專利名稱：一種用于小麥白粉病流行監測的微量病菌Real-time PCR定量檢測方法
技術領域：
本發明涉及植物病害流行監測領域，特別是涉及一種小麥白粉病的監測方法。
背景技術：
由布氏白粉菌(Blumeria graminis f. sp. tritici)引起的小麥白粉病在世界各麥區均有發生。目前此病害已成為我國小麥生產上的重要病害之一，病害流行的預測預報和風險估計是綜合防治的重要部分。盡早、準確地估計病害發生趨勢是有效預測預報的關鍵。雖然我國小麥白粉病發生規律因地區和氣候條件而異，但對越冬麥苗和越夏自生麥苗的潛育侵染程度做及時、準確的監測成為不同地區病害預測預報和風險估計中普遍存在的關鍵環節。而這方面的進展受到傳統、落后方法的制約，如葉片或幼苗取樣培養方法耽工、 費時、靈敏性差。快速發展的分子生物學技術為準確檢測潛育侵染階段的病害提供了有效的工具。分子生物學技術已經廣泛用于病害診斷和檢測，但用于病害流行監測的報道不多。常規PCR技術是最基礎的一種分子檢測技術，但是它只能檢測到一定量以上的病原菌 DNA，對于含量較低的情況，很難檢測到病原菌的存在即檢測的敏感性不好；同時它只能檢測到病菌的有無，無法定量檢測一定單位寄主小麥中病原菌的侵染數量，就不能為植保工作人員提供病害真實的發生程度，從而影響對病害準確的預測預警。
發明內容
本發明根據上述領域的缺陷，提供一種用于小麥白粉病流行監測的微量病菌 Real-timePCR定量檢測方法，具有精確、快速、簡便的優點。一種用于小麥白粉病流行監測的微量病菌Real-time PCR定量檢測方法，步驟如下(1)在目標監測地區的麥田內隨機采取分蘗期GS22的小麥葉片，并提取DNA為模板，以如下白粉菌特異引物5，-AAGCTATGCGGAACTTCGTTT-3，；5，-TAAGGAGTTTTGGCAAGTCCC-3，進行 Real-time PCR 檢測，根據標準曲線 Y1 =-3. 034X1+11. 485，r2 = 0. 994，其中 Y1 為 Real-time PCR 反應的 Ct 值，X1 為白粉菌 DNA 的起始濃度對數值，計算得到白粉菌DNA濃度；(2)以第(1)步中提取的DNA為模板，以如下小麥特異引物 5' -CAACCACTCTCAACGGGAA-3, 5‘ -TCAAAGGTCATAATGCCAGC-3‘進行 Real-time PCR檢測， 記錄根據標準曲線 Y2 = -3. 163X2+6. 252，r2 = 0. 998，其中 Y2 為 Real-time PCR 反應的 Ct 值，X2為小麥DNA的起始濃度對數值，計算得到小麥DNA濃度；(3)若在彡0. 000023時，說明在所述目標監測地區的麥田內將會發生白粉病流行感染，比值越高，病情指數越高，說明白粉菌流行程度越高。步驟(1)中所述對小麥白粉菌Real-time PCR反應的體系為SYBR Prermix ExCN 102229975 A
說明書
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Taq 12. 5μ 1、5μΜ 的正、反引物各 1μ 1、模板 DNA lyl、ddH20 9. 5 μ 1, Real-time PCR 反應程序為95°C預變性30sec ；95°C變性5sec，59°C退火20sec, 72°C延伸20sec，45個循環， 在每個循環的延伸階段收集熒光。步驟O)中所述對小麥Real-time PCR反應的體系為SYBR Prermix Ex Taq 12. 5μ 1、5μΜ 的正反引物各 1μ 1、模板 DNA 2 μ UddH2O 8. 5 μ 1，Real-time PCR 反應程序為95°C預變性30sec ；95°C變性kec，65°C退火延伸30sec，40個循環，在每個循環的退火延伸階段收集熒光。