專利名稱：致病性構象異構體的分析的制作方法
致病性構象異構體的分析相關申請的交叉引用本申請要求2008年4月30日提交的美國臨時專利申請61/049，396的優先權，通 過引用將該申請的內容納入本文。
背景技術：
蛋白質構象疾病(protein conformational disease)包括各種臨床上不相關的 疾病，例如傳染性海綿狀腦病、阿爾茨海默病、ALS和糖尿病，這些疾病因正常蛋白質構象異 常轉換成致病性構象異構體所致。這種轉換進而造成伴有后續組織沉積的致病性構象異構 體的自身締合并且假設可導致周圍組織損傷。這些疾病在臨床表現上也驚人相似，通常經 歷時間長度不同的潛伏期后從診斷快速發展為死亡。在活體對象和由活體對象獲取的樣品中檢測構象疾病蛋白的致病性構象異構體 已證明是困難的。目前證實活體患者中存在致病性構象異構體的技術粗略且具有侵入性。 例如，組織病理學檢查要求對患者存在風險的活組織檢查。組織病理學固有地存在取樣誤 差，因為病損和淀粉樣沉積可能由于進行活組織檢查區域的不同而被忽略。因此，在對象死 亡之前對這些病癥進行確定診斷和治標療法仍然是一個巨大的尚未實現的挑戰。淀粉樣-β蛋白(Α β )聚集體主要是A β 1-40 (Α β 40)和1-42 (Α β 42)，這些聚集 體排他性地與阿爾茨海默病(AD)有關，被視作該疾病的黃金標準標記物。然而，AD唯一的 確定性檢驗是在死后對腦樣品進行Aβ斑塊的免疫組織化學染色。目前，尚沒有FDA批準 的AD死前診斷試驗。血漿或CSF樣品可用于死前試驗。一些死前AD試驗聚集于腦脊液 (CSF)，試圖對可溶性A β 42進行定量。然而，這種生物標記物僅僅用作AD的間接測量。可以特異性地檢測直接來自CSF或其他體液如血漿中的聚集的A β的試驗將具有 巨大的優勢。聚集的Αβ的早期檢測能實現對阿爾茨海默病更快且更有效的診斷以及可能 療法的評價。能夠檢測其他構象疾病蛋白的致病性構象異構體的試驗也是需要的，因為它們也 能實現對這些構象疾病更快和更有效的診斷以及可能療法的評價。優選實施方式的簡要描述本發明部分地涉及致病性構象異構體特異性結合試劑(PCSB試劑)，該試劑優先 與致病性朊病毒蛋白和其他非朊病毒致病性構象異構體發生相互作用。在一些實施方式 中，PCSB 試劑源自朊病毒蛋白片段，例如 ft~P19-30(SEQ ID NO :242)、PrP23_30 (SEQ ID NO: 243),PrPlOO-Ill(SEQ ID NO :244),PrPlOl-IlO(SEQ ID NO :245)、PrP154_165(SEQ ID NO: 246)和(SEQ ID NO :247)。在其它實施方式中，致病性構象異構體特異性結合 試劑的氨基酸序列為SEQ ID NO :242, SEQ ID NO :243, SEQ ID NO :244, SEQ ID NO 245, SEQ ID NO 246 和 SEQ ID NO :247。在其它實施方式中，PCSB試劑是朊病毒蛋白片段的擬肽類似物。在一些實施方式
中，所述擬肽類似物具有以下結構
權利要求
1.一種用于檢測非朊病毒致病性構象異構體的存在的方法，所述方法包括以下步驟使疑似含有所述非朊病毒致病性構象異構體的樣品與致病性構象異構體特異性結合試劑在能使所述試劑與如果存在的所述非朊病毒致病性構象異構體結合以形成復合物的 條件下相接觸；和通過其與所述致病性構象異構體特異性結合試劑的結合來檢測所述樣品中如果有的 話所述非朊病毒致病性構象異構體；其中，所述致病性構象異構體特異性結合試劑源自朊病毒蛋白片段并且優先與致病性 朊病毒蛋白相互作用。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述非朊病毒致病性構象異構體是與淀粉 樣蛋白疾病相關的構象異構體。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述淀粉樣蛋白疾病選自系統性淀粉樣 變、tau病變和共核蛋白病。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述非朊病毒致病性構象異構體是與選自 下組的疾病相關的構象異構體阿爾茨海默病、ALS、免疫球蛋白相關疾病、血清淀粉樣蛋白 A相關疾病和II型糖尿病。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述非朊病毒致病性構象異構體是阿爾茨 海默病構象異構體。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述阿爾茨海默病構象異構體是淀粉樣蛋 白-β (Αβ)蛋白。
7.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述阿爾茨海默病構象異構體是tau蛋白。
