專利名稱：單獨和在聚合凝塊中檢測和計數血小板的方法及設備的制作方法
技術領域：
本發明總的來說涉及用于分析血 液樣本的設備及方法，具體地講，涉及用于檢 測和計數血小板、以及從巨血小板中辨別出血小板和從血小板凝塊中辨別出巨血小板的 設備和方法。
背景技術：
內科醫生、獸醫和科學家檢查人類和動物的生物流體(尤其是血液)，以確定組 分的數量以及識別是否存在在健康的受試者中沒有發現的異常微粒。通常被測量、定量 和識別的組分包括紅細胞(RBC)、白細胞(WBC)和血小板。在哺乳動物中，血小板(也被稱為凝血細胞(thrombocyte))是小的不規則形狀的 無核細胞碎片，其由巨核細胞的裂解產生。某些動物(例如，鳥、爬行動物和魚)中的凝 血細胞在功能上類似于哺乳動物的血小板，但是比哺乳動物的血小板大約10倍且是有核 的。血小板分析可以包括對樣本內的血小板的數目、大小、形狀、結構和體積的確定， 包括確定樣本中是否存在血小板或凝血細胞的凝塊。在某些自然形成的條件下，作為對 身體所遭遇的損傷(例如，出血、組織損傷等)所作出的有用響應，血小板將在受試者內 聚集成凝塊。另一方面，采集在血液樣本內形成的血小板凝塊用來進行分析通常是無用 的，并且可能妨礙血液樣本的分析。抗凝血劑(例如，EDTA)可以用來防止血小板在樣 本內凝塊，但是如果血液樣本與抗凝血劑的混合存在延遲，則凝塊仍會形成。一旦凝塊 形成，抗凝血劑通常不能將它們分成單獨的血小板。在被分析的樣本內存在血小板凝塊 通常是有問題的，這是因為它們將導致錯誤的低血小板計數，這將導致對患者的錯誤診 斷和嚴重后果。在諸如Wintrobe，s Clinical Hematology第12版的醫學文獻中詳細描述的已知的
血液檢查技術通常將檢查方法分為手動、離心和阻抗型方法。手動方法通常涉及產生精 確確定的血液或流體樣本的體積，該血液或流體樣本被定量稀釋并且在計數室中被直觀 計數。用于細胞計數的手動檢查方法包括檢查其中通過目測確定微粒類型的相對量的外 周涂片。離心檢查方法涉及對樣本進行離心，使得根據組分的相對密度將樣本分成多個 組分層。可以給組分層染色，以增強可見性或檢測性。阻抗型方法涉及檢查根據被測 量的微粒而處理的血液的精確體積；例如溶解RBC來計數有核細胞以及在導電流體中體 積(volumetrically)稀釋樣本。該過程通常涉及監視施加給通過窄通道的樣本的電流或電 壓，以確定當微粒以單行通過時微粒對電流/電壓的影響。其他技術涉及對通過光束入 射到以單行通過的微粒的光的強度和散射角的分析。還可以使用流式細胞測定法，該方 法涉及利用附著于針對細胞或微粒類型上存在的表面抗原決定簇的抗體的熒光基團給懸 浮中的感興趣的微粒染色、用適當波長的光激發染色微粒、以及分析各個微粒/細胞的發光(emission)。除了外周涂片或離心分離之外，上述所有方法都要求滴涂精確的樣本體積。樣 本體積的不精確將導致相關分析中同一數量的定量誤差。除了離心方法之外，上述所有 方法還都要求樣本與一種或多種液體試劑或稀釋劑混合，并且為了獲得精確的結果還要 求對儀器進行校準。在外周涂片的情況下，需要高度訓練來正確地檢查涂片。上述的許 多方法產生大量的污染物，而處理這些污染物是昂貴的。另外，上述方法不適于確定其 中紅細胞和凝血細胞有核的鳥、爬行動物和魚中的以及其中紅細胞尺寸非常小并且可能 與血小板混淆的某些哺乳動物中的全血計數(CBC)。
發明內容
