專利名稱：測定和表征人體液中微泡的新方法
技術領域：
本發明大體上涉及癌癥診斷領域。更具體地，本發明涉及定量和定性人體液中外來體(exosomes)的方法。
背景技術：
外來體是大小介于30-120nm之間的微泡，其通過通常用于受體釋放和細胞間相互通信的胞吐途徑活躍地分泌。在多步超速離心后，可以在細胞培養上清液和一些體液中檢測到外來體。除了主要組織相容性復合體蛋白(MHC I、MHC II)以及參與抗原呈遞的蛋白之外，外來體可能攜帶參與多種細胞功能的膜蛋白和胞質蛋白。在特定生理條件下，從不同細胞類型分泌外來體，所述細胞類型如樹突狀細胞(DC)、淋巴細胞、肥大細胞和上皮細胞。該過程導致形成了籃樣細胞貯器，其含有也稱為多泡體(MVB)的這些多融合源微泡。已通過超結構觀察分辨了該過程，特別是在正常細胞中。但是，通過外來體制備物的免疫電子顯微鏡和蛋白質印跡分析已表明這些微泡共表達了不同胞內液泡的標志物，如早期內涵體 (例如，Rab5)、溶酶體(例如CD63、CD81、LAMP-1)和晚期吞噬體(Rab7)，以及其它一些細胞特異性更強的蛋白(例如MHC III類抗原)。從腫瘤細胞釋放的外來體明顯多于從正常細胞釋放的外來體，并且它通常與免疫抑制作用有關。除了一些腫瘤標記物(如，結腸癌的CEA、黑素瘤的MART-I或gp-100)的表達外，腫瘤來源的外來體在多個方面與正常細胞的外來體可比較。此外，似乎腫瘤外來體的來源在多個方面是與正常外來體不相似的。這可能是由于惡性細胞從細胞質到胞外環境的囊泡運輸更有活力所造成的，反之亦然。腫瘤外來體在癌癥發展中的作用是最近出現的研究領域。初始數據表明這些細胞器起到DC介導的T細胞交叉激活的腫瘤抗原性材料載體的作用。這些結果支持了使用腫瘤外來體作為抗癌疫苗的臨床嘗試。越來越多的有關這些微泡對免疫系統不同組件所施加的一大批抑制作用的證據明確支持腫瘤外來體參與了疾病發展。特別地，最近表明由各種來源的人腫瘤細胞分泌的外來體能夠通過死亡配體(例如i^asL、TRAIL)的表達在激活的T 細胞中引起細胞凋亡，并且能夠抑制NK功能和促使從正常單核細胞生成骨髓源抑制細胞。 這些數據連同腫瘤可能來源的外來體可以在癌癥患者的血漿和腫瘤滲漏中大量存在這一可復現證據支持了腫瘤外來體在影響宿主微環境以允許腫瘤細胞生長和發展中的作用。考慮到對外來體在癌癥發展中的作用理解的深入以及對發現新治療、改善對腫瘤惡性程度以及生長的診斷和隨訪的需求不斷提高的這一事實，因此需要檢測和測定人體液中外來體的方法和工具。然而，事實上目前用于檢測外來體的方法不是非定量的(TEM)，就是定量性較差(WB)。盡管流式細胞術已用于定量外來體，但該方法不能進行研究人員需要的精確測定。事實上，雖然FACS (熒光激活細胞分選法)分析是定量細胞(即使是小尺寸細胞)的合適方法，但是它不適合于對這些小囊泡(即50-100nm)的量進行定量。此外，總平均熒光的粗略測定不能對給定樣品中存在的微泡數量進行精確定量。此外，FACS分析不允許同時分析不同的樣品。因此，需要對來自少量體液的外來體進行檢測和定量的方法。此外，考慮到癌癥早期診斷對疾病治療至關重要這一事實，需要潛在的腫瘤標志物和預后因子。發明簡述獲得有關外來體的有用體內數據的主要問題為從人體液(特別是從血漿)獲得外來體以對其進行定量和表征的目前可用方法的效率水平較低。所述體液也可以是腹水、腦脊液、骨髓、尿液、糞便或支氣管肺泡洗液。為了提供目前所面臨的這些問題的解決方案，本發明公開提供了對來自體液(特別是來自人血漿)的外來體進行檢測和定量的簡單可靠的方法。根據本發明公開，基于ELISA的檢測(稱為hoTest)允許對來自健康供體和腫瘤患者人血漿的外來體進行定量和表征。通過該測試，有可能對來自移入人黑素瘤或結腸癌細胞的SCID小鼠以及腫瘤患者的血漿的外來體樣微泡進行表征。本發明公開顯示血漿外來體水平與腫瘤大小直接相關，并且僅在從腫瘤患者血漿純化的外來體中可檢測到窖蛋白-1。根據本發明公開，人患者血漿中腫瘤外來體的檢測在人惡性腫瘤的診斷和隨訪中是有用的。本文公開的技術允許進行在腫瘤診斷、隨訪和篩選的臨床實踐中有用的非侵入性測試。根據本發明公開所述的技術還在腫瘤的臨床研究中有用。