8.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述致病性構象異構體特異性結合試劑源 自選自下組的化合物PrP19_3。(SEQ ID NO 242),PrP23^30 (SEQ ID NO 243),PrP100_m (SEQ ID NO 244), PrP101_110 (SEQ ID NO 245), PrP154_165 (SEQ ID NO 246) ,PrP226_237 (SEQ ID NO :247)， SEQ ID NO 14, SEQ ID NO :50，SEQ ID NO :68，
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述樣品選自器官、全血、血液成分、血液 組分、血漿、血小板、血清、腦脊液(CSF)、腦組織、神經系統組織、肌肉組織、骨髓、尿、眼淚、 非神經系統組織、活檢或尸檢。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述樣品包括血漿或腦脊液。
11.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述朊病毒蛋白片段選自以下肽 PrP19_30 (SEQ ID NO 242) ,PrP23_30 (SEQ ID NO :243)，PrP100_m (SEQ ID NO :244)，PrP101_110(SEQ ID NO :245)，PrP154_165 (SEQ ID NO :246), PrP226_237 (SEQ ID NO :247)，SEQ ID NO: 14，SEQ ID NO 50 禾口 SEQ ID NO :68。
12.如權利要求1所述的方法，其特征在于，朊病毒蛋白片段選自PrP19_3C1(SEQID NO 242), PrP23_30 (SEQ ID NO :243), PrP100_m (SEQ ID NO :244), PrP101_110 (SEQ ID NO :245)，SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :50 和 SEQ ID NO :68。
13.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述致病性構象異構體特異性結合試劑包 含選自下組的氨基酸序列SEQ ID NO :242, SEQ ID NO :243，SEQ ID NO :244，SEQ ID NO 245，SEQ ID NO :246，SEQ ID NO :247，SEQ ID NO :14，SEQ ID NO 50 和 SEQ ID NO :68。
14.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述致病性構象異構體特異性結合試劑包 含選自下組的氨基酸序列SEQ ID NO :242, SEQ ID NO :243，SEQ ID NO :244，SEQ ID NO 245，SEQ ID NO :14，SEQ ID NO 50 和 SEQ ID NO :68。
15.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述致病性構象異構體特異性結合試劑包 括選自下組的擬肽試劑(a)SEQID NO :229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240 或 241 ；(b)SEQID NO :229，230，232，233，237，238，239 或 240 ；(c)SEQID NO :230，237，238，239 或 240 ；(d)SEQID NO 240 ；(e)
16.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述致病性構象異構體特異性結合試劑在 生理學pH下具有至少正3的凈電荷。
17.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述試劑在生理學pH下具有至少正4的 凈電荷。
18.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述致病性構象異構體特異性結合試劑經 可檢測標記。
19.如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述試劑用生物素進行可檢測標記。
20.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述試劑連接于固相支持體。