根據本發明的一方面，提供了一種用于對基本上未稀釋的血液樣本中的血小板 進行計數的方法。該方法包括以下步驟1)將樣本滴落在適于靜止地保持樣本以進行 分析的分析腔室內，該腔室由第一平板和第二平板限定，這兩個平板都是透明的；2)在 樣本中摻合染色劑，該染色劑用于使血小板在曝光于一個或多個預定的第一波長的光時 發出熒光；3)以第一波長的光照射包含血小板的樣本的至少一部分；4)對所述的樣本的 至少一部分成像，包括產生表示來自血小板的熒光發射的圖像信號，該熒光發射具有強 度；5)使用圖像信號，通過血小板的熒光發射來識別血小板；6)確定在所述的樣本的至 少一部分內識別出的單獨的血小板的平均熒光發射強度值；7)使用所述的樣本的至少一 部分內的血小板凝塊的熒光發射、面積、形狀和粒度中的一個或多個來識別所述的樣本 的至少一部分內的血小板凝塊；以及8)使用為樣本內的單獨的血小板確定的平均熒光發 射強度值，對每個血小板凝塊內的血小板進行計數。本發明的優點在于本發明提供了血液樣本內的精確血小板計數。大多數現有技 術的血液分析儀通過假設樣本內一定大小的組分實際上是血小板來對樣本內的血小板數 目進行計數。因此，大于正常尺寸血小板的巨血小板和血小板凝塊可能在計數中沒有被 考慮并且可能被作為白細胞來計數。作為結果的較低血小板計數能夠被錯誤地解釋為血 小板減少癥。本發明識別巨血小板和血小板凝塊，并且對血小板凝塊內的血小板進行計 數。因此，提供了一種比大多數現有技術的自動血液分析儀所提供的更加精確的血小板 計數，并且避免了會導致錯誤的低血小板計數和錯誤的高白細胞計數的將巨血小板和血 小板凝塊計數為白細胞。本發明的另一個優點在于本發明能夠識別和計數血樣樣本內的巨血小板。本發明的另一個優點在于本發明可以用來利用極少的樣本量來確定血液樣本的 特性，該極少的樣本量可以通過毛細管穿刺從病人直接獲得，從而使得本發明對現場護 理應用來說更加有用，或者可以根據需要從靜脈樣本獲得該極少的樣本量。本發明的方法的另一個優點在于其 對于外部和內部流體都適用，并且與重力和 方位無關，因此該方法適于用在手持式設備中和微重力條件下。通過下面提供的包括附圖的詳細描述，本發明的方法及與其有關的優點將更加 顯然。
圖1至圖4是可用在本發明的方法中的分析腔室的截面示意圖。圖5是具有多個分析腔室的條帶的示意平面圖。圖6是具有分析腔室的一次性容器的示意平面圖。圖7是具有分析腔室的一次性容器的示意截面圖。圖8是可與本發明的方法一起使用的分析設備的示意圖。圖9是以第一強度放大來成像的包含摻合有吖啶橙熒光染料的基本上未稀釋的 血液樣本的腔室的一部分的彩色圖像，其中基本上未稀釋的血液樣本已被從吸收了該染 料的組分(例如，WBC、血小板等)產生熒光發射的波長的光照射過。圖10是以大于第一強度放大的第二強度放大來成像的圖9所示的彩色圖像。圖11是包含摻合有吖啶橙熒光染料的基本上未稀釋的血液樣本的腔室的一部 分的彩色圖像，其中基本上未稀釋的血液樣本已被從組分產生熒光發射的波長的光照射 過，其示出了 WBC、血小板凝塊和血小板的不同的發光分布(emissionprofile)。圖12是包含摻合有吖啶橙熒光染料的基本上未稀釋的血液樣本的腔室的一部 分的彩色圖像，其中基本上未稀釋的血液樣本已被從組分產生熒光發射的波長的光照射 過，其示出了血小板、巨血小板和網狀細胞的不同的發光分布。圖13是包含摻合有吖啶橙熒光染料的基本上未稀釋的血液樣本的腔室的一部 分的彩色圖像，其中基本上未稀釋的血液樣本已被從組分產生熒光發射的波長的光照射 過，其示出了血小板和網狀細胞的不同的發光分布。該圖像還包括根據圖像編輯的WBC 和在背景下微弱可見的RBC。圖14是圖13所示的圖像的黑白版本，其是通過用顯示該圖像的光密度的波長的 光照射樣本產生的。該圖像示出了樣本內的網狀細胞和RBC的光密度分布，該光密度分 布能夠識別出網狀細胞。圖15是根據本發明的一方面的方法的步驟的框圖。
具體實施方式