此外，正如已知可以在細胞釋放的外來體內或在血漿中檢測到一些病毒(例如，HIV和HCV)以及朊病毒，本發明公開所述的技術還可以用于表征和研究其它疾病，如病毒、傳播性和自身免疫性疾病。此外， 基于在外來體上表達的蛋白(例如，腫瘤標志物、病毒蛋白、朊病毒蛋白)，本發明提供了改善現有臨床測試的工具。本發明的原理基于兩個要點1.先前技術中沒有使得能夠對外來體進行定量和表征的方法，特別是對通常在人血漿樣品中獲得的少量外來體。2.在多種人類疾病狀況(特別是癌癥)中對非侵入性診斷和/或預后測試尚未滿足的需求。因此，本發明的目標是提供定量和表征外來體的方法，特別是定量和表征少量(in small volumes)夕卜來體的方法。本發明的另一個目標是提供定量和表征血漿樣品中外來體的方法。本發明的另一個目標是提供測定少于2ml的體液中外來體水平以及對外來體的蛋白組成進行基本完全表征的方法。此外，本發明的目標是提供同時定量幾個樣品中外來體的方法。另外，根據本發明公開所述的測試表明血漿中外來體的數量與腫瘤大小有關。因此，本發明的另一個目標是提供隨訪以及提供癌癥患者預后的方法。此外，本發明的目標是提供測試以建立血漿外來體的細胞來源并評價其中是否存在一些傳染性(HIV、HCV)和/或傳播性(transmissible)試劑(例如，朊病毒蛋白)。
圖1.從人黑素瘤細胞培養物上清液中純化的外來體的檢測。A.用于外來體檢測和定量的Ex0Test(ELISA)裝置示意圖。B.通過ExoTest對純化的⑶63+外來體進行劑量遞增分析。初始濃度相當于50 μ g外來體，并且將外來體以2倍稀加入。C.在從人黑素瘤細胞(Me501)培養上清液純化的不同量的外來體中的⑶63、 Rab5b和Lamp-I表達的蛋白質印跡分析。D.在從Me501細胞上清液純化并涂覆至乳膠珠的黑素瘤來源的外來體中的Ral^b 和⑶63表達的FACS分析。圖2.移入人黑素瘤的SCID小鼠的血漿外來體的檢測。A.通過ExoTest對從移入人黑素瘤細胞的SCID小鼠的血漿中純化的腫瘤外來體進行的劑量遞增分析。B.在從移入人黑素瘤細胞(Me501)的SCID小鼠血漿純化的外來體中進行的 Rab-5b和CD63表達的FACS分析。C.在腫瘤生長的不同時間分析的移入Me501的SCID小鼠中的血漿外來體水平與腫瘤大小的相關性。每個時間點用5只動物表示小鼠組。外來體水平表示為0D450X1000。圖3.外來體中窖蛋白-1 (Cav-I)表達的表征A.人黑素瘤細胞和巨噬細胞的細胞提取物和外來體中Cav-I的蛋白質印跡分析。B.從Me501細胞、移入Me501的SCID小鼠血漿以及腫瘤陰性SCID小鼠血漿純化的外來體中⑶64、Rab-5b和Cav-I的蛋白質印跡分析。C.從移入了 Me501的SCID小鼠血漿純化的外來體中Cav-Ι表達的FACS分析。D.來自攜帶黑素瘤并在移入后5周處死的SCID小鼠的⑶63+和Cavl+外來體的血漿水平。圖4.來自黑素瘤患者的血漿中的外來體的定量。使用⑶63 (A)或窖蛋白-1⑶作為檢測抗原，通過ExoTest對從健康供體和黑素瘤患者的血漿純化的外來體進行定量。用箱線圖示表示數據每個箱中的水平線和垂直線分別表示中位數和第一四分位數-第三四分位數。黑點表示離群值。外來體水平表示為 0D450X 10000。通過曼-惠特尼檢驗(Mann-Whitney test)評價了組間差異。圖 5.未分離(unfractioned)樣品的 ExoiTest (Elisa)測試A.與人巨噬細胞、黑素瘤細胞的未分離培養上清液(50ml)以及黑素瘤患者的血漿相比，測定了純化的外來體(50yg蛋白)中可檢測外來體的量。數據表示為平均值 +/-SD。B.在患者(ri = 9，實心菱形)和健康供體(ri = 4，空心菱形)的純化的或未分離的血漿樣品中測定的CD63+外來體的血漿水平的回歸分析。外來體水平表示為0D450X 1000。圖6.黑素瘤患者血漿中外來體的定量使用CD63或如gplOO和MART-I的典型黑素瘤蛋白作為檢測抗原，通過ExoTest 對從黑素瘤患者(MEL)和健康供體(HD)血漿純化的外來體進行定量。數據表示為平均值士 SD。外來體水平表示為0D450X1000。