專利名稱：黃麻根系總蛋白雙向電泳方法
技術領域：
本發明涉及一種黃麻的根系總蛋白雙向電泳方法，屬于生物技術領域。是能夠在
沿海灘涂大面積生長的黃麻根系的蛋白質組分離，該方法可直接應用于能夠在沿海灘涂生 存的高耐鹽植物研究開發利用。
背景技術：
抗逆性是植物在系統進化過程中，為適應不良環境獲得的一種對策。在植物的生 存環境中一些非生物因子脅迫，對植物的生長發育和生存都會產生嚴重的影響，為了應對 外界環境的不利影響，植物在進化過程中形成了完整的防御機制。為了解析其防御機制就 勢必需要分離一些與逆境相關的蛋白質。 黃麻(0rchorus olitorius L.)又稱絡麻、綠麻，是一種能在沿海灘涂地大面積 生長的一年生草本韌皮纖維經濟作物，在沿海灘涂開發熱的今天可作為灘涂改良的先鋒作 物。由于其能夠耐受沿海灘涂高鹽脅迫，因此成了耐鹽性研究中的一種優秀的指示植物材 料。 但由于其植物體內含有鹽漬化條件下產生的多種次生代謝物(色素、酚類、醌類
等)，眾多干擾使得作為蛋白質組研究的核心技術_雙向電泳成為挑戰，常規方法不能成功
制備純度高的蛋白，在電泳過程中，合理的參數設定可有效的除鹽，聚焦等。以黃麻植物根
系為材料，進行根系總蛋白的制備，建立適用于黃麻根系蛋白質組學分離的雙向電泳方法，
可為鹽漬化環境下植物材料耐鹽性蛋白質組學研究提供實驗基礎和參考。 本發明的突破點就是建立鹽漬化環境下的高耐鹽植物黃麻的雙向電泳方法體系，
利用該方法可對黃麻進行蛋白質組學研究分析。
發明內容
技術問題 本發明目的在于提供一種黃麻根系的總蛋白分離的雙向電泳方法，是針對能夠生
存在沿海灘涂的植物黃麻的根系總蛋白采用雙向電泳方法進行分離，該技術經反復實驗證
明樣品制備全、分離蛋白點多、重復性好、圖譜清晰，是一套適用于黃麻根系總蛋白組分析
的雙向電泳技術。 技術方案 本發明所述的一種黃麻根系的總蛋白雙向電泳方法，按下列步驟進行 1)采集黃麻根系，超純水清洗干凈，用液氮罐裝運回，在實驗室-7(TC以下保存備 用； 2)將2g黃麻根系迅速放入冰浴的研缽中加入液氮研磨，研磨過程中加入0. 2g聚 乙烯吡咯烷酮，直到研磨成細粉，轉入預冷-2(TC的50ml離心管； 3)加入3倍體積-2(TC預冷的三氯乙酸提取液，充分混合后，放在-2(TC 1.5h，三 氯乙酸提取液配制質量體積比10X三氯乙酸TCA，質量體積比0. 07X二硫蘇糖醇DTT， lmM苯甲基磺酰氟PMSF，溶劑為丙酮； 4)35000g，4t:離心15min，取沉淀，加入25ml預冷的樣品洗滌液，充分混合后，放 在-20°C lh，期間間隔渦旋；樣品洗滌液配制質量體積比0. 07% DTT， lmM PMSF，溶劑為丙 酮； 5)20000g，4t:離心15min，取沉淀，加入25ml預冷的樣品洗滌液，充分混合后，放 在-2(TC lh，期間間隔渦旋;
6)重復步驟5)—次； 7)20000g，4。C離心15min，去掉上清后，用濾紙封口 ，真空干燥；
8)將粗蛋白溶于裂解液，室溫1. 5h ;裂解液配制7M尿素、2M硫脲、質量體積比 4% 3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-l-丙磺酸CHAPS、65mM DTT、lmM PMSF、體積比 0.2%載體兩性電解質； 9)離心，得到上清液用3倍體積預冷的樣品洗滌液-2(TC沉淀0. 5h后再20000g、 4t:、15min離心，棄上清液； 10)沉淀再次溶解于步驟8)中的500 iU裂解液，充分溶解后，離心，取上清；
11)蛋白質定量采用Bradford法測定其蛋白濃度； 12)第一向等電聚焦電泳按上樣量350iig，上樣體積330ia，對已定量好的蛋白 樣品進行稀釋，上樣水化液同步驟8)中的裂解液，將樣品加入固相pH梯度IPG膠條聚焦 盤內后，再將PH 4-7， 17cm的IPG膠條膠面向下放入盤中，除去膠面與樣品液間的氣泡，用 2. 5ml礦物油/條，覆蓋膠條，進行等電聚焦； 13)膠條平衡將聚焦好后的固相pH梯度IPG膠條進行平衡I、 II，每次平衡時間 為20min，平衡緩沖液配制如下 膠條平衡緩沖液母液6M尿素，質量體積比2%十二烷基磺酸鈉SDS，O. 375MpH8. 8 的Tris-HCl，體積比20%甘油，溶劑為水。 膠條平衡緩沖液I :每10ml膠條平衡緩沖液母液加入0. 2g DTT ; 膠條平衡緩沖液II :每10ml膠條平衡緩沖液母液加入0. 25g碘乙酰胺； 14)第二向SDS-PAGE電泳將平衡好的膠條置于膠濃度為質量體積比12 %的
SDS-PAGE膠上，用質量體積比0. 5%、含有質量體積比0. 002%溴酚藍的低熔點瓊脂糖封膠
液封住頂部，按如下參數進行電泳16t:恒溫下，恒功率，先用1瓦/條，1. 5h ;再用15瓦/
條，4 6h ; 15)染色方法采用硝酸銀法進行染色。
整個過程的溶液配制均需用超純水。
整個過程的裂解液與上樣水化液均需現用現配。
