專利名稱：用于診斷膀胱腫瘤的蛋白芯片及制備方法
技術領域：
本發明涉及一種醫學檢測試劑，特別是一種以受檢者尿液為樣本，檢測受檢者是
否可能患有膀胱腫瘤的蛋白芯片，以及這種芯片的制備方法。更為確切講本發明是一種采
用免疫膠體金技術(Immune colloidal gold technique)，是以膠體金作為示蹤標志物應 用于膀胱腫瘤的免疫標記試劑。
背景技術：
腫瘤的發生是多個基因和蛋白發生改變的結果，多認為多指標腫瘤標志物聯合檢 測可以彌補單項指標檢測的不足，從而提高診斷的準確性。我國在1997年開始立項對生 物芯片技術的研究，近年來發展十分迅猛，目前已取得巨大的進展，且已在生命科學領域中 發揮作用。蛋白質芯片的出現為提高腫瘤的診斷水平提供了技術基礎，具有高通量、高靈敏 度、高特異性和微量化的優點。國內外雖已投入了大量的資金進行實驗，但目前尚無膀胱癌 診斷相關蛋白芯片產品問世。另據報道，美國FDA至今尚未通過一項用于膀胱腫瘤的蛋白 芯片產品認證許可。 膀胱癌是泌尿系統中最常見的惡性腫瘤，占所有惡性腫瘤的20%。男女發病比例 約為4 : 1，60歲以后發病率增高，近年來發病呈年輕化趨勢，淺表性膀胱癌占70%以上，且 術后復發率高，初次治療后復發率高達50% 70%。因此要求患者定期隨訪，平均每1 3月需復查一次膀胱鏡，使患者非常痛苦。據測算平均每年每個膀胱癌患者的醫療費高達 數萬元，再加上患者喪失勞動力，直接威脅著國民的健康，給經濟和社會發展造成了嚴重的 損失。膀胱癌的分期分級不同其相應的預后亦極不相同，若早期發現并及時予以治療，患者 可獲得很高的5年生存率，甚至完全得到治愈。在目前使用的診斷方法中，膀胱鏡檢查和尿 脫落細胞學檢查是膀胱癌診斷的金標準，但是膀胱鏡畢竟是一種侵入性檢查，患者較為痛 苦，接受性差。同時對膀胱頂部及膀胱前壁的腫瘤有時不易發現，且尿道狹窄患者無法行膀 胱鏡檢查；尿脫落細胞學雖為無創的診斷方法，但陽性率受多種因素的影響，其敏感性只有 18. 4% 62. 0%，其效果遠遠不能令人滿意。目前尚無針對膀胱癌簡便易行可靠的早期篩 查和診斷方法。因此，探索新的無創診斷方法，提高膀胱腫瘤的診斷水平、尤其是早期診斷 水平，顯得尤為迫切，而且具有良好的經濟效益及社會效益，并且有很好的市場前景。
發明內容
本發明提供一種受檢者尿液為樣本，檢測受檢者是否患有膀胱腫瘤的蛋白芯片。
本發明的診斷膀胱腫瘤的蛋白芯片由下述物質組成a.在固相載體上包被有 Survivin抗原蛋白、纖維粘連抗原蛋白Fibronectin，以及基質核金屬蛋白酶9即匪P9三 種腫瘤標志物的單克隆抗體；b.在封閉容器內貯藏的偶聯于膠體金上的Survivin抗體、 Fibronectin抗體及匪P9抗體。 本發明的診斷膀胱腫瘤的蛋白芯片中，在固相載體上包被以1% BSA稀釋的三種 腫瘤標志物Survivin蛋白、纖維粘連蛋白、基質核金屬蛋白酶9的單克隆抗體，三者之間按1:1: 2的比例包被，其相對量為分別為lOii g/ml、10ii g/ml、20ii g/ml。
本發明的診斷膀胱腫瘤的蛋白芯片的制備方法為
a.制備標記抗體所用的膠體金；b.用已制備好的膠體金標記Survivin抗體、Fibronectin抗體及匪P9抗原，并將 標記后的膠體金溶于膠體金保存液中，再將其置于密封容器內保存。