本發明的方法總的來說利用了分析腔室，該分析腔室可用于靜止地保持基本上 未稀釋的抗凝全血樣本以進行分析。該腔室的典型大小可以保持大約0.2至1.0 μ 1的樣 本，但是該腔室不限于任何特定的體積容量，該容量可以為適應分析應用而改變。在此 使用的術語“基本上未稀釋的”表示根本未被稀釋的血液樣本或者未被故意稀釋的血液 樣本，但是為了進行分析，可以對血液樣本添加一些試劑。如果添加有試劑的話，就該 試劑添加對樣本稀釋的程度來說，在臨床上這種稀釋對所進行的分析沒有顯著的影響。 通常，將在執行本發明的方法過程中使用的試劑只有抗凝血劑(例如，EDTA、肝素)和 染色劑。這些試劑通常以干粉形式來添加，其目的是不稀釋樣本。在某些情況下(例 如，非常快速的分析-諸如可能發生在從患者手指采血或者從新生兒腳跟采血時)，不必 添加抗凝血劑，但是在大多數情況下優選的是添加抗凝血劑以確保樣本處于分析可接受 的形式。術語“靜止”用來描述樣本被滴落在腔室內以進行分析，并且在分析過程中該 樣本不會相對于腔室故意移動。就血液樣本內存在運動的程度來說，血液樣本的形成組 分的布朗運動占主導，該運動不會破壞本發明的設備的使用。
摻合到血液樣本的至少一部分中的染色劑(colorant)(例如，染料、著色劑等) 有助于對吸收該染色劑的組分(例如，血小板、WBC等)的識別和定量分析。當被某些 波長(例如，大約470nm)的光激發時，染色劑發出特征波長(例如，530nm、585nm和 660nm)的熒光。組分將要發出的熒光的特定波長是該組分和激發光的波長的特性。在 一些實施例中，根據組分內的染色劑的濃度，染色劑還可以吸收一個或多個預定波長的 光。可接受的染色劑的示例包括體外活體染料吖啶橙和astrozone orange。然而，本發明 不限于體外活體染料。所屬領域的技術人員會知道適當的染色劑的濃度范圍，或者在無 須過度實驗的情況下能夠確定適當的染色劑。 現在參照圖1，分析腔室10由具有內表面14的第一平板12和具有內表面18的 第二平板16限定。平板12、16都是足夠透明的，以使得能夠傳輸通過足量的預定波長 的光，以執行如下所述的光密度分析。平板12、16的至少一部分是彼此平行的，在該部 分內，內表面14和內表面18彼此間隔開高度20，該高度可以是已知的或者是可測量的。 所示出的RBC 22置于腔室10內。本發明的方法可以利用具有上述特性的各種不同的分析腔室類型，因此不限于 任何特定類型的分析腔室。具有平行的平板12、16的分析腔室簡化了該分析，因此是優 選的，但是并不是本發明所必需的；例如，可以使用這樣一種腔室，即，該腔室的一個 平板相對于另一個平板成已知的非平行角度布置。現在參照圖2至圖5，示出了一個可接受的腔室10的示例，該腔室10包括第一 平板12、第二平板16、以及至少三個布置在平板12和平板16之間的隔離物26。隔離 物26可以是可布置在平板12和平板16之間的可用于將平板12和平板16彼此分隔的任 何結構。在平板12和平板16之間延伸的隔離物26的尺寸28在此被稱為隔離物26的高 度28。隔離物26的高度28通常彼此不完全相等(例如，存在制造公差)，但是處于商 業上可接受的用于類似分析設備中的分隔裝置的公差內。球狀珠是可接受隔離物26的一 個示例，并且商業上可從例如 Bangs Laboratories of Fishers，Indiana, U.S.A.獲得。在圖3所示的腔室實施例中，隔離物26由彈性大于第一平板12和第二平板16中 的一個或者兩個的材料組成。從圖3可以看出，較大的隔離物26被壓縮到大多數隔離物 26接觸平板12、16的內表面14、18的程度，從而使得腔室高度僅僅稍微小于平均的隔離 物26的直徑。在圖4所示的腔室實施例中，隔離物26由彈性小于第一平板12和第二平 板16中的一個或兩個的材料組成。在圖4中，第一平板12由比球狀隔離物26和第二平 板16更有彈性的材料形成，并且將以帳篷式(tent-like)的方式覆蓋隔離物26。在該實施 例中，雖然腔室10的小局部區域可能偏離期望的腔室高度20，但是腔室10的平均高度 20將非常接近平均的隔離物26的直徑的高度。分析顯示使用該實施例可以將平均腔室高 度20控制為小于4微米的腔室高度的上下或更好。除了受到上述的彈性特性(以及 諸如隔離物的分布密度之類的其他因素)的限制，隔離物26和平板12、16可以由各種材 料制備，只要平板12、16足夠透明。