專利名稱：一種丙型肝炎病毒及其表面抗原的試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明屬于感染性疾病檢測技術領域。具體涉及到一種丙型肝炎病毒及其表面包 膜抗原E2的試劑盒，同時還涉及一種丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2試劑盒的檢測方 法，它適用于丙型肝炎病毒及其丙型肝炎病毒抗原的檢測。
背景技術：
丙型肝炎是一種主要經血液傳播的疾病，丙型肝炎病毒Ofepatitis C Virus, HCV)慢性感染可導致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，部分患者可發展為肝硬化甚至肝細胞癌 (HCC)，對患者的健康和生命危害極大，已成為嚴重的社會和公共衛生問題。丙型肝炎呈全 球性流行，是歐美及日本等國家終末期肝病的最主要原因。據世界衛生組織統計，全球HCV 的感染率約為3%，估計約1. 7億人感染了 HCV，每年新發丙型肝炎病例約3. 5萬例。丙型 肝炎目前尚無有效疫苗，也沒有有效的治愈方法。因此，控制丙型肝炎只能從傳染源和傳播 途徑入手，早期準確診斷和發現HCV感染者就是防控丙型肝炎傳染源、阻斷傳播途徑最為 有效的手段。所以，世界各國都不遺余力的研究丙型肝炎的診斷新技術。自從1989年建立了丙肝病毒抗-HCV檢測方法以來，丙型肝炎的檢測技術就處于 不斷發展中。到目前為止，丙型肝炎檢測技術主要有抗-HCV檢測、HCV-RNA核酸擴增檢測、 和HCV核心抗原的檢測。目前用于臨床HCV感染檢測的主要指標僅為抗HCV和HCV-RNA，但 兩者在丙肝診斷中均存在一定的局限性，如對于免疫功能不正常、或“窗口期”的HCV感染 者，則不能檢出抗-HCV，有一定的漏檢率；HCV RNA其操作復雜，而且儀器特殊、檢測費用昂 貴，在一般實驗室不易開展。作為HCV感染的檢測手段，HCV表面抗原檢測丙型肝炎病毒的 感染具有十分重要的意義。
發明內容
發明的目的是在于提供了一種丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2的試劑盒，該 試劑可以檢測丙型肝炎病毒的感染，檢測速度快，操作方便安全，省時效率高，而且價格低 廉，檢測靈敏度和精確度都很高，應用前景廣闊。發明的另一個目的是在于提供了一種丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2的試劑 盒檢測丙型肝炎病毒的方法，該試劑盒優于HCV抗體檢測法，本方法可以檢測窗口期，即病 毒感染的早期或潛伏期，有利于早期對病人的防治；另外在成本和操作上也優于HCV-RNA 核酸擴增檢測法，比HCV-RNA核酸擴增檢測法成本低，操作更簡便，檢測靈敏度和精確度 高。本發明試劑盒對丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2檢測的方法是利用一種能特異性 結丙型肝炎病毒表面包膜抗原E2的單鏈DNA適配子作為探針，采用丙型肝炎病毒及其表面 包膜抗原E2多克隆抗體包被孔板，生物素標記的該DNA適配子作為探針，類似夾心ELISA 法，用于檢測血清或體液中丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2。為了實現上述目的，本發明采用以下技術措施—種丙型肝炎病毒及其丙型肝炎病毒包膜抗原E2的試劑盒，它包括抗丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗體，酶標板(購自海門市三和新華玻璃實驗儀器廠)，生物素 標記核酸適配子ZE18，辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素(購自北京博奧生物技術有限公 司)及其顯色底物3’，3’，5，5’-四甲基聯苯胺(TMB)(購自深圳達科為生物技術有限公 司)。所述的抗丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗體(或抗血清)的制備將 丙型肝炎病毒包膜抗原E2的真核表達載體pcDNA3. 