專利名稱：利用親和柱分析全蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及一種蛋白質組技術領域的方法，具體是一種利用親和柱分析全蛋白的
方法。
背景技術：
蛋白質是生物體內行使生物功能的分子載體。生物樣品中全蛋白的分析鑒定對 闡明生物功能、生理狀態和疾病的發生發展和治療具有重要作用。生物樣品常含有數千種 蛋白，一般情況下，不超過二十種的高豐度蛋白占蛋白總量的99%，而數千種低豐度蛋白 占蛋白總量不到1%，高豐度蛋白與低豐度蛋白的豐度范圍高達9個數量級。基于鳥槍法 (shot-g皿strategy)的生物質譜可簡捷快速鑒定生物樣品中多種蛋白。但由于質譜儀器本 身檢測能力、檢測靈敏度和檢測蛋白豐度范圍的限制，樣品中高豐度蛋白易于掩蓋低豐度 蛋白的檢測信號，低豐度蛋白漏檢率高。現有技術手段無法簡單快捷地分析鑒定生物樣品 中全蛋白，尤其是漏檢低豐度蛋白。 經對現有技術的文獻檢索發現，在質譜鑒定之前進行預分離可以改善樣品中低 豐度蛋白的檢出幾率，常用傳統多維液相色譜、多維電泳預分離方法以及剔出高豐度蛋 白的予頁處理方法(Gao等，Large scale depletion of the high-abundance proteins and analysisof middle—and low—abundance proteins in human liver proteome bymultidimensional liquid chromatography. Proteomics 8(2008) :939 947.)與質譜
聯用改善了低豐度蛋白的檢出幾率。但在實際操作中，大規模剔除高豐度蛋白，傳統多維液 相色譜和常用多維電泳預分離方法操作復雜，耗時費力，工作量大，不利于疏水蛋白、極大 和極小分子量蛋白、極高等電點和極低等電點蛋白以及膜蛋白的分析。而且大規模剔除高 豐度蛋白的操作需要首先分析鑒定高豐度蛋白，再制備相應蛋白抗體，操作時間長，工作量 大，操作繁瑣。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種利用親和柱分析全蛋白的方 法。本發明的方法可克服高豐度蛋白淹沒低豐度蛋白信號的技術不足，提高極端性質蛋白 檢出率。 本發明是通過以下技術方案實現的，本發明包括如下步驟
步驟一，合成親和分離材料，得到親和分離材料庫； 步驟二，提取生物樣品全蛋白，從步驟一所得的親和分離材料庫中篩選出吸附蛋 白種類占全蛋白20 80%的親和材料組合； 步驟三，從步驟二所得親和材料組合中選擇一種或多種分別填充親和柱，之后利 用所得親和柱，采用級聯組合分析方法、串聯組合分析方法、或者級聯與串聯混合的組合分 析方法分析生物樣品全蛋白，得到多組蛋白復雜度簡化的樣品； 步驟四，對步驟三所得樣品分別進行胰蛋白酶消化和LC-MS/MS分析，進而完成生物樣品全蛋白的全蛋白分析。 步驟一中，所述親和分離材料庫具體為以如下組合中的氨基化合物為 配體，采用以環氧氯丙烷為骨架的單氨基化合物配體合成法合成相應的親和分離 材料；以如下組合中的氨基化合物為配體，采用以三氯三氮嗪為骨架的雙氨基化 合物配體合成法合成相應的親和分離材料；所有合成的親和分離材料構成親和分 離材料庫；所述氨基化合物的組合為3-amino-l-propanol、2-phenethylamine、 acrylamide、3， 5—dinitroaniline、3—methoxypropylamine、2_methy1—5—nitroaniline、 ethanolamine、2， 4一dichloroaniline、 ethylenediamine、2—aminobenzothiazole、 4_methyl_3_nitroaniline、3_methyl_o_phenylenediamine、 octylamine、2，
5- dichloroaniline、 propylamine、4， 4' -thiodiani 1 ine、 1， 4-phenylenediamine、 4，4-diaminodiphenylmethane、 o-toluidine、4，4' -oxydianiline、 p-toluidine、2，
6- dimethylaniline、2， 4， 6-trichloroaniline、4， 4-methylene-bis (2-chloroani1i ne) 、 m-toluidine、4-aminobipheny1、2， 3-dichloroaniline、4-aminobenzoic acid、 methyl 2-aminobenzoate、4， 4' _methylene_bis(2-methylani1ine)、 m-anisidine、 4—aminoazobenzene、 o-anisidine、 aniline、2，4_diamino_6_methylphenol、4_amino_2， 6—dinitrotoluene、l—naphthylamine、 isopropylamine、2，4—diaminotoluene、 benzidine、3' _aminoacetophenone、4_methyl_m_phenylenediamine、2， 4一dimethylaniline、4一isopropylaniline、2， 4一dinitroani1ine、 benzylamine、 4' -aminoacetophenone、4-methyl_o_phenylenediamine、2，6-dichloroaniline、 