適的容器包括瓶子、小瓶和試管。容器可以用多種材料制成，例 如玻璃或塑料。作為本發明的一個實施方案，當試劑是針對C2orfl8mRNA的探針時，試劑可以 固定在固體基質(例如多孔條帶(porous strip))上，形成至少一個檢測位點。多孔條帶的 測量或檢測區可包括多個位點，每一個位點含有一種核酸(探針)。測試條帶還可以含有 陰性和/或陽性對照的位點。或者，對照位點可以位于與測試條帶不同的條帶上。任選 地，不同檢測位點可以含有不同量的固定核酸，即，在第一檢測位點有較高的量，在隨 后的位點有較少的量。在添加測試樣品時，顯示可檢測信號的位點的數目可提供樣品中 存在的C2orfl8 mRNA量的定量指示。檢測位點可以配置成任何適合的可檢測的形狀， 典型地呈橫跨測試條帶的橫條(bar)或點(dot)狀。或者，本發明提供了上述用于檢測、診斷或確定胰腺癌存在或發生傾向的試 劑。篩選方法通過siRNA敲低過表達C2orfl8的細胞內的內源C2orfl8可顯著抑制細胞生長， 提示C2orfl8在保持細胞活力中的至關重要作用。而且，進行免疫細胞化學分析和細胞 分級分離隨后進行Western印跡分析的結果提示C2orfl8定位于線粒體，表明C2orfl8可 能參與細胞凋亡或細胞內的能量內穩平衡。這些關于C2orfl8功能和亞細胞定位的發現 提示，C2orfl8可能是用于胰腺癌治療的有前途的分子靶點。
            
因此，本發明提供了篩選用于抑制過表達C2orfl8的細胞的增殖的候選劑和化合物的方法。細胞可以是癌細胞，具體地是胰腺癌細胞，更具體地是PDAC細胞。使 用C2orfl8基因、由該基因編碼的多肽或其片段、或基因的轉錄調節區域，有可能篩選 可抑制該基因表達或由該基因編碼的多肽的生物活性的作用劑或化合物。在本發明的內 容中，所述生物活性可以是細胞增殖活性。這些作用劑或化合物可以作為治療或預防 C2orfl8相關疾病(例如癌癥，如胰腺癌)的藥物的候選作用劑或化合物。因此，本發明 進一步提供了使用C2orfl8基因、由該基因編碼的多肽或其片段、或該基因的轉錄調節區 域來鑒定用于治療或預防C2orfl8相關疾病(例如癌癥，具體地胰腺癌，更具體地PDAC) 的候選作用劑或化合物的方法。通過本發明篩選方法鑒定的作用劑或化合物是可以抑制C2orfl8基因表達或基因 的翻譯產物的活性的作用劑或化合物，并且是預期可有效治療C2orfl8相關疾病(例如癌 癥，具體地胰腺癌，更具體地PDAC)的作用劑或化合物。也就是說，通過本發明鑒定的 作用劑或化合物預期具有臨床利益，并可進一步在動物模型或測試受試者中測試其阻止 過表達C2orfl8的細胞生長的能力。在本發明的內容中，待通過本篩選方法鑒定的作用劑或化合物可以是任何生物 制品、任何化合物或包括數種化合物的組合物。而且，根據本發明篩選方法暴露于細胞 或蛋白質的測試作用劑或化合物可以是單個化合物或多個化合物的組合。當在本方法中 使用多個化合物的組合時，各化合物可以順次或同時被接觸。在本發明的篩選方法中可以使用任何測試作用劑或化合物，例如細胞提取物、 細胞培養上清、發酵微生物產品、海洋生物提取物、植物提取物、純化的或粗蛋白、 肽、非肽化合物、合成微分子化合物(包括核酸構建體，例如反義RNA、雙鏈分子、 siRNA,核酶等)和天然化合物。本發明的測試作用劑或化合物也可以用本領域已知的組 合庫方法中的多種方法中的任一種獲得，包括但不僅限于(1)生物文庫，(2)空間可尋址的平行固相或溶液相文庫，(3)需要去卷積的合成文庫方法，(4)“ 一珠子一化合物(one-bead one-compound)“文庫方法和(5)使用親和色譜選擇的合成文庫方法。生物文庫方法僅限于肽文庫，而其它四種方法可用于肽、非肽寡聚體或化合 物小分子文庫(Lam，Anticancer Drag Des 1997, 12:145-67)。用于合成分子庫的方 法的實例可以在本領域技術中找到(DeWitt et al.，Proc Natl AcadSci USA 1993，90  6909-13 ； Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994，91  11422-6 ； Zuckermann et al., J Med Chem 37  2678-85，1994 ； Cho et al., Sciencel993, 261  1303-5; Carell et al.， Angew Chem Int Ed Engl 1994，33  2059 ； Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994， 33  2061 ； Gallop et al., J MedChem 1994，37  1233-51)。化合物庫可以在溶液中存 在(見Houghten，Bio/Techniques 1992，13:412-21)，或在珠子(Lam，Nature 1991， 354  82-4)、芯片(Fodor，Nature 1993，364  555-6)、細菌(美國專利 5,223,409)、 孢子(美國專禾U 5,571,698 ； 5,403,484,和 5,223,409)、質粒(Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA1992, 89  1865-9)或噬菌體(Scott and Smith, Science 1990，249  386-90 ；Devlin, Science 1990，249  404-6 ； Cwirla et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1990，87  6378-82 ； Felici, J Mol Biol 1991，222  301-10;美國專利申請 2002103360)上存在。
            
通過任何本發明篩選方法鑒定的化合物結構的一部分通過添加、刪除和/或置 換加以改變而得到的化合物，均包含在通過本發明篩選方法獲得的作用劑或化合物中。
            
而且，當被篩選的測試作用劑或化合物是蛋白質或編碼蛋白質的DNA時，可 以確定蛋白質的全氨基酸序列從而推導編碼該蛋白質的核酸序列，或者可以分析所得蛋 白質的部分氨基酸序列，以便根據該序列制備作為探針的寡聚DNA，并用該探針篩選 cDNA文庫以獲得編碼該蛋白質的DNA。所得的DNA可用于制備測試作用劑或化合物， 作為治療或預防癌癥的候選物。
            
I.計算機模擬(In silico)篩選方法
            
可以利用具有所尋求性質的已知化合物的分子結構的信息，和/或被抑制的靶 分子(即C2orfl8)的分子結構的信息，來幫助構建測試化合物文庫。的初步篩選適合于 進一步評估的測試化合物的方法之一，是對測試化合物與其靶標之間的相互作用進行計 算機建模。在本發明中，對測試化合物與C2orfl8之間相互作用的建模可提供對該相互 作用本身的細節的深入認識，并提示破壞該相互作用的可能策略，包括潛在的相互作用 分子抑制劑。
            
計算機建模技術為針對選定分子的三維原子結構的可視化以及會與該分子相互 作用的新化合物的合理設計提供了可能。三維構建典型地依賴于從選定分子的χ-射線晶 體分析或NMR成像而來的數據。分子動力學需要力場數據。計算機圖形系統為預測新 化合物如何連接靶分子，以及實驗操作化合物和靶分子的結構以優化結合特異性提供了 可能。為了預測當分子和化合物之一或二者發生細小改變時分子-化合物相互作用是什 么樣的，需要分子力學軟件和計算密集型計算機，它們通常耦聯著分子設計程序和用戶 之間的用戶友好的、菜單驅動的界面。
            
上文一般性描述的分子建模系統的一個實例由CHARMm和QUANTA程序， Polygen Corporation, Waltham, Mass組成。CHARMm實施能量最小化和分子動力學功 能。QUANTA實施構建、圖形建模和分子結構分析。利用QUANTA可進行分子相互行 為的互動性構建、修飾、和可視化分析。
            
大量文獻回顧了與特定蛋白相互作用的藥物的計算建模，例如Rotivinen，et al.Acta Pharmaceutica Fennica 97, 159-166 (1988) ； Ripka, NewScientist 54—57 (Jun. 16, 1988) ； McKinlayandRossmann, Annu.Rev.Pharmacol.Toxiciol.29, 111-122(1989)； Perry and Davies, Prog Clin BiolRes.291  189-93 (1989) ； Lewis and Dean，Proc.R.Soc. Lond B Biol Sci.236，125-40 and 141-62(1989)；關于核酸組分模型受體的有 Askew，et al., J.Am.Chem.Soc.lll, 1082-90(1989)。
            
其它篩選和圖形描述化合物的計算機程序可以從例如BioDesign，Inc., Pasadena, Calif., Allelix, Inc, Mississauga，Ontario, Canada,禾口 Hypercube，Inc., Cambridge, Ontario。見例如 DesJarlais et al. (1988) J.Med.Chem.31  722-9 ； Meng et al. (1992) J.Computer Chem.13  505-24; Meng et al. (1993) Proteinsl7  266-78; Shoichet et al. (1993) Science 259  1445-50 等公司獲得。
            
一旦鑒定了 C2orfl8的假定抑制劑，便可采用組合化學技術，根據已鑒定假定抑制劑的化學結構構建任意數目的變異體。所得的假定抑制劑、或“測試作用劑”或“測 試化合物”文庫可以用本發明的方法進行篩選，以鑒定可抑制C2orfl8的生物活性的測試 作用劑或化合物。
            
II.基于蛋白質的篩詵方法
            
根據本發明，C2orfl8基因的表達被提示對于過表達該基因的細胞(例如癌細 胞，具體地說胰腺癌細胞，更具體地說PDAC細胞)的生長和/或生存至關重要。因 此，我們考慮可抑制由該基因編碼的多肽的表達或功能的作用劑或化合物可抑制該細胞 的生長和/或生存，從而可用于抑制細胞生長和治療或預防癌癥。因此，本發明提供了 使用C2orfl8多肽鑒定用于抑制細胞生長的候選作用劑或化合物，或者用于治療或預防 C2orfl8相關疾病的候選作用劑或化合物的方法。在本發明中，待抑制生長的細胞的特征 是過表達C2orfl8，例如癌細胞，如胰腺癌細胞，具體地說是胰腺導管腺細胞。C2orfl8 相關疾病的特征是C2orfl8過表達，例如癌癥，如胰腺癌，具體地說是PDAC。
            
除了 C2orfl8多肽之外，多肽的片段也可用在本發明的內容中，只要其保留天然 存在的C2orfl8多肽的至少一種生物學活性即可。
            
多肽或其片段可以進一步與其它物質連接，只要所得的多肽或片段保留原始肽 的至少一種生物活性即可。可用的物質包括肽、脂質、糖和糖鏈、乙酰基、天然和合 成聚合物等。這些種類的修飾可以用于提供額外的功能或使多肽和片段穩定。
            
用于本方法的多肽或片段可以通過傳統的純化方法作為天然存在的蛋白質從自 然界中獲得，或者通過根據所選氨基酸序列化學合成獲得。例如，可適用于合成的傳統 肽合成方法包括
            
1) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966 ；
            
2) The Proteins, Vol.2, Academic Press, New York, 1976 ；
            
3) Peptide Synthesis (in Japanese), Marazen Co., 1975 ；
            
4) Basics and Experiment of Peptide Synthesis (in Japanese)，Marazen Co.，1985 ；
            
5) Development of Pharmaceuticals (second volume) (in Japanese)， Vol.14 (peptide synthesis), Hirokawa，1991 ；
            
6)W099/67288 ；和
            
7) Barany G & Merrifield R.B.，Peptides Vol.2, “ Solid Phase Peptide Synthesis"， Academic Press, New York, 1980，100-118.
            
或者，蛋白質可以利用任何已知用于產生多肽的遺傳工程方法獲得(例如 Morrison J., J Bacteriology 1977, 132  349—51 ； Clark-Curtiss & Curtiss， Methods in Enzymology (eds.Wu et al.) 1983, 101  347-62)   例如，首先，制備多核苷酸，其以可表 達的形式編碼目標蛋白(例如在調節序列包括啟動子的下游)，將其轉化進入合適的宿主 細胞，然后培養宿主細胞產生蛋白質。更具體地，通過將基因插入到用于表達表達外來 基因的載體內，例如pSV2neo，pcDNA I，pcDNA3.1, pCAGGS或pCD8，在宿主(例 如動物)細胞中表達編碼C2orfl8多肽的基因。表達可使用啟動子。任何通用的啟動子 均可采用，包括例如 SV40 早期啟動子(Rigby in Williamson(ed.)，Geneticengineering, vol.3.Academic Press, London, 1982, 83-141), the EF- α 啟動子(Kim et al., Gene 1990，91  217-23)，CAG 啟動子(Niwa et al., Gene 1991，108  193)，RSV LTR 啟動子(Cullen，Methods in Enzymology 1987，152  684-704), Sralpha 啟動子(Takebe et al.，Mol Cell Biol 1988，8  466)，CMV 中早期啟動子(Seed et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1987，84: 3365-9)，SV40 晚期啟動子(Gheysen et al.，J Mol Appl Genet 1982, 1  385-94)，腺病毒晚期啟動子(Kaufman et al., Mol Cell Biol 1989，9  946)，HSV TK 啟 動子等。可以根據任何方法將載體引入宿主細胞內表達C2orfl8基因，例如電穿孔方法 (Chu et al., Nucleic Acids Res 1987，15  1311-26)、磷酸鈣方法(Chen et al., Mol Cell Bioll987, 7  2745-52)、DEAE 葡聚糖方法(Lopata et al.，Nucleic Acids Res 1984，12: 5707-17 ； Sussman et al., Mol Cell Biol 1984，4  1641-3)、脂轉染方法(Derijard B，Cell 1994，7  1025-37) ； Lamb et al., Nature Genetics 1993，5  22—30 ； Rabindran et al., Science 1993，259  230-4)等。
            