c.制備用于包被三種瘤標的硝酸纖維素膜固相載體； d.將三種腫瘤標志物分別包被于固相載體上。將Survivin蛋白、纖維粘連蛋白、 基質核金屬蛋白酶9的單克隆抗體以1% BSA稀釋好，室溫平衡30min后，用微陣列打點機 點樣于硝酸纖維素膜上。 腫瘤標志物是由腫瘤細胞所產生，存在于組織或體液中，反映腫瘤存在和生長的 一類物質。膀胱與外界相通，檢測尿液中的腫瘤標志，易于操作，患者容易接受，且方便進行 大規模普查。雖然近年來，一些單項腫瘤標志物指標被許多學者所重視并得到研究，已獲得 一些進展，但因其單獨應用受到假陽性率或假陰性率較高的干擾，不能滿意地解決臨床診 斷中所要求較高的敏感度和高的特異度指標，這限制了其應用。因此聯合檢測多個腫瘤標 志物來提高診斷的準確性則顯得尤為重要。 相應的實驗結果顯示尿液中Survivin蛋白診斷膀胱癌的敏感性為95X，特異性 為93% ;尿液中Fibronectin診斷浸潤性膀胱移行上皮癌的靈敏度為76. 47% 100%， 特異度為87. 22%，診斷正確率僅為86. 96% ;E。雖然NUTT實驗發現匪P-9在高分期膀胱 癌中明顯增高，主要降解IV型膠原、明膠和纖維粘連蛋白，因此匪P9對腫瘤細胞浸潤和轉 移至關重要。臨床實驗表明匪P9高表達患者的預后與低表達患者的預后有顯著的差異， 故匪P9更是判斷浸潤性膀胱移行上皮癌預后的重要指標。通過ELISA法分別檢測了以上 三種腫瘤標志物在膀胱癌患者和健康人群尿液中的含量，結果顯示聯合檢測三種腫瘤標志 物進行臨床診斷可使其檢測靈敏度顯著增高，而診斷的符合率可上升20%。這些結果為將 Survivin、 Fibronectin、和MMP-9聯合應用研發診斷性蛋白芯片診斷膀胱癌提供了科學依 據。而且實驗還表明將前述的三種腫瘤標志物聯合檢測，其診斷準確性明顯高于單獨一種 標志物的檢測組合。
具體實施例方式以下提供
具體實施例方式
本發明的診斷性蛋白芯片的檢測原理為雙抗夾心法。具體操作過程為
1、制備膠體金。①用50ml量筒量取35ml的1X檸檬酸三鈉預熱至6(TC ;②用 1000ml量筒量取975ml去離子水，加入圓底燒瓶中；③用25ml量筒量取25ml的1%氯金 酸加入盛水的圓底燒瓶中并搖勻，加入時注意勿沾內壁；④將燒瓶在電熱套中加熱，直到 沸騰并持續lmin ;⑤在搖晃燒瓶時將預熱的檸檬酸三鈉迅速加入燒瓶，加入時注意勿沾內 壁；⑥加快搖晃的速度，使氯金酸與檸檬酸三鈉充分反應，液體金黃色變為黑色，再變為酒 紅色，持續加熱10min ;⑦10min后關閉電源，將燒瓶取出蓋上玻璃皿降溫；⑧直到溫度降至 室溫，測其0D值；⑨測的最大波長必須在526士2nm。 2、包被抗體。硝酸纖維素膜上分區包被Survivin、Fibronectin、和匪P-9(用1% BSA稀釋)的單克隆抗體，其抗體相對量分別為10ii g/ml、10ii g/ml、20ii g/ml。
3、制作金標抗體。①將制備的裸金分裝，200ml/瓶，放入冰水浴；②調ffl值，每瓶 加入0. 1M K2C03約8ml，搖勻；③配制lmg/ml的抗體每瓶加1. 2ml，滴加二抗每次加0. 6ml， 邊加邊搖，搖動時不要起泡，滴加速度約為5 10滴/分鐘，滴加完后放置30min ; 加入 已配好并過濾的10X的BSA 20ml/瓶，1滴/秒，邊加邊搖，放置5min ;⑤加入1X的PEG， 40ml/瓶，1滴/秒，邊加邊搖，放置5min，過夜。 4、點樣。將受檢者的尿液點樣，待完全滲入后；加1滴PBST洗滌液，使之與包被在 硝酸纖維素膜上的Survivin、 Fibronectin、和匪P-9單抗特異結合，形成抗原抗_體復合 物。 5、滴加金標抗體。加入數滴經膠體金標記過的Survivin、 Fibronectin、和匪P-9