本發明提供一種用于小麥白粉病流行監測的微量病菌Real-time PCR定量檢測方法，通過一對白粉菌特異性引物，一對小麥特異性引物，采用Real-time PCR方法，分別擴增待測小麥葉片提取的DNA，定量檢測小麥白粉菌的DNA濃度和小麥葉片的DNA濃度，通過二者比值估計待測小麥所在的地區的小麥白粉病流行程度。本發明通過實驗室的研究發現， 苗期潛伏侵染白粉菌DNA濃度與小麥DNA濃度比值與小麥白粉病發生的病情指數之間存在顯著相關性；田間調查取樣實驗進一步證明該相關性。本領域技術人員知道，病情指數代表病害的流行程度，植保人員可根據該比值作出病害流行的預測預警，并采取進一步的預防和防治措施特別是對于潛伏期的小麥，由于外觀上沒有任何癥狀，但是一旦出現癥狀，傳染流行速度非常迅速，因此對未表現癥狀的監測田，本發明的定量檢測方法尤其有意義，本發明根據田間實驗數據發現，白粉菌DNA與小麥DNA的比值大于等于0. 000023時，測定比值之后一定天數內，能夠測到大于0病情指數，因此本發明將0. 000023定為病害發生的閾值， 若檢測到的比值更大，說明白粉菌流行程度會更嚴重，需采取有效的預防和防治措施。本發明的方法之所以能夠對未表現癥狀的麥田區進行預測預警，與real-time PCR方法能夠提高檢測的靈敏性有關，real-time PCR方法能夠提高檢測的靈敏性，這能夠降低檢測潛伏期白粉菌的假陰性，另外PCR方法中兩對引物的特異性對于預測預警的準確性也起著關鍵的作用，從圖4、圖5可以看出，小麥特異性引物能夠將小麥與小麥病原微生物及大麥、燕麥、 黑麥分開，使PCR擴增檢測到的DNA僅僅包括小麥的DNA，從而保證比值中的分母不大于實際值，進而保證測得的比值的準確性，因此降低了檢測的假陰性可能。總而言之，與現有方法相比，本發明具有以下的技術優勢1.檢測準確性高。本發明應用的小麥白粉菌特異性引物是已報道的根據ITS序列設計的引物，能夠將其與其它小麥病害區分開來。同時本方法根據小麥ITS序列設計的小麥特異引物具有特異性，能將其與小麥病害及大麥、燕麥、黑麥區分開。2.靈敏度高。本發明利用Real-time PCR方法，可定量檢測小麥白粉菌DNA的最低濃度為1X10—V g/μ 1，大大提高了檢測的靈敏度，對處于潛伏期的病原菌也能檢測到。3.檢測快速。Real-time PCR方法不需常規PCR反應后處理，簡便迅速。4.定量準確。Real-time PCR方法可以對初始模板量準確定量，同時采用小麥白粉菌DNA/小麥DNA的比值，可以校正DNA提取的差異和PCR擴增效率的不同，降低系統誤差，因此本發明可滿足不同試驗者在不同儀器上進行試驗，定量結果更準確。因此本方法實用性強，可滿足植物病害檢測和監測的需要。
圖1 小麥白粉菌引物Bgt-F/Bgt-R Real-time PCR標準曲線制作擴增曲線圖
圖2 小麥白粉菌引物Bgt-F/Bgt-R Real-time PCR標準曲線制作熔解曲線3 小麥白粉菌引物Bgt-F/Bgt-R Real-time PCR標準曲線制作標準曲線4 小麥引物Wheat-Fl/Wheat-Rl引物特異性檢測結果(1)其中M:D2000Marker，1 :ddH20，2 6 小麥Chancellor、京雙 16、銘賢 169、京411、 保豐104，7 10小麥白粉菌菌株E01、E10、E42、E45，11 12 桿銹菌株34C2、21C3CTH，13 15 葉銹菌株 PHT08-5-18、THT08-23-2、THP4-932201，16 19 條銹菌株 CY29.CY30XY3U CY33，20 :CM,21 :WK,22 :GF，23 24 葉枯 YB1、YB2。