p_anisidine、2， 6-diethylaniline、 o_aminoazotoluene、4_amino_2_nitrophenol、 l_amino_2_naphthol_4_sulfonic acid、2， 6-dinitroaniline、2， 4一diaminoanisole、 2—aminophenol、 o-dianisidine、2_amino_3_nitrophenol、2—aminobenzimidazole、 2_aminopyridine、6_amino caproic acid、2—naphthylamine、2—furfurylamine、 2_methoxy_5_methylaniline、5_aminoisophthalic acid、2—nitroaniline、 4—phthalazinedione、3—aminopyridine、 cyclohexylamine、2_methy1—3—nitroaniline、 1—aminoanthraquinone、3_aminophenol、4—aminosalicy1ic acid、4_aminophenol、 arginine、2_methyl_4_nitroaniline、2_aminoterephthaiic acid、3_nitroaniline、 9-aminoacridine、4-nitroaniline、 tryptamine、2_methyl_6_nitroani1ine禾卩3， 3' -dichlorobenzidine。 步驟三中，所述親和分離材料組合具體為分別以1，6-己二胺、色胺和6-氨基己 酸為配體，采用以環氧氯丙烷為骨架的單氨基化合物配體合成法合成的相應的親和分析材 料；分別以丁胺和十一胺、乙二胺和L-精氨酸、苯胺和氨基醋酸、對氨基苯脒鹽酸鹽和L-脯 氨酸、芐胺和酪胺、以及間氨基酚和間苯二胺為配體，采用以三氯三氮嗪為骨架的雙氨基化 合物配體合成法合成的相應的親和分離材料；上述得到的9種親和材料組成親和分離材料 組合。 步驟三中，所述級聯組合分析方法具體為取生物樣品全蛋白，通過第一根親和柱 吸附洗脫，得到流穿和洗脫兩組樣品；將流穿和洗脫兩組樣品分別通過第二根親和柱，各自 再次得到流穿和洗脫兩組樣品，此時共有四組樣品；依次類推，當通過第n根親和柱后，共 得到2n組樣品；所述n為> 2的自然數。
優選地，所述n為> 3的自然數。 步驟三中，所述串聯組合分析方法具體為取生物樣品全蛋白，通過第一根親和柱 吸附洗脫，得到流穿和洗脫兩組樣品；流穿組樣品通過第二根親和柱吸附洗脫，得到流穿和 洗脫兩組樣品，共三組樣品；依次類推，將每一次得到的流穿組樣品再次通過親和柱吸附洗 脫，得到與之相應的流穿和洗脫兩組樣品，在通過第m根親和柱后，共得到m+l組樣品；所述 m為^ 3的自然數。 優選地，所述m為> 5的自然數。 與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果本發明設計合成具有結構多樣性 的親和配體的分離材料庫，利用親和材料對不同類別蛋白吸附特異不同的性質，通過幾種 親和材料柱的串聯組合和(或)級聯組合進行生物樣品中的復雜蛋白的簡化分組；本發明 的方法流程簡單，不需要大型儀器設備，易于自動化，只需要3 6小時就可以完成蛋白分 組，相比傳統的SDS-PAGE、兩維電泳、兩維液相色譜法，時間大大縮短；親和柱組合分組對 蛋白樣品復雜度簡化后，在LC-MS/MS分析對多肽的分離可以只采用一維C18反相分離，免 用了離子交換步驟，進而可節省幾個小時；親和柱組合分組后檢出蛋白數量比分組前提高 60 150% ，檢出蛋白對原始樣檢出蛋白覆蓋率高達80 90%以上，比現有文獻報道檢出 的蛋白數提高很多。
圖1親和組合分組系統工作流程示意圖。
具體實施例方式
以下實例將結合附圖對本發明作進一步說明。本實施例在以本發明技術方案為前 提下進行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。 下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的 條件。
本實施例中涉及到的實驗，操作過程如下
(1)組織蛋白提取 用剪刀切碎樣品組織(如是微生物細胞，則離心后收獲菌體)，然后用pH為7. 0 含O. l麗aCl的磷酸鹽緩沖液充分洗滌并濾干，然后按每克組織10ml比例加裂解緩沖液 (0. 5mol/L醋酸，10mmol/L EDTA， 1. 0mmol/L PMSF， pH2. 8)，機械組織勻槳機勻槳，4。C下用 5000g離心10min，收集上清，然后超聲處理(400W，超3秒，停2秒，共800秒)，紗布過濾， 調PH到中性，再用17000g離心15min，收集上清液，分裝好，-7(TC保存備用。
(2)蛋白樣品的胰蛋白酶(trypsin)消化 分離后樣品透析除鹽并濃縮，制成凍干樣品。10 50ii g凍干樣品重溶于還原溶 液(6Mguanidine hydrochloride, 50mM Tris-HCl，3mM DTT， pH8，30ii 1)，于60。C培育1小 時；還原完后加入1. 5 iil的1M iodoacetamide，在暗處室溫烷基化處理30分鐘；然后加入 270ul的50mM ammonium bicarbonate buffer (pH 8. 5)將鹽濃度降低，遂力口入O. 5 5 u g 的活化胰蛋白酶(trypsin) ，37t:過夜。胰蛋白酶(trypsin)消化后的肽混和物凍干保存。
(3) LC-MS/MS分析
6
