一種a型肉毒毒素檢測試紙條的制作方法

專利名稱：一種a型肉毒毒素檢測試紙條的制作方法
技術領域：
本實用新型屬于生物檢測領域，具體涉及一種A型肉毒毒素檢測試 紙條。
背景技術：
肉毒毒素(Botulinum neurotoxin, BoNT )是由厭氧的肉毒梭菌 (Clostridium botulinum)產生的一種毒性極強的蛋白類毒素，其中A、 B、 E型肉毒毒素可引起人類肉毒中毒，我國報道由肉毒毒素致病者大多數為 A型。各型肉毒毒素分子量均約150 000D;由二硫鍵鏈接重鏈和輕鏈組 成，包括一條重鏈(H，約100kD)和一條輕鏈(L，約50kD)， H鏈包含了 N-末端(約50kD)和C-末端(約50kD),輕鏈通過二石充鍵與重鏈的N-末端 連接。其中A型肉毒毒素的研究最為深入，其應用也最為廣泛。從對A型 毒素的研究來推斷，肉毒毒素分子是一種酸性蛋白質，各型毒素的等電 點(pl)在5.3~6. l之間。肉毒毒素是已知毒素中毒力最強(天然物質中 最強)的神經麻痹毒素，比氰化鉀毒力大1萬倍，其小鼠LD50介于0. 1 ~
lng/kg體重，少至0.1-1 jug的毒素就可導致成人中毒死亡，純化的肉 毒毒素lmg能殺死2億只小鼠。BoNT可以經消化道攝入、呼吸道吸入、 傷口或眼睛等吸收而導致人類肉毒中毒。此外，該毒素凈皮一些國際恐怖 和極端組織利用來制造恐慌。自"9ar，恐怖襲擊事件后，美英等西方國 家便把BoNT列為最有可能被使用的生物恐怖劑之一。因此，了解和認識 BoNT檢測方法對于及早采取應對措施具有十分重要的醫學和軍事意義。
現階段檢測方法則根據肉毒毒素所具有的理化特性、生化特性和免 疫原性發展出的多種檢測法，其中以免疫檢測法為主。免疫檢測法大多 是依賴于抗原抗體反應的免疫學方法，包括多克隆和/或單克隆為基礎的 放射免疫法或酶聯免疫吸附法(ELISA)，免疫層析試驗和電化學發光生 物傳感器等。盡管免疫檢測法發展迅速，但經典的小鼠致死試驗仍是檢 測肉毒毒素的金標準。目前肉毒毒素中毒的實驗室檢驗，檢出污染物中存在肉毒毒素并鑒 定出毒素型別是確定肉毒中毒的關鍵。肉毒毒素檢測的金標準是經典的
小鼠致死試驗，其檢出極限可達10-20 pg,但該實-瞼也存在許多缺點， 主要表現在耗時長、工作量大、需要大量實驗動物等。國內外許多實驗 室都曾在血清學檢測方法上做過大量研究，如酶聯免疫分析(ELISA)、 放射免疫分析、肽鏈內切酶聯免疫檢測等，這些方法在克服耗時性、需 要特殊設備以及檢驗靈敏度和特異性矛盾等方面存在或多或少的缺陷， 從而限制了這些方法的推廣應用，至今還沒有哪種方法能真正替代經典 的動物實驗。

實用新型內容
本實用新型的目的在于提供一種方便、快捷地檢測A型肉毒毒素的抗 原試紙。該試紙的工作原理是利用特異性抗原-抗體的結合，用膠體金 標記抗體，與待檢抗原結合后，使與試紙結合的捕獲抗體顯色。
本實用新型試紙在檢測A型肉毒毒素的同時，可利用金標免疫分析儀
進行的半定量檢測方法。
本實用新型一種方便、快捷地檢測A型肉毒毒素的檢測試紙，它包含
(1)反應支持物； (2 )吸水墊；
(3 )硝酸纖維膜，該膜包被有A型肉毒毒素的多克隆抗體條帶和質 控羊抗兔IgG的條帶；
(4 )金標抗體保護膜，其中含有膠體金標記的A型肉毒毒素單克隆抗體。