由聚對苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate) 組成的透明塑料薄膜是可接受的平板12、16的示例，并且由聚苯乙烯(polystyrene)、聚 碳酸酯(polycarbonate)、硅酮(silicone)等制成的球狀珠是可接受的隔離物26。可接受 的隔離物的特定示例是由聚苯乙烯制成的球體，在商業上可以從例如Thermo Scientific of Fremont, California, U.S.A.目錄編號為4204A獲得4微米(4 μ m)直徑的這種球體。參照圖5，垂直布置在另一個平板上方的平板12包括多個以規則的間隔布置的多個口 30(例 如，用作氣孔)，并且平板12和平板16在多個點處結合在一起。在一些實施例中，結合 材料32形成了可用于將樣本34橫向地包含在分析腔室10內的外腔室壁。這個可接受的 分析腔室的示例在美國專利申請公開No.2007/0243117、2007/0087442、以及2008年4月 2日提交的美國臨時專利申請No.61/041,783和2008年10月31日提交的美國臨時專利申 請No.61/110,341中詳細地進行了描述，這些文獻在此以引用方式整體并入本文。 另一個可接受的腔室10的示例布置在如圖6和圖7所示的一次性容器36中。腔 室10形成在第一平板12和第二平板16之間。第一平板12和第二平板16都是透明的， 以允許光穿過腔室10。第一平板12和第二平板16的至少一部分彼此平行，在該部分內， 內表面14和內表面18彼此間隔開高度20。該腔室10的實施例在美國專利No.6,723,290 中更詳地進行了描述，該專利以引用方式整體并入本文。圖2至圖7所示的分析腔室表 示可接受的用于本發明方法的腔室。然而，本發明的方法不限于這些特定實施例。不必為了本公開目的而知道腔室的確切高度。基于典型的細胞尺寸，對于大多 數動物品種來說，大約2至6微米(2-6 μ m)的腔室高度是可接受的。大約3至5微米 (3-5 μ m)的腔室高度20尤其適于分析人類血液。然而，本發明不限于任何特定的腔室 高度，只要使用該腔室高度能夠實現在此所述的方法即可。使用分析設備來執行對靜止地置于腔室10內的樣本的分析，該分析設備可用于 對樣本的至少一部分進行照射和成像并且對該圖像進行分析。以容許基于基本單位來確 定來自樣本的所述部分的熒光發射和光密度的方式產生該圖像。術語“基本單位”或者
“圖像單位”是指所定義的能夠分辨樣本圖像的增量單位。通常被定義為在特定成像系 統內能夠單獨處理的最小圖元的像素是圖像單位的一個示例，并且圖像單位還可以包括 集合單位形式的少量像素。還可以以線性項(例如，在焦平面上每像素幾微米)來描述成 像設備的放大倍數，其中線性維度沿著應用于圖像的正交網格的一個特定軸。在焦平面 上被傳感器像素捕獲的實際樣本面積因此是成像設備所應用的放大系數的函數。因此， 已知成像設備的放大倍數是有用的，但不是必要的。與該像素有關的體積因此是每個像 素的圖像的面積與腔室高度的乘積。例如，如果放大倍數為每像素0.5微米，則占據200 個像素的圖像將具有50平方微米的面積，而體積則為50平方微米與腔室高度的乘積。現在參照圖8，適用于本發明的方法的分析設備44的示例包括樣本照明器46、 析像器48、以及可編程分析器50。樣本照明器46包括光源，該光源選擇性地產生某些期 望波長的光。例如，可以使用發射期望波長(例如，420nm，440nm, 470nm等)的光的 LED。作為選擇，可以使用產生寬波長范圍(例如，大概400-670nm)的光的光源，雖然 在一些情況下，這種光源可能需要濾波。分析設備44可以包括用于控制光的光學器件。 樣本照明器46包括透射光源和表面照明光源，每一個均可用于照射停留在腔室10內的樣 本中的一些或者全部。可接受的析像器48的示例是電耦合器件(CCD)類型的圖像傳感 器，其將穿過樣本的光的圖像轉換成為電子數據形式(即，信號)。