1A-E2 (來源于Vaccine，2007，25 1544-1551)，肌肉多點注射入家兔，每隔一周后注射一次，每次免疫注射100 200微克質 粒DNA，注射三次，用基因電導入儀(購自寧波新芝生物科技有限公司)在注射部位電極 導入DNA，第三次注射后2周，再用丙型肝炎病毒包膜抗原E2重組蛋自(來源于Vaccine， 2007,25 :1544-1551)加強免疫，免疫注射2次，每次免疫注射100微克蛋白，兩周后心臟取 血，IOOOrpm離心分離血清，即為丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗體(或抗血清)。保 存于-80°C。所述的核酸適配子觀18為本發明者通過SELEX篩選技術，通過篩選到的能特異性 結合丙型肝炎病毒包膜抗原E2的單鏈DNA適配子，命名為觀18(具體步驟見發明專利申 請號:200810197315. 4，發明人章曉聯，陳芳)。所述的生物素標記核酸適配子觀18 將觀18序列送公司合成，公司合成生物素標 記觀18的5，端(命名為bio-ZE18)。并用無菌雙蒸水稀釋為400nM的濃度，_20°C保存。 新型生物素標記的DNA適配子具有SEQIDN0. 1，所示的核苷酸序列；一種丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2的試劑盒檢測丙型肝炎病毒的方法，檢測步驟是1、將1 200兔抗丙型肝炎病毒包膜抗原的多克隆抗血清(效價為1 12800， PBS稀釋)包被酶標板(如96孔)，4度過夜。2、含有 5/10000 吐溫-20 的磷酸鹽緩沖液(PBS 溶液=NaCl 8g，KCl 0. 2g，Na2HPO4 1. 44g，KH2PO4 0. 24g,加去離子水溶解，定容至IOOOml，調pH至7. 4，15磅滅菌20min,置4°C 保存)，洗滌六遍。3,1% (g/ml)牛血清白蛋白(BSA) (PBS溶解)封閉96孔板，100 μ 1/孔，37度封 閉1小時。4、加入待檢樣品、包括HCV病毒(來源于Cell Mol Immunol. 2009,6(4) :235-44)、 HCV病毒陽性血清、或對照樣品，100 μ 1/孔，37度孵育1小時。5、含有5/10000吐溫-20的PBS，洗滌六遍。6、加入 bio4E18G00nM/孔，PBS 稀釋)，37 度孵育 1 小時。7、含有5/10000吐溫-20的PBS，洗滌六遍。8、加入加辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素(HRP-sti^ptoavidin) (1 1000， PBS稀釋)，100 μ 1/孔，37度孵育1小時。9、含有5/10000吐溫-20的PBS，洗滌六遍。10、加入底物顯色劑(TMB) (TMB干粉10mg，溶于5ml無水乙醇中Qmg/ml)。pH5. 0 顯色液IOml中，加入ang/ml TMB 0.5ml，再加入2μ1 30% H2O2，臨用前配制)顯色2min， 用2M濃硫酸中止顯色。本發明中所用的底物顯色劑配方包括A底物是TMB 20mg(固體)， 先用無水乙醇IOml溶解，充分振蕩(試劑瓶要干凈，干燥)，加雙蒸水定容到100ml，此即是A底物；B底物是取1水檸檬酸2. lg，無水Na2HP04 2. 82g，0. 75%的過氧化氫0. 6細1，雙 蒸水定容至100ml (無須調pH值，應在4. 5-5. 0范圍)，此即是B底物。使用時，A底物與B 底物各取5ml混勻。11、1小時內在Themo scientific Multskan mk3多功能酶標儀450nM下檢測吸 光度。檢測結果是丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒E2抗原或HCV感染陽性病人及其丙型肝炎 病毒E2抗原陽性病人的0D450值均大于設定的臨界值(cutoff值)，而陰性樣品或正常健 康人的0D450值均小于臨界值(cutoff值)，cutoff值=0. 1 X陽性對照的平均0D450值 +陰性對照的平均0D450值。說明本試劑盒的檢測結果能有效的鑒別出丙型肝炎病毒、或 HCV感染感染患者與正常健康人或非丙型肝炎病毒感染感染患者的不同。本發明的優點是核酸適配子體外容易合成，且能特異性與丙型肝炎病毒包膜抗 原結合，而不與其他病毒等病原體結合，同時對于丙型肝炎病人陽性的血清，都能表現出高 于臨界值(cutoff值)的OD值，而對于陰性的，OD值都在臨界值(cutoff值)以下，說明 核酸適配子檢測有較高的靈敏性。因此，對于核酸適配子在丙型肝炎病人的早期診斷方面， 在臨床上有很大的應用前景。