本實用新型涉及的上述A型肉毒毒素的檢測試紙，它還包含樣品墊， 該樣品墊的材料選用聚脂膜、玻璃纖維或濾紙纖維。
本實用新型涉及的上述A型肉毒毒素的檢測試紙，其中反應支持物 選用PVC板。
本實用新型涉及的上述A型肉毒毒素的檢測試紙，其中吸水墊選用 濾油紙。
本實用新型涉及的上述A型肉毒毒素的檢測試紙，其中金標抗體保 護膜的材料選用聚脂膜、玻璃纖維或濾紙纖維，其上均勻涂布有膠體金標記的A型肉毒毒素單克隆抗體。
另一方面，本實用新型涉及的上述A型肉毒毒素的檢測試紙，其中， 吸水墊、硝酸纖維膜、金標抗體保護膜、樣品墊和反應支持物按照附圖1 所示方式構成；反應支持物5位于底層，硝酸纖維膜2位于反應支持物5 上的中部，該膜的T處是A型肉毒毒素單克隆抗體包被的檢測條帶，并 且C處是羊抗兔IgG包被的質控條帶；金標抗體保護膜3位于硝酸纖維 膜上部的一側并與之部分重疊，該膜含有膠體金標記的A型肉毒毒素單 克隆抗體；吸水墊1位于硝酸纖維膜2上部的相對于金標抗體保護膜3 而言的另一側并與2部分重疊；樣品墊4位于2上與1相反的一側并與3 部分重疊。
又一方面，本實用新型涉及的上述A型肉毒毒素的檢測試紙，以吸 水墊一側為起始端，樣品墊一側為末端，A型肉毒毒素單克隆抗體的檢測 條帶位于接近末端，羊抗兔IgG包被的質控條帶接近于起始端。
再一方面，A型肉毒毒素單克隆抗體的條帶與羊抗兔IgG包被的質控 條帶之間的距離適宜是硝酸纖維膜長度的25%- 75%長，優選40% - 60% , 更優選45 - 55 %,最優選50%。
本實用新型A型肉毒毒素檢測試紙的制備方法，該方法包括 (1)用隔流噴金劃線機以一定噴膜速度噴涂A型肉毒毒素的多克隆 抗體和質控羊抗兔IgG兩個條帶的硝酸纖維膜；
在該噴涂包被膜的步驟中，噴膜速度優選是10-100mm/s,更優選是 45 - 55mm/s，最優選是50mm/s;所述A型肉毒毒素的單克隆抗體(由軍 事醫學科學院病毒所提供)的濃度為0.1-10 mg/ml更優選是0.5-2.5 mg/ml，最優選為lmg/ml，單克隆抗體的稀釋液可以為PBS;質控羊抗兔 IgG可以購自鼎國生物技術公司，其濃度為0.1-10 mg/ml更優選是 0. 5-2. 5 mg/ml,最優選為lmg/ml;
(2 )制備一種含有膠體金標記的A型肉毒毒素單克隆抗體的玻璃纖 維膜，將膠體金標記的A型肉毒毒素單克隆抗體均勻涂布在聚脂膜、玻 璃纖維膜或濾紙纖維膜(購自Milipore公司)上；
(3)所述A型肉毒毒素的單克隆抗體(由軍事醫學科學院病毒所提 供)穩定膠體金的適當抗體量為5-25ug,優選抗體量為10-20ug,更 優選的抗體量為12-18ug，最優選抗體量為16. 8ug,該抗體可以用5mM本實用新型所述試紙在檢測A型肉毒毒素中的應用(見圖2)。首先 將標本放入裝有稀釋液的小瓶內，將試紙"4"處(即末端處)插入瓶內， 樣品中的液體吸起上行， 一般10-15分鐘后判讀結果，試紙直至觀察完 結果后方可取出。
如果標本中含有A型肉毒毒素抗原，則標本中的A型肉毒毒素抗原 將與試紙上膠體金標記的A型肉毒毒素單克隆抗體形成相應的復合物， 液體上行并將與硝酸纖維膜上的A型肉毒毒素多克隆抗體結合，并且顯 示顏色，形成紅色線條，即在"T"處形成紅色條帶。無論是否含有相對 應的抗原，膠體金標記單克隆抗體繼續向上展開并與在硝酸纖維膜上的 羊抗兔IgG形成紅色沉淀線，即在"C"處形成紅色條帶。此線是質控線， 如膠體金失效，此線就不會出現，說明試紙失效。陽性結果會出現2條 紅色沉淀線，陰性結果出現1條紅色沉淀線，如不出現線條說明試紙失 效。