互補金屬氧化物半導 體(“CMOS” )類型的圖像傳感器是另一種可以使用的圖像傳感器的示例，然而本發明 不限于這些示例中的任意一個。可編程分析器50包括中央處理單元(CPU)并且連接至 樣本照明器46和析像器48。CPU適于(例如，被編程為)選擇性地執行實現本發明方 法所必需的功能。應當注意，可以使用硬件、軟件、固件或者其結合來實現可編程分析器50的功能。所屬領域的技術人員將能夠對處理單元進行編程以執行在此所述的功能， 而不需要進行過度的實驗。題目為“Apparatus for Analyzing Biologic Fluids”且于2005 年3月15日發布的美國專利No.6,866,823公開了這種分析設備44，該美國專利內容以引 文方式整體并入本文。
該分析設備適于處理從對樣本的至少一部分的照射產生的圖像信號，以識別和 計數樣本內的組分。該圖像信號包括基于每個像素的熒光發射和光密度。每個像素的發 光強度及顏色和光密度共同建立了被照射樣本部分的圖像。在該共同的圖像內，分析設 備適于使用所選組分的熒光強度、顏色含量和熒光發射的光密度、以及在某些實例中還 有所選組分的物理特性(例如，面積、邊緣幾何形狀等)中的一個或多個來識別該組分的 分布。該分析設備使用圖像分布來在所選組分中進行區分，直到剩余組分表示目標組分 (例如，血小板)為止，此時可以對該目標組分進行計數。根據本發明的方法，基本上未稀釋的全血樣本被引入腔室10內，然后靜止地停 留在腔室10內。在將樣本引入腔室前或者在將樣本引入腔室時，在樣本中摻合抗凝血 劑和染色劑。染色劑被樣本內的組分(例如，WBC、血小板和網狀細胞)吸收。在一 些應用中，在樣本中加入等容球狀試劑以使樣本內的一些RBC或全部RBC呈現球狀形 狀。可接受的等容球狀試劑的一個示例是兩性離子去污劑。球狀試劑的一個特定示例是 Zwittergent 3-16去污劑，其是由美國的新澤西州的EMD Chemicals公司的一個機構 Calibriochem生產的兩性離子去污劑。添加到樣本中的球狀試劑的量足以使至少執行血細 胞比容分析所需的多個RBC成為球狀。該特定的量將取決于具體的試劑和測試環境，并 且所屬領域的技術人員無需進行過度實驗就能夠確定。自然的雙凹圓盤狀RBC和RBC 相對于血小板的相對尺寸可以使樣本內的血小板“隱藏”在樣本內的RBC中；例如，在 RBC的凹陷內。使RBC成為球狀降低了血小板被隱藏在樣本內的RBC中的可能性，并 且增大了血小板被視為血漿內的獨立單位的可能性，從而增大了對樣本進行的定量血小 板分析的準確性。用使光透射穿過樣本的分析設備44照射靜止地停留在腔室內的樣本的至少一部 分。雖然不要求對停留在腔室內的整個樣本成像，但是這是優選的，因為這樣做通常能 夠提供對樣本的更全面的分析并且伴隨著準確性的提高。用已知能夠激發來自組分的與 被組分吸收的染色劑有關的熒光發射的波長的光來照射樣本。當被大約470nm波長的紫 光照射時用吖啶橙染色的組分產生熒光發射。圖9至圖13所示的照片示出了樣本內發 現的組分(例如，血小板、巨血小板、WBC、網狀細胞、血小板凝塊)的熒光發射。特 定的發光取決于所使用的染色劑和被照射細胞的細胞內成分(例如，染色劑與細胞或血 小板的成分相互作用會引起發光)。一些組分具有作為熒光光度標記的熒光發射(也稱 為“分布”)，所述熒光光度標記表示產生組合光的多個波長的熒光發射的特定比率(例 如，特征的“紅色/綠色”比率)，其對于該組分來說是相對唯一的，因此可以用來識別 該組分。其他組分的熒光發射標記不能容易地將彼此區分開。為了區分這些組分，用被 血紅蛋白吸收的量稍微大于被血小板或血漿吸收的量的波長的光來照射樣本。可以依照 光密度來測量吸收量，然后可以利用光密度來區分包含血紅蛋白的組分和不包含血紅蛋 白的組分。由于圖像的熒光發射部分是諸如所使用的染色劑的類型和樣本內的染色劑的濃度之類的因素的函數，因此，對樣本強度進行校準是有用的，但不是必須的。