圖1本試劑盒檢測HCV、HCVE2抗原特異性的鑒定丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原E2、以及與HCV陽性病人血清的結合OD值 明顯高于對健康正常人血清的OD值，有顯著差別，*p < 0. 05，有很高的特異性。圖2本發明試劑盒檢測HCV、以及不同病人特異性的鑒定本發明試劑盒分別檢測丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原E2、以及乙或丙肝 陽性病人血清、結核(TB)陽性病人血清等，檢測結果是丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜 抗原E2、以及與丙肝(HCV)陽性病人血清的結合OD值明顯高于對其他病人血清的OD值， 有顯著差別，*P < 0.05。說明本法能有效的鑒別出丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原 E2、以及丙肝(HCV)陽性病人與其他病人間的不同。圖中HBV patients 代表HBV陽性病 人血清；TB patients 代表結核TB陽性病人血清；HCV patients 代表HCV陽性病人血清； Healthy donors 代表健康正常人血清。
具體實施例方式實施例1 本試劑盒檢測HCV病人特異性的鑒定本試劑盒檢測丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原E2、以及IM份HCV陽性病人 血清和135份健康正常人血清。對象丙型肝炎病毒來源于Cell Mol Immunol. 2009,6 ) :235-44 ；丙型肝炎 病毒包膜抗原 E2 來源于 Vaccine，2007，25 :1544-1551 ；HCV 感染者:2007-03/2008-08 在 武漢大學中南醫院、武漢市傳染病醫院等臨床診斷明確為丙型肝炎病毒(HCV)感染的患 者，并排除其他肝炎病毒和HIV病毒感染，平均年齡44 (8 80)歲。部分患者使用干擾素 進行抗病毒治療；非HCV感染者同期在武漢大學中南醫院就醫、臨床已排除HCV感染的患 者，平均年齡35 (8 79)歲。一種丙型肝炎病毒及其丙型肝炎病毒包膜抗原E2的試劑盒，它包括抗丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗體，酶標板(購自海門市三和新華玻璃實驗儀器廠)，生物素 標記核酸適配子ZE18，辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素(購自北京博奧生物技術有限公 司)及其顯色底物TMB(購自深圳達科為生物技術有限公司)。生物素標記核酸適配子觀18 將觀18序列送公司合成，合成生物素標記觀18的 5，端(命名為bio-ZE18)。并用無菌雙蒸水稀釋為400nM的濃度，_20°C保存。一種丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2的試劑盒檢測丙型肝炎病毒的方法，其檢測步驟如下1、將1 200兔抗丙型肝炎病毒包膜抗原的多克隆抗血清(效價為1 12800， PBS稀釋)包被96孔ELISA板，4度過夜。2、含有 5/10000 吐溫-20 的磷酸鹽緩沖液(PBS 溶液=NaCl 8g，KCl 0. 2g，Na2HPO4 1. 44g，KH2PO4 0. 24g,加去離子水溶解，定容至IOOOml，調pH至7. 4，15磅滅菌20min,置4°C 保存)，洗滌六遍。