圖5 小麥引物Wheat-Fl/Wheat-Rl引物特異性檢測結果O)其中M :D2000Marker, 1 4 小麥阿夫、螞蚱麥、鄭9023、摩洛哥，5 8 大麥浙秀 12、縣無芒六棱、倍取 10 號、義烏二棱；9 13 黑麥 Z1649、Z1650、Z1651、Z1652、Z1653 ； 14 18 燕麥 ZIF00025、ZIF00026、ZIF00027、ZIF00029、ZIF00030。圖6 小麥引物Wheat-Fl/Wheat-Rl引物靈敏性檢測結果其中M :D2000Marker, 1 :ddH20，2 :1Χ1θΛ^/μ 1,3 :lXl(T5mg/y 1,4 JXlO—mg/ μ 1,5 :lXl(T7mg/y 1,6 :lXl(T8mg/y 1。圖7 小麥Wheat-Fl/Wheat-RlReal-time PCR標準曲線制作擴增曲線8 小麥Wheat-Fl/Wheat-RlReal-time PCR標準曲線制作熔解曲線9 小麥WheT-Fl/Wheat-RlReal-time PCR標準曲線制作標準曲線10 接種后第一天小麥白粉菌Real-time PCR檢測擴增曲線11 接種后第一天小麥白粉菌Real-time PCR檢測熔解曲線12 室內接種試驗第1天比值與病情指數之間的關系橫坐標表示小麥白粉菌DNA/小麥DNA ( μ g/mg)比值，縱坐標表示病情指數。圖13 室內接種試驗第2天比值與病情指數之間的關系橫坐標表示小麥白粉菌DNA/小麥DNA ( μ g/mg)比值，縱坐標表示病情指數。圖14 室內接種試驗第3天比值與病情指數之間的關系橫坐標表示小麥白粉菌DNA/小麥DNA ( μ g/mg)比值，縱坐標表示病情指數。圖15 室內接種試驗第4天比值與病情指數之間的關系橫坐標表示小麥白粉菌DNA/小麥DNA ( μ g/mg)比值，縱坐標表示病情指數。圖16 田間試驗病情指數與比值之間的直線方程，采樣后7天橫坐標表示小麥白粉菌DNA/小麥DNA ( μ g/mg)比值，縱坐標表示病情指數。圖17 田間試驗病情指數與比值之間的直線方程，采樣后12天橫坐標表示小麥白粉菌DNA/小麥DNA ( μ g/mg)比值，縱坐標表示病情指數。圖18 田間試驗病情指數與比值之間的直線方程，采樣后17天橫坐標表示小麥白粉菌DNA/小麥DNA ( μ g/mg)比值，縱坐標表示病情指數。
具體實施例方式實施例1 小麥白粉菌Real-time PCR擴增及標準曲線的制作1.用于檢測小麥白粉菌的特異性引物。Bgt-F :5’ -AAGCTATGCGGAACTTCGTTT-3’Bgt-R :5，-TAAGGAGTTTTGGCAAGTCCC-3，
2. Real-time PCR擴增小麥白粉菌的反應體系Real-time PCR擴增小麥白粉菌的25 μ 1反應體系包括dYBR Prermix Ex Taq (TaKaRa) 12. 5 μ 1、正反引物(5 μ Μ)各 1 μ 1、模板 DNA 1 μ 1、ddH20 9· 5 μ 1。3. Real-time PCR擴增小麥白粉菌的反應程序PCR 反應程序95°C 預變性 30sec ；95°C 變性 5sec，59°C 退火 20sec，72°C 延伸 20sec，45個循環，在每個循環的延伸階段(72°C )同步多次收集熒光。熔解曲線生成程序95 °C，20sec, 59 V，20sec,從55 °C 95 °C每升高0. 5 V保持 IOsec讀取熒光一次，獲取熔解曲線。4.制作標準曲線所需小麥白粉菌DNA模板的制備接種白粉菌于小麥幼苗，當葉片上出現褪綠斑后，將葉片剪成葉段放在培養基 (瓊脂粉5g，0. 苯駢咪唑溶液60ml，蒸餾水1000ml)上，待分生孢子生長旺盛時收集孢子粉，提取病原菌DNA。利用微量光吸收檢測儀Nano Drop (ND-1000)測定DNA的濃度和純度，并將DNAlO倍梯度稀釋，使濃度為1 X 10_2 μ g/ μ 1-1 X 10_8 μ g/ μ 1。