專利名稱：一種相思子毒素的膠體金檢測試紙的制作方法
技術領域：
本實用新型屬于生物檢測領域，具體涉及相思子毒素的檢測試紙和在檢測相思子
毒素中的應用。
背景技術：
相思子毒素是從豆科藤本植物相思子(Abrusprecatorius)的種子中提取的一種 劇毒性高分子蛋白毒素，其含量約占種子2.8% 3.0%。相思子毒素存在4種同族毒素 (isoabrins)，艮卩abrin—a、abrin—b、abrin—c、禾口 abrin—d，相X寸分子質量介于63kDa 67kDa 之間，它們由不同的基因所編碼，但同屬于一個多基因家族；其中abrin-b、abrin-c由于其 B鏈凝集活性低而只有較弱的細胞毒性作用；而abrin-a、abrin-d則有極強的細胞毒性，小 鼠的LD50為0. 04 ii g/kg，成年人攝入的致死劑量為5. 0 ii g/kg 7. 0 y g/kg，其毒性強度 是蓖麻毒素(小鼠LD503. 0 ii g/kg)的70多倍，已被列為潛在的重要毒素戰劑和生物恐怖 病原物質之一。 針對相思子毒素中毒，目前國內外還沒有適用于人的解毒藥和特異抗毒素 等專用特效藥。針對這一現狀，對相思子類毒素等生物戰劑醫學防護領域的研究，重 點應集中在偵檢、治療和疫苗預防等方面。目前免疫技術是檢測相思子毒素中毒的 最常用技術手段，主要有放射性免疫法(Radioimmunoassay, RIA)和酶聯免疫吸附法 (Enzyme-linkedimm皿osorbent assay, EUSA)。 RIA技術主要是通過使用放射性元素1251對毒素進行標記，實現對蓖麻毒素中毒 的檢測和監控。這一方法非常適宜應用于對中毒患者血液中蓖麻毒素的含量檢查以及法 醫學鑒定，最低檢測線可達50 100pg/ml。其缺點是放射性元素的處理比較麻煩，且耗時 較長。ELISA技術現已被廣泛的應用于生物樣本中蓖麻毒素的檢測，最低檢測線可以達到 100pg/ml。基于免疫技術的生物傳感器也被應用于檢測毒素和生物戰劑，利用毒素不同的 響應元件作為傳感器的敏感組件，可以同時測定多種毒素毒劑，小巧輕便，適于野外及現場 的使用。 上述方法雖然靈敏度高，但對于樣品的檢測有很大的局限性首先，劇毒毒素的抗 體獲得比較困難，放射性免疫測定還要求至少知道分析物的部分一級結構；另外，ELISA法 孵育時間長，不適合作為現場檢測。上述方法已經滿足不了當代防恐需要，迫切需要可以現 場、快速、定量檢測相思子毒素的方法。
實用新型內容本實用新型的目的是提供一種方便、快捷地檢測相思子毒素的試紙。該試紙的工 作原理是利用特異性抗原_抗體的結合，用膠體金標記抗體，與待檢抗原結合后，使與試紙 上結合的捕獲抗體顯色。 本實用新型能夠基于一份標本和一個試紙，快速方便地檢測出標本中的相思子毒 素，節省了大量人力物力，方便、快速、簡捷。[0008] 本實用新型涉及一種方便、快捷地檢測相思子毒素的檢測試紙，它包含(i)反應支持物； (2)吸水墊； (3)硝酸纖維膜，該膜包被有兔抗重組相思子毒素A鏈多克隆抗體檢測條帶和質 控羊抗鼠IgG的質控條帶；所述的羊抗鼠IgG可購自鼎國生物技術有限公司，另外，金標抗 體保護膜標記的是鼠抗的重組抗體，所以質控用的是羊抗鼠IgG。 本實驗采用高純度的重組相思子A鏈抗原蛋白，免疫兔制備大量多克隆抗體，獲 得高純度高特異性的抗體。在抗體純化方面，除采用辛酸_硫酸銨分級沉淀方法獲得抗體 外；還利用抗體與蛋白A的高親和作用，采用重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF親和層析純化抗體。 (4)金標抗體保護膜，其中含有膠體金標記的鼠抗重組相思子毒素A鏈多克隆抗 體。 本實驗采用高純度的重組相思子A鏈抗原蛋白，以重組相思子A鏈作為抗原免疫 KM小鼠，然后腹腔注射S180細胞，剌激KM小鼠產生腹水，腹水量大，抗體效價高，獲得高純 度高特異性的抗體。在抗體純化方面，除采用辛酸-硫酸銨分級沉淀方法獲得抗體外；還利 用抗體與蛋白A的高親和作用，采用重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF親和層析純化抗體。 本實用新型涉及的上述相思子毒素的檢測試紙，它還包含樣品墊，該樣品墊的材 料選自聚酯膜、玻璃纖維或濾紙纖維。 本實用新型涉及的上述相思子毒素的檢測試紙，其中反應支持物選用PVC板。 本實用新型涉及的上述相思子毒素的檢測試紙，其中吸水墊選用濾紙。 本實用新型涉及的上述相思子毒素的檢測試紙，其中金標抗體保護膜選用聚酯
膜、玻璃纖維或濾紙纖維，其上均勻涂布有膠體金標記的鼠抗重組相思子毒素A鏈多克隆抗體。 另一方面，本實用新型涉及的上述相思子毒素的檢測試紙，其中吸水墊、硝酸纖維 膜、金標抗體保護膜、樣品墊和反應支持物按照附圖1所示方式構成；反應支持物5位于底 層，硝酸纖維膜2位于反應支持物5上的中部，該膜的T處是兔抗重組相思子毒素A鏈多克 隆抗體包被的檢測條帶，并且C處是羊抗鼠IgG包被的質控條帶；金標抗體保護膜3位于硝 酸纖維膜上部的一側并與之部分重疊，該膜含有膠體金標記的鼠抗重組相思子毒素A鏈多 克隆抗體；吸水墊1位于硝酸纖維膜2上部的相對于金標抗體保護膜3而言的另一側并與 硝酸纖維膜2部分重疊。樣品墊4位于硝酸纖維膜2上與吸水墊1相反的一側并與金標抗 體保護膜3部分重疊。 又一方面，本實用新型涉及的上述相思子毒素的檢測試紙，以吸水墊一側為起始 端，樣品墊一側為末端，兔抗重組相思子毒素A鏈多克隆抗體的檢測條帶位于接近末端，羊 抗鼠IgG包被的質控條帶接近于起始端。 本實用新型檢測相思子毒素的試紙的制備方法，該方法包括以下步驟膠體金探 針的制備，金標墊的制備，硝酸纖維膜的噴涂包被。1、膠體金探針的制備 (1)將HAuCl4先配制為0. 01 %水溶液，磁力攪拌下準確加入lml 1 %的HAuCl4，同 時加入1. 5-3mll^的檸檬酸三鈉水溶液，顏色穩定后繼續加熱，冷卻至室溫后加純水補足 至100ml，4t:避光保存；[0023] (2)用K2C03調PH值為約7-9，優選為約7. 8-8. 9，更優選約8. 2-8. 5 ; (3)將膠體金調至pH 8. 2-8. 5，用5mM PB(pH 7. 2)稀釋抗體至0. 2mg/ml ; (4)保持膠體金穩定。 本實用新型還披露一種獲得維持膠體金穩定的抗體最佳標記劑量的方法，該方法 包括 a.取10只潔凈的1. 5ml離心管，分別加入膠體金溶液1ml ; b.在1-10號管內分別力Q入lOii l、20ii l、30ii l、40ii l、50ii l、60ii l、70ii 1、
80iil、90iil、100ii1的5mM PB，再依次加入稀釋好的0. 2mg/ml的待標記抗體90iU、
80 ii l、70ii l、60ii l、50ii l、40ii l、30ii l、20ii 1、10ii 1、0ii l，混勻，放置2分鐘； c.在10個管內分別加入10% NaCl溶液100 iU，混勻后室溫靜置2小時，觀察顏