3,1% (g/ml)牛血清白蛋白(BSA) (lmg/mLPBS 溶解)封閉 96 孔板，100 μ 1/孔，37 度封閉1小時。4、加入待檢樣品，100 μ 1/孔，37度孵育1小時。2. 5.含有5/10000吐溫-20的PBS，洗滌六遍。6、加入 bio4E18G00nM/孔，PBS 稀釋)，37 度孵育 1 小時。7、含有5/10000吐溫-20的PBS，洗滌六遍.8、加入加辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素(HRP-sti^ptoavidin) (1 1000， PBS稀釋)，100 μ 1/孔，37度孵育1小時。9、含有5/10000吐溫-20的PBS，洗滌六遍.10、加入底物顯色劑(TMB) (TMB干粉10mg，溶于5ml無水乙醇中Qmg/ml)。pH5. O 顯色液IOml中，加入ang/ml TMB 0.5ml，再加入2μ1 30% H2O2，臨用前配制)顯色2min，
用2M濃硫酸中止顯色。11、1小時內在Themo scientific Multskan mk3多功能酶標儀450nM下檢測吸光 度。檢測結果是丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原E2以及HCV感染陽性病人及其丙型 肝炎病毒E2抗原陽性病人的0D450值均大于設定的臨界值(cutoff值)，而正常健康人及 陰性樣品的0D450值均小于臨界值(cutoff值)，cutoff值=0. IX陽性對照的平均0D450 值+陰性對照的平均0D450值。說明本試劑盒的檢測結果能有效的鑒別出丙型肝炎病毒、 丙型肝炎病毒包膜抗原、以及丙型肝炎病毒感染感染患者與正常健康人或非丙型肝炎病毒 感染感染患者的不同。結果見圖1。實施例2 本發明試劑盒檢測丙型肝炎病毒、以及不同病人特異性的鑒定分別檢 測丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原E2、以及乙肝或丙肝陽性病人血清、結核陽性病人血清。對象丙型肝炎病毒來源于Cell Mol Immunol. 2009，6 G) :235-44 ；丙型肝炎病 毒包膜抗原 E2 來源于 Vaccine，2007，25 :1544-1551 ；HCV 感染者:2007-03/2008-08 在武 漢大學中南醫院、武漢市傳染病醫院等臨床診斷明確為丙型肝炎病毒(HCV)感染的患者， 并排除其他肝炎病毒和HIV病毒感染，平均年齡44 (8 80)歲。部分患者使用干擾素進 行抗病毒治療；結核病人樣本來源于武漢市醫療救治中心住院病人確診為僅結核陽性病人；乙肝病人來源于武漢大學中南醫院，明確為乙型肝炎病毒(HBV)感染的患者，并排除 其他肝炎病毒和HIV病毒感染，平均年齡44 (8 80)歲；非HCV感染者同期在武漢大學中 南醫院就醫、臨床已排除HCV，HBV, HIV感染的患者，平均年齡35(8 79)歲。一種丙型肝炎病毒包膜抗原E2的試劑盒，它包括抗丙型肝炎病毒包膜抗原E2 的多克隆抗體，酶標板(購自海門市三和新華玻璃實驗儀器廠)，生物素標記核酸適配子 觀18，辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素(購自北京博奧生物技術有限公司)及其顯色底 物TMB(購自深圳達科為生物技術有限公司)。生物素標記核酸適配子觀18的制備將觀18序列送公司合成，合成生物素標記 ZE18的5，端(命名為bio-ZE18)。并用無菌雙蒸水稀釋為400nM的濃度，_20°C保存。一種丙型肝炎病毒及其表面包膜抗原E2的試劑盒檢測丙型肝炎病毒的方法，其檢測步驟如下1.將1 200兔抗丙型肝炎病毒包膜抗原的多克隆抗血清(效價為1 12800， PBS稀釋)包被96孔ELISA板，4度過夜；2.含有5/10000吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(PBS溶液NaCl 8g，KCl 0. 2g， Na2HPO4L 44g, KH2PO4 0. 24g,加去離子水溶解，定容至1000ml,調pH至3. 4. 15磅滅菌 20min,置4°C保存)，洗滌六遍；3. 