5.標準曲線的制作將10倍梯度稀釋的模板DNA每個濃度3次重復進行標準曲線的制作。實施結果建立并優化STOR Green I熒光染料法Real-time PCR反應體系，獲得了小麥白粉菌定量檢測的標準曲線y = -3. 034X+11. 485 (r2 = 0. 994)，其中y表示Real-time PCR反應的Ct值，χ表示DNA濃度的對數值。并且Real-time PCR能檢測到的小麥白粉菌DNA的最低濃度為lX10_Vg/yl(見附圖1、2、3)。實施例2 小麥Real-time PCR擴增及標準曲線的制作1.用于檢測小麥的特異性引物Wheat-Fl 5' -CAACCACTCTCAACGGGAA-3‘Wheat-Rl 5' -TCAAAGGTCATAATGCCAGC-3‘2.小麥引物特異性及靈敏性檢測1)反應體系25 μ 1 反應體系包括10 X iTaq Buffer (含 Mg2+) 2. 5 μ 1、IOmM dNTP Mixture 0. 5μ 1、正反引物(5μΜ)各 1μ 1、模板 DNA 2 μ l、Taq 酶 2. 5U/μ 1 0. 5 μ l、ddH2017. 5μ 1。2)反應程序94°C預變性:3min ；94°C變性 lmin，59°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，30 個循環；最后72°C延伸IOmin3)特異性檢測利用小麥白粉菌、小麥條銹菌、小麥葉銹菌、小麥桿銹菌、小麥赤霉菌、小麥紋枯菌、小麥根腐菌、小麥葉枯菌及大麥、燕麥、黑麥DNA檢測引物的特異性。4)靈敏性檢測將提取的小麥DNA使用微量光吸收檢測儀Nano Drop (ND-1000)測定DNA的濃度和純度，10倍梯度稀釋，檢測引物的靈敏性。5)檢測結果的分析取10 μ 1 PCR產物用1. 5 % (重量/體積)瓊脂糖凝膠電泳分離，經溴化乙錠染色、凝膠成像后根據擴增產物的大小判定結果。3. Real-time PCR擴增小麥的反應體系Real-time PCR 擴 ±曾小麥的 25 μ 1 反應體系包括SYBR Prermix Ex Taq (TaKaRa) 12. 5 μ 1、正反引物(5 μ Μ)各 1 μ 1、模板 DNA2y l、ddH20 8· 5μ 1。4. Real-time PCR擴增小麥的反應程序PCR反應程序95°C預變性30sec ；95°C變性5sec，65°C退火延伸30sec，40個循環，在每個循環的退火延伸階段(65°C)同步多次收集熒光。 熔解曲線生成程序95 °C，20sec，65 V，IOsec,從55 °C 97 °C每升高0. 5 V保持 IOsec讀取熒光一次，獲取熔解曲線5.標準曲線的制作將提取的小麥DNA使用微量光吸收檢測儀Nano Drop (ND-1000)測定DNA的濃度和純度，10倍梯度稀釋，使濃度為IX 10_4mg/μ l_lX10_8mg/y 1，每個濃度重復3次，制作標準曲線。實施結果通過特異性檢測，除小麥模板DNA能得到171bp的擴增產物外，其余模板均不能得到擴增產物，說明引物能將小麥同小麥病害及大麥、燕麥、黑麥區分開來(見附圖4、
5)。在常規PCR檢測下，該引物能檢測到的小麥DNA最低濃度為1X 10_6mg/ μ 1 (見附圖
6)。同時建立并優化STORGreen I熒光染料法Real-time PCR反應體系，得到標準曲線y =-3. 163x+6. 252 (r2 = 0. 998)，其中 y 表示 Real-time PCR 反應的 Ct 值，χ 表示 DNA 濃度的對數值(見附圖7、8、9)。實施例3 應用Real-time PCR定量檢測室內潛伏侵染小麥白粉菌1.取樣不同濃度接種，以接種后第1天 第4天每天取樣，將采集的葉片提取DNA作為 PCR模板。采樣后剩余的葉片繼續培養，調查嚴重度和發病率，計算病情指數。表1.室內試驗病情指數及小麥白粉菌DNA/小麥DNA ( μ g/mg)比值