例如，對 于給定的染色劑濃度，來自WBC的熒光發射平均來說大于來自血小板的熒光發射。這可 以從為同一樣本的圖像的圖9和10中清楚地看到。圖10中的熒光發射的放大倍數大于 圖9中所使用的放大倍數。圖9清楚地顯示了來自WBC 40的熒光發射，而微弱地顯示 了來自血小板42的熒光發射。圖10清楚地顯示了 WBC 40和血小板42，并且還顯示了 如何通過它們的熒光發射強度來將它們區分開。該校準識別出了關于該分析設備的WBC 的相關強度水平和血小板的相關強度水 平，并且相應地對分析設備進行了校準。通過照射樣本產生的熒光發射和透射光被轉化成基于每個像素的圖像信號，這 些信號共同建立了被照射樣本部分的圖像。在該共同的圖像內，分析設備適于使用熒 光發射的熒光強度、顏色含量和光密度中的一個或多個來識別某些所選組分的分布。可 以使用比較上述各個特性的算法來執行通過上述特性來識別組分分布的過程，以識別組 分。一旦組分被識別，就可以對其進一步分析。例如，可以通過熒光發射分布來識別樣 本內的有代表性的多個血小板，并且可以共同地對它們進行分析來確定血小板的熒光發 射強度的平均值。在一些實例中，組分熒光分布還用以使用熒光信號分布來確定組分的 內部面積和邊緣區域。可以對單獨組分的面積進行平均，以確定平均面積值。可以分析 邊緣分布來獲得平滑度和/或幾何形狀；例如，確定組分的邊緣是否是圓形的、非圓形 的、不規則的、等等。這些特性隨后被用來對樣本內的組分進行區分，直到剩余組分表 示目標組分(例如，血小板)為止，此時可以對目標組分進行計數。為了示出本發明的示例，在基本上未稀釋的血液樣本中摻合EDTA、吖啶橙和兩 性離子去污劑，并且將樣本引入具有兩個透明的平板的腔室內，用于確定樣本內的血小 板計數。包括RBC、網狀細胞、WBC、血小板、巨血小板和血小板凝塊的組分靜止地停 留在樣本內。用470nm、413nm和540nm中的至少一種來照射樣本。470nm照射產生 來自吖啶橙的熒光發射。其他染色劑可能在被其他波長的光照射時發光。413nm和/或 540nm的照射被用來通過血紅蛋白的光密度來表示血紅蛋白的存在，如下將討論。獲取 被照射的樣本的數字圖像。分析樣本的圖像以識別置于樣本內的各種組分。例如，可以通過WBC的熒光 標記(例如，由顯著的紅色細胞質熒光和綠色細胞核熒光組成的熒光發射圖案)、WBC 的熒光發射的相對強度、WBC占據的面積以及WBC的形狀中的一個或多個來單獨識別 WBC (見圖9-11)。從而，例如通過對圖像進行濾波將WBC從樣本的剩余物中區分出 來，使得在圖像中不再考慮WBC。現在參照圖12，可以通過巨血小板44的熒光分布、面積和形狀中的一個或多個 來識別巨血小板44。可以在背景中微弱地看到RBC45。巨血小板44的色度比與正常的 血小板42的色度比類似，但是由于其微粒質量較大，所以發光強度較大。巨血小板44在 尺寸上還明顯地大于正常的血小板42并且是圓形的。正常的血小板42通常為不規則的 形狀。大多數正常尺寸的血小板的直徑為1.5至3μιη。相比之下，巨血小板44的直徑 大于7 μ m并且通常處在ΙΟμιη至20μιη范圍內。巨血小板的識別和計數提供了重要的 臨床信息，這是因為巨血小板的存在可能是巨大血小板綜合癥(Bemard-soulier syndrome) 和骨髓增生性疾病(myeloproliferative disorder)(例如，慢性骨髓白血病(CML)、真性紅 細胞增多癥、原發性血小板增多癥、以及特發性骨髓外化生)的指標。通過將巨血小板44的熒光發射(色度和強度)、面積和周界形狀中的一個或多個與正常血小板的熒光發射 值、面積和周界形狀進行比較，其中包括比較平均的血小板強度和面積值，來識別樣本 內的巨血小板44。作為可用來識別巨血小板的標準的一個示例，可以對分析設備進行編 程，使其具有一個或多個相對于正常血小板的比較標準(例如，基于平均的正常血小板 面積或強度的標準偏差的平均血小板面積或強度的倍數，或者通過預定的面積或強度值 等)。