5 10 ii g重溶的胰蛋白酶消化肽混和物首先上樣到Zorbax 300 SB-C18 p印tidetraps (Agilent Technologies, Wilmington, DE)脫鹽；然后對肽混禾口物 在Zorbax300SB-C18反相毛細管層析柱(100踐inner diameter X 15cm， Agilent Technologies)上進行反向層析分離，流速設定為500nl/min，先用4 50% B的直線梯度 (A :0.1% (v/v)formic acid ;B :84% (v/v)acetonitrile and 0.1% (v/v)formic acid) 洗50分鐘，接著一個50 100% B梯度洗4分，100% B梯度維持10分。自動收集的峰在 線上樣到Fi皿iganLTQ離子阱質譜儀(single li固r quadrupole ion tr即)進行肽鑒定。 收集一級和二級質譜數據，自動形成肽質譜文件。LC-MS/MS完成每個樣品的肽質譜原始文 件，利用Sequest軟件設定條件針對組織蛋白所屬來源的蛋白數據庫進行搜庫，跟已知蛋 白序列理論多肽序列比對分析進行匹配，從而找出樣品內可能具有的非冗余可信蛋白。為 了避免錯誤匹配，采用ISB/SPC Proteomics Tools-TPP V4. 2過濾錯誤匹配，肽的p值設定 為大于等于0. 9，蛋白置信度設定為95%以上。
(4)比較分析分組前后檢出的蛋白數量 將親和柱組合分組的所有組分檢出的蛋白合并，并剔出掉重復部分，可以統計出 總共檢出的蛋白數，并可以找出只在某一個組分里出現的蛋白。跟未分組的原始樣品相比， 分組后檢出蛋白數可以提高60 150%，分組后檢出蛋白對原始樣檢出蛋白覆蓋率高達 80 90%以上。只在特定組分出現的蛋白在總蛋白中占比40 80%。
實施例1 以環氧氯丙烷為骨架的親和材料合成 取S印harose CL-4B (100克)用10倍體積的去離子水洗滌，抽干成濕餅狀；然后 懸浮于50ml活化緩沖液(1M Na0H， 2. 5g硼氫化鈉，10ml環氧氯丙烷)，在攪拌下6(TC恒溫 反應2小時，等pH接近7. 0時停止反應，然后倒入玻璃磨砂漏斗中，在抽濾下用10倍體積 的蒸餾水洗滌，環氧氯丙烷活化的S印harose 4B分裝于可密封的玻璃瓶中(20g/瓶)。
取各種氨基化合物0. 5g(見表1)溶解于25mL 0. 1M氫氧化鈉/L 二氧六環中，分 別加入到盛有活化的S印harose 4B的瓶中，貼好標簽，在攪拌下于6(TC反應24h。加入lmL 巰基乙醇，繼續反應2小時，10倍體積的蒸餾水充分洗滌至pH中性，體積分數為20%的乙 醇中保存待用。這種方法用于合成單氨基化合物配體，按不同氨基化合物數字編號命名為 Am， m為氨基化合物數字編號。如，A6、 A84分別為用1， 6-己二胺和6-氨基己酸連接到活 化的S印harose 4B上構建而成的兩種單氨基親和配體。
表l親和配體合成中使用的氨基化合物
氨基化合物 氨基化合物 3_amino_l_propanol acryl咖ide 3-methoxypropyl咖ine ethanol咖ine ethylenediamine 4_methyl_3_nitro￡iniline octylamine propylamine 1， 4-phenylenedi咖ine o—toluidine
2， 5-dichloroaniline 4， 4' 一thiodianiline
2， 4一dichloroaniline 2—aminobenzothiazole
4， 4一di咖inodiphenylmethane 4， 4' 一oxydianiline
p-toluidine2， 6-dimethylaniline2， 4， 6-trichloroaniline4， 4_methylene_bis(2-chloroaniline)m—toluidine4一aminobiphenyl2， 3-dichloroaniline4一aminobenzoic acidmethyl 2-aminobenzoate4， 4' -methylene-bis(2-methylaniline)m—anisidine4一膽ino3zobenzeneo-anisidine肌iline2， 4_diamino_6_methylphenol4_amino_2， 6-dinitrotoluenel一n即hthyl咖ineisopropylamine2， 4一di咖inotoluenebenzidine3'-咖inoacetophenone4_methyl_m_phenylenediamine2， 4-dimethylaniline4_i sopropylani1ine2， 4-dinitroanilinebenzylamine4'-咖inoacetophenone4_methyl_o_phenylenediamine2， 6-dichloroanilinep-anisidine2， 6-diethylanilineo—aminoazotoluene4一咖ino-2-nitropheno1l一膽ino-2-n即hthol-4一sulfonic acid2， 6-dinitroaniline2， 4_diaminoanisole2-aminopheno1o-dianisidine2-咖ino-3-nitropheno12-aminobenzimidazole2-咖inopyridine6-amino c即roic acid2-n即hthyl咖ine2-furfurylamine2_methoxy_5_methylani1ine5-aminoisophthalic acid2-nitroaniline4一phthalazinedione3-咖inopyridinecyclohexylamine2-methyl-3-nitroani1inel—aminoanthraquinone3-aminopheno14一aminosalicylic acid4一咖inopheno1arginine2-methyl-4一nitroani1ine2-aminoter印hthalic acid