在本實用新型的技術方案中，采用了純化的A型肉毒毒素多克隆抗 體和羊抗兔IgG,將兩者分別固相于硝酸纖維膜上，同時利用膠體金標記 的A型肉毒毒素單抗，基于膜層析雙抗體夾心法的原理，從而成功地快 速簡便檢測出標本中的A型肉毒毒素。


圖IA本實用新型試紙的正面示意圖。 圖IB本實用新型試紙的側面示意圖。
圖1A和1B中，l吸水墊；2硝酸纖維膜(A:包被A型肉毒毒素多 克隆抗體條帶，C:包被羊抗兔IgG的質控條帶)；3:含有膠體金標記A 型肉毒毒素單克隆抗體的玻璃纖維膜；4:樣品墊；5:反應支持物。
圖2:檢測結果示意圖；T、 C兩條線陽性；C一條線陰性；無效。
圖3:檢測結果示意圖；圖中，l.A型天然肉毒毒素50 pg/m, 2. A 型天然肉毒毒素IO ng/ml， 3 .A型天然肉毒毒素15 pg/ml， 4. PBS。
圖4:檢測結果示意圖；圖中1為A型天然肉毒毒素，2為E型天然 肉毒毒素。
具體實施方式
以下實施例用于說明本實用新型，但不用來限制本實用新型的范圍。
實施例l、 A型肉毒毒素多克隆抗體的制備
(1 )抗A型肉毒毒素多克隆抗體的制備
用純化的rBoNT/A蛋白200 jn g與等體積的福氏完全佐劑充分混勻， 首免新西蘭純種大耳白兔。兩周后用0.5 mg蛋白和等體積福氏不完全佐 劑加強免疫1次；隔三周后再用0. 5 mg蛋白和等體積福氏不完全佐劑加 強免疫l次；此后每周耳緣靜脈采血，間接ELISA測定效價。如還需再 進行加強免疫，每次免疫間隔兩周，最后一次免疫一周后大量采血。
心臟或頸動脈或腹股靜脈采血后于37 。C放置l h, 4 。C過夜，使血 塊收縮。小心吸出析出的血清。在4。C下2500 g離心血塊30 min，取上 清液即血清部分與此前析出的血清混合。4 。C 1500 g離心全部分離的血 清部分。將血清分裝凍存于-70 。C。 (2 )抗rBoNT/A多克隆抗體的純化
方法利用正辛酸-硫酸銨分步沉淀法純化抗體。
具體實施例取1份血清加入4份60 mM pH 4. 0的醋酸緩沖液，用 NaOH調節pH為4. 5。以每毫升稀釋液中加入70 pl正辛酸的比例，f茲力 攪拌30 min。 4 °C10000 r/min離心30 min，棄沉淀，耳又上清液通過濾 紙過濾，加入5倍體積的PBS,調節pH為7. 4，然后置冰浴中，按照每 毫升混合液加O. 27 g碌L酸銨，繼續石茲力攪拌30 min, 9000 r/min， 4 。C 離心15min,收集沉淀物，溶于PBS中，透析至無NH4+, -70 。C保存， 并經SDS-PAGE鑒定其純度。
實施例2、 A型肉毒毒素單克隆抗體的制備
(1)抗rBoNT/A單克隆抗體的制備
A型雜交瘤細胞均由河北省科學院生物科學研究所制備，拿到雜交瘤 細胞后，首先進行細胞培養，培養起細胞后，用間接ELISA法測定細胞培 養上清與天然毒素是否結合，選兩抹鑒定為陽性且細胞生長狀態良好的 雜交瘤細胞抹進行亞克隆篩選。再選取穩定性和效價均較高的兩抹細胞 林用以大量制備單克隆抗體。利用細胞培養上清來進行單克隆抗體的亞 型鑒定，采用的是美國Roche公司Mouse Monclonal Antibody IsotypingKit。