1 % (g/mL)牛血清白蛋白(BSA) (PBS溶解)封閉96孔板，100 μ 1/孔，37度封 閉1小時；4.加入待檢樣品，100 μ 1/孔，37度孵育1小時；5.含有5/10000吐溫-20的PBS，洗滌六遍；6.加入 bio-ZE18 (400nM/ 孔，PBS 稀釋)，37 度孵育 1 小時;7.含有5/10000吐溫-20的PBS，洗滌六遍；8.加入加辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素(HRP-sti^ptoavidin) (1 1000， PBS稀釋)，100 μ 1/孔，37度孵育1小時；9. 5/10000 吐溫-20 的 PBS，洗滌六遍.10.加入底物顯色劑，顯色2分鐘，用2Μ濃硫酸中止顯色。本發明中所用的底物TMB顯色劑配方包括Α底物是TMB 20mg (固體)，先用無水 乙醇IOml溶解，充分振蕩(試劑瓶要干凈，干燥)，加雙蒸水定容到IOOml，此即是A底物； B底物是取1水檸檬酸2. lg，無水Na2HP04 2. 82g，0. 75%的過氧化氫0. 6細1，雙蒸水定容 至100ml (無須調pH值，應在4. 5-5. 0范圍)，此即是B底物。使用時，A底物與B底物各取 5ml混勻。11. 1小時內在Themo scientific Multskan mk3多功能酶標儀450nM下檢測吸光 度。檢測結果是丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原E2以及丙型肝炎病毒感染陽性病人 及其丙型肝炎病毒E2抗原陽性病人的0D450值均大于設定的臨界值(cutoff值)，而正常 健康人及陰性樣品、結核陽性病人，乙肝病人的0D450值均小于臨界值(cutoff值)，cutoff 值=0.1 X陽性對照的平均0D450值+陰性對照的平均0D450值。說明本試劑盒的檢測結 果能有效的鑒別出丙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒包膜抗原、以及丙型肝炎病毒感染感染患 者與乙肝病毒感染患者、結核病人等的不同。結果見圖2。實施例3
本發明試劑盒與HCV-RNA、HCV-Ab檢測相比較對象丙型肝炎病毒；HCV感染者2007-03/2008-08在武漢大學中南醫院、武漢市 傳染病醫院等臨床診斷明確為丙型肝炎病毒(HCV)感染的患者，并排除其他肝炎病毒和 HIV病毒感染，平均年齡44 (8 80)歲。部分患者使用干擾素進行抗病毒治療。②非HCV 感染者同期在武漢大學中南醫院就醫、臨床已排除HCV感染的患者，平均年齡35 (8 79)
歲οHCV-RNA檢測FQ2PCR方法，采用Roche公司LightCycler熒光定量PCR擴增儀 及數據處理軟件。檢測試劑為中山大學達安基因股份有限公司提供的丙型肝炎病毒(HCV) Taqman探針法核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒。抗-HCV檢測采用上海科華生物技術工程有限公司提供的酶聯免疫法原理 (ELISA)抗-HCV檢測試劑盒(主要組分HCV核心抗原和非結構區抗原包被的微孔板和酶 標記特異性抗人IgG)；在意大利SEAC公司生產的Alisei全自動酶免分析系統上檢測，相 關參數按試劑說明書設置。本試劑盒檢測將抗丙型肝炎病毒包膜抗原的多克隆抗血清包被ELISA板后，洗 后，加入不同病人血清和健康正常人血請對照，經反復洗滌，未結合的病毒被洗去，結合在 板上的HCV再用生物素標記的適配子捕獲，再經反復洗滌后，加辣根過氧化物酶標記的鏈 霉親和素，最后加入底物顯色，顯色終止后，在酶標儀450nm的吸收波長上測其OD值。檢測 結果本試劑盒檢測的OD值高低與病毒含量呈正相關性；本試劑盒與HCV-RNA、HCV-Ab檢 測結果相比較呈正相關性。以上檢測結果見表一。 麥一本發明試劑盒與HCV-RNA檢測方法、HCV-Ab抗體檢測相比較
權利要求