3-nitroaniline9一aminoacridine
4一nitroanilinetryptamine
2-methyl-6-nitroani1ine3，3' -dichlorobenzidine實施例2以三氯三氮嗪為骨架的仿生配基的合成
100克環氧氯丙烷活化的S印harose CL 4B介質懸浮于350ml去離子水，然后加入150ml35% (v/v)氨水，在攪拌(200r/min)下30。C恒溫12小時。NH廠S印haroseCL-4 B懸 浮在350ml50% (v/v)冰浴丙酮溶液中，隨后將8g三氯三氮嗪溶于80ml _201:預冷丙酮， 快速加入介質懸浮液，用飽和NaHC03維持pH在6. 5 8. 0之間，O 4t:繼續攪拌2小時 停止反應。
用3倍介質體積的丙酮，丙酮去離子水(體積比i : i)，去離子水，順序洗滌反
應，得二氯三氮嗪_氨基-S印harose CL 4B ;稱取20g 二氯三氮嗪-氨基-S印harose CL 4B，與溶解于一定量的蒸餾水中(20 50mL)5倍摩爾過量的氨基化合物(Rl)混勻，5(TC水 浴振蕩24小時，反應過程中，用飽和NaHC03和lmol/L醋酸使溶液pH保持在7 7. 5之間， 10倍體積蒸餾水充分洗滌，抽干。然后與溶解于一定量蒸餾水(20 50mL)中的R2氨基 化合物(5倍摩爾過量)混合，95t:反應24小時，反應過程中，用飽和NaHC03和lmol/L醋酸使溶液PH保持在6 7之間。最后10倍體積的蒸餾水充分洗滌三次，抽干，體積分數為
20%的乙醇中保存待用。這種方法用于合成雙氨基化合物配體，按不同氨基化合物數字編
號命名為Am-n， m、 n為氨基化合物Rl和R2的數字編號，如A7_56， All-70，和A29_32。各
化合物編號分別為7 (乙二胺)、56 (L-精氨酸)11 (對氨基苯脒鹽酸鹽)、70 (L-脯氨酸)、
29(間氨基酚)、32(間苯二胺)。 實施例3 蛋白吸附性能評價與挑選 對親和分離材料庫吸附蛋白性能進行評價，選擇吸附蛋白種類占全蛋白20至 80%的親和柱。 首先，將合成好的配體介質取1ml分別裝填到層析柱中，寫好標簽，用15ml平衡緩 沖液(pH7. O，含0. 1M NaCl的lOmM磷酸鹽緩沖液)充分洗滌平衡；然后取1 4mg組織蛋 白上樣，柱上結合30分鐘，用10 20ml平衡緩沖液洗去未結合蛋白(通過蛋白紫外檢測儀 監控，直到基線平)；最后用3ml洗脫緩沖液(pH12，10mM Glycine-NaOH緩沖液)洗脫柱上 結合蛋白，立即調節pH中性。收集的各個配體結合的蛋白樣品，進行SDS-PAGE電泳分析，通 過電泳膠考馬斯亮藍染色的圖譜比對分析，從條帶分布就可以找出差異大的配體介質。通 過每個親和介質吸附蛋白后的洗脫樣品的LC-MS/MS質譜分析可以確定每個親和介質吸附 的具體蛋白種類，從而比較這些親和介質的蛋白吸附差異。
符合吸附蛋白種類占全蛋白20至80%的親和柱有 A6， A84， A15分別為用環氧化學把編號化合物連接到層析基質的親和分離材料；
Al-4， A7-56, A8_54， All_70， A25-35和A29-32,分別為兩種編號的化合物通過三 氯三氮嗪骨架連接到層析基質的親和分離材料。各化合物編號分別為1(丁胺)、4(十一 胺)、6(1,6-己二胺)、7(乙二胺)、8(苯胺)、11(對氨基苯脒鹽酸鹽)、15(色胺)、25(芐 胺)、29 (間氨基酚)、32 (間苯二胺)、35 (酪胺)、54 (氨基醋酸)、56 (L-精氨酸)、70 (L-脯 氨酸)、84(6-氨基己酸)； lmg人血清蛋白過Al-4、A6、A7-56、A8-54、All-70、A15、A25-35、A29-32和A84九根 親和材料后，按上述條件得到的9份柱上結合蛋白樣品分別trypsin消化，LC-MS/MS分析， Sequest搜庫過濾鑒定的非冗余可信蛋白。Al-4、 A6、 A7_56、 A8_54、 All_70、 A15、 A25_35、 A29-32和A84九份柱上結合蛋白樣品中鑒定的非冗余可信蛋白組數量分別為19、46、10、 25、41、27、17、38和44種，其中各柱專一吸附(不與其它重復)的蛋白數量分別為1、7、1、 1、12、1、2、6和6種，主要是低豐度蛋白。 2mg小鼠睪丸組織蛋白過Al-4、A6、A7-56、A8-54、All-70、A15、A25-35、A29-32和 A84九根親和材料后，按上述條件得到的9份柱上結合蛋白樣品分別trypsin消化，LC-MS/ MS分析，Sequest搜庫過濾鑒定的非冗余可信蛋白。Al_4、 A6、 A7_56、 A8_54、 All_70、 A15、 A25-35、A29-32和A84九份柱上結合小鼠睪丸蛋白樣品中鑒定的非冗余可信蛋白組數量分 別為111、173、120、196、93、151、287、106和86種，其中各柱專一吸附(不與其它重復)的 蛋白數量分別為H、34、23、30、16、20、78、12和17種，差異吸附效應明顯。9柱總共鑒定的 535個非冗余小鼠睪丸可信蛋白中，各柱專一吸附蛋白數量為242(45.2%)，在2、3、4、5、6、 7、8和9柱中重復出現的蛋白數量分別為105、59、44、30、33、12、4和6種。
