專利名稱：嗜水氣單胞菌的Dot-ELISA檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及生物技術領域，具體地說是一種嗜水氣單胞菌的Dot-ELISA 檢測試劑盒。
背景技術：
嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)屬于弧菌科氣單胞菌屬，是一類廣 泛存在于水環境的病原菌，也是危害魚類、兩柄類、爬行類和哺乳類動物的致 病菌。目前，國內外已有一些研究者對嗜水氣單胞菌的檢測做過研究，并相繼 開展了免疫熒光技術、選擇性培養基鑒別培養法、葡萄球菌A蛋白協同凝集試 驗、單克隆抗體技術、凝集法、聚合酶鏈反應、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等。
斑點酶聯免疫吸附實驗(Dot-ELISA)是上世紀80年代初發展起來的一項 免疫學新技術。它與ELISA相似，只是將固相載體變為硝酸纖維素膜(NC膜)。 Dot-ELISA方法的優點在于快速、簡便，既保留了常規ELISA的優點，又克服 了其繁瑣的程序，且結果直觀可用肉眼直接觀察。這種方法不僅較其它方法快 速準確，而且可大幅度降低檢驗成本，減少勞動強度，省時省料。但是現有 Dot-ELISA所用的設備不易操作、成本高、勞動較復雜、無法在非實驗室環境下 進行、難以快速檢測、難以有效應用于野外現場環境。 發明內容
本實用新型的目的是針對上述情況，提供了-"種嗜水氣單胞菌的Dot-ELISA 檢測試劑盒，用以解決該致病菌無法現場檢測的難題。
3本實用新型的技術方案是這樣實現的所述的嗜水氣單胞菌的Dot-ELISA 檢測試劑盒，包括盒體和襯墊，在襯墊上設有放置硝酸纖維素膜的方格及存放
不同溶液不同顏色瓶帽的試劑瓶瓶位，所述的試劑瓶瓶位分別為濃縮PBST液瓶 位、PBS緩沖液瓶位、兔抗嗜水氣單胞菌抗血清標準液瓶位、辣根過氧化物酶 標記的羊抗兔IgG標準液瓶位、牛血清白蛋白瓶位、DAB顯色液瓶位、嗜水氣 單胞菌標準菌液瓶位；在盒體盒蓋的內側設有放置培養皿的口袋。
濃縮PBST液瓶位內放置有50ml帶白色標示層瓶帽的透明塑料試劑瓶，PBS 緩沖液瓶位內放置有50ml藍色標示層瓶帽的透明塑料試劑瓶，兔抗嗜水氣單胞 菌抗血清標準液瓶位內放置有2ml紅色標不層瓶帽的透明塑料試劑瓶，辣根過 氧化物酶標記的羊抗兔IgG標準液瓶位內放置有lml綠色標示層瓶帽的透明塑 料試劑瓶，牛血清白蛋白瓶位內放置有紫色標示層瓶帽的深色玻璃試劑瓶，DAB 顯色液瓶位內放置有黑色標示層瓶帽的深色玻璃試劑瓶，嗜水氣單胞菌標準菌 液瓶位內放置有黃色標示層瓶帽的透明塑料試劑瓶。
本實用新型的有益效果靈敏高，可檢出的最低檢測限為1.0X104cfti，可 一次性進行多個樣本的測定，減少檢測樣本所需要的時間，所需的試劑用不同 大小、不同顏色的試劑瓶封裝在盒內，易于快速區分，具有成本節約、操作簡 便易行、可在非實驗室條件進行、便于攜帶和運輸等優勢，能快速、簡便、靈 敏地用于水產動物致病菌嗜水氣單胞菌的檢測。
圖1是本實用新型的結構示意圖。
圖中1—盒體，2—襯墊，3—方格，4一濃縮PBST液瓶位，5—PBS緩沖 液瓶位，6—兔抗嗜水氣單胞菌抗血清標準液瓶位，7—辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG標準液瓶位，8—牛血清白蛋白瓶位，9一DAB顯色液瓶位，10—嗜
水氣單胞菌標準菌液瓶位，ll一培養皿，12—口袋。
具體實施方式
以下結合附圖對本實用新型作進一步說明。圖1中，所述的嗜水氣單胞菌 的Dot-ELISA檢測試劑盒，包括盒體1和襯墊2，其特征在于在襯墊2上設有 放置硝酸纖維素膜的方格3及存放不同溶液不同顏色瓶帽的試劑瓶瓶位，所述 的試劑瓶瓶位分別為濃縮PBST液瓶位4、 PBS緩沖液瓶位5、兔抗嗜水氣單胞 菌抗血清標準液瓶位6、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG標準液瓶位7、牛血 清白蛋白瓶位8、 DAB顯色液瓶位9、嗜水氣單胞菌標準菌液瓶位10;在盒體1 盒蓋的內側設有放置培養皿11的口袋12。
濃縮PBST液瓶位4內放置有50ml帶白色標示層瓶帽的透明塑料試劑瓶， PBS緩沖液瓶位5內放置有50ml藍色標示層瓶帽的透明塑料試劑瓶，兔抗嗜水 氣單胞菌抗血清標準液瓶位6內放置有2ml紅色標示層瓶帽的透明塑料試劑瓶， 辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG標準液瓶位7內放置有lml綠色標示層瓶帽 的透明塑料試劑瓶，牛血清白蛋白瓶位8內放置有紫色標示層瓶帽的深色玻璃 試劑瓶，DAB顯色液瓶位9內放置有黑色標示層瓶帽的深色玻璃試劑瓶，嗜水 氣單胞菌標準菌液瓶位10內放置有黃色標示層瓶帽的透明塑料試劑瓶。