發明詳述外來體是大小介于30-120nm之間的微泡，通過正常細胞以及腫瘤細胞將其活躍地分泌到胞外環境中。考慮到對外來體在癌癥發展中的作用理解的深入以及對發現新治療、改善對腫瘤惡性程度以及生長的診斷和隨訪的需求不斷提高的這一事實，因此需要檢測和測定人體液中外來體的方法和工具。由于通過一系列對腫瘤微環境有害的作用外來體潛地參與了疾病發展的促進，因此通過靈敏、特異并且可行的測定對人血漿或血清中外來體進行定量的可能性成為關鍵問題。如果這種測定可用，則它將成為評價這些微泡在癌癥預后中潛在作用的基礎工具以及作為檢測或監測腫瘤性疾病的新型預后因子或標志物。但是，目前使用的方法(例如TEM和WB)不能定量或者定量性較差，借此明確地需要定量檢測和測定人體液中外來體的方法。因此，本發明公開的目標是為臨床腫瘤學家提供診斷癌癥患者并對其進行隨訪研究的新型工具。此外，本發明公開的目標是提供用于診斷其它人類疾病的新方法，如病毒或朊病毒疾病，其中顆粒在微泡中傳播。本文公開的新型定量測試是基于ELISA介導的外來體檢測，并且它是第一個簡單、靈敏并且可靠的外來體定量測試。通過本方法檢測的蛋白不是外來體特異性的，而是僅由如內涵體和溶酶體的胞質細胞器共有的，這些細胞器的膜不會作為質膜結構回收利用。 該特征排除了檢測壞死腫瘤細胞來源的碎片上的這些蛋白或它們的溶解形式的可能性。本發明公開的測定優選地包括通用腫瘤標志物(窖蛋白1)，其允許優先檢測腫瘤分泌的外來體。通過以下實施例中所述的不同比較性方法(蛋白質印跡(Western blotting)和流式細胞術)以及不同實驗條件進行的一系列綜合研究，證明了本發明公開的新型測試的可靠性。本發明公開的新型方法是基于我們稱為ExoTest的夾心ELISA測試，其基于持家蛋白(CD63和Rab-5)以及腫瘤相關標志物窖蛋白_1的表達對血漿外來體進行捕獲和定量。ExoTest使用抗-Ral^抗體捕獲純化的外來體制備物中存在的外來體。作為檢測抗體，ExoTest使用識別外來體抗原(CD63)或由外來體的細胞來源表達的其它抗原如窖蛋白-1 (與腫瘤轉移行為有關的蛋白)的抗體。在第一組實驗中，我們使用了來自人腫瘤細胞系培養基的外來體制備物，并且將ExoTest的結果與通過蛋白質印跡和FACS獲得的那些結果進行比較。結果表明使用所有三種方法時，外來體制備物中的典型外來體抗原均為可檢測的。然而，與FACS或WB(蛋白質印跡)分析相比，ExoTest允許對具有更少量起始材料的相同制備物中的外來體和更廣泛的蛋白組進行定量分析。當對血漿樣品進行分析時，該技術特征極其重要。實際上，使用WB時，對移入人黑素瘤或結腸癌細胞的SCID小鼠的血漿混合物的分析經常是不可重復的或者至少是很難重復的，但是ExoTest允許對人腫瘤-SCID 小鼠血漿中的外來體水平進行定量分析。新穎且重要的發現是，基于ExoTest結果，血漿中的外來體水平與腫瘤大小顯著相關并且在移入后隨時間增加。此外，循環的外來體連同典型的蛋白呈現出由在小鼠中生長的人腫瘤表達的腫瘤標志物(未顯示)。因此，使用CD63作為檢測抗原的ExoTest能夠對黑素瘤患者和健康受試者的血漿中的外來體進行定量。由于腫瘤細胞分泌大量外來體，因此未發現黑素瘤患者和健康對照人的血漿中CD63陽性外來體水平之間的差異的確令我們感到吃驚。為了鑒別可能的腫瘤特異性外來體，我們使用窖蛋白-1作為檢測抗原進行了 ExoTest。最近的出版物已報道了循環的窖蛋白-1的血漿水平與轉移性前列腺腺癌顯著相關。有趣的是，窖蛋白-1已經參與了致癌細胞轉化的病理發生、腫瘤發生和轉移。首先，我們通過FACS和WB證明窖蛋白-1存在于從移入腫瘤的SCID 小鼠和腫瘤患者的血漿純化的人腫瘤來源的外來體中。然后，通過使用ExoTest，我們能夠觀察到與健康個體的血漿相比，腫瘤患者中窖蛋白-1陽性外來體的血漿水平顯著提高，這表明窖蛋白-1可能代表了特異性腫瘤標志物，并且ExoTest是定量這種提高的成功測試。總之，結果表明檢測外來體的ExoTest能夠發揮作用并且對人循環外來體的檢測和定量可用。此外，該測試提供了檢測血漿外來體制備物中不同蛋白的可能性，其對于特定類型的腫瘤患者具有潛在的應用。本發明公開還提供了基于血漿外來體定量和表征的用于腫瘤患者的新型預后/診斷工具。這與黑素瘤患者特別相關，因為靈敏并且可靠的血清標志物仍然有限并且LDH(乳酸脫氫酶)水平仍然是用于評價疾病過程和預后的唯一預后性血清因子。以下詳細說明了本發明。公開了實施例和實驗的細節以便為本領域技術人員提供更多的理解和指導。本發明的范圍由隨附的權利要求確定。