接種密度病情第1天取第2天取第3天取第4天取(孢子/cm2)指數樣比值樣比值樣比值樣比值119900.2970.2380.2600.6921.736213880.2250.0280.0710.0391.21436620.1180.1010.0570.3900.87144200.0520.0180.0110.1080.13552130.0240.0150.0040.1880.055對照0000002.引物小麥白粉菌引物Bgt-F/Bgt-R及小麥引物Wheat_Fl/Wheat-Rl分別為
Bgt-F :5’ -AAGCTATGCGGAACTTCGTTT-3’Bgt-R :5，-TAAGGAGTTTTGGCAAGTCCC-3，Wheat-Fl 5' -CAACCACTCTCAACGGGAA-3‘Wheat-Rl 5' -TCAAAGGTCATAATGCCAGC-3‘3. Real-time PCR 反應體系1)小麥白粉菌Real-time PCR反應體系Real-time PCR擴增小麥白粉菌的25 μ 1反應體系包括SYBR Prermix Ex Taq (TaKaRa) 12. 5 μ 1、正反引物(5 μ Μ)各 1 μ 1、模板 DNA 1 μ 1、ddH20 9· 5 μ 1。2)小麥 Real-time PCR 反應體系Real-time PCR 擴增小麥的 25 μ 1 反應體系包括SYBR Prermix Ex Taq (TaKaRa) 12. 5 μ 1、正反引物(5 μ Μ)各 1 μ 1、模板 DNA2y l、ddH20 8· 5μ 1。4. Real-time PCR 反應程序1)小麥白粉菌Real-time PCR程序PCR 反應程序95°C 預變性 30sec ；95°C 變性 5sec，59°C 退火 20sec，72°C 延伸 20sec，45個循環，在每個循環的延伸階段(72°C )同步多次收集熒光。熔解曲線生成程序95 °C，20sec, 59 V，20sec,從55 °C 95 °C每升高0. 5 V保持 IOsec讀取熒光一次，獲取熔解曲線。2)小麥 Real-time PCR 程序PCR反應程序:95°C預變性30sec ；95°C變性5sec，65°C退火延伸30sec，40個循環，在每個循環的退火延伸階段(65°C)同步多次收集熒光。熔解曲線生成程序95°〇，2086(3，651，1086(3，從551 971每升高0. 5°C保持 IOsec讀取熒光一次，獲取熔解曲線。5.小麥白粉菌DNA/小麥DNA的比值與病情指數的相關性通過小麥白粉菌的Real-time PCR的標準曲線計算出未知樣品的白粉菌濃度，小麥的Real-time PCR的標準曲線計算出未知樣品的小麥的濃度，將其比值與病情指數做相關性分析。實施結果根據小麥白粉菌的Real-time PCR反應體系和反應程序，以接種不同天后葉片 DNA為模板，結果接種1天后，就能檢測到葉片中潛伏的小麥白粉菌，大大提高了檢測的靈敏度(見附圖10、11)。通過室內接種不同密度，以接種不同天后的葉片DNA為模板，根據小麥白粉菌和小麥的Real-time PCR反應體系和反應程序分別進行擴增，結果表明小麥白粉菌DNA/小麥 DNA的比值與葉片培養后的病情指數之間有極顯著相關性(見附圖12、13、14、15)，此結果表明，本發明的檢測方法可以定量監測小麥白粉病的發生程度，對小麥白粉病的早期、快速和準確的預測預報提供有效的數據。