色變化。 未加抗體及加入量不足以穩定膠體金的試管中的液體顏色呈現由紅變藍的變化， 而加入抗體量達到或超過最低穩定劑量的試管則保持紅色不變。與對照管(l號管)相比， 顏色最接近、含抗體劑量最低的試管所含的抗體劑量，即為lml膠體金所必須的抗體穩定 劑量，在此基礎上再加20%單抗，即為抗體最佳標記劑量。本實用新型經過反復試驗和分 析，得出的結果表明維持膠體金溶液適宜抗體量為8-15ug，優選抗體量10-12ug，更優選 10. 5-12. Oug，最優選為12ug。 2、金標墊的制備 取上述pH的膠體金以lml/管分裝于1.5ml的離心管中。每支管中加入8-15ug 標記劑量，優選抗體量10-12ug，更優選10. 5-11. 5ug，最優選為llug的抗體，輕搖混勻后放 置。每管中加入10X的BSA100ia，混勻放置。將上面初步制得的膠體金探針在12000rpm、 4t:下離心30分鐘，棄上清液。每支離心管中加入lml重懸液懸浮沉淀后同上離心。棄上 清液，管底得到暗紅色的疏松狀沉淀，加入500 ii 1重懸液重懸后于4°C ， 1000rpm，離心10分 鐘；取上清液，均勻滴在lcm寬的玻璃纖維上，37t:干燥。 3、硝酸纖維膜的噴涂包被 (1)利用隔流噴金劃線機以50mm/s的噴膜速度包被兔抗重組相思子毒素抗體和 質控羊抗鼠IgG兩個條帶的硝酸纖維膜； 在該噴涂包被膜的步驟中，噴膜速度優選是10-100mm/s，更優選是45-55mm/s，最 優選是50mm/s ;所述兔抗St多克隆抗體，其加入量為l_5mg/ml，該多克隆抗體的稀釋液 可以為PBS ;質控兔抗羊IgG可以購自鼎國生物技術公司，其濃度為0. l-5mg/ml更優選是 0. 5-2. 5mg/ml，最優選為lmg/ml ; (2)制備含有膠體金標記的鼠抗重組相思子毒素A鏈多克隆抗體的金標抗體保護
膜，具體為將膠體金標記的鼠抗重組相思子毒素A鏈多克隆抗均勻涂布在玻璃纖維膜上
來制備，其中，抗體用PB稀釋，pH為7-9，優選7. 5-9，最適ffl值為8. 5。 本實用新型所述試紙在檢測相思子毒素中的應用，參見附圖2。 利用本實用新型試紙檢測相思子毒素的方法中，先將待測標本放入裝有稀釋液的
小瓶內，再用移液器將樣品混合液加入試紙"4"處(即末端)，樣品中的液體依靠虹吸作用
上行，一般需10-15分鐘判讀結果 如標本中含有相思子毒素，則它將與試紙上膠體金標記的鼠抗重組相思子毒素A鏈多克隆抗體形成相應的復合物，液體展開上行并與硝酸纖維膜上的兔抗重組相思子毒素 A鏈多克隆抗體結合，形成紅色線條，即在"T"處形成紅色條帶。 無論是否含有相對應的抗原，膠體金標記多克隆抗體繼續隨液體繼續上行并與該 膜上的羊抗鼠IgG形成紅色沉淀線，即在"C"處形成紅色條帶。此線是質控線，如膠體金失 效，此線就不會出現，說明試紙失效。 陽性結果會出現2條紅色沉淀線，陰性結果出現1條紅色沉淀線，如不出現線條說 明試紙失效。可利用金標免疫分析儀進行半定量檢測。 本實用新型的技術方案是采用純化的兔抗重組相思子毒素A鏈多克隆抗體、和 羊抗鼠IgG分別固相于硝酸纖維膜上，結合膠體金標記的鼠抗重組相思子毒素A鏈多克隆 抗體，應用膜層析雙抗體夾心法的原理檢測標本中的相思子毒素。
圖1A本實用新型試紙的正面示意圖。 圖1B本實用新型試紙的側面示意圖。
其中，圖1A和IB :1 :吸水墊；2 :硝酸纖維膜(T :包被兔抗重組相思子毒素A鏈多 克隆抗體檢測條帶；C :包被羊抗鼠IgG的質控條帶)；3 :金標抗體保護膜含有膠體金標記 鼠抗重組相思子毒素A鏈多克隆抗體的玻璃纖維膜；4 :樣品墊；5 :反應支持物。
圖2 :檢測結果示意圖；T、 C兩條線陽性；C 一條線陰性；無效。
