專利名稱：：Abo血型定型檢測試劑卡的制備方法
技術領域：
：本發明涉及一種血型定型卡及其應用。更具體的說，本發明涉及一種ABO血型定型檢測試劑卡的組成、制備方法及其應用，涉及輸血醫學領域。(二)
背景技術：
：自1900年發現ABO血型以來，1907年由Hoktoen(美國科學家海克頓)首先提出了血型鑒定在輸血治療中的重要性。1908年其他學者又提出了交叉配合實驗的概念，強調了血型鑒定的重要性。輸血是臨床搶救病人生命的重要醫療手段之一，正確鑒定血型是安全輸血的首要步驟，ABO血型不相容在臨床輸血中會導致嚴重的即發性溶血性輸血反應，危及患者生命。因此，ABO血型的準確定型至關重要，是安全輸血的基礎和保障。衛生部在2000年發文要求，規定每位供血及受血的個體均要進行ABO、Rh血型定型鑒定〔衛生部衛醫發(2000)184號文件〕。在國外，已經有部分廠家生產用于ABO血型定型的試劑卡，但其采用的凝膠為葡聚糖凝膠，此凝膠的顆粒大小為70納米以上，顆粒較大，凝膠之間的縫隙較大，從而使得進行AB0血型定型的靈敏度降低。此外，已有的卡僅進行AB0正定型，不進行AB0反定型，降低了AB0血型定型的準確性，容易導致AB0血型定型的錯誤。國內目前尚無廠商生產AB0血型定型檢測試劑卡產品。(三)
發明內容本發明的目的在于克服上述不足，提供一種靈敏度高、特異性好、質量穩定、能同時進行正反定型的AB0血型定型檢測試劑卡的制備方法。本發明的目的是這樣實現的一種ABO血型定型檢測試劑卡的制備方法，所述試劑卡上具有6個微柱凝膠管，所述6個微柱凝膠管分別是一管含有IgM性質的單克隆抗A抗體的凝膠管、一管含有IgM性質的單克隆抗B抗體的凝膠管、三管用于反定型的含有凝膠懸浮介質的凝膠管和一管用于陰性對照的含有凝膠懸浮介質的凝膠管，所述方法包括以下工藝過程步驟一、凝膠懸浮介質的配制所述凝膠懸浮介質配方如下對羥基苯甲酸甲酯(5.5-6.5)X10—4g/ml對羥基苯甲酸丙酯(1.0-1.5)X10—4g/ml步驟二、凝膠的制備選用聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠，顆粒大小為30-60納米。用步驟一配制的凝膠懸浮介質浸泡后再用該凝膠懸浮介質洗滌3-5次，除去凝膠破損碎片以及聚集的凝膠顆粒，收集得到顆粒大小均勻的、且完整呈球形的適用的凝膠；步驟三、抗體的選擇選擇IgM性質的單克隆抗A抗體，效價>128選擇IgM性質的單克隆抗B抗體，效價>128;步驟四、凝膠的配制將步驟二制備的凝膠與步驟三選擇的各抗體均按照體積比2:16:l的比例混合，分別配制成含有IgM性質的單克隆抗A抗體的凝膠和含有IgM性質的單克隆抗B抗體的凝膠；將步驟二制備的凝膠與步驟一配制的凝膠懸浮介質按照體積比2:16:1的比例混合，配制成含有凝膠懸浮介質的凝膠；步驟五、分裝按照每管22-28微升的量，將步驟四配制的各凝膠分別加入到一空白卡片的六個微柱管中，形成具有6個微柱凝膠管的AB0血型定型檢測試劑卡。本發明的有益效果是本發明的第一個方面，提出了一種標準化的凝膠懸浮介質體系，用于凝膠的洗滌和懸浮，并可以長時間維持抗體以及凝膠的穩定，其特點在于1、設計了具有很強緩沖能力的緩沖體系，采用磷酸鉀鹽、鈉鹽以及氨基酸組成的緩沖體系，使體系的PH值維持在6.6-6.8。