C2orfl8蛋白還可以在體外采用體外翻譯系統加以產生。
            
待與測試作用劑或化合物接觸的C2orfl8多肽可以是例如純化的多肽、可溶蛋白 或與其它多肽融合的融合蛋白。
            
II-1.鑒定與C2orfl8多flt結合的作用劑或化合物
            
與蛋白結合的作用劑或化合物很可能改變編碼該蛋白的基因的表達或蛋白的生 物活性。因此，在一個方面中，本發明提供了篩選可抑制細胞生長和治療或預防C2orfl8 相關疾病的作用劑或化合物的方法，其包括如下步驟
            
a)使測試作用劑或化合物與C2orfl8多肽或其功能片段接觸；
            
b)檢測多肽(或片段)與測試作用劑或化合物的結合；和
            
c)選擇與多肽(或片段)結合的測試作用劑或化合物。
            
根據本發明，可以評估測試作用劑或化合物抑制細胞生長和治療或預防C2orfl8 相關疾病的測試作用劑或化合物的治療效果。因此，本發明還提供了篩選用于抑制細胞 生長和治療或預防C2orfl8相關疾病的作用劑或化合物的方法，包括如下步驟
            
a)使測試作用劑或化合物與C2orfl8多肽或其功能片段接觸；
            
b)檢測多肽(或片段)與測試作用劑或化合物的結合；和
            
c)將b)的結合與測試作用劑或化合物的治療效果相關聯。
            
在本發明中，可以將治療效果和測試作用劑或化合物的結合性質相關聯。例 如，當測試作用劑或化合物與多肽(或片段)結合時，該測試作用劑或化合物可以被鑒定 或選擇作為具有治療效果的候選作用劑或化合物。或者，當測試作用劑或化合物不與多 肽(或片段)結合時，測試作用劑或化合物可以被鑒定為沒有顯著治療效果的作用劑或化 合物。測試作用劑或化合物與C2orfl8多肽的結合可以例如通過使用針對多肽的抗體進 行免疫沉淀加以檢測。因此，為了進行這種檢測，優選地，用于篩選的C2orfl8多肽或 其功能片段含有抗體識別位點。用于篩選的抗體可以是識別本發明C2orfl8多肽的抗原 性區域(例如表位)的抗體，其制備方法是本領域眾所周知的，并且任何方法均可在本發 明中用于制備這類抗體或其等價物。
            
或者，C2orfl8多肽或其功能片段可以被表達成融合蛋白，融合蛋白包括位于其 N或C端的具有特異性已經揭示的針對多肽N或C端的單克隆抗體的識別位點(表位)。 可以使用商業上可獲得的表位-抗體系統(ExperimentalMedicine 1995，13  85-90)。商 品化的載體能夠通過利用其多克隆位點表達與例如半乳糖苷酶、麥芽糖結合蛋白、谷胱甘肽S轉移酶、綠色熒光蛋白(GFP)等融合的融合蛋白，這樣的載體可用于本發 明。而且，本領域還已知這樣的融合蛋白，它們含有小得多的表位，可以通過這對該表 位的抗體進行免疫沉淀而檢測到(ExperimentalMedicine 1995，13: 85-90)。這些表位由 數十個氨基酸構成，從而不改變C2orfl8多肽或其片段性質，它們也可用于本發明。實 例包括，但不限于，多聚組氨酸(His標簽)、流感凝集物HA、人c-myc、FLAG、水泡 性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7標簽)、人類單純皰疹病毒糖蛋白 (HSV-標簽)、E-標簽(單克隆噬菌體上的表位)等。
            
谷胱甘肽S轉移酶(GST)也是眾所周知的可以通過免疫沉淀檢測的融合蛋白的 配對物(counterpart)。當使用GST作為與C2orfl8多肽或其片段融合形成融合蛋白的蛋 白質時，融合蛋白可以用針對GST的抗體或特異結合GST的物質，即例如谷胱甘肽(例 如谷胱甘肽-Sepharose 4B)加以檢測。
            
在免疫沉淀中，通過向C2orfl8多肽和測試作用劑或化合物的反應混合物添加 抗體(識別C2orfl8多肽或其自身的功能片段，或多肽或片段標記的表位)而形成免疫 復合物。如果測試作用劑或化合物具有結合多肽的能力，那么所形成的免疫復合物將由 C2orfl8多肽、測試作用劑或化合物和抗體構成。相反，如果測試作用劑或化合物沒有這 種能力，那么所形成的免疫復合物僅包括C2orfl8多肽和抗體。因此，測試作用劑或化 合物與C2orfl8多肽的結合能力可以通過例如測量所形成免疫復合物的大小來檢查。任 何用于檢測物質大小的方法均可使用，包括色譜、電泳等。例如，當使用小鼠^G抗體 進行檢測時，可以使用蛋白A或蛋白G sepharose定量所形成的免疫復合物。
            
關于免疫沉淀的更多細節，見例如Harlow etal.，Antibodies, Cold SpringHa rbor Laboratory publications, New York, 1988, 511-52。
            
而且，用于篩選可與之結合的測試作用劑或化合物的C2orfl8多肽或其功能片段 可以和載體結合。可用于結合多肽的載體實例包括不溶性多糖，例如瓊脂糖、纖維素和 葡聚糖；以及合成樹脂，例如聚丙烯酰胺、葡聚糖和硅膠；優選地，可以使用由上述材 料制備的商業可獲得的珠子和平板(例如多孔板、生物傳感器芯片等)。當使用珠子時， 可以將它們填充到柱子內。或者，在本領域還已知磁珠的使用，使用磁珠能夠通過磁性 容易地分離結合在珠子上的多肽和測試作用劑或化合物。
            
多肽與載體的結合可以根據常規的方法進行，例如化學鍵合和物理吸附。或 者，多肽可以通過特異識別蛋白質的抗體結合于載體上。而且，多肽與載體還可以借助 相互作用的分子(例如親和素和生物素的組合)來結合。
            
使用這些結合于載體的C2orfl8多肽或其功能片段的篩選方法包括例如如下步 驟使測試作用劑或化合物與載體結合的多肽接觸，孵育混合物，清洗載體，和檢測和 /或測量與載體結合的作用劑或化合物。結合可以在緩沖液中進行，緩沖液例如但不限于 磷酸緩沖液和Tris緩沖液，只要緩沖液不抑制結合即可。
            
使用這些載體結合的C2orfl8多肽或其功能片段的篩選方法的實例包括親和色 譜。例如，C2orfl8多肽可以被固定在親和柱的載體上，將含有至少一種測試作用劑或化 合物的溶液施加給柱子。在加載測試作用劑或化合物之后，清洗柱子，然后用合適的緩 沖液洗脫與多肽結合的測試作用劑或化合物。
            
使用表面等離子體共振現象的生物傳感器可以用作檢測或定量本發明結合作用劑或化合物的手段。當使用這種生物傳感器時，C2orfl8多肽與測試作用劑或化合物的相 互作用可以作為表面等離子體共振信號實時得到觀察，只需使用極少量的多肽，且無需 標記(例如BIAcore，Pharmacia)。因此，有可能用生物傳感器例如BIAcore評估多肽與 測試作用劑之間的結合。
            
通過使分子暴露于固定在載體上的特定蛋白，從合成化合物中篩選或在天然物 質文庫或隨機噬菌體肽展示庫中篩選與特定蛋白結合的分子的方法，或者基于組合化學 技術的高通量篩選方法(Wrighton et al.，Science 1996，273  458-64 ； Verdine, Nature 1996，384 11-3)來分離蛋白質以及化合物的方法，也是本領域技術人員公所周知的。 這些方法也可以用于篩選與C2orfl8蛋白或其片段結合的作用劑或化合物(包括激動劑和 拮抗劑)。
            
當測試作用劑或化合物是蛋白質時，本發明的方法可以使用例如West-Western 印跡分析Mkolnik etal.，Cell 1991，65:83-90)。具體地，與C2orfl8蛋白結合的蛋白質可以通過下述方式獲得從預期表達至少一種與C2orfl8多肽結合的蛋白質的細胞、 組織、器官或培養細胞(例如胰腺癌細胞)制備第一 cDNA文庫，用噬菌體載體(例如 ZAP)在LB-瓊脂糖上表達由cDNA文庫的載體所編碼的蛋白質，將表達的載體固定在濾 膜上，使純化并標記的C2orfl8多肽與上述濾膜反應，然后根據C2orfl8多肽的標記檢測 表達C2orfl8多肽所結合的蛋白的噬菌斑。
            
標記物質，例如放射性同位素(例如4，14C, 32P, 33P, 35S, 125I, 131I) >酶(例 如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、β -半乳糖苷酶、α -葡萄糖苷酶)、熒光物質(例 如熒光素異硫氰酸酯(FITC)、若丹明)和生物素/親和素，可用于標記本發明方法中的 C2orfl8多肽。當蛋白質用放射性同位素標記時，檢測或測量可以通過液體閃爍進行。或 者，當蛋白質用酶標記時，可以通過添加酶的底物用吸收光度計檢測底物的酶學變化， 例如顏色產生，來檢測或測量。此外，當使用熒光物質作為標記時，結合蛋白可以用熒 光光度計進行檢測或測量。
            
而且，與蛋白結合的C2orfl8多肽可以通過利用特異結合C2orfl8多肽，或者特 異結合與C2orfl8多肽融合的蛋白或多肽(例如GST)的抗體進行檢測和測量。在本發明 篩選中使用抗體的情況下，抗體優選地用上述的標記物質之一進行標記，并基于該標記 物質進行檢測和測量。或者，可以使用針對C2orfl8多肽的抗體作為第一抗體，用標記 有標的底物的第二抗體進行檢測。而且，在本篩選中與C2orfl8多肽結合的抗體可以用 蛋白G或蛋白A柱加以檢測或測量。
            
或者，在本發明篩選方法的另一個實施方案中，可以使用利用細胞的雙雜 交系統(〃 MATCHMAKER Two-Hybrid system “， “ MammalianMATCHMAKER Two-HybridAssayKit"， “ MATCHMAKER one-Hybridsystem" (Clontech) ； “ Hybri ZAP Two-Hybrid Vector System" (Stratagene) ； thereferences“ Dalton et al., Cell 1992, 68: 597-612〃 和〃 Fields etal.，Trends Genet 1994，10: 286-92")。在雙雜交系統中， C2orfl8多肽或其片段與SRF結合區或GAL4結合區融合，并在酵母細胞中表達。從預 期表達至少一種與C2orfl8多肽結合的蛋白質的細胞制備cDNA文庫，從而使該文庫在表 達時與VP16或GAL4轉錄激活區融合。然后，將cDNA文庫引入到上述酵母細胞中， 從檢測到的陽性克隆分離文庫來源的cDNA(當與C2orfl8多肽結合的蛋白在酵母細胞內表達時，兩者的結合會激活報告基因，使陽性克隆可以被檢測到)。由CDNA編碼的蛋 白質可以通過將所上面分離到的CDNA引入到大腸桿菌中并表達該蛋白加以制備。
            
作為報告基因，除了 HB3基因之外，可以使用例如Ade2基因、IacZ基因、CAT基因、螢光素酶基因等。
            
由本篩選鑒定的作用劑或化合物是C2orfl8多肽激動劑或拮抗劑的候選物。術語 “激動劑”是指可通過與多肽結合激活多肽功能的分子。而術語“拮抗劑”是指可以通過與多肽結合抑制多肽功能的分子。而且，通過本篩選作為拮抗劑分離的作用劑或化合 物是可以在體內抑制C2orfl8多肽與分子(包括核酸(RNA和DNA)和蛋白質)之間相互 作用的候選物。
            
II-2. iSi寸徹丨丨C2orfl8碰刪編牛糊乍膽丨·勁勿
            
根據本發明，證明了 C2orfl8基因的表達對過表達C2orfl8的細胞，例如癌細 胞，具體地胰腺癌細胞，更具體地PDAC細胞，的生長和/或生存至關重要。因此，可 阻礙或抑制C2orfl8基因翻譯產物的表達或生物功能的作用劑或化合物被認為可用作抑制 細胞生長的候選作用劑或化合物，或者用于治療或預防C2orfl8相關疾病的候選作用劑或 化合物。因此，本發明還提供了使用C2orfl8多肽或其片段來篩選用于抑制細胞生長的候 選作用劑或化合物或者用于治療或預防C2orfl8相關疾病的候選作用劑或化合物的方法， 其包括如下步驟
            
a)使測試作用劑或化合物與C2orfl8多肽或其功能片段接觸；和
            
b)檢測步驟a)中多肽或片段的生物活性。
            
根據本發明，可以對抑制細胞生長的測試作用劑或化合物或者用于治療或預防 C2orfl8相關疾病的候選作用劑或化合物的治療效果進行評估。因此，本發明還提供了使 用C2orfl8多肽或其片段篩選可抑制細胞生長的候選作用劑或化合物或者用于治療或預防 C2orfl8相關疾病的候選作用劑或化合物的方法，其包括如下步驟
            
a)使測試作用劑或化合物與C2orfl8多肽或其功能片段接觸；和
            
b)檢測步驟a)中多肽或片段的生物活性；和
            
c)將b)的生物活性與測試作用劑或化合物的治療效果相關聯。
            
在本發明中，治療效果可以和C2orfl8多肽或其功能片段的生物活性相關聯。 例如，當與不存在該測試作用利或化合物時檢測到的水平相比，測試作用劑或化合物阻 礙或抑制C2orfl8多肽或其功能片段的生物功能時，測試作用劑或化合物可以被鑒定或選 擇為具有治療效果的候選作用劑或化合物。或者，當測試作用劑或化合物不妨礙或抑制 C2orfl8多肽或其功能片段的生物活性時，測試作用劑或化合物可以被鑒定為沒有顯著治 療效果的作用劑或化合物。
            
任何多肽均可用于篩選，只要它具有C2orfl8多肽的一種生物學功能，可以用作 本發明篩選方法的指標即可。因為C2orfl8多肽具有促進癌細胞之細胞增殖的能力，所 以可以用作篩選指標的C2orfl8多肽的生物學活性包括人類C2orfl8多肽的這種細胞增殖 活性。例如，可以使用人類C2orfl8多肽，也可以使用與其功能等價的多肽，包括其功 能片段。這些多肽可以被內源表達，或者由合適的細胞外源表達。
            
當待在本發明檢測的生物活性是細胞增殖活性或抗細胞凋亡活性時，可以通過 例如如下方法進行檢測制備表達C2orfl8多肽或其功能片段的細胞，在測試作用劑或化合物的存在下培養細胞，和確定細胞增殖的速度，測量細胞周期等，以及通過檢測傷口 愈合活性，進行基質膠(Matrigel)侵襲測定和測量集落形成活性。
            
根據本發明的一個方面，篩選在上面的步驟(b)之后進一步包括步驟C)選擇 與不存在該測試作用劑或化合物時檢測到的生物活性相比，抑制多肽生物活性的測試作 用劑或化合物。
            