具體實施方式
以下實施例用于說明本實用新型，但不用來限制本實用新型的范圍。實施例1、相
思子毒素檢測的膠體金試紙的制備 1、膠體金探針的制備 (1)將HAuCl4先配制成0. 01 %水溶液，取100ml純水加熱至沸騰。磁力攪拌下準 確加入1ml 1%的HAuCl4，同時加入1. 5ml質量分數為1%的檸檬酸三鈉水溶液。顏色穩定 后繼續加熱煮沸15分鐘，冷卻至室溫后加純水補足至100ml，4t:避光保存。 (2) K2C03調PH值為8. 2-8. 5左右。 (3)將膠體金調至適宜的pH，優選8. 0-8. 5，更優選8. 2，用5mMPB (pH 7. 2)稀釋抗
體至0. 2mg/ml 。 2、金標墊的制備 取pH 8. 2的膠體金以1ml/管的量分裝于1. 5ml的離心管中。每支管中加入最佳 標記劑量的抗體，輕搖混勻后放置5分鐘或稍長，此步為抗體與金顆粒結合。每管中加入 10%的BSAlOOiU，混勻放置10分鐘或稍長，此步為封閉。將上面初步制得的膠體金探針 以12000rpm，離心30分鐘，4。C，棄上清。每支離心管中加入1ml重懸液懸浮沉淀后同上離 心。棄上清，留下管底暗紅色疏松狀沉淀，加入500 ii 1重懸液重懸后于4°C ， lOOOrpm，離心 10分鐘；取上清液，均勻的滴加在1cm寬的玻璃纖維上，37。干燥2. 5-3小時。 3、硝酸纖維膜的噴涂包被 (1)利用隔流噴金劃線機以50mm/s的噴膜速度包被兔抗重組相思子毒素A鏈多克 隆抗體(lmg/ml含有1. 5% BSA)和質控羊抗鼠IgG(購自鼎國生物技術公司，lmg/ml)兩個 條帶的硝酸纖維膜；[0057] (2)含有膠體金標記鼠抗重組相思子毒素A鏈多克隆抗體12ug的玻璃纖維膜，PB
稀釋；最適ra值為8.5。 實施例2、相思子毒素檢測試紙 參見圖l，反應支持物為6. 2cmX0. 4cm PCV板；吸水墊為2cmX0. 4cm的濾油紙；
1. 8cmX0. 4cm的硝酸纖維膜依次包被羊抗鼠IgG (購自鼎國生物技術公司，lmg/ml)，兔 抗重組相思子毒素A鏈多克隆抗體；含有0. 4cmX0. 4cm膠體金標記的鼠抗重組相思子毒
素A鏈多克隆抗體(標金濃度12ug PB稀釋；最適ra值為8.2)玻璃纖維膜；樣品墊為
2. 7cmX0. 4cm的玻璃纖維；即形成了相思子毒素檢測試紙。 實施例3、檢測方法 參見附圖2，將待測標本與樣品稀釋液混勻，再用移液器將樣品混合液加入試紙樣 品孔處，樣品中的液體依靠虹吸作用上行，10-15分鐘判讀結果 如含有相思子毒素，則與試紙上膠體金標記的鼠抗重組相思子毒素A鏈多抗形成 相應的復合物，上行與包被在硝酸纖維膜上的流兔抗重組相思子毒素A鏈多抗結合，形成 紅色線條，即在"T"處形成紅色條帶。 無論是否含有相對應的抗原，膠體金標記多抗繼續向上爬行與包被在膜上的羊抗 鼠IgG形成紅色沉淀線，即在"C"處形成紅色條帶。此線是質控線，如膠體金失效，此線就 不會出現，說明試紙失效。 陽性結果會出現2條紅色沉淀線，陰性結果出現1條紅色沉淀線，如不出現線條說 明試紙失效。 實施例4、采用DJM-3定量金標免疫分析儀半定量檢測 1、可先用檢測法檢測相思子毒素試紙條20個陰性值，利用金標儀檢測試其T/C的 比值平均計算出相思子毒素試紙條的定閾值。 2、其次利用定閾值來用金標儀機器檢測相思子毒素試紙條能達到的最低濃度。 3、判讀結果時大于或等于定閾值為陽性，小于定閾值為陰性。 檢測相思子毒素標準品各個濃度下，判定值(CUT-OFF)為0. 043的T/C讀值(表 1)。每個濃度檢測兩次取平均值。可見15ng/ml、7. 5ng/ml結果為陰性；30ng/ml 6000ng/ ml結果為陽性；檢測靈敏度為30ng/ml。 表1相思子毒素膠體金試紙條各濃度半定量檢測結果序號檢測值T (V)質控值C (V)T/C結果