21.如權利要求20所述的方法，其特征在于，所述固相支持體選自硝基纖維素、聚苯 乙烯膠乳、聚氟乙烯、重氮化紙、尼龍膜、活化珠和磁敏性珠。
22.一種用于檢測非朊病毒致病性構象異構體的存在的方法，所述方法包括以下步驟使疑似含有所述非朊病毒致病性構象異構體的樣品與致病性構象異構體特異性結合 試劑在能使所述試劑與如果存在的所述非朊病毒致病性構象異構體結合以形成復合物的 條件下相接觸；使所述復合物與構象疾病蛋白特異性結合試劑在適合結合的條件下相接觸；和 通過其與所述構象疾病蛋白特異性結合試劑的結合來檢測所述樣品中如果有的話所 述非朊病毒致病性構象異構體的存在；其中，所述致病性構象異構體特異性結合試劑源自朊病毒蛋白片段并且優先與致病性 朊病毒蛋白相互作用。
23.如權利要求22所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在形成所述復合物之后 去除未結合的樣品材料。
24.如權利要求22所述的方法，其特征在于，所述構象疾病蛋白特異性結合試劑是標 記抗體。
25.如權利要求22所述的方法，其特征在于，所述非朊病毒致病性構象異構體是Αβ蛋 白，所述構象疾病蛋白特異性結合試劑是抗-Αβ抗體。
26.一種用于檢測非朊病毒致病性構象異構體的存在的方法，所述方法包括以下步驟使疑似含有所述非朊病毒致病性構象異構體的樣品與致病性構象異構體特異性結合 試劑在能使所述試劑與如果存在的所述非朊病毒致病性構象異構體結合以形成第一復合 物的條件下相接觸；去除未結合的樣品材料；使所述非朊病毒致病性構象異構體從所述第一復合物解離下來，從而形成解離的非朊 病毒致病性構象異構體；使所述解離的非朊病毒致病性構象異構體與第一構象疾病蛋白特異性結合試劑在允 許結合以形成第二復合物的條件下相接觸；和通過檢測所述第二復合物的形成來檢測樣品中如果有的話所述非朊病毒致病性構象 異構體的存在；其中，所述致病性構象異構體特異性結合試劑源自朊病毒蛋白片段并且優先與致病性 朊病毒蛋白相互作用。
27.如權利要求沈所述的方法，其特征在于，利用可檢測標記的第二構象疾病蛋白特 異性結合試劑來檢測第二復合物的形成。
28.如權利要求沈所述的方法，其特征在于，所述致病性構象異構體特異性試劑偶聯 于固相支持體。
29.如權利要求沈所述的方法，其特征在于，所述第一構象疾病蛋白特異性結合試劑 偶聯于固相支持體。
30.如權利要求沈所述的方法，其特征在于，通過使所述第一復合物暴露于硫氰酸胍 而使所述非朊病毒致病性構象異構體從所述第一復合物解離。
31.如權利要求沈所述的方法，其特征在于，通過使所述復合物暴露于高PH或低pH而 使所述非朊病毒致病性構象異構體從所述第一復合物解離。
32.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在解離之后中和高pH或 低PH的步驟。
33.如權利要求沈所述的方法，其特征在于，所述非朊病毒致病性構象異構體是Αβ蛋 白，所述構象疾病蛋白特異性結合試劑是抗-Αβ抗體。
34.如權利要求33所述的方法，其特征在于，通過使所述復合物暴露于高pH條件而使 所述Aβ蛋白從所述第一復合物解離。
35.如權利要求34所述的方法，其特征在于，所述高pH條件是約80°C下約0.IN的 NaOH0
36.一種用于檢測非朊病毒致病性構象異構體的存在的方法，所述方法包括以下步驟使疑似含有所述非朊病毒致病性構象異構體的樣品與第一致病性構象異構體特異性 結合試劑在能使所述第一試劑與如果存在的所述非朊病毒致病性構象異構體結合以形成 第一復合物的條件下相接觸；使所述疑似含有所述非朊病毒致病性構象異構體的樣品與第二致病性構象異構體特 異性結合試劑在能使所述第二試劑與所述第一復合物中的所述非朊病毒致病性構象異構 體結合的條件下相接觸，其中所述第二試劑包含可檢測的標記；和通過其與所述第二試劑的結合來檢測所述樣品中如果有的話所述非朊病毒致病性構 象異構體；其中，所述第一和第二致病性構象異構體特異性結合試劑源自朊病毒蛋白片段并且優 先與致病性朊病毒蛋白相互作用。
37.一種用于檢測非朊病毒致病性構象異構體的存在的方法，所述方法包括以下步驟(a)使疑似含有所述非朊病毒致病性構象異構體的樣品與構象疾病蛋白特異性結合試劑在能使所述試劑與如果存在的所述非朊病毒致病性構象異構體結合以形成復合物的條 件下相接觸；(b)去除未結合的樣品材料；(C)使所述復合物與致病性構象異構體特異性結合試劑在能使所述致病性構象異構體 特異性結合試劑與所述非朊病毒致病性構象異構體結合的條件下相接觸，其中所述致病性 構象異構體特異性結合試劑包含可檢測的標記；和通過其與所述致病性構象異構體特異性結合試劑的結合來檢測所述樣品中如果有的 話所述非朊病毒致病性構象異構體；其中，所述致病性構象異構體特異性結合試劑源自朊病毒蛋白片段并且優先與致病性 朊病毒蛋白相互作用。