而且，通過與對不表達C2orfl8細胞的效果相比較，可以確認候選作用劑或化合 物對C2orfl8的特異性。如果候選作用劑或化合物能夠在表達C2orfl8的細胞中起效，而 在不表達C2orfl8的細胞中不起效，則候選作用劑或化合物對C2orfl8具有特異性。通過 本篩選分離的作用劑或化合物是C2orfl8多肽拮抗劑的候選作用劑或化合物，因此是抑制 多肽與分子(包括核酸(RNA和DNA)和蛋白質)之間的體內相互作用的候選作用劑或化 合物。
            
除了細胞增殖活性或抗細胞凋亡活性之外，C2orfl8蛋白還具有對ANT2蛋白的 結合活性。因此，本發明還提供了用于篩選可抑制C2orfl8與ANT2之間結合的作用劑 或化合物的方法。可抑制C2orfl8與ANT2之間結合的作用劑或化合物預期可以抑制癌 細胞的增殖，因此可用于治療或預防癌癥。因此，本發明還提供了用于篩選可抑制癌細 胞增殖的候選作用劑或化合物的方法，和用于篩選用于治療或預防癌癥的候選作用劑或 化合物的方法。
            
更具體地，該方法包括如下步驟
            
(a)在測試作用劑或化合物的存在下，使C2orfl8蛋白與ANT2蛋白接觸； 
            
 (b)檢測C2orfl8與ANT2蛋白之間的結合水平；
            
(c)比較C2orfl8和ANT2蛋白之間的結合水平與不存在該測試作用劑或化合物 時檢測到的水平；和
            
(d)選擇可降低C2orfl8和ANT2蛋白之間結合水平的測試作用劑或化合物作為 可抑制C2orfl8與ANT2蛋白之間結合的作用劑或化合物，即可用于抑制癌細胞增殖和治 療或預防癌癥的候選作用劑或化合物。
            
根據本發明，可以對測試作用劑或化合物對抑制細胞生長的治療效果或者候選 作用劑或化合物對治療或預防C2orfl8相關疾病的治療效果進行評價。因此，本發明還 提供了用于篩選可抑制癌細胞增殖的候選作用劑或化合物的方法，和用于篩選用于治療 或預防癌癥的候選作用劑或化合物的方法。更具體地，該方法包括如下步驟
            
(a)在測試作用劑或化合物的存在下，使C2orfl8蛋白與ANT2蛋白接觸；
            
(b)檢測C2orfl8與ANT2蛋白之間的結合水平；
            
(c)比較C2orfl8和ANT2蛋白之間的結合水平與不存在該測試作用劑或化合物 時檢測到的水平；和
            
(d)將C)的結合水平與測試作用劑或化合物的治療效果相關聯。
            
在本發明中，可以將治療效果和C2orfl8與ANT2蛋白的結合水平相關聯。例 如，當與不存在測試作用劑或化合物時檢測到的水平相比，測試作用劑或化合物降低 C2orfl8與ANT2蛋白的結合水平時，測試作用劑或化合物可以被鑒定或選擇作為具有治 療效果的候選作用劑或化合物。或者，當與不存在測試作用劑或化合物時檢測到的水平 相比，測試作用劑或化合物沒有降低C2orfl8與ANT2蛋白的結合水平時，測試作用劑或化合物可以被鑒定或選擇作為沒有顯著治療效果的候選作用劑或化合物。
            
在本發明的內容中，兩個蛋白的“結合的抑制”是指至少降低蛋白質之間的結 合。因此，在一些情況下，樣品中結合對的百分比與合適(例如沒有用測試作用劑處理 的)的對照樣品相比將會降低。結合蛋白的量可以是對照樣品中結合蛋白的量的例如 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 25%, 10%, 5%, 1 %或者更少(例如 0% )。
            
這里，C2orfl8蛋白和ANT2蛋白可以包括如上所述的這些蛋白的功能等價物。 用于篩選的C2orfl8或ANT2蛋白或其功能等價物可以通過本領域技術人員眾所周知的 方法作為重組蛋白或天然蛋白加以制備。蛋白質可以通過任何已知的用于產生肽的遺 傳工程方法獲得(例如 Morrison J.，JBacteriology 1977，132  349-51 ； Clark-Curtiss & Curtiss, Methods inEnzymology (eds.Wu et al.) 1983, 101  347-62)。例如，重組蛋白可以 通過如下方法加以制備將編碼該蛋白的DNA (例如具有SEQ ID NO: 11 (用于C2orfl8) 或25(用于ANT2)的核苷酸序列的DNA)插入到合適的表達載體內，將載體引入到合適 的宿主細胞，在合適的培養介質中溫育宿主細胞，獲得宿主細胞的提取物，然后對提取 物進行色譜分離，例如離子交換色譜、反相色譜、凝膠過濾或利用固定有針對該蛋白質 的抗體柱的親和色譜，或者通過多個上述柱子的組合，純化出蛋白質。
            
另外，當可用于本發明內容的蛋白質在宿主細胞內(例如動物細胞和大腸桿 菌)作為與谷胱甘肽S轉移酶蛋白的融合蛋白或者作為附加了多個組氨酸的重組蛋白表 達時，所表達的重組蛋白可以用谷胱甘肽柱或鎳柱純化。在純化融合蛋白之后，如果需 要，還可能通過用凝血酶或因子-Xa切割除去除目標蛋白之外的區域。
            
天然蛋白可以通過本領域技術人員已知的方法加以分離，例如通過使親和柱與 表達該蛋白質的組織或細胞提取物接觸，其中在親和柱中結合有與如上所述的C2orfl8或 ANT2蛋白結合的抗體。抗體可以是多克隆抗體、單克隆抗體或任何修飾抗體，只要它 結合C2orfl8或ANT2蛋白即可。
            
C2orfl8或ANT2蛋白或其功能等價物也可以利用體外翻譯系統在體外產生。
            
進一步，C2orfl8或ANT2蛋白的部分肽也可以用于本發明，只要它們保留彼此 之間的結合活性即可。這些部分肽可以通過遺傳工程方法、已知的肽合成方法、或者用 合適的肽酶消化天然C2orfl8或ANT2蛋白來產生。對于肽合成，可以使用例如固相合 成或液相合成。可用于合成的傳統肽合成方法包括
            
1) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966 ；
            
2) The Proteins, Vol.2, Academic Press, New York, 1976 ；
            
3) Peptide Synthesis (日文)，Marazen Co.，1975 ；
            
4) Basics and Experiment of Peptide Synthesis (in Japanese)，Marazen Co.，1985 ；
            
5) Development of Pharmaceuticals (second volume)(曰 文)， Vol.14 (peptidesynthesis), Hirokawa, 1991 ；
            
6)W099/67288 ；和
            
7) Barany G.& Merrifield R.B., Peptides Vol.2, “ Solid Phase Peptide Synthesis"，Academic Press, New York, 1980，100-118.
            
多肽或其片段可以進一步與其它物質相連，只要該多肽或片段保留其原來的彼 此之間結合的能力即可。可用的物質包括肽、脂質、糖和糖鏈、乙酰基、天然和合成聚合物等。可以實施這些類型的修飾以賦予多肽額外的功能或使和片段穩定。
            
在測試作用劑或化合物存在下進行接觸的C2orfl8和ANT2多肽或其功能等價物 可以是，例如，純化的多肽、可溶蛋白或與其它多肽融合的融合蛋白。
            
本發明的篩選方法提供了高效而快速的鑒定方法，可以鑒定很可能干擾C2orfl8 與其結合配偶ANT2之間的結合的測試作用劑或化合物。一般地，任何可以確定測試作 用劑或化合物干擾這種結合的能力的方法均適用于本發明。例如，可以采用ELISA形 式的競爭和非競爭性抑制測定。應當進行對照實驗以確定系統的最大結合能力(例如使 C2orfl8與ANT2接觸，并確定與C2orfl8結合的ANT2的量)。
            
作為鑒定可抑制蛋白間結合的作用劑或化合物的方法，可以使用本領域技術人 員眾所周知的許多方法。這些鑒定可以作為體外測定系統實施，例如在細胞系統中實 施。更具體地，首先，C2orfl8或其配偶體ANT2與支持物結合，然后使另一蛋白與測試 作用劑或化合物一起與之接觸。接著，溫育混合物，清洗，并檢測和/或測量與支持物 結合的另一蛋白。
            
可用于結合蛋白質的支持物的實例包括不溶性多糖，例如瓊脂糖、纖維素和葡 聚糖；和合成樹脂，例如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅橡膠(silicon)；優選地可以使用由 上述材料制成的商業可獲得的珠子和平板(例如多孔板、生物傳感器芯片等)。當使用珠 子時，可以將它們填充到柱子內。或者，磁珠的使用也是本領域已知的，使用磁珠能夠 容易地通過磁力分離結合在珠子上的蛋白質。
            
蛋白與支持物的結合可以根據常規的方法進行，例如化學鍵合和物理吸附。或 者，可以通過特異識別該蛋白的抗體使蛋白與支持物結合。此外，還可以借助相互作用 的分子，例如親和素與生物素的組合，來實現蛋白與支持物的結合。
            
蛋白間的結合在緩沖液中實施，緩沖液例如但不僅限于，磷酸鹽緩沖液和Tris 緩沖液，只要該緩沖液不抑制蛋白間的結合即可。
            
在本發明中，可以使用利用表面等離子體共振現象的生物傳感器作為檢測或定 量結合蛋白的裝置。當使用這種生物傳感器時，蛋白之間的相互作用可以作為表面等離 子體共振信號實時地得到觀察，僅需使用極少量的多肽并且無需標記(例如BIAcore， Pharmacia)。因此，有可能使用生物傳感器例如BIAcore評估C2orfl8與ANT2之間的結口 O
            
或者，可以標記C2orfl8或ANT2，而且結合蛋白的標記物可以用來檢測或測量 結合蛋白。具體地說，在預標記某種蛋白質之后，在測試作用劑或化合物的存在下使被 標記的蛋白與其它的蛋白接觸，然后在清洗之后根據標記物檢測或測量結合蛋白。
            
放射性同位素(例如3H, 14C, 32P, 33P, 35S, 125I, 1311)、酶(例如堿性磷酸 酶、辣根過氧化物酶、半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶)、熒光物質(例如熒光素異 硫氰酸酯(FITC)、熒光黃、德州紅(Texas red)、綠色熒光蛋白和若丹明)、磁珠(例如 DYNABEADS )、量熱標記(calorimetric label)(例如膠體金或有色玻璃或塑料(例如聚 苯乙烯、聚丙烯、乳膠(latex)等)球珠)、和生物素/親和素等標記物質，可用于在本 發明方法中標記蛋白。如下專利教導了這些標記的使用，包括美國專利3,817,837、 3,850,752、3,939,350、3,996,345, 4,277,437、4,275,149 和 4,366,241。然而，本發明并不 僅限于此，任何可以通過光譜學、光化學、生物化學、免疫化學、電學、光學或化學手段檢測到的標記均可使用。
            
當蛋白用放射性同位素標記時，檢測或測量可以通過液體閃爍實施。或者，用 酶標記的蛋白質可以通過添加酶的底物用吸收光度計檢測底物的酶學變化，例如顏色產 生，加以檢測或測量。而且，在使用熒光物質作為標記的情況下，結合蛋白可以用熒光 光度計加以檢測或測量。
            
而且，本篩選方法中的結合還可以用針對C2orfl8或ANT2的抗體加以檢測或測 量。例如，在使固定在支持物上的C2orfl8與測試作用劑或化合物和ANT2接觸之后， 溫育混合物并清洗，并可以用針對ANT2的抗體進行檢測或測量。或者，可以將ANT2 固定在支持物上，并可以使用針對C2orfl8的抗體作為檢測抗體。
            
當在本篩選中使用抗體時，抗體優選地用上面提到的一種標記物質標記，并根 據該標記物質進行檢測或測量。或者，針對C2orfl8或ANT2的抗體可以用作第一抗體， 然后用標記有標記物質的第二抗體檢測第一抗體。而且，在本發明篩選中與蛋白結合的 抗體可以用蛋白G或蛋白A柱加以檢測或測量。
            
或者，在本發明鑒定方法的另一個實施方案中，可以使用利用細胞的雙雜交系 統(〃 MATCHMAKERTwo-Hybridsystem"，“ MammalianMATCHMAKERTwo-Hybrid Assay Kit “， “ MATCHMAKER one-Hybridsystem “ (Clontech) ； “ HybriZAP Two-Hybrid Vector System “ (Stratagene)；參考文獻"Dalton and Treisman, Cell 1992, 68: 597-612〃， “ Fields and Sternglanz, Trends Genet 1994, 10: 286-92〃)。在雙 雜交系統中，例如，C2orfl8與SRF結合區或GAL4結合區融合，并在酵母細胞中表達。 ANT2與VP16或GAL4轉錄激活區融合，在測試作用劑或化合物的存在下也在酵母細胞 中表達。或者，可以將ANT2和SRF結合區或GAL4結合區融合，而將C2orfl8與VP16 或GAL4轉錄激活區融合。當測試作用劑或化合物不抑制C2orfl8和ANT2間的結合時， 兩者的結合激活報告基因，使陽性克隆可以被檢測。作為報告基因，除了 HB3基因之 外，也可以使用例如Ade2基因、LacZ基因、CAT基因、螢光素酶基因等。
            
這里，C2orfl8與ANT2間的結合水平還可以作為C2orfl8與ANT2結合后發生 的任何變化而被測量。具體地，這種篩選可以通過使測試作用劑或化合物與表達C2orfl8 和ANT2的細胞(例如J82或UMUC細胞)接觸來實施。例如，可以檢測對細胞增殖的 抑制，以確定測試作用劑或化合物對C2orfl8與ANT2結合的影響。
            
1.競爭測定模式
            
競爭測定可以用于篩選本發明的測試作用劑或化合物。例如，競爭ELISA形 式可以包括與固體支持物結合的C2orfl8 (或ANT2)。 結合的C2orfl8 (或ANT2)與 ANT2(或C2orfl8)和測試作用劑或化合物溫育。經過足夠長時間以允許測試作用劑或 化合物和/或ANT2 (或C2orfl8)與C2orfl8 (或ANT2)結合之后，對底物進行清洗，除 去未結合的材料。然后確定與C2orfl8結合的ANT2的量。這可以用多種本領域已知的 方法中的任何一種實現，例如通過使用標記有可檢測標簽的ANT2(或C2orfl8)物質，或 者通過使經過清洗的底物與針對ANT2 (或C2orfW)的被標記抗體接觸。與C2orfl8 (或 ANT2)結合的ANT2 (或C2orfl8)的量與測試作用劑或化合物干擾C2orfl8與ANT2結合 的能力成反比。Harlow & Lane，Antibodies, ALaboratory Manual (1988)中介紹了包括抗 體和標簽在內的標準方法。
            