Balb/c小鼠用石蠟油腹部注射致敏一周后，小鼠注射O. 5 ml約含l x 106個雜交瘤細胞的生理鹽水懸液。l-2周后待小鼠腹部明顯變大，精 神狀態不好時，拉頸處死取腹水。于12000 rpm離心10 min以去除油狀不 溶物，將腹水分裝凍存于-20 'C。 (2)抗rBoNT/A單克隆抗體的純化
用HiTrapTM Protein G HP和AKTAdesignTM System純化小鼠腹水。 首先，將腹水用binding buffer以適當比例稀釋，用0.45 pm濾器過濾 后備用。用10倍^主體積的binding buffer以5 ml/min的洗速平衡5 ml的 蛋白G柱后將備用樣品上柱純化，上樣速度設為1 ml/min。此后，用binding buffer沖平直至流出液的紫外吸收值低于30即流出液中不再有蛋白。換 elution buffer進行洗脫，從紫外吸收值高于100時開始收集，低于80時 收集完畢，收集洗脫液的試管中預先加入10%的1 M, pH 9. O的Tris-HCl, 使pH恢復至7. 0左右，以免抗體失去活性。用elution buffer沖洗柱子 至紫外吸收值低于30時改用純水沖洗l O個柱體積后，再用2 0%乙醇沖洗5 個柱體積，最終要將柱子浸泡于20%乙醇中并于4 。C保存。將純化后的單 抗用5 mM PB于磁力攪拌下4 。C透析4 h后，分裝，-70 。C保存備用，并 經SDS-PAGE鑒定其純度為13. 52mg/ml。
實施例3、 A型肉毒毒素的檢測試紙
參見附圖1，反應支持物為6. 2cm x 0. 4cmPCV板；吸水墊為2cm x 0. 4cm的濾油紙；1. 8cm x 0. 4cm的硝酸纖維膜依次包被羊抗兔IgG， A 型肉毒毒素多克隆抗體(lmg/ml，稀釋液為PBS );含有0. 4cm x 0. 4cm 膠體金標記的A型肉毒毒素單克隆抗體(16. 8ug，用5mMPB稀釋)， 玻璃纖維膜；金標抗體(其標金PH為7. 5，濃度為0. 2mg/nd )保護膜為 2. 7cm x 0. 4cm的玻璃纖維；即形成了 A型肉毒毒素抗原檢測試紙。
實施例4、 A型肉M素的試紙檢測方法
參見圖2，使用A型肉毒毒素試紙的檢測方法包括 將標本放入裝有稀釋液的小瓶內，將實施例3-5中的任一試紙"4" 處插入瓶內，樣品中的液體吸起上行，10分鐘判讀結果，直至觀察完結果后方可取出試紙
如含有A型肉毒毒素抗原，則與試紙上膠體金標記的A型肉毒毒素 單抗形成相應的復合物，上行與包被在硝酸纖維膜上的流A型肉毒毒素 多抗結合，形成紅色線條，即在"A"處形成紅色條帶。
無論是否含有相對應的抗原，膠體金標記McAb繼續向上爬行與包被 在膜上的羊抗兔IgG形成紅色沉淀線，即在"C"處形成紅色條帶。此線 是質控線，如膠體金失效，此線就不會出現，說明試紙失效。 陽性結果會出現2條紅色沉淀線，陰性結果出現l條紅色沉淀線，如不出 現線條說明試紙失效。如若肉眼無法辨別T處紅色條帶，可利用金標免疫 分析儀進行半定量檢測。
實施例5、 DJM-3定量金標免疫分析儀半定量檢測
1、 可先用檢測法檢測A型肉毒毒素試紙條20個陰性值，利用金標儀檢 測試其T/C的比值平均計算出A型肉毒毒素試紙條的定閾值。