與輸血領域通常采用的單一的枸櫞酸緩沖體系相比，具有緩沖能力更強的特點，有利于保持整個體系處于要求的緩沖范圍，同時保證了整個凝膠懸浮介質的離子強度。2、具有更加有效的低鹽濃度體系，從其組成可以看出，本發明的凝膠懸浮介質采用氨基酸和氯化鈉作為添加劑，輔助以微量的磷酸鹽來維持低離子強度環境，保持凝膠顆粒呈圓球顆粒并充分溶脹，并維持凝膠顆粒的直徑大小在所要求的范圍內(30-60納米)。3、本發明具有獨特的潤滑體系，采用一定濃度的牛蛋白、對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯，使得紅細胞通過凝膠間隙時獲得合適的潤滑能力，使無凝集的紅細胞具有完全通過凝膠顆粒間隙的能力，而凝集的紅細胞則不能通過。4、本發明具有優越的防腐體系，選擇有機物苯甲酸酯類作為防腐劑，采用對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯協同作用(各種對羥基苯甲酸單酯中的側面碳鏈長短的不同，因而其在穿透細胞膜的能力不同，并且其抑菌的作用位點也就不同，所以各種單酯針對不同種類微生物的抑制能力就不同。幾種酯的復合，具有更好的防腐能力。國內外大量的實際應用也證實了復合的對羥基苯甲酸酯比單一的對羥基苯甲酸酯的抑菌效果好)，有效防止細菌的繁衍，獲得較長時間的保存期，同時不僅避免使用疊氮鈉化學防腐劑對凝膠懸浮介質體系的離子強度提升從而對AB0血型定型檢測試劑卡的靈敏度和特異性產生的不良影響，也避免使用抗生素類在保存過程中所代謝產生的中間體對AB0血型定型檢測試劑卡的特異性產生的不良影響。本發明的另一方面，為了保證本發明ABO血型定型檢測試劑卡的質量，在制備過程中還需要對凝膠進行篩選，即，首先要選擇適當的凝膠，一般應該滿足的條件是選擇顆粒直徑為30-60納米，經過丙烯酰化后的葡聚糖凝膠。對篩選獲得的凝膠原料需要進行溶脹、洗滌、懸浮，目的是讓凝膠顆粒充分溶脹，洗滌去除破損的凝膠顆粒、聚集的凝膠顆粒、內徑在30-60納米以外的超大或超小凝膠顆粒以及凝膠以外的其它雜質成分。洗滌完成后用凝膠懸浮介質來懸浮凝膠。本發明的再一方面，為了保證本發明ABO血型定型檢測試劑卡的質量，在制備過程中還需要對與凝膠混合的抗體原料進行篩選。綜上所述，本發明的ABO血型定型檢測試劑卡之所以可以具有優良的特異性、靈敏度以及長達1年的保存期，是在于整個體系各種成分的協同作用，各種凝膠的排列于一張卡上可以保證僅使用一張卡就能完成ABO血型正反定型，緩沖體系可以維持分型卡反應體系需要的PH;低鹽濃度體系可以保證凝膠顆粒得到充分溶脹且凝膠顆粒直徑在所需要的范圍內。潤滑體系可以保證凝膠顆粒之間適當的潤滑能力。酯類防腐劑可以防止凝膠或抗體因為細菌繁殖而失效。丙烯酰化的凝膠可以保證凝膠顆粒之間的合適的間隙。標準化的抗體可以保障抗原的有效檢出。用此ABO血型定型檢測試劑卡進行ABO血型定型，產生的陽性反應均不低于3+。一般在18-25t:條件下保存有效期不低于12個月。總之，本發明的實施提供了標準化的ABO血型定型檢測試劑卡產品，各醫院和采供血機構可以直接從生產供應商處得到標準一致的ABO血型定型檢測試劑卡，為準確進行ABO血型正反定型、保證安全輸血創造條件。具體實施例方式以下通過具體實施例詳細說明本發明的實施和所具有的有益效果，旨在幫助閱讀者更好的理解本發明的精神和實質，并不能對本發明的實施范圍構成任何限定。