在一種變化形式中，用親和標簽標記C2orfl8(或ANT》。然后將被標記的 C2orfl8 (或ANT2)與測試作用劑或化合物和ANT2 (或C2orfl8) —起溫育，然后免疫沉 淀。然后用針對ANT2 (或C2orfl8)的抗體對免疫沉淀物進行Western印跡。與前面的 競爭試驗形式相同，被檢測與C2orfl8 (或ANT2)結合的ANT2 (或C2orfl8)的量與測試 作用劑或化合物干擾C2orfl8與ANT2結合的能力成反比。
            
2.非競爭測定樽式
            
對于構建為不易用例如在本文中描述的競爭性測定進行篩選的形式的測試作用 劑或化合物文庫，非競爭結合測定也可以用于初始篩選。這種文庫的一個實例是噬菌體 展示文庫(見例如 Barrett etal.，Anal Biochem 1992，204  357-64)。
            
使用噬菌體庫是因為能夠快速產生工作量的多種不同重組肽。噬菌體文庫不適 合進行本發明的競爭測定，但可以有效地以非競爭模式進行篩選，確定哪種重組肽作為 與C2orfl8或ANT2結合的測試作用劑或化合物。對于在非競爭模式中鑒定的測試作用劑 或化合物，隨后可以用本領域眾所周知的任何方法來制備，并進一步用競爭測定模式進 行篩選。噬菌體和細胞展示文庫的制備和篩選是本領域眾所周知的，在例如下列文獻中 有討論Ladner et al.，WO 88/06630 ； Fuchs et al.，Biotechnology 1991，9  1369-72 ； Gowardetal., TIBS 1993，18: 136-40 ； Charbit etal., EMBO J 1986，5  3029-37; Cull etal., PNAS USA 1992, 89: 1865-9; Cwirla etal.，PNAS USA 1990, 87: 6378-82。
            
非競爭性測定的一個實例遵循與上面關于競爭測定所說明的相類似的程序，只 是不添加其中一種組分(C2orfl8或ANT》。然而，由于非競爭模式確定與C2orfl8或 ANT2結合的測試作用劑或化合物，需要為每種候選物確定測試作用劑或化合物與同時 C2orfl8和ANT2結合的能力。因此，例如，可以通過下述方法測定測試作用劑或化合 物與固定的C2orfl8的結合清洗掉未結合的測試作用劑或化合物；從支持物上洗脫結 合的測試作用劑或化合物，隨后通過例如質譜、蛋白質定量(Bradford或Lowry測定或確 S^Onm吸光度)對洗脫物進行分析。或者，可以省略洗脫步驟，測試作用劑或化合物 的結合可以通過監視支持物表面上有機層的光譜性質來測定。監視表面光譜性質的方法 包括，但不僅限于，吸光度、反射、透射、雙折射、折射系數、衍射、表面等離子體共 振、橢圓光度(ellipsometry)、共振鏡技術(resonantmirror techniques)、光柵耦合波導技術 (grating coupled waveguide techniques)和多普勒共振光譜，所有這些都是本領域技術人員 已知的。本測定中也可以使用標記的測試作用劑或化合物，以免除對洗脫步驟的需要。 在這種情況下，在清洗掉未結合的材料后，與支持物結合的標記物的量與測試作用劑或 化合物的結合成正比。
            
已經開發了許多眾所周知的機器人系統用于溶液相化學。這些系統包括自動化 工作站，例如由Takeda Chemicanndustries，LTD. (Osaka, Japan)開發的自動化合成裝置 和許多利用機器人臂的機器人系統(Zymate II，ZymarkCorporation，Hopkinton, Mass.； Orca, Hewlett Packard, Palo Alto, Calif.),它們模擬由化學家實施的人工合成操作。 上述的任何裝置均適用于本發明。本領域技術人員顯然能夠想到對這些裝置進行什么 性質的修改和如何實施這樣的修改(如果有的話)，使它們能夠像本文中描述地那樣運 行。此外，相關領域技術人員大量的組合庫本身是可以商業獲得的(見例如ComGenex， Princeton, N.J.，Asinex, Moscow, Ru，Tripos, Inc., St.Louis, MO, ChemStar, Ltd,Moscow，RU，3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences，Columbia，MD，寸乂 O
            
根據本發明的一個方面，本篩選方法必需的組分可以作為試劑盒提供，用于篩 選可抑制C2orfl8和ANT2間結合的作用劑或化合物，或可抑制胰腺癌細胞增殖的作用劑 或化合物，或用于治療或預防胰腺癌的作用劑或化合物。試劑盒可以包含例如C2orfl8多 肽或其功能等價物，和/或ANT2多肽或其功能等價物。進一步，試劑盒可以包括對照 作用劑(陽性和/或陰性)、可檢測的標簽、反應緩沖液、細胞培養介質、篩選所需的容 器、用于實施本方法的使用說明(例如文字、磁帶、VCR、CD-ROM等)等。組分和試 劑可以包裝在不同的容器內。
            
III.基于核苷酸的篩詵方法
            
III-I.使用C2orfl8基因的篩選方法
            
如上面所詳細說明的，通過控制C2orfl8基因的表達水平，可以控制細胞生長或 C2orfl8相關疾病的發生和進展。因此，可以使用C2orfl8基因的表達水平作為指標進行 篩選，鑒定可用于抑制細胞生長或治療或預防C2orfl8相關疾病的候選作用劑或化合物。 在本發明的內容中，這種篩選可以包括例如如下步驟
            
a)使測試作用劑或化合物與表達C2orfl8基因的細胞接觸；
            
b)檢測C2orfl8基因的表達水平；和
            
C)選擇與不存在測試作用劑或化合物時檢測到的水平相比可降低C2orfl8基因的 表達水平的測試作用劑或化合物。
            
根據本發明，可以評估測試作用劑或化合物對抑制細胞生長的治療效果或者候 選作用劑或化合物對治療或預防C2orfl8相關疾病的治療效果。因此，本發明還提供了 用于篩選可抑制癌細胞增殖的候選作用劑或化合物的方法，和用于篩選用于治療或預防 C2orfl8相關疾病的候選作用劑或化合物的方法。
            
在本發明的內容中，這種篩選可以包括例如如下步驟
            
a)使測試作用劑或化合物與表達C2orfl8基因的細胞接觸；
            
b)檢測C2orfl8基因的表達水平；和
            
c)將b)的表達水平與測試作用劑或化合物的治療效果相關聯。
            
在本發明中，可以將治療效果和C2orfl8基因的表達水平相關聯。例如，當與 不存在測試作用劑或化合物時檢測到的水平相比，測試作用劑或化合物可降低C2orfl8基 因的表達水平時，測試作用劑或化合物可以被鑒定或選擇作為具有治療效果的候選作用 劑或化合物。或者，當與不存在測試作用劑或化合物時檢測到的水平相比，測試作用劑 或化合物不降低C2orfl8基因的表達水平時，測試作用劑或化合物可以被鑒定或選擇作為 沒有顯著治療效果的作用劑或化合物。
            
更具體地，所述表達水平可以通過從下組選出的方法進行檢測
            
(a)檢測編碼C2orfl8多肽或其功能等價物的mRNA的量；
            
(b)檢測C2orfl8多肽或其功能等價物的量；和
            
(c)檢測C2orfl8多肽或其功能等價物的生物活性。
            
優選地，表達C2orfl8多肽的細胞的細胞增殖活性可以作為所述生物活性被檢 測。
            
在本發明中，細胞的特征是過表達C2orfl8，例如癌細胞，如胰腺癌細胞，胰腺 導管腺癌(PDAC)細胞。C2orfl8相關疾病的特征是過表達C2orfl8，例如癌癥，如胰腺 癌，具體地胰腺導管腺癌(PDAC)。可以通過使表達C2orfl8基因的細胞與測試作用劑或 化合物接觸，然后檢測C2orfl8基因的表達水平，來鑒定可抑制C2orfl8基因表達的作用 劑或化合物。自然，也可以使用表達該基因的細胞群體代替單個細胞來實施鑒定。與不 存在測試作用劑或化合物時的表達水平相比，存在測試作用劑或化合物時檢測到表達水 平降低，表明測試作用劑或化合物是C2orfl8基因的抑制劑，提示該測試作用劑或化合物 有可能用于抑制癌癥，因此是治療或預防癌癥的候選作用劑或化合物。
            
基因的表達水平可以通過本領域技術人員周知的方法進行估計。C2orfl8基因的 表達水平可以用例如在“實施例”中說明的方法來確定。
            
用于這種鑒定的細胞或細胞群體可以是任何細胞或任何細胞群體，只要它表達 C2orfl8基因即可。例如，細胞或細胞群體可以是或者含有衍生自組織的上皮細胞。或 者，細胞或細胞群體可以是或者含有衍生自癌性細胞的永生細胞，包括來自胰腺癌，例 如PDAC，的永生細胞。表達C2orfl8基因的細胞包括例如從癌癥建立的細胞系(例如 MIA_PaCA2)。而且，細胞或細胞群體可以是或者含有被C2orfl8基因轉染的細胞。
            
本方法允許篩選各種作用劑或化合物，并且特別適合于鑒定功能核酸分子，包 括反義RNA、siRNA等。
            
III-2.使用C2orfl8基因轉錄調節區域的篩選方法
            
根據另一個方面，本發明提供了包括如下步驟的方法
            
a)使測試作用劑或化合物與引入了載體的細胞接觸，其中該載體由C2orfl8基因 的轉錄調節區和在該轉錄調節區控制下表達的報告基因構成；
            
b)檢測所述報告基因的表達或活性；和
            
c)選擇與不存在測試作用劑或化合物時檢測到的水平相比，可降低所述報告基 因的表達或活性的測試作用劑或化合物。
            
根據本發明，可以評估測試作用劑或化合物對抑制細胞生長的治療效果或者治 療或預防C2orfl8相關疾病的候選作用劑或化合物的治療效果。因此，本發明還提供了 用于篩選可抑制癌細胞增殖的候選作用劑或化合物的方法，和用于篩選用于治療或預防 C2orfl8相關疾病的候選作用劑或化合物的方法。
            
在本發明的內容中，這種篩選可以包括例如如下步驟
            
根據另一個方面，本發明提供了包括如下步驟的方法
            
a)使測試作用劑或化合物與引入了載體的細胞接觸，其中該載體由C2orfl8基因 的轉調節區和在該轉錄調節區控制下表達的報告基因構成；
            
b)檢測所述報告基因的表達或活性；和
            
c)將b)的表達水平與測試作用劑或化合物的治療效果相關聯。
            
在本發明中，可以將治療效果和所述報告基因的表達或活性相關聯。例如，當 與不存在測試作用劑或化合物時檢測到的水平相比，測試作用劑或化合物可降低所述報 告基因的表達水平時，測試作用劑或化合物可以被鑒定或選擇作為具有治療效果的候選 作用劑或化合物。或者，當與不存在測試作用劑或化合物時檢測到的水平相比，測試作 用劑或化合物不會降低所述報告基因的表達水平時，測試作用劑或化合物可以被鑒定或選擇作為沒有顯著治療效果的作用劑或化合物。
            
合適的報告基因和宿主細胞是本領域眾所周知的。篩選所需的報告構建體可以 用C2orfl8基因的轉錄調節區域制備，可以根據基因的核苷酸序列信息從基因組文庫獲得 含有轉錄調節區域的核苷酸節段，作為上述C2orfl8基因的轉錄調節區域。
            
轉錄調節區域可以是例如C2orfl8基因的啟動子序列。篩選所需的報告構建體可 以通過將報告基因序列連接于C2orfl8基因的轉錄調節區域來制備。這里的C2orfl8基因 的轉錄調節區域是如下的區域，從起始密碼子到上游至少500bp，優選地上游lOOObp， 更優選地上游5000或lOOOObp。含有轉錄調節區域的核苷酸節段可以從基因組文庫中 分離或者可以通過PCR擴增。鑒定轉錄調節區域的方法以及測定規程是眾所周知的 (Molecular Cloningthird edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press)。 用含有所述報告構建體的載體轉染宿主細胞，并通過本領域眾所周知的方法檢測報告基 因的表達水平或活性(例如使用光度計、吸收光度計、流式細胞儀等)。這里所定義的 “降低表達水平或活性”優選為比不存在化合物時使報告基因的表達水平或活性降低至少10%，更優選地降低至少25%，50%或75%，最優選地降低至少95%。
            
當使用與C2orfl8基因的調節序列(例如啟動子序列)可操作連接的報告基因轉 化細胞時，通過鑒定報告基因產物的表達水平可以鑒定測試作用劑或化合物是抑制還是 提高C2orfl8基因的表達。
            
作為報告基因，可以使用例如本領域眾所周知的例如Ade2基因、IacZ基因、 CAT基因、螢光素酶基因、HIS3基因等。檢測這些基因表達的方法是本領域眾所周知 的。
            
III-3.選擇適合于特定個體的治療劑或化合物
            
不同個體的遺傳構成上的差異會導致他們代謝各種藥物的相對能力不同。對于 在受試者體內被代謝后發揮抗腫瘤作用劑或化合物功能的作用劑或化合物，它們可以通 過誘導受試者細胞中的基因表達模式的變化，使癌癥狀態的特征向非癌癥狀態的基因表 達模式特征改變，從而顯示自身的存在。因此，利用C2orfl8基因，本文中公開了它在 癌性和非癌性細胞間具有差異表達，可以在來自所選受試者的測試細胞群體中對假定的 治療或預防性癌癥抑制劑進行檢測，以確定該作用劑或化合物是否適合于在該受試者體 內抑制癌癥。
            
為了鑒定適合于特定受試者的癌癥抑制劑，將來自受試者的測試細胞群體暴露 于候選治療劑或化合物，并確定C2orfl8基因的表達。在本發明方法的內容中，測試細 胞群體含有表達C2orfl8基因的癌細胞。優選地，測試細胞是上皮細胞。
            