2、 其次利用定閾值來用金標儀機器檢測A型肉毒毒素試紙條能達到的最 低濃度。
3、 判讀結果時大于或等于定閾值為陽性，小于定閾值為陰性。
試驗例1、膠體金免疫層析試紙敏感性檢測
以天然肉毒毒素溶液(濃度為50 ng/ml、 10 pg/ml、 5 pg/ml )進 行檢測，以不含肉毒毒素的PBS溶液樣品為空白對照，檢測結果見附圖3。 結果顯示A型免疫層析條檢測靈敏度為5 pg/ml。
試驗例2、膠體金免疫層析試紙特異性檢測
優化檢測帶、質控帶蛋白濃度和膠體金探針濃度以及層析條的特征 后，以樣品稀釋液(PBS)處理A型天然肉毒毒素素使其濃度均為50 jug/ml 以進行檢測。結果如附圖4所示，可見檢測條對于檢測無關毒素無非特異 現象出現。
本實用新型能夠基于一份標本和一個試紙，快速方便地檢測出標本 中的A型肉毒毒素抗原，能夠一次性的捕獲出A型肉毒毒素，節省了大量人力物力，方便、快速、簡捷，不需特殊儀器設備，不需專業培訓， 結杲清晰易辨，操作簡單，易于推廣，適合基層，適合于突發事件的大
批量現場檢測，適合流行病學調查，對A型肉毒毒素的感染診斷起到輔 助作用。
權利要求1、一種檢測試紙，其特征在于，它包含(1)反應支持物；(2)吸水墊；(3)硝酸纖維膜，該膜包被有A型肉毒毒素多克隆抗體條帶和質控羊抗兔IgG的條帶；(4)金標抗體保護膜，其中含有膠體金標記的A型肉毒毒素單克隆抗體。
2、 根據權利要求1所述的試紙，其特征在于，它還包含樣品墊。
3、 根據權利要求2所述的試紙，其特征在于，所述反應支持物(5)位于 底層，所述硝酸纖維膜(2)位于反應支持物(5)上的中部，該膜的T處是A 型肉毒毒素單克隆抗體包被的檢測條帶，并且C處是羊抗兔IgG包被的 質控條帶；所述金標抗體保護膜(3)位于硝酸纖維膜上部的一側并與之部 分重疊，該膜含有膠體金標記的A型肉毒毒素單克隆抗體；所述吸水墊 (1)位于硝酸纖維膜(2)上部的相對于金標抗體保護膜(3)而言的另一側 并與硝酸纖維膜(2)部分重疊；所述樣品墊(4)位于硝酸纖維膜(2)上與吸 水墊(1)相反的一側并與金標抗體保護膜(3)部分重疊。
4、 根據權利要求3所述的試紙，其特征在于，所述吸水墊一側為起始端， 所述樣品墊一側為末端，A型肉毒毒素多克隆抗體的條帶位于接近末端， 羊抗兔IgG包被的質控條帶接近于起始端。
專利摘要本實用新型公開了一種檢測試紙，它包含反應支持物；吸水墊；硝酸纖維膜，該膜包被有A型肉毒毒素多克隆抗體條帶和質控羊抗兔IgG的條帶；金標抗體保護膜，其中含有含有膠體金標記的A型肉毒毒素單克隆抗體。本實用新型試紙能夠基于一份標本和一個試紙，快速方便地檢測出標本中的A型肉毒毒素抗原，能夠一次性的捕獲出A型肉毒毒素，節省了大量人力物力，方便、快速、簡捷，不需特殊儀器設備，不需專業培訓，結果清晰易辨，操作簡單，易于推廣，適合基層，適合于突發事件的大批量現場檢測，適合流行病學調查，對A型肉毒毒素的感染診斷起到輔助作用。
文檔編號G01N33/577GK201373876SQ200920105709
公開日2009年12月30日 申請日期2009年3月4日 優先權日2009年3月4日
發明者孫曉紅, 張曉龍, 宇 楊, 靜 王, 王景林, 謝士嘉 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院