實施例1:步驟一、凝膠懸浮介質的配制所述凝膠懸浮介質配方如下對羥基苯甲酸甲酯(5.5-6.5)X10—Vml對羥基苯甲酸丙酯(1.0-1.5)X10—Vml甘氨酸(1.6-1.9)X10—Vml氯化鈉(1.7-1.8)X10—Vml磷酸二氫鉀(2.1-2.4)X10—Vml磷酸氫二鈉(4.6—4.8)X10—4g/ml牛血清白蛋白《4%，以上試劑用蒸餾水溶解，調PH值為6.6-6.8。步驟二、凝膠的制備選用聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠，顆粒大小為30-60納米。用凝膠懸浮介質浸泡后再用凝膠懸浮介質洗滌3-5次，除去凝膠破損碎片以及聚集的凝膠顆粒，收集得到顆粒大小均勻的、且完整呈球形的適用的凝膠。步驟三、抗體的選擇選擇IgM性質的單克隆抗A抗體，效價>128選擇IgM性質的單克隆抗B為抗體，效價>128步驟四、凝膠的配制將步驟二制備的凝膠與步驟三選擇的各抗體均按照體積比2:16:l的比例混合，分別配制成含有IgM性質的單克隆抗A抗體的凝膠和含有IgM性質的單克隆抗B抗體的凝膠；將步驟二制備的凝膠與步驟一配制的凝膠懸浮介質按照體積比2:16:1的比例混合，配制成含有凝膠懸浮介質的凝膠；步驟五、分裝按照每管2228微升的量加入到空白卡片中，將步驟四配制的各凝膠加入到一空白卡片的六個微柱管中，形成具有6個微柱凝膠管的ABO血型定型檢測試劑卡。步驟六、半成品測定要求含有抗體的微柱凝膠管中，具有與抗體相應抗原的紅細胞產生^3+的陽性反應，即紅細胞集中在凝膠上層表面，呈現直線型。而與不含有抗體對應抗原的紅細胞產生陰性反應，即紅細胞可以全部通過凝膠到達微管底部，沉積在微管底部。而不含抗體只含有凝膠懸浮介質和凝膠混合物的凝膠管中紅細胞可以全部通過凝膠到達微管底部，沉積在微管底部，呈現陰性反應。步驟七、封口用鋁箔紙通過壓膜方式將微柱管上口密封。貼標簽標記后于18-25t:保存。步驟八、保存試驗上述ABO血型定型檢測試劑卡保存了1年以上，在此保存期間，該AB0血型定型檢測試劑卡具有以下檢測結果(1)外觀AB0血型定型檢測試劑卡中的抗A凝膠呈均勻藍色，抗B凝膠呈均勻黃色，凝膠懸浮介質懸浮的凝膠呈均勻乳白色，膠面上端有12mm清澈透明的液體，凝膠顆粒之間不應有氣泡和異物。(2)靈敏度含有抗體的微柱凝膠管中，具有與抗體相應抗原的紅細胞產生^3+的陽性反應，即紅細胞集中在凝膠上層表面，呈現直線型。(3)特異性含有抗體的微柱凝膠管中，具有與抗體相應抗原的紅細胞產生陽性反應，即紅細胞集中在凝膠上層表面，呈現直線型。與不含有抗體對應抗原的紅細胞產生陰性反應，即紅細胞可以全部通過凝膠到達微管底部，沉積在微管底部。而不含抗體只含有凝膠懸浮介質和凝膠混合物的凝膠管中紅細胞可以全部通過凝膠到達微管底部，沉積在微管底部，呈現陰性反應。實施例2:所述AB0血型定型檢測試劑卡使用方法如下1、ABO血型定型檢測試劑卡有六個凝膠管。其中第一管為抗A凝膠，第二管為抗B凝膠，第1-2管用于檢測被檢者紅細胞AB0系統A、B抗原的檢查(正定型)；第三管至第六管為空白凝膠(含有凝膠懸浮介質凝膠)。從第三管至第五管用于反定型試驗，分別用A型、B型、0型試劑紅細胞檢測被檢樣本中的ABO系統抗體(反定型)。第六管為陰性對照。