具體地，可以將測試細胞群體在候選治療劑或化合物的存在下溫育，測量測試 細胞群體中C2orfl8基因的表達水平，并與一個或多個參考序型進行比較，例如癌性參考 表達序型、非癌性參考表達序型或不存在該治療劑或化合物時的參考表達序型。
            
與治療劑或化合物接觸的測試細胞群體中與含有癌細胞的參考細胞群體或不存 在該作用劑或化合物的參考細胞群體相比，C2orfl8基因的表達水平降低表明該治療劑或 化合物在該測試細胞群體所來源的受試者體內具有治療潛力。
            
用于抑制細胞生長或治療或預防癌癥的組合物
            
通過本發明任何篩選方法鑒定的作用劑，針對C2orfl8基因的雙鏈分子，和針對C2orfl8多肽的抗體，可抑制或阻礙C2orfl8基因的表達，或C2orfl8多肽的生物活性， 從而抑制細胞增殖。因此，本發明提供了用于抑制細胞生長的組合物或用于治療或預防 C2orfl8相關疾病的組合物，該組合物包括通過本發明任何篩選方法鑒定的作用劑，例如 針對C2orfl8基因的雙鏈分子，或針對C2orfl8多肽的抗體，肽模擬物、化合物或其組 合。在本發明中，細胞的特征是過表達C2orfl8，例如癌細胞，如胰腺癌細胞，具體地是 胰腺導管腺癌(PDAC)細胞。C2orfl8相關疾病的特征是過表達C2orfl8，例如癌癥，如 胰腺癌，具體地是胰腺導管腺癌(PDAC)。本組合物可用于治療或預防C2orfl8相關疾 病，例如癌癥，具體地是胰腺癌，如PDAC。
            
組合物可以作為藥物用于人類和其它哺乳動物，例如小鼠、大鼠、豚鼠、家 兔、貓、狗、綿羊、豬、牛、猴、狒狒和黑猩猩。
            
在本發明的內容中，用于本發明在下文詳述的活性成分(包括篩選到的作用 劑、反義核酸、雙鏈分子、抗體等)的合適藥物制劑包括適合于口服、經直腸、經鼻、 局部(包括含服和舌下)、陰道或腸胃外(包括肌肉內、皮下和靜脈內)給藥的制劑，或 者通過吸入或吹入給藥的制劑。優選地，給藥是靜脈內給藥。制劑可以任選地包裝成離 散的劑量單位。
            
適合于口服給藥的藥物制劑包括膠囊、微膠囊、扁膠囊和藥片，分別含有預定 量的活性成分。合適的制劑還包括粉末、酏劑、顆粒、溶液、懸浮液和乳劑。活性成分 任選地作為大丸劑、藥糖劑或糊劑施加。或者，根據需要，藥物組合物可以非口服，處 于用水或任何其它可藥用的液體配制的無菌溶液或懸浮液的注射劑形式。例如，本發明 的活性成分可以和可藥用的載體或介質，具體地說，無菌水、生理鹽水、植物油、乳化 劑、懸浮劑、表面活性劑、穩定化劑、調味劑、賦形劑、載體(vehicle)、防腐劑、粘合 劑等混合成普遍接受的藥物實踐所需的單位劑量形式。這種制備物中所含活性成分的量 可以在指定的可得范圍內實現合適的劑量。
            
可以摻混在藥片和膠囊中的添加劑的實例包括，但不僅限于，粘合劑例如明 膠、玉米淀粉、黃芪膠(tragacanthgum)和阿拉伯膠；賦形劑例如結晶纖維素；膨脹劑例 如玉米淀粉、明膠和褐藻酸；潤滑劑例如硬脂酸鎂；甜味劑例如蔗糖、乳糖或糖精；和 調味劑例如薄荷、紅珠樹油(Gaultheriaadenothrix oil)和櫻桃(cherry)。藥片可以通過壓 縮或成形(任選地與一種或多種制劑成分一起)制成。壓縮藥片可以通過在合適的機械 內以自由流動形式，例如粉末或顆粒，壓縮活性成分，并任選地與粘合劑、潤滑劑、惰 性稀釋劑、潤滑、表面活性或分散劑混合，來制備。成形藥片的制備可以通過在合適的 機械內成形用惰性液體稀釋劑潤濕的粉末狀化合物。藥片可以根據本領域眾所周知的方 法包衣。任選地還可以配制藥片使活性成分在體內緩慢地或可控地釋放。藥片的包裝可 以含有供每個月服用一片的片劑。而且，當單位劑量形式是膠囊時，除了上面的成分之 外，還可以進一步含有液體載體，例如油。
            
口服液體制備物可以處于例如水性或油性的懸浮液、溶液、乳液、糖漿或酏劑 (elixir)的形式，或者可以制備為干燥產品，用于在使用前用水或其它合適的載體重建。 這種液體制備物可以含有常規的添加劑，例如懸浮劑、乳化劑、非水載體(其可以包括 食用油)或防腐劑。
            
用于腸胃外給藥的制劑包括水成或非水成無菌注射液，其可以含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑(bacteriostats)和使得制劑與預期接受者的血液等滲的溶質；并且水成和 非水成無菌懸浮液可以包含懸浮劑和增稠劑。制劑可以以單位劑量或多劑量容器形式存 在，例如密封的安瓿和小瓶(vial)，并可以保存于冷凍干燥(凍干)條件下，僅需要在即 將使用前添加無菌液體載體，例如鹽、注射用水。或者，制劑可以被制備成用于連續灌 注。臨時使用(Extemp0rane0us)的注射溶液或懸浮液可以用前述種類的無菌粉末、顆粒 或藥片制備。
            
而且，用于注射的無菌組分可以遵循正常的適合于注射的藥物實施方法使用溶 媒(例如無菌水)加以制備。生理鹽水、葡萄糖和其它等滲液體，包括輔助劑，例如 D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化鈉，也可用作注射用水溶液。這些可以和合適 的增溶劑，例如醇如乙醇；多元醇(polyalcohols)如丙二醇和聚乙二醇；和非離子表面活 性劑如聚山梨醇酯80 (TM)和HCO-50。
            
芝麻油或大豆油可以用作油質液體，其可以和作為增溶劑的苯甲酸芐酯或苯甲 醇聯用，并可以和如下物質一起配制，例如緩沖劑如磷酸鹽緩沖劑和乙酸鈉緩沖劑；鎮 痛劑如鹽酸普魯卡因；增溶劑如甲醇和苯酚；和/或抗氧化劑。所制備的注射劑可以被 填充到合適的安瓿中。
            
用于直腸給藥的制劑包括具有標準載體例如可可脂或聚乙二醇的栓劑。用于在 口腔局部給藥(例如向頰或舌下)的制劑包括錠劑(lozenges)，其含有的活性成分置于增 味基料(base)如蔗糖和阿拉伯樹膠或黃芪膠內；和糖錠劑(pastilles)，其含有的活性成分 置于基料如明膠、甘油、蔗糖或阿拉伯樹膠中。為了活性成分的鼻內給藥，可以使用液 體噴霧劑或可分散的粉末或者液滴的形式。液滴可以用水或非水基料制備，基料中還含 有一種或多種分散劑、增溶劑或懸浮劑。
            
為了通過吸入給藥，組合物被方便地用吹藥器(insufflator)、噴霧器、加壓包裝 或其它輸送氣溶膠噴霧的便利裝置給藥。加壓包裝可以包括合適的推進劑，例如二氟二 氯甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適的氣體。在加壓氣溶膠的場 合，劑量單位可以通過提供計量輸送閥門加以確定。
            
或者，為了通過吸入或吹入給藥，組合物可以采用干粉組合物的形式，例如活 性成分與合適粉末基料例如乳糖或淀粉的粉末混合物。粉末組合物可以按照單位劑量形 式處于例如膠囊、針劑、凝膠或氣泡(blister)包裝內，并在吸入器或吹藥器的幫助下施 加該粉末。
            
其它的劑型包括釋放治療劑的可植入裝置和貼劑(adhesive patch)。
            
如果期望，可以將上述制劑進行調整以適于恒定地釋放活性成分再加以采用。 藥物組合物還可以含有其它活性成分，例如抗微生物劑、免疫抑制劑或防腐劑。
            
應當理解，除了上面具體提到的成分之外，本發明的制劑還可以包括其它在本 領域中關于該具體劑型的傳統作用劑，例如適合于口服的制劑可以包括增味劑。
            
優選的單位劑量制劑是含有有效劑量的每種本發明活性成分或其合適組分的制 劑，它們在下文“治療C2orfl8相關疾病的方法” 一節中有敘述。
            
I.含有雙鏈分子的組合物
            
本發明提供了用于阻止細胞生長和/或治療或預防C2orfl8相關疾病的組合物， 其包括任何上述的或者通過上述本發明篩選方法篩選出的雙鏈分子。本發明的雙鏈分子可以適用于抑制細胞生長和預防或治療C2orfl8相關疾病。
            
在一個實施方案中，包含本發明一種或多種雙鏈分子的組合物可以被包裹在輸 送囊泡(delivery vehicle)，例如脂質體中，載體和稀釋劑及其鹽內用于施加給受試者， 和/或可以以可藥用的劑型提供。用于輸送核酸分子的方法在下列文獻中有介紹 Akhtar S & Juliano RL.Trends Cell Biol.l992May ； 2(5)  139-44. ； Delivery Strategies for Antisense OligonucleotideTherapeutics, ed.Akhtar, 1995 ； Maurer N, et al.， Mol Membr Biol.l999Jan-Mar ； 16(1)  129-40. ； Hofland & Huang.Handb Exp Pharmacol. 1999137  165-192。 它進一步介紹了用于輸送核酸分子的一般方法(US 6,395,713和WO 199402595)。這些規程可以用于輸送幾乎任何雙鏈分子。雙鏈分子可以通過多種本領 域技術人員已知的方法施用給細胞，包括但不僅限于，包裹在脂質體內，通過離子電 滲，或者通過摻入到其他囊泡內，例如生物可降解的聚合物、水凝膠、環糊精(見例如 Gonzalez H, etal.，Bioconjug Chem. 1999 Nov-Dec ； 10(6)  1068-74. ； WO 03/47518 和 WO 03/46185)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)和PLCA微球(見例如US 6,447,796 和US 2002130430)、生物可降解的納米膠囊和生物粘性的微球，或者通過蛋白質性載體 (W020005372》。在另一個實施方案中，本發明的雙鏈分子還可以制備或者與聚乙烯亞 胺及其衍生物絡合，例如聚乙烯亞胺-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-GAL)或聚 乙烯亞胺-聚乙二醇-三-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-triGAL)衍生物。在一個實施方 案中，本發明的雙鏈分子如US20030077^9所述地加以制備(即基于液體的制劑)，本文 引用其全部內容作為參考。
            
本發明的雙鏈分子還可以和其它治療化合物一起施加給受試者，以提高整體的 治療效果。使用多種化合物治療病癥可以提高有益的效果，同時降低副作用的發生。
            
在另一個實施方案中，本發明還提供了本發明雙鏈分子在制造用于治療或預防 表達C2orfl8基因的癌癥的藥物組合物中的用途。例如，本發明涉及使用可抑制細胞內 C2orfl8基因表達的雙鏈分子制造用于治療表達C2orfl8基因的癌癥的藥物組合物，該分 子包括彼此雜交形成雙鏈分子并且靶定SEQ ID NO  7或8的序列的有義鏈和與之互補的 反義鏈。
            
在另一個實施方案中，本發明還提供了本發明的雙鏈核酸分子在治療或預防表 達C2orfl8基因的癌癥中的用途。或者，本發明進一步提供了用于制造治療表達C2orfl8 基因的癌癥的藥物組合物的方法或過程，其中該方法或過程包括制備藥物或生理可接受 的載體與抑制細胞內C2orfl8基因表達的雙鏈分子的步驟，該分子包括有義鏈和與之互補 的反義鏈，它們彼此雜交形成該雙鏈分子并靶定SEQ ID NO: 7或8的序列作為活性成 分。
            
在另一個實施方案中，本發明還提供了用于制造用于治療表達C2orfl8基因的癌 癥的藥物組合物的方法或過程，該方法或過程包括將活性成分與藥物或生理可接受的載 體摻混的步驟，其中該活性成分是可抑制細胞內C2orfl8基因表達的雙鏈核酸分子，該 分子包括有義鏈和與之互補的反義鏈，它們彼此雜交形成該雙鏈核酸分子并靶定SEQ ID NO  7或8的序列。
            
II.包括反義核酸的組合物
            
相應于C2orfl8基因核苷酸序列的反義核酸可用于降低在癌細胞中被上調的基因的表達水平，并可用于抑制細胞生長和癌癥治療，因此也包含在本發明內。反義核酸起 作用的方式是通過與C2orfl8基因的核苷酸序列或與之相應的mRNA結合，抑制該基因的 轉錄或翻譯，促進mRNA的降解，和/或抑制由該基因編碼的蛋白質的表達。因此，結 果，反義核酸抑制C2orfl8蛋白在癌細胞內發揮功能。這里，詞組“反義核酸”是指特 異和靶序列雜交的核苷酸，不僅包括與靶序列完全互補的核苷酸，也包括具有一個或多 個核苷酸錯配的核苷酸。例如，本發明的反義核酸包括與C2orfl8基因或其互補序列在至 少15個連續核苷酸的跨度上具有至少70%或者更高，優選地至少80%或者更高，更優選 地至少90%或者更高的同源性的多核苷酸。本領域已知的算法可用于確定這種同源性。
            
本發明的反義核酸通過與基因的DNA或mRNA結合，抑制它們的轉錄或翻譯， 促進mRNA的降解，和抑制蛋白質的表達，最終抑制蛋白質發揮功能，從而對產生由 C2orfl8基因編碼的蛋白的細胞發揮作用。
            
本發明的反義核酸可以通過與合適的對核酸無活性的基料混合而制成外用制備 物，例如擦劑或糊藥。
            
另外，如果需要，本發明的反義核酸可以通過添加賦形劑、等滲劑、增溶劑、 穩定化劑、防腐劑、鎮痛劑等被制備成藥片、粉末、顆粒、膠囊、脂質體膠囊、注射 劑、溶液、滴鼻液和凍干劑。還可以使用負載有反義核酸的介質(antisense-mounting medium)以增加持久性和膜滲透性。實例包括但不僅限于脂質體、聚_L_賴氨酸、脂 質、膽固醇、Iipofectin或它們的衍生物。這可以通過已知的方法加以制備。
            