單克隆抗體，待滲完90秒后，加1滴PBST洗滌液，與以上抗原抗-體復合物特異結合，完成
對標本中抗原_抗體復合物的金染色。 6、芯片閱讀儀掃描反應后的芯片，記錄灰度值。 檢測實例 分別取正常人尿樣和已經證實患有膀胱癌病人的尿樣各五份，分為對照組和實驗 組。嚴格按照上述步驟操作，進行對比和驗證本蛋白芯片的檢測結果。結果發現，在蛋白芯 片上，以正常人尿液為樣品檢測的反應點，即對照點的色度沒有變化；而以膀胱癌患者尿液 為樣品檢測的反應點，其色度明顯濃于對照點，參見表1 。
表1不同尿樣濃度的灰度值比較
對照組實驗組試樣編號檢測灰度值試樣編號檢測灰度值
17.30611.080
26.51321.051
36.49231.040
46.53341.018
57.72351.011 實驗還發現，各個反應點之間的色度也因尿液中三種蛋白的含量高低不同而深淺 不同，且檢測樣品的灰度值隨著被檢樣品三種蛋白濃度的增加而呈現良好的遞增關系，表 現出樣品濃度對其相應芯片閱讀儀掃描值的相關型曲線，說明芯片閱讀儀掃描結果值隨著 不同濃度樣品的增加而增加，且有著良好的相關性。而且實驗還表明將前述的三種腫瘤標 志物聯合檢測，其診斷準確性明顯高于單獨一種標志物的檢測組合。
權利要求
診斷膀胱腫瘤的蛋白芯片，其特征是該芯片至少由下述物質組成a.在固相載體上包被有Survivin抗原蛋白、纖維粘連抗原蛋白Fibronectin，以及基質核金屬蛋白酶9即MMP9三種腫瘤標志物的單克隆抗體；b.在封閉容器內貯藏的偶聯于膠體金上的Survivin抗體、Fibronectin抗體及MMP9抗體。
2. 權利要求1所述的診斷膀胱腫瘤的蛋白芯片，其特征是固相載體上包被以1% BSA 稀釋的三種腫瘤標志物Survivin蛋白、纖維粘連蛋白、基質核金屬蛋白酶9的單克隆抗體 的相對量為分別為1:1:2。
3. 權利要求1或2所述的診斷膀胱腫瘤的蛋白芯片的制備方法，其特征是a. 制備標記抗體所用的膠體金；b. 用已制備好的膠體金標記Survivin抗體、Fibronectin抗體及匪P9抗原，并將標記 后的膠體金溶于膠體金保存液中，再將其置于密封容器內保存。c. 制備用于包被三種瘤標的硝酸纖維素膜固相載體；d. 將三種腫瘤標志物包被于固相載體上。將Survivin蛋白、纖維粘連蛋白、基質核金 屬蛋白酶9的單克隆抗體以1% BSA稀釋好，室溫平衡30min后，用微陣列打點機點樣于硝酸纖維素膜上。
全文摘要
本發明公開一種以受檢者尿液為樣本，檢測受檢者是否可能患有膀胱腫瘤的蛋白芯片，以及這種芯片的制備方法。本發明的芯片至少由下述物質組成a.在固相載體上包被有Survivin抗原蛋白、纖維粘連抗原蛋白Fibronectin，以及基質核金屬蛋白酶9即MMP9三種腫瘤標志物的單克隆抗體；b.在封閉容器內貯藏的偶聯于膠體金上的Survivin抗體、Fibronectin抗體及MMP9抗體。
文檔編號G01N33/68GK101718792SQ20091026055
公開日2010年6月2日 申請日期2009年12月10日 優先權日2009年12月10日
發明者王志平 申請人:蘭州大學