38.一種用于檢測非朊病毒致病性構象異構體的存在的方法，所述方法包括以下步驟提供包含致病性構象異構體特異性結合試劑的固相支持體；合并所述固相支持體與可檢測標記的配體，其中，所述致病性構象異構體特異性結合 試劑對所述可檢測標記的配體的結合親和力比所述試劑對所述非朊病毒致病性構象異構 體的結合親和力弱；在能使所述樣品中可能存在的所述非朊病毒致病性構象異構體結合所述試劑并置換 所述配體的條件下合并樣品與所述固相支持體；和檢測所述試劑與所述樣品中的所述非朊病毒致病性構象異構體之間形成的復合物； 其中，所述致病性構象異構體特異性結合試劑源自朊病毒蛋白片段并且優先與致病性 朊病毒蛋白相互作用。
39.一種用于區分非朊病毒致病性構象異構體和非朊病毒非致病性構象異構體的方 法，所述方法包括以下步驟使疑似含有所述非朊病毒致病性構象異構體的樣品與致病性構象異構體特異性結合 試劑在能使所述試劑與如果存在的所述非朊病毒致病性構象異構體結合以形成復合物的 條件下相接觸；和通過所述致病性構象異構體與所述試劑的結合來區分所述非朊病毒致病性構象異構 體和所述非朊病毒非致病性構象異構體；其中，所述致病性構象異構體特異性結合試劑源自朊病毒蛋白片段并且優先與致病性 朊病毒蛋白相互作用。
40.一種診斷非朊病毒構象疾病的方法，所述方法包括以下步驟使疑似含有所述非朊病毒致病性構象異構體的樣品與致病性構象異構體特異性結合 試劑在能使所述試劑與如果存在的所述非朊病毒致病性構象異構體結合以形成復合物的 條件下相接觸；和通過其與所述試劑的結合來檢測所述樣品中如果有的話所述非朊病毒致病性構象異 構體；如果檢測到所述非朊病毒致病性構象異構體則診斷為構象疾病； 其中，所述致病性構象異構體特異性結合試劑源自朊病毒蛋白片段并且優先與致病性 朊病毒蛋白相互作用。
41.一種用于檢測非朊病毒致病性構象異構體的存在的方法，所述方法包括以下步驟使疑似含有所述非朊病毒致病性構象異構體的樣品與致病性構象異構體特異性結合 試劑在能使所述試劑與如果存在的所述非朊病毒致病性構象異構體結合以形成復合物的 條件下相接觸；和通過其與所述致病性構象異構體特異性結合試劑的結合來檢測所述樣品中如果有的 話所述非朊病毒致病性構象異構體；其中，所述致病性構象異構體特異性結合試劑包括具有SEQ ID NO =229,230,231,232, 233，234，235，236，237，238，239，240 或 241 的擬肽區域。
42.一種用于檢測非朊病毒致病性構象異構體的存在的方法，所述方法包括以下步驟使疑似含有所述非朊病毒致病性構象異構體的樣品與致病性構象異構體特異性結合 試劑在能使所述試劑與如果存在的所述非朊病毒致病性構象異構體結合以形成復合物的 條件下相接觸；和通過其與所述致病性構象異構體特異性結合試劑的結合來檢測所述樣品中如果有的 話所述非朊病毒致病性構象異構體；其中，所述致病性構象異構體特異性結合試劑選自
43. 一種用于檢測致病性阿爾茨海默病構象異構體的存在的方法，所述方法包括以下 步驟使疑似含有所述致病性阿爾茨海默病構象異構體的樣品與致病性構象異構體特異性 結合試劑在能使所述試劑與如果存在的所述致病性阿爾茨海默病構象異構體結合以形成 復合物的條件下相接觸；使所述復合物與構象疾病蛋白特異性結合試劑在適合結合的條件下相接觸；和 通過其與所述構象疾病蛋白質特異性結合試劑的結合來檢測所述樣品中如果有的話 所述致病性阿爾茨海默病構象異構體的存在；其中，所述致病性構象異構體特異性結合試劑是
44.如權利要求43所述的方法，其特征在于，所述致病性阿爾茨海默病構象異構體是 Αβ蛋白，所述構象疾病蛋白特異性結合試劑是抗_Αβ抗體。
45.如權利要求43所述的方法，其特征在于，所述致病性阿爾茨海默病構象異構體是tau蛋白，所述構象疾病蛋白特異性結合試劑是抗-tau抗體。
46.如權利要求43所述的方法，其特征在于，所述致病性構象異構體特異性試劑偶聯 于磁珠。
全文摘要
本發明提供了用于檢測樣品中非朊病毒致病性構象異構體的存在的方法，該方法包括使疑似含有非朊病毒致病性構象異構體的樣品與致病性構象異構體特異性結合試劑在能使所述試劑結合致病性構象異構體(如果存在的話)的情況下相接觸；和根據其與試劑的結合檢測樣品中的致病性構象異構體(如果有的話)；其中，致病性構象異構體特異性結合試劑通常源自朊病毒蛋白片段并優先與致病性朊病毒蛋白相互作用。本發明還提供了用于診斷構象疾病的方法。
文檔編號G01N33/53GK102083450SQ200980115911
公開日2011年6月1日 申請日期2009年4月29日 優先權日2008年4月30日
發明者A·劉, A·楊, D·佩列茲, M·(C·)高, P·吳, X·王 申請人:諾華有限公司