本發明的反義核酸可抑制C2orfl8蛋白的表達并可用于抑制該蛋白質的生物活 性。此外，可以使用表達抑制劑，包括本發明的反義核酸，因為它們能夠抑制C2orfl8蛋 白的生物活性。
            
本發明的反義核酸包括經過修飾的寡核苷酸。例如，硫代寡核苷酸可用于為寡 核苷酸提供核酸酶抗性。
            
在另一個實施方案中，本發明還提供了本發明反義核酸在制造用于治療表達 C2orfl8基因的癌癥的藥物組合物中的用途。
            
在另一個實施方案中，本發明還提供了本發明反義核酸在治療或預防表達 C2orfl8基因的癌癥中的用途。
            
或者，本發明進一步提供了用于制造用于治療表達C2orfl8基因的癌癥的藥物組 合物的方法或過程，其中該方法或過程包括將藥物或生理可接受的載體與作為活性成分 的本發明反義核酸一起配制的步驟。
            
在另一個實施方案中，本發明還提供了用于制造用于治療表達C2orfl8基因的癌 癥的藥物組合物的方法或過程，其中該方法或過程包括混合活性成分與藥物或生理可接 受的載體的步驟，其中該活性成分是本發明的反義核酸。
            
III.包含抗體的組合物
            
在癌癥中過表達的C2orfl8基因的基因產物的功能可以通過施用與該基因產物結 合或者以其他方式抑制其功能的化合物加以抑制。這種化合物可以包括例如針對C2orfl8 多肽的抗體，該抗體可以用作細胞生長抑制劑或用于治療或預防C2orfl8相關疾病的藥物 組合物的活性成分。
            
本發明涉及針對由C2orfl8基因編碼的蛋白質的抗體或抗體片段的用途。如這里所討論的，術語“抗體”是指上述意思。
            
抗體可以通過與多種分子，例如聚乙二醇(PEG)偶聯進行修飾。本發明包括此 類經過修飾的抗體。經過修飾的抗體可以通過抗體的化學修飾而獲得。這些修飾方法是 本領域的常規方法。
            
或者，用于本發明的抗體可以是嵌合抗體，具有針對C2orfl8多肽的來自非人類 抗體的可變區和來自人類抗體的恒定區，或者是人源化抗體，其由來自非人類抗體的互 補決定區(CDR)、框架區(FR)和來自人類抗體的恒定區構成。這些抗體可以通過使用 已知的技術加以制備。人源化可以通過用嚙齒動物的一個或多個CDR序列替代人類抗體 的相應序列來實現(見例如Verhoeyen etal.，Science 1988，239  1534-6)   因此，這些 人源化抗體是嵌合抗體，其中完整人可變區的很小一部分被替換成來自非人類物種的相 應序列。
            
還可以使用完全人抗體，其包括人類可變區以及人類框架區和恒定區。這些抗 體可以用各種本領域已知的技術產生。例如，體外方法涉及使用在噬菌體上展示的人 類抗體片段的重組文庫(例如Hoogenboom etal.，J MolBiol 1992，227:381-8)。類似 地，可以通過將人類免疫球蛋白座位引入到轉基因動物例如小鼠體內來制備人類抗體， 這樣的動物中內源免疫球蛋白基因被部分或者完全失活。該方法在例如下列美國專利中 有介紹Nos.6,150,584 ； 5,545,807 ； 5,545,806 ； 5,569,825 ； 5,625,126 ； 5,633,425 ；和 5,661,016。
            
當所得的抗體要施加給人類(抗體治療)時，優選地使用人類抗體或人源化抗體 以減少免疫原性。
            
如上所得的抗體可以被純化成均質。例如，抗體的分離和純化可以根據用于 一般蛋白的分離和純化方法來實施。例如，抗體可以通過適當地選擇和組合使用柱色 譜加以分離和純化，例如親和色譜、過濾、超濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝膠電 夕永、等電聚焦等(Antibodies  A LaboratoryManuaLEd Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)),但是并不僅限于此。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作親和柱。 可以使用的蛋白A柱的實例包括例如Hyper D，POROS和Sepharose F.F. (Pharmacia)。
            
除了親和之外，色譜的實例包括例如離子交換色譜、疏水色譜、凝膠過濾、反 才目色譜、吸附色譜等(Strategies for Protein Purification andCharacterization  A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996))。色 譜程序可以通過液相色譜，例如HPLC和FPLC實施。
            
在另一個實施方案中，本發明還提供了本發明抗體在制造用于治療表達C2orfl8 基因的癌癥的藥物組合物中的用途。
            
在另一個實施方案中，本發明還提供了用于治療或預防表達C2orfl8基因的癌癥 的本發明抗體。或者，本發明進一步提供了制造用于治療表達C2orfl8基因的癌癥的藥 物組合物的方法或過程，其中該方法或過程包括將藥物或生理可接受的載體與作為活性 成分的本發明抗體配制的步驟。
            
在另一個實施方案中，本發明還提供了制造用于治療表達C2orfl8基因的癌癥的 藥物組合物的方法或過程，其中該方法或過程包括將活性成分與藥物或生理可接受的載 體混合的步驟，其中該活性成分是本發明的抗體。
            
抑制細胞牛長的方法
            
通過siRNA抑制胰腺癌細胞系中的內源C2orfl8可導致過表達C2orfl8的細胞的 生長被顯著抑制，這提示了 C2orfl8在保持這些細胞生存力中的至關重要的作用。因此， 本發明涉及通過抑制C2orfl8的表達和/或C2orfl8蛋白的活性而抑制細胞生長。C2orfl8 的表達是被，例如，特異靶定C2orfl8基因的雙鏈分子所抑制的。C2orfl8靶序列包括例 如SEQ ID NO: 7或8的核苷酸。在本發明中，細胞的特征是過表達C2orfl8，例如癌細 胞，如胰腺癌細胞，具體地PDAC細胞。
            
這些修飾方法可以離體或者在體外實施(例如通過將細胞與作用劑一起培養)， 或者在體內實施(例如通過向受試者施加作用劑)。這些方法涉及施加蛋白質，或蛋白質 的組合，或者核酸分子，或者核酸分子的組合，作為治療手段來對抗C2orfl8基因的異常 表達或者其基因產物的異常活性。
            
因此，可用于本發明內容的作用劑包括例如
            
(i)由C2orfl8基因編碼的多肽或其類似物、衍生物、片段或同源物；
            
(ii)C2orfl8基因或基因產物的抗體或其片段；
            
(iii)反義核酸或“功能異常(dysfunctional)，，的核酸(即由于C2orfl8基因核酸 內的異源插入)；(siRNA)
            
(iv)雙鏈分子，例如小干擾RNA(SiRNA)；或
            
(ν)調節劑(即可改變C2orfl8多肽與其結合配偶體之間相互作用的抑制劑、拮 抗劑)。
            
利用功能異常反義分子通過同源重組“敲除”多肽的內源功能(見例如 Capecchi, Science 1989, 244  128892)。
            
水平增加可以通過如下的方法容易地檢測到定量細胞內的肽和/或RNA， 并在體外測定RNA或肽的水平、結構和/或所表達肽的活性(或表達被改變的基因的 mRNA)。本領域眾所周知的方法包括，但不僅限于，免疫測定(例如通過Western印跡分 析、免疫沉淀隨后進行十二烷基硫酸鈉6DS)聚丙烯酰胺凝膠電泳、免疫細胞化學等)、 RT-PCR和/或雜交測定以檢測mRNA的表達(例如Northern測定、點印跡、原位雜交等 ο
            
根據本發明的一個方面，可以使用通過本發明篩選到的作用劑。可以使用本領 域技術人員眾所周知的方法施加這些作用劑。如果所述作用劑可以由DNA編碼，則可以 將DNA插入到用于表達該DNA的載體內，并將該載體施加給細胞。為了將雙鏈分子的 載體引入到細胞內，可以使用轉染增強劑。FuGENE6 (Roche diagnostics)，Lipofectamine 2000 (Invitrogen), Oligofectamine (Invitrogen),禾口 Nucleofector (Wako pure Chemical)可用 作轉染增強劑。
            
治療C2orfl8相關疾病的方法
            
治療、減輕或預防C2orfl8相關疾病包括任何下列步驟例如手術除去過表達 C2orfl8的細胞、抑制癌性細胞的生長、退化或萎縮腫瘤、誘導緩解或抑制癌癥發生。 C2orfl8相關疾病的有效治療可降低患有C2orfl8相關疾病的個體的死亡率，改善其預 后，降低血液中腫瘤標志的水平，和減輕與C2orfl8相關疾病相伴的可檢測癥狀。
            
通過siRNA敲低過表達C2orfl8基因的細胞系內的內源C2orfl8可導致細胞生長被顯著抑制，提示C2orfl8在維持這些細胞生存能力方面起著至關重要的作用。因此， 本發明涉及通過抑制C2orfl8的表達和/或C2orfl8蛋白的活性來治療或預防C2orfl8相 關疾病。C2orfl8的表達被，例如，特異靶定C2orfl8基因的雙鏈分子所抑制。C2orfl8 靶序列包括例如SEQ IDNO  7或8的核苷酸。而且，C2orfl8的活性被抗_C2orfl8抗 體或肽模擬物所抑制。在本發明中，C2orfl8相關疾病的特征是過表達C2orfl8，例如癌 癥如胰腺癌，具體地PDAC。
            
在本發明中，抑制性核酸可以作為裸核酸、或者與輸送試劑結合、或者作為表 達該抑制核酸的重組質粒或病毒載體施用給受試者。
            
用于和本發明抑制核酸聯合施用的合適的輸送試劑包括Miras TnmsitTKO親脂試 劑；Iipofectin ； Iipofectamine ； cellfectin ；或聚陽離子(例如聚賴氨酸)，或脂質體。優選的輸送試劑是脂質體。
            
脂質體可以輔助將抑制性核酸輸送到特定的組織，例如視網膜或腫瘤組織，還 可以增加抑制性核酸的血液半衰期。適用于本發明的脂質體用常規的囊泡形成性脂質形 成，此類脂質一般包括中性或帶負電荷的磷脂和固醇例如膽固醇。一般對如下的因素的 考慮指導脂質的選擇，例如期望的脂質體大小和脂質體在血流中的半衰期。已知有多 種方法用于制備脂質體，例如在下列文獻中所述Szoka et al.，Ann Rev Biophys Bioeng 1980，9  467 ；和美國專利Nos.4,235,871 ； 4,501,728 ； 4,837,028 ；和5,019,369，本文引 用其全部內容作為參考。
            
優選地，包裹本發明抑制性核酸的脂質體包括配體分子，其能夠將脂質體輸送 到癌癥部位。與腫瘤細胞中普遍存在的受體結合的配體，例如與腫瘤抗原結合的單克隆 抗體，是優選的。
            
特別優選地，包裹本發明抑制核酸的脂質體被修飾，從而避免被單核巨噬細胞 和網狀內皮系統清除，例如通過具有與結構表面結合的調理作用抑制模塊。在一個實施 方案中，本發明的脂質體可以同時包括調理作用抑制模塊和配體。
            
用于制備本發明的脂質體的調理作用抑制模塊通常是與脂質體膜結合的大型親 水性聚合物。如在本說明書中所使用的，例如，當調理作用抑制模塊化學地或物理地搭 接在膜上時，例如通過脂溶性錨(anchor)插入膜本身，或者通過與膜脂質的活性基團直 接結合，則調理作用抑制模塊與脂質體膜“結合”。這些調理作用抑制性親水性聚合物 形成保護性表層，顯著地減少單核巨噬細胞系統(“MMS” )和網狀內皮系統(” RES” ) 對脂質體的攝入；在例如美國專利第4,920,016號中對此有記載，后者的全部公開內容援 引并入本說明書。因此，與未修飾的脂質體相比，被調理作用抑制模塊修飾過的脂質體 能夠保留在血液循環中的時間顯著更長。出于以上理由，上述脂質體有時也被稱為“隱 形”(stealth)脂質體。
            
已知隱形脂質體蓄積在依靠多孔性或“滲漏性”微血管系統供給的組織中。因 此，在以這樣的微血管系統缺損為特征的靶組織，例如實體瘤中，這些脂質體會高效率 地蓄積。參見 Gabizon 等，Proc Natl Acad Sci USA 1988，18:6949-53。此外，由于 RES的攝入的減少，防止隱形脂質體在肝臟和脾臟中的顯著蓄積，從而降低隱形脂質體 的毒性。因此，用調理作用抑制模塊修飾的本發明的脂質體能夠將本發明的雙鏈核酸分 子輸送至腫瘤細胞。
            
適用于修飾脂質體的調理作用抑制模塊優選為分子量約500 約40,000道爾 頓、更優選約2,000 約20,000道爾頓的水溶性聚合物。這樣的聚合物中包括聚乙二醇 (PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如，甲氧基PEG或PPG、和PEG或PPG硬脂酸 酯；合成聚合物如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；直鏈狀、分枝狀或者樹狀聚酰胺 胺(polyamidoamine)；聚丙烯酸；聚醇(polyalcohols)，諸如化學結合有羧基或氨基的聚 乙烯醇和聚木糖醇，以及神經節苷脂，諸如神經節苷脂GM1。PEG、甲氧基PEG、或甲 氧基PPG或其衍生物的共聚體也是適合的。此外，抑制調理作用的聚合物可以是PEG與 聚氨基酸、多糖、聚酰胺胺、聚亞乙基胺或者多核苷酸中的任何一種的嵌段共聚物。抑 制調理作用的聚合物也可以是含有氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛 酸、甘露糖醛酸、透明質酸、果膠酸、神經氨酸、海藻酸、角叉膠；氨基化多糖類或寡 糖(直鏈狀或者分枝狀)；或者羧基化的多糖或寡糖，例如，通過與碳酸的衍生物反應而 連接了羧基的羧基化多糖類或寡糖。
            
優選地，調理作用抑制模塊是PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG衍生物 修飾的脂質體有時稱作“PEG化脂質體”。
            