實施例實施例11.外來體的來源A.細胞培養上清液我們使用了兩類人腫瘤細胞系，即黑素瘤和結腸癌。Mel 501和Mel BS是通過手術切除(Istituto Nazionale del Tumori，Milan，Italy)從患者黑素瘤損傷部位獲得的兩種轉移性黑素瘤細胞系。我們還使用了兩種結直腸癌細胞系Colo206(從結直腸癌患者的肝轉移中產生)和 1869 col (由 IstitutoSuperiore di Sanita，的 Maccalli 博士提供)。 所有細胞系均在RPMI 1640培養基上培養，其中添加了 100IU/ml青霉素、ΙΟΟμ g/ml鏈霉素 (Gibco)、2mM 谷氨酰胺 I (Gibco)和 10% 胎牛血清(FCS) (Invitrogen, Milan, Italy)。使用 CD14 磁珠(Milteny Biotec, Germany)和 GM-CSF(500U/ml)培養 5 天，從健康血液供體的白細胞層獲得了人單核細胞源巨噬細胞(MDM)。B.人腫瘤SCID-小鼠血漿使用4-5 周齡的 CB. 17 SCID/SCID 雌性小鼠(Harlan，S. Pietro al Natisone, Italy)并且將其保持在特定的無病原體的條件下。根據MCCR準則執行所有動物程序。將 SCID小鼠飼養在小型隔離籠中，并且所有食物、水和草墊在使用前高壓滅菌。在小鼠右側皮下注射人黑素瘤或結腸癌細胞，每只小鼠注射2. 5 X IO6個細胞。用卡尺測定腫瘤生長并且如前所述(Luciani L等人，J. Natl. Cancer Inst.，2004)根據以下公式估計腫瘤重量腫瘤重量(mg)=長度(mm) X寬度2(mm)/2。使移入的腫瘤生長至500mg重，并且從在腫瘤生長不同時間點處死的不同動物中收集移入腫瘤的小鼠的500 μ 1血漿。C.人供體和腫瘤患者的血漿從來自患有原發性或轉移性黑素瘤的患者以及年齡和性別相當的健康供體并經過EDTA處理的全血中收集人血漿樣品。將樣品儲存于-70°C直至分析。2.體外和體內外來體的制備從T-175燒瓶中7 匯合的細胞培養物中收集人黑素瘤和結腸癌細胞系的上清液，并且按照先前的說明(Andreola等人，J.Exp. Med. 2002)稍加修改進行微泡分離。簡而言之，在300Xg離心10分鐘使細胞成顆粒之后，將上清液在1200Xg離心20分鐘，接著在 IOOOOXg 離心 30 分鐘。使用 0. 22 μ m 濾器(Stericup , Millipore Corp.，Bedford, Massachusetts,USA)過濾該上清液，然后在Beckman超速離心機(Beckman Coulter)中以 IOOOOOXg離心1小時從而使外來體成顆粒。用大量磷酸鹽緩沖液(PBQ清洗一次后，將外來體懸浮于少量PBS中或懸浮于適當的裂解緩沖液中，并將其儲存于-80°C直至進一步實驗分析。為了從血漿樣品中獲得外來體，將來自移入人腫瘤的SCID小鼠或來自腫瘤患者和健康供體的肝素化血液在400Xg離心20分鐘。然后收集血漿、將其分成等份并儲存于_70°C直至分析。使用對小體積進行超速離心的Beckman TL100對血漿樣品進行如上所述的相同離心程序以分離外來體。3.外來體的流式細胞術分析在結合于乳膠珠的純化外來體上通過流式細胞術分析確定了外來體上的抗原表達。將外來體制備物(5-10 μ g)與5μ 1直徑4μπι的醛/硫酸鹽乳膠珠(Interfacial Dynamics, Portland, OR) —同培育，并重懸浮于含有2 % FCS的400 μ 1 PBS中。將外來體涂覆的珠(20 μ 1)在4 °C與下列抗體培育30分鐘抗_Rab5 (Santa Cruz)、 抗-CD63-FITC (Pharmigen)、抗-CD81-PE (Pharmingen)、抗窖蛋白 _1 (N-20 克隆，Santa Cruz)，然后，如果需要，與PE-或FITC-偶聯的二抗一同培育并在FACSCalibur流式細胞儀 (BDBiosciences)上進行分析。