對于平均血小板面積，任何給定樣本內的血小板面積的分布通常被描述成對數-正 態分布函數，并且可以使用已知技術在統計學上進行確定。被識別出的巨血小板然后被 分辨出來，并且取決于所期望的特定信息，巨血小板被包含在血小板計數中和/或被視 為獨立的組分族群。網狀細胞46發出的熒光分布類似于正常血小板發出的熒光分布，這是因為它們 都包含核材料。圖13中的照片示出網狀細胞46和血小板42的熒光發射。圓形的黑色 突出顯示的部分是圖像中放置WBC的圖像部分，但是該圖像被遮住。在某種程度上通 過網狀細胞46和血小板42的熒光發射能夠將它們區分開，其中網狀細胞46比血小板42 看起來稍微明亮并且具有稍微多的紅色。還可以用波長為413nm和/或540nm的光照射 樣本來辨別網狀細胞46，這些波長的光被血紅蛋白吸收的量顯著地大于樣本內存在的其 他材料吸收的量，因此能夠指示血紅蛋白的存在。可以按照光密度來對血紅蛋白的光吸 收進行定量。圖14示出了網狀細胞的OD。使用熒光發射圖案和OD中的一個或兩個來 將網狀細胞從樣本的剩余物中辨別出來。在大多數血液樣本中，在已經辨別出WBC、巨血小板和網狀細胞之后剩余的具 有熒光發射的組分即使不完全是也主要是血小板。可以對樣本內的單獨的血小板進行識 別和計數。然而，在一些血液樣本中，樣本內的一部分血小板可能聚集成一個或多個凝 塊，這些凝塊在尺寸上可以很大；例如，為WBC尺寸的1到4倍。圖11的照片顯示了 血小板凝塊48和WBC 40。通過血小板凝塊48的熒光發射分布、通過它們的粒度、以 及在某些情況下通過它們的面積和/或形狀，可以從其他組分(例如，WBC 40、巨血小 板44)中識別出和辨別出血小板凝塊48，其中血小板凝塊48的熒光發射分布的紅色/綠 色比率可以與WBC 40的區分開。例如，血小板凝塊48可以與巨血小板區分開，這是因 為血小板凝塊為不規則的形狀，而巨血小板為基本上圓形的形狀。可以通過編程到分析 設備中的圖像分析軟件來確定血小板凝塊和巨血小板的相對圓度。檢測樣本內存在血小 板凝塊是重要的，這是因為存在將凝塊計數為WBC和/或導致血小板減少癥的錯誤診斷 的可能性(從而錯誤地估計WBC計數)。這些潛在問題與現有的自動分析儀尤其相關。 血小板凝塊的存在是樣本與EDTA不充分混合的指標。 一旦識別出血小板凝塊，就能夠確定凝塊的累積熒光發射強度和凝塊的面積。 然后，可以通過用平均血小板發光強度除累積熒光發射強度來確定凝塊內的血小板數 目。該商值是可接受的對凝塊內的實際血小板數目的近似。還可以通過用平均的血小板 面積除凝塊的面積來確定凝塊內的血小板數目的近似。雖然已經通過本發明的具體實施例示出和描述了本發明，但是所屬領域的技術 人員應當理解在不脫離本發明的思想和范圍的情況下可以在形式上或細節上進行各種變 化。
權利要求
1.一種用于對具有多個血小板的血液樣本中的血小板進行計數的方法，包括以下步驟將樣本滴落在適于靜止地保持樣本以進行分析的分析腔室內，該腔室由第一平板和 第二平板限定，這兩個平板都是透明的；在樣本中摻合染色劑，該染色劑用于使血小板在曝光于一個或多個預定的第一波長 的光時發出熒光；用第一波長的光照射包含血小板的樣本的至少一部分；對所述的樣本的至少一部分成像，包括產生表示來自血小板的熒光發射的圖像信 號，該熒光發射具有強度；使用圖像信號，通過血小板的熒光發射來識別血小板； 確定在樣本內識別出的單獨的血小板的平均熒光發射強度值； 使用樣本內的血小板凝塊的熒光發射、面積、形狀和粒度中的一個或多個來識別樣 本內的血小板凝塊；使用為樣本內的單獨的血小板確定的平均熒光發射強度值，對每個血小板凝塊內的 血小板進行計數。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述血液樣本實質上未被稀釋。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述血液樣本是全血。