實施例4 應用Real-time PCR定量檢測田間潛伏侵染小麥白粉菌2008年在北京市房山區張坊鎮、河北省易縣西陵鎮西大地和橋頭鄉采樣，采樣日期2008年3月27日，采樣時的苗期為分蘗期(GS 22)，每點采集3個重復，每個重復采集30 葉片，提取DNA，根據實施例3的步驟進行PCR擴增，計算菌DNA/小麥DNA比值，第7天、第12天、第17天調查病情指數，如表2所示，結果表明小麥白粉菌DNA/小麥DNA的比值與葉片培養后的病情指數之間有極顯著相關性，白粉菌DNA/小麥DNA的比值達到0. 000023時， 說明在所述目標監測地區的麥田內將會發生白粉病流行感染，比值越高，病情指數越高，說明白粉菌流行程度越高。表2田間試驗病情指數及小麥白粉菌DNA/小麥DNA ( μ g/mg)比值
權利要求
1.一種用于小麥白粉病流行監測的微量病菌Real-time PCR定量檢測方法，步驟如下(1)在目標監測地區的麥田內隨機采取分蘗期GS22的小麥葉片，并提取DNA為模板，以如下白粉菌特異引物 5，-AAGCTATGCGGAACTTCGTTT-3，；5，-TAAGGAGTTTTGGCAAGTCCC-3，進行 Real-time PCR 檢測，根據標準曲線 Y1 =-3. 034X1+11. 485，r2 = 0. 994，其中 Y1 為 Real-time PCR 反應的 Ct 值，X1 為白粉菌 DNA 的起始濃度對數值，計算得到白粉菌DNA濃度；(2)以第(1)步中提取的DNA為模板，以如下小麥特異引物 5' -CAACCACTCTCAACGGGAA-3, 5‘ -TCAAAGGTCATAATGCCAGC-3‘進行 Real-time PCR檢測， 根據標準曲線 Y2 = -3. 163X2+6. 252，r2 = 0. 998，其中 Y2 為 Real-time PCR 反應的 Ct 值， X2為小麥DNA的起始濃度對數值，計算得到小麥DNA濃度；(3)當\J\^ 0. 000023時，說明在所述目標監測地區的麥田內將會發生白粉病流行感染。
2.根據權利要求1所述的用于小麥白粉病流行監測的微量病菌Real-timePCR定量檢測方法，步驟(1)中所述對小麥白粉菌Real-time PCR反應的體系為STORR I^rermix Ex Taq 12. 5μ 1、5μΜ 的正、反引物各 1μ 1、模板 DNA lyl、ddH20 9. 5 μ 1, Real-time PCR 反應程序為95°C預變性30sec ；95°C變性5sec，59°C退火20sec, 72°C延伸20sec，45個循環， 在每個循環的延伸階段收集熒光。
3.根據權利要求1所述的用于小麥白粉病流行監測的微量病菌Real-timePCR定量檢測技術，步驟O)中所述對小麥Real-time PCR反應的體系為R I^rermix Ex Taq 12. 5μ 1、5μΜ 的正反引物各 1μ 1、模板 DNA 2 μ UddH2O 8. 5 μ 1，Real-time PCR 反應程序為95°C預變性30sec ；95°C變性kec，65°C退火延伸30sec，40個循環，在每個循環的退火延伸階段收集熒光。
全文摘要
本發明一種用于小麥白粉病流行監測的微量病菌Real-time PCR定量檢測方法屬于植物病害流行監測領域，通過一對白粉菌特異性引物和一對小麥特異性引物，采用Real-timePCR檢測方法，分別擴增待測小麥葉片提取的DNA，定量檢測小麥白粉菌的DNA濃度和小麥葉片的DNA濃度，通過二者比值評估待測小麥所在的地區的小麥白粉病流行程度。
文檔編號G01N21/64GK102229975SQ20091024434
公開日2011年11月2日 申請日期2009年12月29日 優先權日2009年12月29日
發明者周益林, 曹學仁, 段霞瑜, 鄭亞明, 駱勇 申請人:中國農業科學院植物保護研究所