1.一種丙型肝炎病毒及其表面抗原的試劑盒，其特征在于試劑盒包括抗丙型肝炎 病毒包膜抗原E2的多克隆抗體；酶標板；生物素標記核酸適配子觀18 ；辣根過氧化物酶標 記的鏈霉親和素及其顯色底物3’，3’，5，5’ -四甲基聯苯胺；所述的抗丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗體的制備將丙型肝炎病毒包膜抗原 E2的真核表達載體pcDNA3. 1A-E2，肌肉多點注射入家兔，每隔一周后注射一次，每次免疫 注射200g質粒DNA，注射三次，用基因電導入儀在注射部位電極導入DNA，第三次注射后2 周，再用丙型肝炎病毒包膜抗原E2重組蛋白加強免疫，免疫注射2次，每次免疫注射100 μ g 蛋白，兩周后心臟取血，IOOOrpm離心分離血清，為丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗 體，保存于-80°C ；所述的生物素標記核酸適配子觀18 將觀18序列合成，合成生物素標記觀18的5’端 為bio-ZE18，用無菌雙蒸水稀釋為400nM的濃度，_20°C保存。
2.權利要求1所述的一種丙型肝炎病毒及其丙型肝炎病毒包膜抗原E2的試劑盒檢測 丙型肝炎病毒的方法，其步驟是A、將1 200兔抗丙型肝炎病毒包膜抗原的多克隆抗血清包被酶標板，4度過夜；B、含有5/10000吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，PBS溶液=NaCl8g，KCl 0. 2g，Na2HPO4 1. 44g，KH2PO4 0. 24g,加去離子水溶解，定容至IOOOml，調pH至7. 4，15磅滅菌20min,置4°C 保存，洗滌六遍；CU% g/ml牛血清白蛋白，PBS溶解，封閉96孔板，100 μ 1/孔，37度封閉1小時；D、加入待檢樣品包括HCV病毒HCV病毒陽性血清、或對照樣品，100μ 1/孔，37度孵育 1小時；Ε、含有5/10000吐溫-20的PBS，洗滌六遍；F、加入bio-ZE18,400nM/孔，PBS稀釋，37度孵育1小時;G、含有5/10000吐溫-20的PBS，洗滌六遍；H、加入加辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素，1 1000，PBS稀釋，100μ 1/孔，37度孵 育1小時；J、含有5/10000吐溫-20的PBS，洗滌六遍；K、加入底物顯色劑，顯色2分鐘，用2Μ濃硫酸中止顯色；LU小時內在多功能酶標儀450ηΜ下檢測吸光度；所述的底物顯色劑配方包括Α底物是TMB 20mg，先用無水乙醇IOml溶解，充分振蕩， 加雙蒸水定容到IOOml ；B底物是取1水檸檬酸2. Ig,無水Na2HP042. 82g，0. 75 %的過氧化 氫0. 6細1，雙蒸水定容至100ml，使用時，A底物與B底物各取5ml混勻。
3.權利要求1所述的一種丙型肝炎病毒及其表面抗原的試劑盒，其特征在于所述的 生物素標記核酸適配子ZE18，其序列為SEQIDN0. 1所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發明公開了一種丙型肝炎病毒及其表面抗原的試劑盒及檢測方法。包括抗丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗體，酶標孔板，生物素標記單鏈DNA適配子ZE18，辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素及其顯色底物。將抗丙型肝炎病毒包膜抗原E2的多克隆抗體包被酶標孔板，加入丙型肝炎病毒或待檢血清或血液樣品以及對照樣品，經洗滌六次，結合在板上的丙型肝炎病毒或包膜抗原E2再用生物素標記的適配子ZE18捕獲，加辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素，加入底物顯色，顯色終止后，在酶標儀的吸收波長上測其OD值。本試劑盒檢測速度快，操作方便安全，省時效率高，有效地對丙型肝炎病毒進行檢測。試劑盒價格低廉，檢測靈敏度和精確度很高，應用前景廣闊。
文檔編號G01N33/543GK102081093SQ20091027304
公開日2011年6月1日 申請日期2009年11月30日 優先權日2009年11月30日
發明者章曉聯, 胡藝蘭 申請人:武漢大學