4.外來體的蛋白質印跡分析在含有Triton X_100、0. 1 % SDS、0. IM Tris HCl (pH 7)和蛋白酶抑制劑 (10 μ g/ml抑肽酶、10 μ g/ml亮肽素和2mM苯甲磺酰氟)(Sigma)的裂解緩沖液中裂解純化的外來體。通過Bradford微測定方法(Bio-RadLaboratories,Hercules, CA)確定外來體蛋白的濃度。將總計50 μ g的蛋白重懸浮于SDS樣品緩沖液并煮沸5分鐘，在10 %的SDS-PAGE 凝膠上分離并在硝酸纖維素上進行電轉染(Protran BA85, Schleicher and Schuell)。將膜與⑶63 (1 50稀釋)和Rab-恥(1 50稀釋)的抗體進行印跡反應，用適當的HRP偶聯二抗(Amersham Pharmacia)培育并通過增強化學發光法顯像(ECL，Pierce)。5.開發用于外來體的ELISA測試(ExoTest)根據本發明公開的新型ELISA測試(ExoTest)是基于外來體中存在的特異性蛋白。如內涵體和溶酶體的胞質細胞器共有這些蛋白(分別為Rab-5和CD63)，所述細胞器的膜不像質膜結構一樣會脫落或重利用，因此排除了存在來源于膜破裂的結構的可能性。將96 孔板(Nunc, Milan, Italy)用多克隆抗 _Rab_5b 抗體(A-20 克隆，Santa Cruz)包被，每孔加入100 μ 1 WpH 9. 6的碳酸鹽緩沖液，其中所述抗體的最終濃度為 4yg/ml，將該孔板在4°C培育過夜。用PBS清洗3次后，每孔加入100 μ 1的封閉溶液(含有0. 5% BSA的PBS)并在室溫下保持1小時。用PBS清洗3次后，加入50 μ g純化的外來體(最終體積為100 μ 1/孔)并在37°C培育過夜。用PBS清洗3次后，用封閉溶液將適當的檢測抗體(抗-CD63單抗(H5C6克隆，Pharmingen)或抗窖蛋白_1單抗(2297克隆， Pharmingen))稀釋為4 μ g/ml，每孔為100 μ 1，并將其在37°C培育1小時。用PBS清洗3 次后，在室溫下將該板與用封閉溶液1 50000稀釋的ΙΟΟμΙ HRP-偶聯抗-小鼠過氧化物酶二抗(Pierce,Milan, Italy) 一同培育1小時。用PBS清洗最后3次后，用POD (Roche Applied Science, Milan, Italy)使反應顯色，并用IN的H2SO4封閉，使用450nm的濾光器 (Biorad)通過ELISA讀數儀記錄光密度。實施例2ExoTest提供了對細胞培養制備物中所存在外來體的定量并且與蛋白質印跡分析相比，它具有更高的外來體蛋白檢測靈敏度。
根據標準程序處理黑素瘤和結腸癌細胞系的培養上清液以獲得如上所述的純化外來體。對通過差速離心從細胞培養上清液中獲得的外來體制備物進行建立以檢測外來體的夾心ELISA (ExoTest，見圖1A)。ExoTest能夠提供對細胞培養上清液中所存在外來體的定量，從而使CD63+外來體以劑量依賴的方式可檢測(圖1B)。以來源于IOOOOg離心后所獲得顆粒的部分、僅從細胞培養基純化的外來體以及僅以二抗為代表的陰性對照產生了幾乎不可檢測的光密度(0D = 0. 07+/-0. 01)。對在三個不同平板上進行的相同制備物的6個重復計算了檢驗內和檢驗間差異，并且分別為30%和35%。相同的純化外來體制備物的蛋白質印跡和FACS分析確認了通過ExoTest獲得的定性數據。事實上，通過外來體裂解物中的WB，Rab-5b、Lamp-I以及在較少程度上的⑶63 蛋白均在多種外來體制備物中是可檢測的(圖1C)而通過對結合于乳膠珠上的外來體進行的FACS, Rab-5b和CD63是可檢測的(圖1D)。但是，相對于WB分析，通過ExoTest進行的外來體檢測和定量對CD63蛋白的檢測表現出更高靈敏度(圖1C)。確實，通過WB正確檢測 ⑶63或Rab-恥需要至少12. 5μ g外來體蛋白，而ExoTest能夠以最少3μ g的純化外來體制備物的量明確地檢測外來體。