實施例4
串聯分組1采用5種親和配體介質A7-56，A84，A11-70，A6，和A29-32串聯組合分析大鼠肝組 織細胞溶質部分(rat liver cytosol)全蛋白。串聯分組工作流程如圖IA所示。
步驟一，親和層析柱的串聯平衡 A7-56, A84， All_70， A6，和A29-32五根親和配體介質各裝填1ml到層析柱(低端 和頂端封好墊片)，5個層析柱首尾依次串聯連接好。串聯層析柱首先用30ml平衡緩沖液 (pH7. O，含0. 1M NaCl的lOmM磷酸鹽緩沖液)充分洗滌平衡。 步驟二，柱上結合取4mg大鼠肝細胞溶質組織勻漿Fraction O，上樣到串聯柱， 柱上結合60分鐘，用40ml平衡緩沖液洗去未結合蛋白，通過蛋白紫外檢測儀監控直到基線 平，并接收流穿蛋白，定義為Fraction 6。 步驟三，洗脫把五根串聯的層析介質柱分開，每根柱子單獨用3ml洗脫緩沖液 (pH12，10mM Glycine-NaOH緩沖液)洗脫柱上結合蛋白，立即調節pH中性，5根柱子的洗脫 接收液分別定義為Fractionl-Fraction5。 步驟四，胰蛋白酶(trypsin)消化按標準實驗程序分別消化原樣和串聯分配的 Fractionl-Fraction 6各組分。 步驟五，LC-MS/MS分析10 ii g重溶的原樣(Fraction 0)和串聯分配的六個組分 (Fraction 1 Fraction 6)肽混和物按標準實驗程序肽分離、LC-MS/MS分析、搜庫過濾分 析。 步驟六，比較分析分組前后檢出的蛋白數量 將串聯分組的6個組分檢出的蛋白合并，并剔出掉重復部分，總共鑒定出665個大 鼠肝蛋白，而分組前的原始樣品中只檢出370個蛋白，分組后檢出的蛋白數提高了80%，分 組后檢出蛋白對原始樣檢出蛋白覆蓋率高達80% (291個)。665個鑒定的大鼠肝蛋白中， 有430個蛋白只在特定組分出現而不與其它組分重復，在總蛋白中占比64. 7 % ，親和配體 特異性得到充分展示。串聯工作流程簡單，不需要大型儀器設備，易于自動化，只需要2 3小時就可以完成串聯分組工作，比傳統的SDS-PAGE、兩維電泳、兩維液相色譜需要的時間 大大縮短丄C-MS/MS分析時，因為串聯親和柱組合分組對組織蛋白樣品的簡化，對多肽的分 離也只需要采用一維的C18反相分離。
實施例5
串聯分組2 采用的組織材料為假單胞菌M18培養細胞蛋白提取液。采用的5個串聯配體介質為A7-56，A84，All-70，A6，和A29-32。不同數字代表的
氨基化合物為7 (乙二胺)、56 (L-精氨酸)、84 (6-氨基己酸)、11 (對氨基苯脒鹽酸鹽)、
70 (L-脯氨酸)、6(1,6-己二胺)、29 (間氨基酚)、32 (間苯二胺)。 全蛋白分析的步驟 步驟一，親和層析柱的串聯平衡 A7-56, A84， All_70， A6，和A29-32五根親和配體介質各裝填lml到層析柱(低端 和頂端封好墊片)，5個層析柱首尾依次串聯連接好。串聯層析柱首先用30ml平衡緩沖液 (pH7. 0，含0. 1M NaCl的lOmM磷酸鹽緩沖液)充分洗滌平衡。 步驟二，柱上結合取8mg假單胞菌M18培養細胞蛋白提取液，上樣到親和串聯柱，
10柱上結合60分鐘，用40ml平衡緩沖液洗去未結合蛋白(通過蛋白紫外檢測儀監控，直到基 線平)，接收流穿蛋白，定義為Fraction 6。 步驟三，洗脫把五根串聯的層析介質柱分開，每根柱子單獨用3ml洗脫緩沖液 (pH12，10mM Glycine-NaOH緩沖液)洗脫柱上結合蛋白，立即調節pH中性，5根柱子的洗脫 接收液分別定義為Fractionl-Fraction 5。 步驟四，胰蛋白酶(trypsin)消化按標準實驗程序分別消化原樣和串聯分配的 Fractionl-Fraction 6個組分。
步驟五，LC-MS/MS分析 10 g重溶的上步各組分trypsin消化產物分別按標準實驗程序進行肽分離、 LC-MS/MS分析、搜庫過濾分析。 步驟六，比較分析分組前后檢出的蛋白數量 將假單胞菌M18培養細胞蛋白提取液串聯分組的6個組分檢出的蛋白合并，并剔 出掉重復部分，總共檢出611個的假單胞菌蛋白，而未分組的原始樣品只檢出298個蛋白， 分組后檢出蛋白數提高了 105%。只在特定組分出現的蛋白數為450(即組分之間不重復的 蛋白)，在總蛋白中占比73.6%，親和配體特異性得到充分展示。
實施例6
級聯分組l 采用的組織材料為大鼠肝組織細胞溶質部分(rat liver cytosol)，采用三層級 聯組合方式進行親和柱組合分組，然后胰蛋白酶消化、LC-MS/MS分析。采用的3個級聯組 合的配體介質為A15， A8-54和All-70。不同數字代表的氨基化合物為15(色胺)、8(苯 胺)、54 (甘氨酸)、11 (對氨基苯脒鹽酸鹽)、70 (L-脯氨酸)；級聯分組的工作流程如圖1B。
全蛋白分析的步驟
步驟一，親和層析柱的平衡 A15， A8-54和A11-70親和配體介質各裝填0. 4ml到層析柱(低端和頂端封好墊 片，A15裝填1根，A8-54平行裝填2根，All-70平行裝填4根。每個層析柱首先用10ml平 衡緩沖液(PH 7. O，含0. 1M NaCl的lOmM磷酸鹽緩沖液)充分洗滌平衡。