2、用LISS溶液或生理鹽水將待檢者紅細胞配制成0.81X濃度，分別加入第一、第二和第六支微管中，每管50。3、將已知A型、B型和0型紅細胞用LISS溶液或生理鹽水配制成0.81%濃度，分別加入至第三到第五支微管，每管50iU。4、將待檢者血清/血漿分別加入到第三至第六支微管中，每管25iU。5、混勻后用微柱凝膠卡專用離心機離心，900rpm2分鐘，1500rpm3分鐘，取出后肉眼判定結果，記錄。6、判定結果陽性結果紅細胞浮在凝膠表面或膠中，為陽性反應。陰性結果紅細胞沉于微柱凝膠的底部。血型判定見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注"+"為陽性"0"為陰性權利要求一種ABO血型定型檢測試劑卡的制備方法，所述試劑卡上具有6個微柱凝膠管，所述6個微柱凝膠管分別是一管含有IgM性質的單克隆抗A抗體的凝膠管、一管含有IgM性質的單克隆抗B抗體的凝膠管、三管用于反定型的含有凝膠懸浮介質的凝膠管和一管用于陰性對照的含有凝膠懸浮介質的凝膠管，其特征在于所述方法包括以下工藝過程步驟一、凝膠懸浮介質的配制所述凝膠懸浮介質配方如下對羥基苯甲酸甲酯(5.5-6.5)×10-4g/ml對羥基苯甲酸丙酯(1.0-1.5)×10-4g/ml甘氨酸(1.6-1.9)×10-2g/ml氯化鈉(1.7-1.8)×10-3g/ml磷酸二氫鉀(2.1-2.4)×10-4g/ml磷酸氫二鈉(4.6-4.8)×10-4g/ml牛血清白蛋白≤4％，以上試劑用蒸餾水溶解，調pH值為6.6-6.8；步驟二、凝膠的制備選用聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠，顆粒大小為30-60納米，用步驟一配制的凝膠懸浮介質浸泡后再用該凝膠懸浮介質洗滌3-5次，除去凝膠破損碎片以及聚集的凝膠顆粒，收集得到顆粒大小均勻的、且完整呈球形的凝膠；步驟三、抗體的選擇選擇IgM性質的單克隆抗A抗體，效價≥128選擇IgM性質的單克隆抗B為抗體，效價≥128；步驟四、凝膠的配制將步驟二制備的凝膠與步驟三選擇的各抗體均按照體積比2∶1～6∶1的比例混合，分別配制成含有IgM性質的單克隆抗A抗體的凝膠和含有IgM性質的單克隆抗B抗體的凝膠；將步驟二制備的凝膠與步驟一配制的凝膠懸浮介質按照體積比2∶1～6∶1的比例混合，配制成含有凝膠懸浮介質的凝膠；步驟五、分裝按照每管22-28微升的量，將步驟四配制的各凝膠分別加入到一空白卡片的六個微柱管中，形成具有6個微柱凝膠管的ABO血型定型檢測試劑卡。全文摘要本發明涉及一種ABO血型定型檢測試劑卡的制備方法，所述試劑卡上具有6個微柱凝膠管，所述6個微柱凝膠管分別是一管含有IgM性質的單克隆抗A抗體的凝膠管、一管含有IgM性質的單克隆抗B抗體的凝膠管、三管用于反定型的含有凝膠懸浮介質的凝膠管和一管用于陰性對照的含有凝膠懸浮介質的凝膠管。所述方法包括以下工藝過程凝膠懸浮介質的配制、凝膠的制備、抗體的選擇、凝膠的懸浮和分裝。本發明方法制備的ABO血型定型檢測試劑卡卡靈敏度高，特異性好，質量穩定且能同時進行正反定型。文檔編號G01N33/80GK101701961SQ200910234609公開日2010年5月5日申請日期2009年11月25日優先權日2009年11月25日發明者朱慶平,錢國強,陳玉平申請人:江陰力博醫藥生物技術有限公司