T2c2T/dT/C2T/C平判讀
00.00400.5310.514000—
7.5ng/mlO扁0.0120.4760.430-0.03-0.03-0.03
15ng/ml0.0140.0140.5540.380-0.02-0.03-0.03—
30ng/ml0.0250.0260.5230.5220.040.050.05+
60ng/ml0.0460.0490.4790.5160.090.090.09+
120ng/mlO扁0.0850.5500.5510. 160. 140. 15+
300ng/ml0.1630.1640.6150.5710.260.280.27+
600ng/ml0.3250.2840.5970.5230. 540. 540. 54+
1200ng/m0.3320.3270.6060.5840. 540. 560. 55+
6000ng/ml0.3350.3570.5610.5880. 590. 600. 60+ 本實用新型所述的試紙可以配合小型儀器可進行半定量檢測，不需專業培訓，結 果清晰易辨并能客觀保存數據，操作簡單，易于推廣，適合基層，適合于突發事件的現場檢 測，適合流行病學調查，并對相思子毒素的感染診斷起到輔助作用。
權利要求一種檢測試紙，其特征在于，它包含(1)反應支持物；(2)吸水墊；(3)硝酸纖維膜，該膜包被有兔抗重組相思子毒素A鏈多克隆抗體和羊抗鼠I gG包被的質控抗體的檢測條帶質控條帶；(4)金標抗體保護膜，該膜中含有膠體金標記的鼠抗重組相思子毒素A鏈抗體；(5)樣品墊；所述反應支持物位于底層，所述硝酸纖維膜位于反應支持物上的中部，金標抗體保護膜位于硝酸纖維膜上部的一側并與之部分重疊，所述吸水墊位于硝酸纖維膜上部的相對于金標抗體保護膜而言的另一側并與部分重疊；所述樣品墊位于硝酸纖維膜上與吸水墊相反的一側并與金標抗體保護膜部分重疊。
2. 根據權利要求1所述的試紙，其特征在于，所述樣品墊的材料選自聚酯膜、玻璃纖維 或濾紙纖維。
3. 根據權利要求1所述的試紙，其特征在于，所述硝酸纖維膜的T處是兔抗重組相思子 毒素A鏈多克隆抗體包被的檢測條帶，并且C處是羊抗鼠IgG包被的質控條帶。
4. 根據權利要求1所述的試紙，其特征在于，所述吸水墊一側為起始端，所述樣品墊一 側為末端，所述檢測抗體的條帶位于接近末端，所述質控條帶接近于起始端。
專利摘要本實用新型公開了一種檢測試紙，該試紙包含(1)反應支持物；(2)吸水墊；(3)硝酸纖維膜，該膜包被有兔抗重組相思子毒素A鏈抗體和質控抗體的檢測條帶質控條帶；(4)金標抗體保護膜，其中含有膠體金標記的鼠抗重組相思子毒素A鏈抗體。本實用新型試紙可以配合小型儀器可進行半定量檢測，不需專業培訓，結果清晰易辨并能客觀保存數據，操作簡單，易于推廣，適合基層，適合于突發事件的現場檢測，適合流行病學調查，并對相思子毒素的感染診斷起到輔助作用。
文檔編號G01N33/552GK201548545SQ200920108449
公開日2010年8月11日 申請日期2009年6月5日 優先權日2009年6月5日
發明者孫肖紅, 張曉龍, 楊宇, 王景林, 王靜, 聶聰, 胡孔新, 高姍 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院