步驟二，第一級親和分組取4mg大鼠肝組織細胞溶質組織提取液FO上樣到A15 親和柱，柱上結合30分鐘，用10ml平衡緩沖液洗去未結合蛋白(通過蛋白紫外檢測儀監 控，直到基線平)，接收流穿蛋白，流穿組份定義為F卜lt)然后用2ml洗脫緩沖液(pH12， 10mMGlycine-NaOH緩沖液)洗脫柱上結合蛋白，立即調節pH中性，洗脫組份定義為F卜2。此 步驟將原始樣品一分二到兩個不同的亞組份。 步驟三，第二級親和分組第一層親和柱組合分組的兩個組份巳—^F卜2分別上樣到 兩根平衡好的A8-54親和層析柱，柱上結合30分鐘，用10ml平衡緩沖液洗去未結合蛋白 (通過蛋白紫外檢測儀監控，直到基線平)，接收流穿蛋白，兩個流穿組份分別定義為F2—工和 F2—3。然后用2ml洗脫緩沖液(pH12，10mM Glycine-NaOH緩沖液)洗脫柱上結合蛋白，立即 調節PH中性，兩個洗脫組份分別定義為F2—2和F2—4。此步驟將上步樣品二分四。
步驟四，第三級親和分組第二層親和柱組合分組的四個組份F2—pF2—2、F2—3、F2—4分 別上樣到四根平衡好的All-70親和層析柱，柱上結合30分鐘，用10ml平衡緩沖液洗去未 結合蛋白(通過蛋白紫外檢測儀監控，直到基線平)，接收流穿蛋白，四個流穿組份分別定義為F3—p F3—3、 F3—5、 F3—7。然后用2ml洗脫緩沖液(pH12， 10mM Glycine-NaOH緩沖液)洗脫 柱上結合蛋白，立即調節pH中性，四個洗脫組份分別定義為F3—2、F3—4、F3—6和F3—8。此步驟將 上步樣品四分八。 步驟五，胰蛋白酶(trypsin)消化FO、 F卜!、 F!—2、 F2—!、 F2—2、 F2—3、 F2—4、 F3—!、 F3—2、 F3—3、 F3-4、 F3—5、 F3—6、 F3—7和F3—8 —共15個樣品，通過透析除鹽并濃縮處理，制成凍干樣品。各取 50微克凍干樣品重溶于還原溶液(6M guanidine hydrochloride, 50mMTris_HCl， 3mM DTT， pH8， 30 ill)，按標準實驗程序分別消化。
步驟六，LC-MS/MS分析 上步消化好的F0、p F卜2、 F2—p F2—2、 F2—3、 F2—4、 F3—" F3—2、 F3—3、 F3—4、 F3—5、 F3—6、 F3—7和 F3—8 —共15個組分按標準實驗程序肽分離、LC-MS/MS分析、搜庫過濾分析。
步驟七，通過檢出的蛋白數量的比較分析級聯分組的效果 未分組的原始大鼠肝組織細胞溶質部分(rat liver cytosol) F0中，鑒定得到391 個非冗余的可信大鼠肝蛋白。第一級親和層析得到的2個組分F卜工和F卜2中檢出的蛋白合 并，并剔出掉重復部分，總共檢出的蛋白數為499個，檢出的蛋白數提高了 27.6%。第二級 親和層析得到的的4個組分F2—p F2—2、 F2—3和F2—4中檢出的蛋白合并，并剔出掉重復部分，總 共檢出616個可信蛋白，跟未分組的FO相比提高了 57. 5% 。第三級親和層析得到的的8個 組分F3—p F3—2、 F3—3、 F3—4、 F3—5、 F3—6、 F3—7和F3—8中檢出的蛋白合并，并剔出掉重復部分，總共檢 出的738個可信蛋白，跟未分組的FO相比提高了提高了 88. 75% 。通過逐級分配，鑒定的蛋 白逐漸增加，級聯分組的效果是非常明顯。最終通過三級聯親和分組共檢出859個非冗余 的可信大鼠肝蛋白(蛋白組)，檢出的蛋白數提高了 119.6%，也比現有文獻報道的數量提 高1倍以上。未分組樣品中檢出的蛋白有93. 1% (364個)在級聯分組后重現，一共檢出 495個新蛋白。該方法利用不同配體的級聯組合來分組大鼠肝組織細胞溶質部分組織蛋白 樣品，工作流程簡單，不需要大型儀器設備，易于自動化，只需要3 4小時就可以完成級聯 分組工作，
實施例7
級聯分組2 采用的組織材料為小鼠睪丸組織提取液，采用三層級聯的組合方式進行親和柱組
合分組，然后胰蛋白酶消化、LTQ-MS/MS分析。采用的3個級聯組合的配體介質為A15， A8-54
和All-70。不同數字代表的氨基化合物為15 (色胺)、8 (苯胺)、54 (甘氨酸)、11 (對氨基
苯脒鹽酸鹽)、70(L-脯氨酸)。 全蛋白分析的步驟 步驟一，親和層析柱的平衡 A15， A8-54和A11-70親和配體介質各裝填0. 4ml到層析柱(低端和頂端封好墊 片，A15裝填1根，A8-54平行裝填2根，All-70平行裝填4根。每個層析柱首先用10ml平 衡緩沖液(PH 7. O，含0. 1M NaCl的lOmM磷酸鹽緩沖液)充分洗滌平衡。
步驟二，第一級親和分組取4mg小鼠睪丸組織提取液M0上樣到A15親和柱， 柱上結合30分鐘，用10ml平衡緩沖液洗去未結合蛋白(通過蛋白紫外檢測儀監控，直 到基線平)，接收流穿蛋白，流穿組份定義為M1-1。然后用2ml洗脫緩沖液(pH12，10mM Glycine-NaOH緩沖液)洗脫柱上結合蛋白，立即調節pH中性，洗脫組份定義為M卜2。此步
12驟將原始樣品一分二到兩個不同的亞組份。 步驟三，第二級親和分組第一級親和分組的兩個組份M^p 2，分別上樣到兩根 平衡好的A8-54親和層析柱，柱上結合30分鐘，用10ml平衡緩沖液洗去未結合蛋白(通過 蛋白紫外檢測儀監控，直到基線平)，接收流穿蛋白，兩個流穿組份分別定義為M2—工和M2—3。 然后用2ml洗脫緩沖液(pH12，10mM Glycine-NaOH緩沖液)洗脫柱上結合蛋白，立即調節 pH中性，兩個洗脫組份分別定義為M2—2和M2—4。此步驟將上步樣品二分四。