用試劑盒內的試劑配制如下溶液
配制PBST緩沖液用去離子水將濃縮PBST液按1: 19體積比進行稀釋； 配制封閉液取0.1克牛血清白蛋白，加PBS緩沖液至100ml; 配制兔抗嗜水氣單胞菌兔抗血清作用液(一抗)用PBST緩沖液將兔抗嗜 水氣單胞菌抗血清標準液按1: 500體積比進行稀釋；配辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG作用液(酶標二抗)用PBST緩沖液 將辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG標準液按1: 1000體積比進行稀釋； 試劑盒的操作步驟
A. 滴樣先將樣品用勻漿器將所需檢測的組織勻漿，經抗原包被緩沖液 (PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液)稀釋，取10pl所測樣品和嗜水氣單胞菌標準菌液
的稀釋液滴于硝酸纖維素膜上，在自然條件下千燥1 2小時；
B. 洗滌將已點樣的硝酸纖維素膜放置在培養皿ll中，加PBST緩沖液中 漂洗3次，每次5分鐘；
C. 封閉取出，再將硝酸纖維素膜浸入配好的封閉液中，于自然條件下孵 育60min，期間搖動3 4次，取出后用PBST緩沖液漂洗3次，每次5 min，每 次洗滌中間搖動數次；
D. 加抗體取出，再將硝酸纖維素膜浸入稀釋后的兔抗嗜水氣單胞菌抗血 清標準液6中，自然條件下孵育lh，取出，漂洗3次，每次5分鐘；再將其浸 入稀釋后的辣根過氧化物酶標記標記的羊抗兔IgG標準液中，自然條件下孵育 1.5h，取出，用PBST緩沖液漂洗3次，每次5分鐘；
E. 底物顯色及終止反應將硝酸纖維素膜浸入DAB顯色液中，于自然條 件下避光顯色15min，取出，當硝酸纖維素膜出現明顯斑點后，用蒸餾水漂洗2 次以終止反應，然后取出硝酸纖維素膜置于干凈的濾紙上自然干燥，記錄試驗 結果，避光保存。
F. 結果判定觀察硝酸纖維素膜上的顏色，與陽性和空白結果進行比較， 或與標準反應圖例進行對照從而得出結果。
權利要求1.一種嗜水氣單胞菌的Dot-ELISA檢測試劑盒，包括盒體(1)和襯墊(2)，其特征在于在襯墊(2)上設有放置硝酸纖維素膜的方格(3)及存放不同溶液不同顏色瓶帽的試劑瓶瓶位，所述的試劑瓶瓶位分別為濃縮PBST液瓶位(4)、PBS緩沖液瓶位(5)、兔抗嗜水氣單胞菌抗血清標準液瓶位(6)、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG標準液瓶位(7)、牛血清白蛋白瓶位(8)、DAB顯色液瓶位(9)、嗜水氣單胞菌標準菌液瓶位(10)；在盒體(1)盒蓋的內側設有放置培養皿(11)的口袋(12)。
2. 根據權利要求l所述的嗜水氣單胞菌的Dot-ELISA檢測試劑盒，其特征 在于濃縮PBST液瓶位(4)內放置有50ml帶白色標示層瓶帽的透明塑料試 劑瓶，PBS緩沖液瓶位(5)內放置有50ml藍色標示層瓶帽的透明塑料試劑瓶， 兔抗嗜水氣單胞菌抗血清標準液瓶位(6)內放置有2ml紅色標示層瓶帽的透明 塑料試劑瓶，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG標準液瓶位(7)內放置有lml 綠色標示層瓶帽的透明塑料試劑瓶，牛血清白蛋白瓶位(8)內放置有紫色標示 層瓶帽的深色玻璃試劑瓶，DAB顯色液瓶位(9)內放置有黑色標示層瓶帽的深 色玻璃試劑瓶，嗜水氣單胞菌標準菌液瓶位(10)內放置有黃色標示層瓶帽的 透明塑料試劑瓶。
專利摘要本實用新型提供了一種嗜水氣單胞菌的Dot-ELISA檢測試劑盒，包括盒體和襯墊，其特征在于在襯墊上設有放置硝酸纖維素膜的方格及存放不同溶液不同顏色瓶帽的試劑瓶瓶位，所述的試劑瓶瓶位分別為濃縮PBST液瓶位、PBS緩沖液瓶位、兔抗嗜水氣單胞菌抗血清標準液瓶位、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG標準液瓶位、牛血清白蛋白瓶位、DAB顯色液瓶位、嗜水氣單胞菌標準菌液瓶位；在盒體盒蓋的內側設有放置培養皿的口袋。本實用新型可一次性進行多個樣本的測定，減少檢測樣本所需要的時間，操作簡便快速，可在非實驗室條件進行，便于攜帶和運輸，能快速、簡便、靈敏地用于水產動物致病菌嗜水氣單胞菌的檢測。
文檔編號G01N33/569GK201382941SQ20092008480
公開日2010年1月13日 申請日期2009年4月9日 優先權日2009年4月9日
發明者宇 劉, 遷 劉, 吳志新, 周金敏, 君 夏, 楊瑞斌, 王桂堂, 謝從新, 陳孝煊 申請人:陳孝煊