實施例3通過FACS、WB和Exokst獲得的移入人腫瘤的SCID小鼠的體內外來體制備物的定性和定量結果的比較為了驗證使用ExoTest進行人腫瘤源外來體體內檢測的可能性，我們首先進行了向SCID小鼠皮下注射人黑素瘤(Me501)和結腸癌細胞系的實驗。在第一個實驗中，將從攜帶移入腫瘤(100-500mg)的SCID小鼠處死時獲得的血漿樣品進行外來體純化程序。與從細胞培養上清液純化的外來體一樣，通過ExoTest (圖2A)和FACS (圖2B)也能夠清楚并且特異地檢測從小鼠血漿純化的外來體。從對照SCID小鼠(未移入人腫瘤)的血漿獲得的外來體制備物所產生的背景光密度與空白樣品相當(0D = 0. 08士0. 03)，因此表明在免疫緩和的動物中不存在外來體，或者小鼠外來體與人CD63和Rab-恥不產生交叉反應。再次， 為了獲得與使用WB分析相當的結果，ExoTest所需的外來體制備物的量顯著較少。證明可以通過ExoTest回收并檢測人外來體后，為了評價人腫瘤-SCID小鼠中血漿外來體的量是否與腫瘤負荷相關，我們進行了時程實驗。在這些實驗中，使黑素瘤腫瘤在早期移入后生長達5周，從移入后第14天開始并且在隨后的3周內，從各個動物的血漿純化并定量外來體。結果顯示ExoTest所檢測的人外來體的量隨時間平行于腫瘤大小的增加而增加(圖2C)；這表明血漿外來體的定量是監測腫瘤生長的重要方法。使用MeBS細胞獲得了相似的結果(未顯示)。實施例4腫瘤外來體表達窖蛋白-1由于已知外來體代表了細胞間交流的重要并且特異的途徑，因此我們推斷腫瘤源外來體可能與正常生理條件下的循環外來體不同。最近已報道了從前列腺癌PC-3細胞系分離的前列腺小體(由前列腺癌細胞分泌的膜囊)含有窖蛋白-1蛋白，它是細胞膜穴樣內陷的主要成分。另外還已知與健康受試者相比，前列腺癌患者中窖蛋白-1的血清水平升高(Tahir，2003 #21)。但是，現有技術均未表明該蛋白與血液中的膜囊的關系。因此，我們評價了從移入黑素瘤腫瘤的SCID小鼠的血漿中獲得的外來體上是否存在窖蛋白-1。如
10圖3A上結果所證明的，Cavl在人黑素瘤細胞體外分泌的外來體上強烈表達，而在細胞提取物和來自正常人細胞(如，例如原發性單核細胞源巨噬細胞(MDM))的外來體上檢測不到。 這些結果表明以外來體包埋形式分泌的Cal可能是黑素瘤細胞的特異性特征，因此代表了腫瘤源外來體離體分析的潛在標志物。因此，我們研究了從移入黑素瘤腫瘤的SCID小鼠的血漿中獲得的外來體上是否存在Cavl。通過蛋白質印跡(圖3B)、流式細胞術(圖3C) 和ExoTest (圖3D)，在來源于移入黑素瘤腫瘤的SCID小鼠血漿的外來體制備物中檢測了 Cavl，而在對照動物血漿源外來體中未檢測到Cavl (圖!3B、3D)。與黑素瘤和結直腸癌(CRC) 患者的結果一致，通過ExoTest可以使用其它腫瘤標志物(如，黑素瘤的MelanA/Mart-Ι和 CRC的CEA)檢測帶有腫瘤的SCID小鼠中腫瘤外來體的體內釋放，其結果與通過Cavl獲得的結果相當。但是，由于黑素瘤表達的MelanA/MART-Ι可能是不均勻的或表達量較低(特別是在轉移水平時)，并且CEA主要以溶解形式存在于CRC患者的血清中，因此Cavl是更可靠并且可重復的腫瘤標志物。因此，在進一步包括抗-Cavl-特異性抗體的情況下發展了 ExoTest0實施例5通過ExoTest對腫瘤患者血漿的體內外來體制備物進行定量以血漿中外來體的量作為預后工具從人腫瘤-SCID小鼠模型中獲得的數據促使我們研究了 ExoTest是否也能夠檢測和表征從人血漿純化的外來體。如果有可能進行定量，那么我們的目標是驗證腫瘤患者的循環血漿外來體在數量和/或質量上是否不同于健康供體血漿中的那些外來體。從腫瘤患者(n = 62)和健康供體(n = 37)的血漿中純化了外來體，然后對其進行ExoTest和蛋白質印跡以確定是否存在Rab5和⑶63。表1示出了基于⑶63和Cavl表達通過ExoTest進行的外來體定量。表1.研究群組中血菜外來體和LDH水平。CD63+和Cav Ι+exo為用0D450X 1000 表示的血漿外來體。血漿LDH值表示為IU/L。數據用平均值表示(95% C. I.)