步驟四，第三級親和分組第二級親和分組的四個組份M^pM2—2、M2—3和M^4，分別上 樣到四根平衡好的All-70親和層析柱，柱上結合30分鐘，用10ml平衡緩沖液洗去未結合 蛋白(通過蛋白紫外檢測儀監控，直到基線平)，接收流穿蛋白，四個流穿組份分別定義為 Mh、 M3—3、 M3—5、 M3—7。然后用2ml洗脫緩沖液(pH12， 10mM Glycine-NaOH緩沖液)洗脫柱上 結合蛋白，立即調節pH中性，四個洗脫組份分別定義為M3—2、M3—4、M3—6和M3—8。 MO最終通過三 級聯分配成M3—p M3—2、 M3—3、 M3—4、 M3—5、 M3—6、 M3—7和M3—8八個亞分配組分。 步驟五，胰蛋白酶(trypsin)消化收集樣品MO、 M3—^ M3—2、 M3—3、 M3—4、 M3—5、 M3—6、 M3—7 和M3—8按標準實驗程序消化。
步驟六，LC-MS/MS分析 上步消化處理好的MO、 M3—p M3—2、 M3—3、 M3—4、 M3—5、 M3—6、 M3—7和M3—8各10 ii g按標準實
驗程序肽分離、LC-MS/MS分析、搜庫過濾分析。 步驟七，通過檢出的蛋白數量的比較分析級聯分組的效果 未分組的原始小鼠睪丸組織M0中鑒定到526個非冗余的可信蛋白。M3—"M^2、M3—3、 M3—4、M3—5、M3—6、M3—7和M3—8八個組分檢出的蛋白合并，并剔出掉重復部分，總共檢出1378個非 冗余的小鼠睪丸蛋白，跟MO相比提高了 162%，比以前文獻報道的最大檢出數量也提高將 近173. 4%。 步驟八，本實施例建立的小鼠睪丸組織蛋白數據庫特性分析 采用三層級聯親和分組與質譜基于的蛋白組學分析建立了目前為止，最大的小 鼠睪丸蛋白數據庫(1378個蛋白)。在該數據庫中，鑒定的尺寸最小蛋白只有817Da，而 鑒定的最大分子量蛋白高達630. 35kDa，有12個(0. 87 % )鑒定蛋白分子量< 10kDa， 169(12. 26% )個鑒定蛋白分子量> lOOkDa，這都超出了現有小鼠睪丸蛋白組學研究中獲 得極端尺寸蛋白的極限。同時也鑒定得到38個蛋白(2.76%)的pl <4.5，51個蛋白 (3. 7% )的pl > 10，突破傳統2D-PAGE方法的極限。沒有通過特別的富集和處理方法，在小 鼠睪丸級聯親和分配組分中還鑒定到93個(6. 82% )疏水蛋白(GRAVY value > 0)，鑒定到 81個蛋白(5.88%)有1個或多個預測的TM domains。鑒定的小鼠睪丸組織蛋白有707個 集中分布于細胞溶質、線粒體、細胞核和細胞膜四個主要的亞細胞器，占比66. 2%。級聯親 和分配鑒定的1378個小鼠睪丸蛋白中，有1157個蛋白(83.96%)在Uniprot數據庫有GO 分子功能分類定義，其中481個蛋白(41. 57% )為各種催化活性的酶或酶亞基(包括氧化 還原酶、轉化酶、脂酶、水解酶、多聚酶、裂解酶、異構酶等)，占比最大。其它功能蛋白包括分 子伴侶、核糖體蛋白、翻譯和轉錄因子、電子載體、核酸結合蛋白、金屬離子結合蛋白、酶調 節活性蛋白、發育蛋白、運輸蛋白、馬達蛋白和結構分子蛋白等。由于睪丸是生精的組織和 場所，我們對級聯親和分配中鑒定的1378個小鼠睪丸蛋白的功能分析找出了與生精及精 子發育相關的蛋白(IPI00118122， IPI00118783， IPI00118851， IPI00121394， IPI00123400，IPI00125705, IPI00127379, IPI00127431, IPI00131034, IPI00133708, IPI00227900, IPI00380504, IPI00406492, IPI00461359,IPI00138866, IPI00223935)。
權利要求
一種利用親和柱分析全蛋白的方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，合成親和分離材料，得到親和分離材料庫；步驟二，提取生物樣品全蛋白，從步驟一所得的親和分離材料庫中篩選出吸附蛋白種類占全蛋白20～80％的親和材料組合；步驟三，從步驟二所得親和材料組合中選擇一種或多種分別填充親和柱，之后利用所得親和柱，采用級聯組合分析方法、串聯組合分析方法、或者級聯與串聯混合的組合分析方法分析生物樣品全蛋白，得到多組蛋白復雜度簡化的樣品；步驟四，對步驟三所得樣品分別進行胰蛋白酶消化和LC-MS/MS分析，進而完成生物樣品全蛋白的全蛋白分析。
2. 根據權利要求l所述的利用親和柱分析全蛋白的方法，其特征是，步驟一中，所述 親和分離材料庫具體為以如下組合中的氨基化合物為配體，采用以環氧氯丙烷為骨架的 單氨基化合物配體合成法合成相應的親和分離材料；以如下組合中的氨基化合物為配體， 采用以三氯三氮嗪為骨架的雙氨基化合物配體合成法合成相應的親和分離材料；所有合成 的親和分離材料構成親和分離材料庫；所述氨基化合物的組合為3-amino-l-propano1、 2—phenethylamine、 acrylamide、3， 5—dinitroaniline、3—methoxypropylamine、 2_methyl_5_nitroaniline、 ethanolamine、 2， 4一dichloroaniline、 ethylenediamine、 2_aminobenzothiazole、4_methyl_3_nitroaniline、3_methyl_o_phenylenediamine、 octylamine、2，5-dichloroaniline、 propyl amine、4，4' -thiodianiline、1， 4-phenylenediamine、4， 4-diaminodiphenylmethane、 