調理作用抑制模塊可以通過許多公知技術中的任何一種結合到脂質體膜上。例 如，PEG的N-羥基琥珀酰亞胺酯能夠與磷脂酰乙醇胺脂溶性錨(lipid-soluble anchor)結 合，然后再結合到膜上。相似地，可以通過還原性氨基化，用硬脂酰胺脂溶性錨來將右 旋糖酐聚合物衍生化，所述還原性氨基化中使用Na(CN)BH3和混合溶劑，如60°C的四氫 呋喃與水的30  12比例混合物。
            
上文討論了表達本發明的雙鏈核酸分子的載體。這樣的表達至少一種本發明的 雙鏈核酸分子的載體也可以直接施用或者與合適的投遞試劑組合施用，所述合適的投遞 試劑包括 Miras Transit LTl 親脂性試劑、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin> 聚陽離子(例如聚賴氨酸)或脂質體。將表達本發明的抑制性核酸分子的重組病毒載體輸送到患者 的癌癥區域的方法在本技術領域的技術范圍內。
            
本發明的抑制性核酸可以通過任何適合于將抑制性核酸輸送到癌癥部位的方法 施加給受試者。例如，抑制核酸可以通過基因槍、電穿孔施用，或者通過合適的腸胃外 或腸道(enteral)途徑施用。合適的腸道給藥途徑包括口服、直腸或鼻內給藥。
            
合適的非消化道施用途徑包括靜脈內施用(例如靜脈內推注、靜脈內輸注、動 脈內推注、動脈內輸注和針對血管網絡的導管滴注)，組織周圍和組織內注射(例如腫 瘤周圍和腫瘤內注射、視網膜內注射或視網膜下注射)，皮下注射或沉積，包括皮下輸 注(例如利用浸透壓泵)，直接施用到癌癥區域或其附近，例如借助導管或其它放置裝置 (例如，包含多孔性、非多孔性或明膠狀材料的視網膜片劑(retinal pellet)或栓劑或植入 物)，和吸入。優選通過注射或輸注將雙鏈核酸分子或載體施用到癌癥部位或其附近。
            
本發明的抑制性核酸可以以單劑量或者多劑量施用。當本發明的抑制性核酸通 過輸注施用時，輸注可以是單個持續劑量或者可以通過多次輸注輸送。優選地將作用劑 直接注射到位于癌部位處或其附近的組織內。尤其優選地，將作用劑多次注射到癌部位 處或附近的組織內。
            
本領域的技術人員還可以容易地確定用于將本發明的抑制性核酸施用于給定受 試者的合適劑量方案。例如，抑制性核酸可以一次性地，例如作為單次注射或沉積，施用給受試者癌癥部位處或其附近。或者，抑制性核酸可以每天一次或兩次施用給受試 者，歷時大約3-大約觀天，更優選地大約7-大約10天。在優選的劑量方案中，抑制 性核酸每天一次注射到癌癥部位處或其附近，歷時7天。當劑量方案涉及多次施用時， 應當理解施用給受試者的抑制性核酸的有效量可以包括在整個劑量方案期間施用的抑制 性核酸的總量。
            
分別以基因和基因產物的表達水平或生物活性增加(相對于沒有罹患該疾病或 病癥的受試者)為特征的疾病或病癥可以用拮抗(即減少或抑制)該過表達基因的活性的 治療方法進行治療。拮抗活性的治療方法可以治療性或預防性施用。
            
因此，可以在本發明內容中使用的治療方法包括例如
            
(i)由C2orfl8基因編碼的多肽或其類似物、衍生物、片段或同源物；
            
(ii)C2orfl8基因或基因產物的抗體或其片段；
            
(iii)反義核酸或“功能異常(dysfunctional)，，的核酸(即由于在該過表達基因核 酸內的異源插入)；(SiRNA)
            
(iv)雙鏈分子，例如小干擾RNA(SiRNA)；或
            
(ν)調節劑(即可改變過表達多肽與其結合配偶之間相互作用的抑制劑、拮抗 劑)。
            
功能異常反義分子用于通過同源重組“敲除”多肽的內源功能(見例如 Capecchi, Science 1989, 244  128892)。
            
水平增加可以通過如下的方法容易地檢測到定量肽和/或RNA，通過獲得受 試者組織樣品(例如來自活組織檢查)并在體外測定其中RNA或肽的水平、結構和/或 所表達肽的活性(或表達被改變的基因的mRNA)。本領域眾所周知的方法包括，但不 限于，免疫測定(例如通過Western印跡分析、免疫沉淀隨后進行十二烷基硫酸鈉6DS) 聚丙烯酰胺凝膠電泳、免疫細胞化學等)、和/或雜交試驗以檢測mRNA的表達(例如 Northern測定、點印跡、原位雜交等)。
            
預防給藥發生在疾病明顯臨床癥狀顯現之前，從而使疾病或病癥被防止或者進 程延遲。在本發明的內容中，預防是任何可降低疾病的病死率負擔或發病率的活動。預 防可以在一級、二級和三級預防水平上發生。一級預防避免疾病的發生，二級和三級水 平的預防涵蓋旨在防止疾病進展和癥狀出現，以及通過恢復功能降低已經建立的疾病的 負面影響和減少疾病相關并發癥的活性。因此，本發明包括廣泛的旨在減輕C2orfl8相 關疾病，例如癌癥如胰腺癌，具體地說PDAC，的嚴重程度的治療方法。
            
本發明的治療方法可以包括使細胞與可調節C2orfl8基因產物一種或多種活性的 作用劑接觸的步驟。可調節蛋白活性的作用劑實例包括，但不僅限于，核酸、蛋白質、 這些蛋白的天然存在的同源配體、肽、肽模擬物和其它小分子。
            
因此本發明提供了通過降低C2orfl8基因表達或基因產物活性用于治療或減輕受 試者體內癌癥癥狀或者預防癌癥的方法。本方法具體適合于治療或預防C2orfl8相關疾 病，例如癌癥如胰腺癌，具體地說PDAC。
            
合適的治療劑可以預防性或治療性施用給罹患或者具有發生C2orfl8相關疾病的 危險(易感)的受試者。這些受試者可以通過使用標準的臨床方法加以鑒定，或者通過 檢測C2orfl8基因的異常表達水平(“上調”或“過表達”)或基因產物的異常活性加以鑒定。
            
根據本發明的一個方面，通過本方法篩選得到的作用劑可以用于治療或 預防癌癥。本領域技術人員眾所周知的方法可以用于施用這些作用劑給受試者， 例如作為動脈內、靜脈內或經皮注射或者作為鼻內、經支氣管、肌肉內或口服給 藥。如果所述作用劑由DNA編碼，則可以將DNA插入到用于基因治療的載體內， 并將載體施用給受試者以實施治療。為了將雙鏈分子的載體引入到細胞內，可以 使用轉染增強劑。FuGENE6 (Rochediagnostics)，Lipofectamine 2000 (Invitrogen)， Oligofectamine (Invitrogen)禾口 Nucleofector (Wako pure Chemical)可以有用地作為轉染增強 劑。
            
用于給藥的劑量和方法隨著待治療患者的體重、年齡、性別、癥狀、病癥和給 藥方法而不同；然而本領域的技術人員可以常規地選擇合適的劑量和給藥方法。
            
例如，盡管與C2orfl8多肽結合并調節多肽活性的作用劑的劑量取決于前述的 各種因素，但是當正常成年人(60kg體重)口服時，劑量一般為每天大約O.lmg-大約 IOOmg,優選地每天大約l.Omg-大約50mg，更優選地每天大約l.Omg-大約20mg，。
            
當以注射的形式向正常成年人(60kg體重)腸胃外施用作用劑時，盡管不同的 患者、靶器官、癥狀和給藥方法會出現一些差異，但是方便的是靜脈內注射每天大約 O.Olmg-大約30mg，優選地每天大約O.lmg-大約20mg，更優選地每天大約O.lmg-大約 IOmg的劑量。在其它動物的情況下，合適的劑量可以同歸轉化成60kg體重加以計算。
            
類似地，本發明的藥物組合物可以用于治療或預防癌癥。本領域技術人員眾所 周知的方法可用于將組合物施用給受試者，例如作為動脈內、靜脈內或者經皮注射，或 者作為鼻內、經支氣管、肌肉內或經口給藥。
            
對于每種前述病癥，組合物，例如多肽和有機化合物，可以經口或者通過注射 給藥，劑量范圍為每天大約0.1-大約250mg/kg。成年人的計量范圍一般為大約5mg-大 約17.5g/日，優選地大約5mg-大約IOg/日，最優選地大約IOOmg-大約3g/日。藥片 或其它單位劑量形式的以離散單位提供的藥物可以方便地含有在這種劑量下或者作為多 次劑量下有效的量，例如含有大約5mg_大約500mg，通常大約IOOmg-大約500mg的單 位。
            
所用的劑量取決于多種因素，包括受試者的年齡、體重和性別，待治療的確切 病癥和其它嚴重程度。同時，給藥的途徑也隨著病癥及其嚴重程度而不同。在任何情況 下，合適的和最佳的劑量可以由本領域技術人員通過考慮上述因素常規地計算出來。
            
具體地，針對C2orfl8基因的反義核酸可以通過直接施用到患病部位或者通過注 射到血管內從而到達患病部位而施用給患者。
            
本發明反義核酸衍生物的劑量可以根據患者的病癥和所用的期望量而合適地進 行調節。例如，可以施用的劑量范圍是0.1-100mg/kg，優選地0.1-50mg/kg。
            
[發明模式1]
            
下面，本發明將參考實施例進行更加詳細的介紹。然而，下面的材料、方法和 實施例僅僅是舉例說明本發明的多個方面，并不意圖對本發明的范圍進行限制。因此， 與這里所述相似或等價的方法和材料也可以用于實施或測試本發明。
            
一般方法
            
1.細胞系和臨床樣品
            
PDAC 細胞系 MIA_PaCa2 和 Panc-I，禾PNIH3T3，HEK-293T 和 COS7 細胞購自 ATCC (美國典型培養物保藏中心)。PDAC細胞系KLM-1，PK-59，PK-45P, SUIT-2 和PK-I由東北大學(仙臺，日本)生物醫學研究細胞資源中心提供。所有的Panc-1， KLM-1, PK-59, PK-45P, SUIT-2 禾Π PK-I 細胞系均在 RPMI-1640 (Invitrogen， Carlsbad, CA)中生長，所有的 COS-7，NIH3T3, HEK-293,禾Π MIA_PaCa2 細胞系均 在達爾伯克氏改良伊格爾培養基(DMEM) (Invitrogen)中生長。所有細胞系均在補充有 10%胎牛血清(FBS)和抗生素/抗真菌劑溶液的合適培養基中單層生長，并且保持在 37°C含有5% C02的氣氛中。冷凍的并且石蠟包埋的PDAC組織從手術樣品獲得，手術 樣品是在獲得了合適的知情同意后在大阪癌癥和心血管疾病醫學中心切除的。本研究使 用這些臨床樣品得到了東京大學醫學科學研究所IRB和大阪癌癥與心血管疾病醫學中心 IRB的批準。
            
2.半定量 RT-PCR
            
來自胰腺癌組織的PDAC細胞和正常導管上皮細胞的純化如前所述(Nakamura T，et al.0ncogene.2004 Mar 25 ； 23(13)  2385-400.)。對來自純化 PDAC 細胞和正常胰 腺導管上皮細胞的RNA用基于T7的體外轉錄(Epicentre Technologies, Madison, WI) 進行兩輪RNA擴增，合成單鏈cDNA。用Trizol試劑(Invitrogen)根據制造商推薦的程 序提取來自人類胰腺癌細胞系的總RNA。所提取的RNA用DNase I (Roche Diagnostic, Basel, Switzerland)處理，并用 oligcKdT)引物和 Superscript II 反轉錄酶(Invitrogen)反 轉錄成單鏈cDNA。制備每種單鏈cDNA的合適稀釋物用于隨后的PCR擴增，通過監視 α -微管蛋白(TUBA)作為定量對照物。使用如下的引物序列
            
5' -AAGGATTATGAGGAGGTTGGTGT-3‘ 6EQIDN0:1)禾口
            
5' -CTTGGGTCTGTAACAAAGCATTC-3‘ 6EQ ID NO  2)用于 TUBA，
            
5 ‘ -GGTAGCTCAGTCATAAAACACCG-3 ‘ (SEQ ID NO  3)禾口
            
5 ‘ -GTCTCTCCATCATCCTCACTGTC-3 ‘ (SEQ ID NO  4)用于 C2orfl8(NM_017877)。
            
所有的反應涉及在 GeneAmp PCR system 9700 (ΡΕ Applied Biosystems, Foster,CA)上進行最初94°C變性2η ι，隨后經過23個循環(對于TUBA)或28個循環(對于 C2orfl8)94°C 30s, 55°C 30s,和 72°C 30s。
            
3.Northern 印跡分析
            
用Trizol試劑(Invitrogen)從14個胰腺癌細胞系提取總RNA，并進行Northern 印跡分析。用DNase I (Nippon Gene)處理后，用mRNA純化試劑盒(GE Healthcare， Piscataway, NJ)根據制造商的方案純化mRNA。取1微克來自胰腺癌細胞的每種mRNA 以及從正常成人心臟、肺、肝臟、腎臟、骨髓和胰腺分離的mRNA(BD Biosciences，Palo Alto, CA)在變性瓊脂糖凝膠上進行分析，并轉移到尼龍膜上。將該癌癥膜和人多組 織印跡(Clontech，PaloAlto，CA)與 32P-標記的 C2orf 18 cDNA 雜交 16 小時，其中 32P-標 記的 C2orfl8cDNA 是用 Afcga Label 試劑盒(GE Healthcare)標記的。用引物 5 ‘ -GGTAG CTCAGTCATAAAACACCG-3 ‘ 6EQ ID NO  3)和 5 ‘ —GTCTCTCCATCATCCTCACTGT C-3 ‘ (SEQ ID NO  4)制備C2orfl8 cDNA的-個232bp PCR產物作為探針。預雜交、雜交和清洗的實施按照制造商的使用說明。印跡在-80°C放射自顯影10天。
            