CD63+Cavl+exoLDH黑素瘤患者(n = 62)478(390 至 566)524(458 至 590)438(321 至 555)健康供體(n = 37)236(188 至 285)213(180 至 246)360(240 至 480)ExoTest測試允許對從黑素瘤患者和健康供體的血漿純化的外來體中的外來體蛋白進行檢測(圖4A)，與健康供體相比，黑素瘤患者血漿中的外來體水平高達四倍(ρ < 0. 001)。為了確定基于檢測兩種外來體蛋白標志物的ExoTest的靈敏度和特異性，我們計算了表達⑶63和Cavl的血漿外來體的截止值(健康供體樣品中的平均值+/-2SD)，其分別為526和411 (0D450X 1000)。ExoTest對CD63+外來體的檢測表現出低靈敏度(36% ) 和良好的特異性(97. 3% )，而ExoTest對Cavl+外來體的檢測具有較高的靈敏度(62% ) 和相似的特異性(97. 3% )。與該觀察一致，黑素瘤患者中Cavl+外來體的血漿水平顯著高于⑶63+外來體的水平(P = 0. 04)。這些結果表明i)循環Cavl可能與黑素瘤患者中的外來體有關；和ii)可以認為帶有Cal的血漿外來體的定量是有用的腫瘤標志物。另外，我們發現血漿LDH即不與⑶63+血漿外來體相關也不與Cavl+血漿外來體相關，而在⑶63+和Cal+血漿外來體之間觀察到了顯著的相關性(史匹曼系數(Spearman coefficient)為0. 25，P = 0. 04)(圖4C)。此外，ExoTest揭示了在癌或黑素瘤患者的血漿中存在腫瘤抗原，如MART-I或CEA (圖6)。分析中所包括的多數患者(62位中有57位)受到晚期疾病(III-IV期)的影響。 通過ExoTest檢測了所有疾病階段中血漿外來體水平的廣泛分布，其表明不同患者外周循環中存在的外來體量的變化可能反映不同的腫瘤侵襲性水平，并且因此可能成為黑素瘤的新型獨立預后因子。美國癌癥聯合會(AJCC)所指明的其它預后因子包括原發性黑素瘤厚度和潰瘍、轉移性淋巴結數目以及遠處轉移的位點和數目，如本發明公開的結果所表明的， 它們也可能與外來體血清含量相關。實施例6全血漿可以用于外來體定量ExoTest用于臨床目的的潛在應用促使我們驗證了 ExoTest是否可以用于未分離生物液體中外來體的檢測，這將允許進行簡單并且可重復的分析以避免超速離心步驟。 因此，我們比較了來自未分離樣品(人巨噬細胞和黑素瘤細胞的細胞培養上清液以及人血漿)的CD63+外來體以及從相同樣品純化的外來體的檢測和定量。為了提高測試的靈敏度，對于這些特定的實驗，將HRP-偶聯的單抗培育30分鐘而不是15分鐘。如圖5A所示， ExoTest可檢測來自未分離的巨噬細胞和黑素瘤培養上清液以及來自9位黑素瘤患者血漿的外來體的存在性。此外，我們對來自4位健康供體的血漿進行了相同的分析，并且所分析的全部樣品(9位患者+4位健康供體)的回歸分析顯示在這兩種類型的測定之間存在顯著的相關性(圖5B)。這些結果表明了 ExoTest在臨床環境中的潛在應用，其能夠使用全血漿并避免復雜且耗時的外來體純化程序。參考文獻Thery C, Zitvogel L, Amigorena S. Exosomes !composition, biogenesisand function. Nat Rev Immunol. 2002 Aug ；2 (8) :569-79.Stoorvoge 1 W, Kleijmeer MJ, Geuze HJ, Raposo G. The biogenesis andfunctions of exosomes. Traffic. 2002 May ；3 (5) :321-30.Lamparski HG, Metha-Damani A, Yao JY, Patel S, Hsu DH, Ruegg C, LePecq JB. Production and characterization of clinical grade exosomes derivedfrom dendritic cells. J Immunol Methods. 2002 Dec 15 ；270 (2) :211-26.Wubbolts R, Leckie RS, Veenhuizen PT, Schwarzmann G, Mobius W, Hoernschemeyer J, Slot Jff, Geuze HJ, Stoorvogel W. Proteomic andbiochemical analyses of human B cell-derived exosomes. Potential implicationsfor their function and multivesicular body formation. J Biol Chem. 2003 Mar28 ；278(13) 10963-72.Blanchard N,Lankar D,Faure F,Regnault A,Dumont C,Raposo G,HivrozC. TCR activation of human T cells induces the production of exosomes bearingthe TCR/ CD3/zeta complex. J Immunol. 2002 Apr 1 ； 168 (7) :3235-41.