o-toluidine、4， 4' -oxydianiline、 p-toluidine、2， 6-dimethylaniline、2， 4， 6_trichloroaniline、4， 4_methylene_bis (2_c hloroaniline) 、 m_toluidine、4_aminobiphenyl、2， 3_dichloroaniline、4_aminobenzoic acid、 methyl 2—aminobenzoate4， 4' -methylene-bis (2-methylani 1 ine) 、 m_anisidine、4_aminoazobenzene、 o-anisidine、 aniline、2， 4_diamino_6_methylphenol、4_amino_2， 6_dinitrotoluene、l_naphthylamine、 isopropylamine、2，4—diaminotoluene、 benzidine、3' _aminoacetophenone、4_methyl_m_phenylenediamine、2， 4_dimethylaniline、4_isopropylaniline、2， 4一dinitroani1ine、 benzylamine、 4' -aminoacetophenone、4_methyl_o_phenylenediamine、2，6_dichloroaniline、 p_anisidine、2， 6_diethylaniline、 o_aminoazotoluene、4_amino_2_nitrophenol、 l_amino_2_naphthol_4_sulfonic acid、2， 6-dinitroaniline、2， 4一diaminoanisole、 2_aminophenol、 o_dianisidine、2_amino_3_nitrophenol、2_aminobenzimidazole、 2-aminopyridine、6—amino caproic acid、2_naphthylamine、2_furfurylamine、2_methoxy_5_methylani1ine 、 5_aminoi sophthaiic acid、2_nitroaniline、 4_phthalazinedione、3_aminopyridine、 cyclohexylamine、2_methyl_3_nitroaniline、l_aminoanthraquinone、3_aminophenol、 4一aminosalicylic acid、4_aminophenol、 arginine、2_methyl_4_nitroaniline、2_aminoterephthalic acid、3—nitroaniline、 9_aminoacridine、4_nitroaniline、 tryptamine、2_methyl_6_nitroaniline禾卩3，3' -dichlorobenzidine。
3. 根據權利要求2所述的利用親和柱分析全蛋白的方法，其特征是，步驟三中，所述親和分離材料組合具體為分別以1，6-己二胺、色胺和6-氨基己酸為配體，采用以環氧氯丙烷為骨架的單氨基化合物配體合成法合成的相應的親和分析材料；分別以丁胺和十一胺、乙二胺和L-精氨酸、苯胺和氨基醋酸、對氨基苯脒鹽酸鹽和L-脯氨酸、芐胺和酪胺、以及間氨基酚和間苯二胺為配體，采用以三氯三氮嗪為骨架的雙氨基化合物配體合成法合成的相應的親和分離材料；上述得到的9種親和材料組成親和分離材料組合。
4. 根據權利要求1所述的利用親和柱分析全蛋白的方法，其特征是，步驟三中，所述級聯組合分析方法具體為取生物樣品全蛋白，通過第一根親和柱吸附洗脫，得到流穿和洗脫兩組樣品；將流穿和洗脫兩組樣品分別通過第二根親和柱，各自再次得到流穿和洗脫兩組樣品，此時共有四組樣品；依次類推，當通過第n根親和柱后，共得到2n組樣品；所述n為> 2的自然數。
5. 根據權利要求4所述的利用親和柱分析全蛋白的方法，其特征是，所述n為> 3的自然數。
6. 根據權利要求l所述的利用親和柱分析全蛋白的方法，其特征是，步驟三中，所述串聯組合分析方法具體為取生物樣品全蛋白，通過第一根親和柱吸附洗脫，得到流穿和洗脫兩組樣品；流穿組樣品通過第二根親和柱吸附洗脫，得到流穿和洗脫兩組樣品，共三組樣品；依次類推，將每一次得到的流穿組樣品再次通過親和柱吸附洗脫，得到與之相應的流穿和洗脫兩組樣品，在通過第m根親和柱后，共得到m+l組樣品；所述m為> 3的自然數。
7. 根據權利要求6所述的利用親和柱分析全蛋白的方法，其特征是，所述m為> 5的自然數。
全文摘要
一種蛋白質組技術領域的利用親和柱分析全蛋白的方法，包括如下步驟合成親和分離材料，得到親和分離材料庫；提取生物樣品全蛋白，從步驟一所得的親和分離材料庫中篩選出吸附蛋白種類占全蛋白20～80％的親和材料組合；從步驟二所得親和材料組合中選擇一種或多種分別填充親和柱，之后利用所得親和柱，采用級聯組合分析方法、串聯組合分析方法、或者級聯與串聯混合的組合分析方法分析生物樣品全蛋白，得到多組蛋白復雜度簡化的樣品；對步驟三所得樣品分別進行胰蛋白酶消化和LC-MS/MS分析，進而完成生物樣品全蛋白的全蛋白分析。本發明的方法可克服高豐度蛋白淹沒低豐度蛋白信號的技術不足，提高極端性質蛋白檢出率。
文檔編號G01N30/00GK101694485SQ20091030779
公開日2010年4月14日 申請日期2009年9月27日 優先權日2009年9月27日
發明者李榮秀, 譚青喬 申請人:上海交通大學;