4.如權利要求1所述的方法，還包括步驟對單獨停留在樣本內的血小板進行計 數，并且將樣本內的血小板的總數確定為每個血小板凝塊內的血小板和單獨停留在樣本 內的血小板的總和。
5.如權利要求1所述的方法，還包括步驟識別樣本內的巨血小板。
6.如權利要求5所述的方法，其中通過熒光發射、面積和形狀中的一個或多個來識別 樣本內的巨血小板。
7.如權利要求5所述的方法，還包括步驟確定樣本內的至少一個巨血小板的面積。
8.如權利要求7所述的方法，還包括步驟確定在樣本內識別出的單獨的血小板的 平均面積，并且將至少一個巨血小板的面積與平均血小板面積進行比較。
9.如權利要求7所述的方法，還包括步驟確定在樣本內識別出的單獨的血小板的 平均面積和單獨的血小板的面積的統計偏差，并且將至少一個巨血小板的面積與基于單 獨的血小板的面積的統計偏差的值進行比較，以識別至少一個巨血小板。
10.如權利要求7所述的方法，還包括步驟將至少一個巨血小板的面積與預定的值 進行比較，以識別至少一個巨血小板。
11.如權利要求7所述的方法，還包括步驟確定在樣本內識別出的單獨的血小板的 平均面積，其中對每個血小板凝塊內的血小板進行計數的步驟還包括使用樣本內的單獨 的血小板的平均面積。
12.如權利要求1所述的方法，還包括步驟以一個或多個第二波長的光來照射包含血小板的樣本的至少一部分； 對樣本的至少一部分成像，包括產生表示樣本內的一個或多個組分的光密度的圖像 信號；使用圖像信號，來確定樣本內的一個或多個組分的光密度；以及使用光密度來將血小板與一個或多個組分之間彼此區分開。
13.如權利要求1所述的方法，還包括步驟通過用被血紅蛋白吸收的一個或多個 第二波長的光照射樣本的至少一部分，來從包含血紅蛋白的樣本內的組分中分辨出血小 板。
14.一種用于對血液樣本內的血小板進行計數的設備，包括分析腔室，適于靜止地保持樣本以進行分析，該腔室由第一平板和第二平板限定， 這兩個平板都是透明的，其中一定量的染色劑被置于腔室內，該染色劑用于使血小板在 曝光于一個或多個預定的第一波長的光時發出熒光；以第一波長的光照射包含血小板的樣本的至少一部分；成像單元，包括照明器和析像器，該成像單元用于對樣本的至少一部分進行成像并 且產生表示來自血小板的熒光發射的圖像信號，該熒光發射具有強度；以及可編程分析器，適于使用圖像信號通過血小板的熒光發射來識別血小板，并且確 定在樣本內識別出的單獨的血小板的平均熒光發射強度值，以及使用樣本內的血小板凝 塊的熒光發射、面積、形狀和粒度中的一個或多個來識別樣本內的血小板凝塊，以及使 用為樣本內的單獨的血小板確定的平均熒光發射強度值來計數每個血小板凝塊內的血小 板。
全文摘要
提供了一種用于對血液樣本中的血小板進行計數的方法。該方法包括以下步驟1)將樣本滴落在適于靜止地保持樣本以進行分析的分析腔室內，該腔室由第一平板和第二平板限定，這兩個平板都是透明的；2)在樣本中摻合染色劑，該染色劑用于使血小板在曝光于一個或多個預定的第一波長的光時發出熒光；3)以第一波長的光照射包含血小板的樣本的至少一部分；4)對樣本成像，包括產生表示來自血小板的熒光發射的圖像信號，該熒光發射具有強度；5)使用圖像信號，通過血小板的熒光發射來識別血小板；6)確定在樣本內識別出的單獨的血小板的平均熒光發射強度值；7)使用樣本內的血小板凝塊的熒光發射、面積、形狀和粒度中的一個或多個來識別樣本內的血小板凝塊；以及8)使用為樣本內的單獨的血小板確定的平均熒光發射強度值，對每個血小板凝塊內的血小板進行計數。
文檔編號G01N33/80GK102027369SQ200980116792
公開日2011年4月20日 申請日期2009年3月20日 優先權日2008年3月21日
發明者尼滕·V·拉爾普里亞, 斯蒂芬·C·沃德洛, 羅伯特·A·萊文 申請人:艾博特健康公司