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30531權利要求
1.定量和定性人細胞源樣品中或體液中外來體的方法，所述方法包括以下步驟a)從所述人細胞源樣品或體液純化外來體制備物；b)用一抗捕獲所述純化的外來體制備物中的外來體；c)用檢測抗體檢測結合的外來體；d)使酶聯二抗與所述檢測抗體反應；e)加入底物；和f)檢測所述反應。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述體液為人血漿樣品、腹水、腦脊液、骨髓、尿液、糞便或支氣管肺泡洗液。
3.根據權利要求2所述的方法，其中使用的所述體液的體積為少于^iil。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述一抗為抗-Rab恥抗體。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述檢測抗體為抗-CD63或抗窖蛋白-1。
6.監測腫瘤生長的非侵入性方法，所述方法包括下列步驟a)定期獲取患者的體液樣品；b)從所述樣品純化外來體制備物；c)用一抗捕獲所述純化的外來體制備物中的外來體；d)用檢測抗體檢測結合的外來體；e)使酶聯二抗與所述檢測抗體反應；f)加入底物；g)檢測所述反應；和h)獲得所檢測的外來體數量與腫瘤大小之間的相關性。
7.根據權利要求6所述的方法，其中所述一抗為抗-Rab恥抗體，而所述檢測抗體為抗-⑶63或抗窖蛋白-1。
8.根據權利要求6所述的方法，其中所述腫瘤為黑素瘤腫瘤。
9.通過使用根據權利要求1所述的方法檢測帶有窖蛋白-1的外來體以診斷腫瘤的方法，其中所述檢測抗體為抗窖蛋白-1。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述腫瘤為黑素瘤腫瘤。
11.用于定量和定性人細胞源樣品中或體液中外來體的檢測試劑盒，所述試劑盒包括a)從人細胞源樣品或從體液純化外來體制備物的說明書；b)用于捕獲所述純化的外來體制備物中外來體的一抗制備物；c)用于檢測結合的外來體的檢測抗體制備物；d)用于與所述檢測抗體反應的酶聯二抗制備物；和e)所述酶的底物。
12.根據權利要求11所述的檢測試劑盒，其中所述一抗為抗-Rab恥抗體，而所述檢測抗體為抗-⑶63或抗窖蛋白-1。
13.確定循環外來體中是否存在傳染性和/或傳播性試劑的方法，所述方法包括以下步驟a)從人細胞源樣品或從體液純化外來體制備物；b)用一抗捕獲所述純化的外來體制備物中的外來體；c)用檢測抗體檢測結合的外來體；d)使酶聯二抗與所述檢測抗體反應；e)加入底物；和f)檢測所述反應。
14.根據權利要求13所述的方法，其中所述傳染性試劑為HIV或HCV病毒蛋白。
15.根據權利要求13所述的方法，其中所述傳播性試劑為朊病毒蛋白。
全文摘要
本發明公開提供了通過使用夾心ELISA測試捕獲、檢測、表征和定量少量人體液中人外來體的方法。該方法允許對外來體制備物進行完全表征，因此提供了通過使用非侵入性測定區分疾病相關狀況與健康狀態的工具。事實上，該方法可用于使用簡單血漿樣品進行的腫瘤篩選、診斷和預后。同時，循環外來體的測定可以提供有關患者中存在的腫瘤水平的信息。本文提供的方法適合于評價在循環外來體中是否存在一些傳染性和/或傳播性試劑，如病毒蛋白或朊病毒蛋白。
文檔編號G01N33/53GK102317778SQ200980111452
公開日2012年1月11日 申請日期2009年1月26日 優先權日2008年1月25日
發明者M·洛戈齊, S·法伊斯 申請人:漢薩生物醫藥公司