4.C2orf_a,器側一料口免趣織、仆岸械
            
由Sigma-Aldrich日本(石狩，日本)制備了分別對應于C2orfl8蛋白(Genbank 登錄號NP_060347，SEQ ID NO  12)密碼子70-86和密碼子351-371區域的兩條 肽(CRAAGQSDSSVDPQQPF (SEQ ID NO  5)禾口 AEESEQERLLGGTRTPINDAS (SEQID NO  6),用它們的混合物免疫兩只家兔。免疫血清在裝填有可偶聯每種肽抗原的 Affi-Gel 10活化親和介質(Bio-Rad Laboratories，Hercules, CA)的親和柱上根據基本的 方法學進行純化。來自PDAC的常規組織切片從手術樣品獲得，手術樣品是在Osaka癌 癥與心血管疾病醫學中心在獲得了合適的知情同意的前提下切除的。將切片脫蠟，并在 pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液中在108°C下高溫滅菌15η ι。在過氧化物酶阻斷試劑(Dako Cytomation, Carpinteria, CA)中溫育30分鐘以滅活內源過氧化物酶活性。用胎牛血清溫 育封閉之后，將切片用兔抗_C20rfl8多克隆抗體(1  1500稀釋)在室溫下溫育1小時。 用PBS清洗后，用過氧化物酶標記的抗兔免疫球蛋白(Envision kit，Dako Cytomation)進 行免疫檢測。最后，反應物用3，3' - 二氨基聯苯胺(DakoCytomation)顯影。用蘇木 精進行復染。
            
5.C2orfl8特異的小干擾RNA(siRNA)表汰構津體
            
為了下調PDAC細胞內的內源C2orfl8表達，使用psiU6BX3.0載體表 達針對靶基因的短發夾RNA，如前所述(Taniuchi K，et al.Cancer Res.2005 Jan 1 ； 65(1)  105-12.)。U6啟動子被克隆到基因特異序列的上游(來自靶轉錄 本的19-nt序列與該序列的反向互補物被一個短接頭TTCAAGAGA分開)，以 5個胸腺嘧啶作為終止信號，并有一個neo盒子用于遺傳霉素(Invi-trogen)篩 選。C2orfl8 的靶序列是 5 ‘ -GGAGCACAGCTTCCAGCAT-3 ‘ (SEQID NO  7) (#196)，5 ‘ -GCACGACAGTCAGCACAAG-3 ‘ (SEQ ID NO  8) (#574)和 5 ‘ -GTGACTTCCTCTTTATGGA-3 ‘ (SEQ ID NO  9) (#3254)，陰性對照的靶序列是 5' -GAAGCAGCACGACTTCTTC-3 ‘ 6EQ ID NO  10) (siEGFP)。將人 PDAC 細胞 系，MIA_PaCa2和Panc-I細胞，涂布在ΙΟ-cm平板上，并分別用#196，#574，#32  或siEGFP siRNA表達載體用FuGENE6 (Roche)根據制造商的使用說明進行轉染。細胞 用 0.8mg/ml (用于 MIA_Paca2)，或 1.0mg/ml (用于 Panc-Ι)遺傳霉素(Invitrogen)進行 篩選。在轉染7天后收集細胞，通過用上述引物進行則RT-PCR對C2orfl8的敲低效果 進行分析。在含有遺傳霉素的合適培養基中培養9天后，將細胞用100%甲醇固定，用 0.1%結晶紫-H20染色，進行集落形成測定。
            
在3- ，5-二甲基-2-噻唑)_2，5_ 二苯基溴化四唑(MTT)測定中，在轉染 11天后，用細胞計數試劑盒_8(DOJINDO，熊本，日本)測量細胞存活能力。用酶標儀 550 (Bio-Rad)測量490nm吸光度，以630nm吸收作為參考。
            
siRNA 序列
            
[表1]
            
權利要求
            
1.一種檢測或診斷受試者中癌癥的方法，包括確定受試者來源的生物樣品中C2orfl8 的測試表達水平的步驟，其中所述水平與C2orfl8正常對照水平相比的增加表明所述受試 者罹患癌癥或者具有發生癌癥的危險，其中C2orfl8的測試表達水平通過選自下組的任何 一種方法確定(a)檢測C2orfl8 的 mRNA，(b)檢測由C2orfl8編碼的蛋白，和(C)檢測由C2orfl8編碼的蛋白的生物活性。
            
2.權利要求1的方法，其中所述增加對應于比所述正常對照水平高至少10%的測試 C2orfl8表達水平。
            
3.權利要求1的方法，其中所述癌癥是胰腺癌。
            
4.權利要求1的方法，其中通過檢測C2orfl8探針與所述受試者來源生物樣品的基因 轉錄本的雜交來確定C2orfl8表達水平。
            
5.權利要求1的方法，其中通過檢測針對由C2orfl8基因編碼的蛋白質的抗體的結合 來確定C2orfl8表達水平。
            
6.權利要求5的方法，其中所述抗體識別由氨基酸序列 CRAAGQSDSSVDPQQPF (SEQ ID NO  5)禾口 / 或 AEESEQERLLGGTRTPINDAS (SEQ ID NO  6)構成的C2orfl8表位。
            
7.權利要求1的方法，其中受試者來源的生物樣品是活組織檢查。
            
8.一種篩選用于治療或預防癌癥的候選作用劑或能夠抑制癌細胞生長的C2orfl8多肽 激動劑或拮抗劑的候選物的方法，所述方法包括如下步驟a)使測試作用劑與由C2orfl8編碼的多肽接觸；b)檢測所述多肽與所述測試作用劑之間的結合活性；和c)選擇結合該多肽的測試作用劑。
            
9.一種篩選用于治療或預防癌癥或抑制癌細胞生長的候選作用劑的方法，所述方法 包括如下步驟a)使測試作用劑與表達C2orfl8的細胞接觸；b)檢測步驟a)中細胞內的C2orfl8表達水平；和c)選擇與不存在該作用劑時檢測到的C2orfl8的表達水平相比，降低步驟a)的細胞 中C2orfl8的表達水平的測試作用劑。
            
10.權利要求9的方法，其中所述細胞包括胰腺癌細胞。
            
11.一種篩選用于治療或預防癌癥或抑制癌細胞生長的候選化合物的方法，所述方法 包括如下步驟a)使測試作用劑與由C2orfl8編碼的多肽接觸；b)檢測步驟a)的多肽的生物活性；和c)選擇與不存在該測試作用劑時檢測到的生物活性相比，抑制步驟a)的多肽的生物 活性的測試作用劑。
            
12.權利要求11的方法，其中該生物活性是細胞增殖活性。
            
13.—種篩選用于治療或預防癌癥或抑制癌細胞生長的候選作用劑的方法，所述方法 包括如下步驟a)使測試作用劑與引入了如下載體的細胞接觸，該載體包括C2orfl8基因的轉錄調節 區和在所述轉錄調節區控制下表達的報告基因；b)檢測所述報告基因在步驟a)的細胞內的表達或活性水平；和c)選擇與不存在該測試作用劑時的水平相比，降低所述報告基因在步驟a)的細胞中 的表達或活性水平的測試作用劑。
            
14.權利要求8，9，10或13中任一項的方法，其中所述癌癥是胰腺癌。
            
15.一種鑒定可抑制C2orfl8與ANT2之間結合的作用劑的方法，所述方法包括如下 步驟a)使選自下組的第一多肽i)包含氨基酸序列SEQID NO  12的多肽；ii)包含氨基酸序列SEQID NO : 12的多肽，其中添加、替換、刪除或插入了一個 或多個氨基酸，條件是該多肽具有與由氨基酸序列SEQ IDNO : 12組成的多肽等價的對 ANT2的結合活性；iii)包含與由氨基酸序列SEQID NO  12構成的多肽具有至少大約80%同源性的氨 基酸序列的多肽，條件是該多肽具有與由氨基酸序列SEQID NO: 12構成的多肽等價的 對ANT2的結合活性；和iv)由在嚴格條件下與由核苷酸序列SEQID NO: 11構成的多核苷酸雜交的多核苷 酸編碼的多肽，條件是該多肽具有與由氨基酸序列SEQ IDNO  12組成的多肽等價的對 ANT2的結合活性；在作用劑的存在下與選自下組的第二多肽接觸i)包含氨基酸序列SEQID NO  26的多肽；ii)包含氨基酸序列SEQID NO : 26的多肽，其中添加、替換、刪除或插入了一個 或多個氨基酸，條件是該多肽具有與由氨基酸序列SEQ IDNO : 26構成的多肽等價的對 C2orfl8的結合活性；iii)包含與由氨基酸序列SEQID NO  26構成的多肽具有至少大約80%同源性的氨 基酸序列的多肽，條件是該多肽具有與由氨基酸序列SEQID NO: 26構成的多肽等價的 對C2orfl8的結合活性；iv)由在嚴格條件下與由核苷酸序列SEQID NO: 25構成的多核苷酸雜交的多核苷 酸編碼的多肽，條件是該多肽具有與由氨基酸序列SEQ IDNO  26構成的多肽等價的對 C2orfl8的結合活性；b)檢測所述第一多肽與第二多肽之間的結合水平；c)比較所述第一和第二多肽的結合水平與不存在該作用劑時檢測到的結合水平；和d)選擇降低所述第一和第二多肽間結合水平的作用劑。
            
16.一種抑制受試者中癌細胞生長的方法，包括向所述受試者施用雙鏈分子的步驟， 其中所述雙鏈分子降低C2orfl8的表達水平。
            
17.權利要求16的方法，其中所述雙鏈分子包含C2orfl8的有義核酸和反義核酸。
            
18.權利要求17的方法，其中該雙鏈分子包括相應于由SEQID NO 7或8構成的序 列的核苷酸序列作為靶序列。
            
19.權利要求18的方法，所述雙鏈分子具有通式5'-[A]-[B]-[A' ]-3'，其中[A]是相應于由SEQIDNO : 7或8構成的序列的核苷酸序列，[B]是由大約3個到大約23個 核苷酸構成的核苷酸序列，而[A']是由[A]的互補序列構成的核苷酸序列。
            
20.權利要求16的方法，其中將所述雙鏈分子與轉染增強劑一起施用給受試者。
            
21.權利要求16的方法，其中所述癌癥是胰腺癌。
            
22.一種用于治療或預防癌癥的組合物，所述組合物包括藥學有效量的針對C2orfl8 的雙鏈分子作為活性成分，和可藥用的載體。
            
23.權利要求22的組合物，其中該雙鏈分子包括由SEQID NO  7或8構成的核苷酸 序列作為靶序列。
            
24.權利要求22的組合物，其中該雙鏈分子具有通式5'-[A]-[B]-[A' ]-3'，其中 [A]是相應于核苷酸序列SEQ ID NO 7或8的核苷酸序列，[B]是由大約3個到大約23 個核苷酸構成的核苷酸序列，而[A']是與[A]互補的核苷酸序列。
            
25.一種用于治療或預防癌癥的組合物，包括藥學有效量的編碼針對C2orfl8的雙鏈 分子的載體作為活性成分，和可藥用載體。
            
26.權利要求22或25的組合物，其中所述癌癥是胰腺癌。
            
27.—種雙鏈分子，包括有義鏈和反義鏈，其中該有義鏈包含相應于由SEQID NO: 7或8構成的靶序列的核苷酸序列，并且其中該反義鏈包含與所述有義鏈互補的核苷酸序 列，其中所述有義鏈和所述反義鏈彼此雜交形成所述雙鏈分子，并且其中所述雙鏈分子 在被引入到表達C2orfl8基因的細胞內時抑制所述基因的表達。
            
28.權利要求27的雙鏈分子，其中所述有義鏈的長度為大約19個-大約25個核苷酸。
            
29.權利要求28的雙鏈分子，其中所述雙鏈分子是單個核苷酸轉錄本，其包含通過單 鏈核苷酸序列連接的有義鏈和反義鏈。
            
30.權利要求29的雙鏈分子，其中所述雙鏈分子具有通式5'-[A]-[B]-[A' ]-3'， 其中[A]是由SEQ ID NO: 7或8構成的核苷酸序列，[B]是由大約3個到大約23個核苷 酸構成的核苷酸序列，而[A']是與[A]互補的核苷酸序列。
            
31.一種載體，包括含有有義鏈核酸和反義鏈核酸的多核苷酸的組合中的任一個或二 者，其中所述有義鏈核酸包含核苷酸序列SEQIDNO : 7或8，并且所述反義鏈核酸包含 與所述有義鏈互補的序列，其中所述有義鏈和所述反義鏈的轉錄本彼此雜交形成雙鏈分 子，并且其中所述載體在被引入到表達C2orfl8基因的細胞內時抑制細胞增殖。
            
32.載體，包括含有有義鏈核酸和反義鏈核酸的多核苷酸的組合中的任一個，其中所 述有義鏈核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO : 7或8，并且所述反義鏈核酸包含與所述有義 鏈互補的序列，其中所述有義鏈和所述反義鏈的轉錄本彼此雜交形成雙鏈分子，并且其 中所述載體在被引入到表達C2orfl8基因的細胞內時抑制細胞增殖。
            
33.權利要求31的載體，其中所述轉錄本進一步包含連接所述有義鏈和所述反義鏈的 單鏈核苷酸序列。
            
34.權利要求33的載體，其中所述多核苷酸具有通式5'-[A]-[B]-[A' ]-3'，其中 [A]是由SEQ ID NO : 7或8構成的核苷酸序列，[B]是由大約3個到大約23個核苷酸構 成的核苷酸序列，而[A']是與[A]互補的核苷酸序列。
            
35.一種與C2orfl8蛋白結合的抗體。
            
36.權利要求35的抗體，其中該抗體識別由氨基酸序列CRAAGQSDS SVDPQQPF (SFQ ID NO  5)禾口 / 或 AEESEQERLLGGTRTPINDAS (SEQ ID NO  6)構成 的C2orfl8表位。
            
37.一種用于檢測受試者體內的癌癥的作用劑，其包括權利要求35的抗體。
            
全文摘要
            
本文描述了用于檢測或診斷發生癌癥(特別是胰腺癌)的傾向的客觀方法。在一個實施方案中，該診斷方法涉及利用抗-C2orf18抗體確定C2orf18表達水平的步驟。本發明進一步提供了篩選可用于治療C2orf18相關疾病(例如癌癥，如胰腺癌)的治療劑的方法，抑制細胞生長和治療或減輕其癥狀的方法。本發明還提供產品，例如多核苷酸、多肽、和載體雙鏈分子、抗體、載體和由它們構成的組合物。
            
文檔編號G01N33/15GK102026672SQ20098011719
            
公開日2011年4月20日 申請日期2009年3月10日 優先權日2008年3月12日
            
發明者中川英刀, 中村佑輔, 中鶴修一 申請人:腫瘤療法科學股份有限公司
            
                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
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