整個過程所需的DTT均需現用現加。 步驟12)中的等電聚焦參數設置如下50V水化，13h ;250V慢速，lh ;500V慢速， lh ;2000V線性，lh ;8000V線性，4h ;8000V快速，60000V. h ;500V快速，保持。
步驟14)中膠濃度質量體積比12 %的SDS PAGE凝膠所用的溶液體積比 含量為，水質量體積比30%丙烯酰胺0. 375M pH8. 8的Tris-HCl :質量體積
比10%十二烷基硫酸鈉質量體積比10%過硫酸銨體積比10%四甲基乙二胺= 33 : 40 : 25 : i : i : o. 15。
步驟14)電極緩沖液配制如下按質量體積比0. 1 %十二烷基硫酸鈉，0. 025mol/L 三羥甲基氨基甲烷和0. 192mol/L甘氨酸進行配制，溶劑為水，并調制pH值為8. 3。
步驟15)中的染色方法程序如下 步驟1 :取50ml冰乙酸、200ml無水乙醇、加水至500ml固定，1. 5h ; 步驟2 :取lg硫代硫酸鈉，56. 36g三水合乙酸鈉，150ml無水乙醇，加水至500ml敏
化，30min ; 步驟3 :500ml水漂洗三遍，5min/次； 步驟4 :1. 25g硝酸銀溶于500ml水，避光銀染，20min ; 步驟5 :500ml水漂洗二遍，lmin/次； 步驟6 :12. 5g碳酸鈉，0. 2ml甲醛，加水至500ml，顯色共2次；第一次待溶液變黃
后倒掉，第二次顯色到理想的背景和清晰度； 步驟7 :7. 3g Na2EDTA溶于500ml水終止，10min。 有益效果 本發明針對黃麻體內含有鹽漬化條件下產生的多種次生代謝物(色素、酚類、醌 類等)，眾多干擾使得作為蛋白質組研究的核心技術_雙向電泳成為挑戰，首次建立了一套 適合黃麻根系蛋白質組學研究的雙向電泳方法。 本套方法首次將黃麻根系總蛋白樣品進行制備，采用雙向電泳方法對其進行分 離，分離得到蛋白點多，經PDQuest軟件檢測，蛋白點多于IIOO個，圖譜清晰，無橫縱紋現 象，蛋白點圓，重復性好。可在黃麻根系蛋白組學中直接運用。
下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。
圖1黃麻室內水培根系總蛋白雙向電泳圖譜。
1為乙醇脫氫酶2為黃酮醇合成酶；3為RBAP2蛋白。
圖2沿海灘涂生長的黃麻根系總蛋白雙向電泳圖譜。
1為乙醇脫氫酶；2為黃酮醇合成酶；3為RBAP2蛋白。
具體實施方式
實施例1 采用美國Beckmen高速低溫離心機、雙向電泳PROTEAN IIXi/XL Cell(美國 BIO-膽) 1)采集室內水培黃麻根系，超純水清洗干凈，用過濾紙吸干根系表面水份，立即放
入液氮罐迅速冷凍，然后在實驗室-701:以下冰箱保存備用； 2)將2g黃麻根系樣品迅速放入冰浴的研缽中加入液氮研磨，研磨過程中加入 0. 2g聚乙烯吡咯烷酮，直到研磨成細粉，轉入預冷-2(TC的50ml離心管；
3)加入3倍體積-2(TC預冷的三氯乙酸提取液，充分混合后，放在-2(TC 1.5h，三 氯乙酸提取液配制質量體積比10X三氯乙酸TCA，質量體積比0. 07X二硫蘇糖醇DTT， lmM 苯甲基磺酰氟PMSF，溶劑為丙酮；4)35000g，4t:離心15min，取沉淀，加入25ml預冷的樣品洗滌液，充分混合后，放在-20°C lh，期間間隔渦旋；樣品洗滌液配制質量體積比0. 07% DTT， ImM PMSF，溶劑為丙 酮； 5)20000g，4。C離心15min，取沉淀，加入25ml預冷的樣品洗滌液，充分混合后，放 在-2(TC lh，期間間隔渦旋;
6)重復步驟5) —次； 7)20000g，4。C離心15min，去掉上清后，用濾紙封口 ，真空干燥；
8)將粗蛋白溶于裂解液，室溫1. 5h ;裂解液配制7M尿素、2M硫脲、質量體積比 4% 3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-l-丙磺酸CHAPS、65mM DTT、lmM PMSF、體積比 0.2%載體兩性電解質； 9)離心，得到上清液用3倍體積預冷的樣品洗滌液-2(TC沉淀0. 5h后再20000g、 4t:、15min離心，棄上清液； 10)沉淀再次溶解于步驟8)中的500 iU裂解液，充分溶解后，離心，取上清；
11)蛋白質定量采用Bradford法測定其蛋白濃度將蛋白質定量標準梯度稀釋 后用考馬斯亮藍G-250染色，在波長595nm下測定吸光值，做標準曲線，并計算出蛋白質含 12)第一向等電聚焦電泳按上樣量350iig，上樣體積330iil，對已定量好的蛋白 樣品進行稀釋，上樣水化液同步驟8)中的裂解液，將樣品加入固相pH梯度IPG膠條聚焦 盤內后，再將PH 4-7， 17cm的IPG膠條膠面向下放入盤中，除去膠面與樣品液間的氣泡，用 2. 5ml礦物油/條，覆蓋膠條，進行等電聚焦，等電聚焦程序設置如下50V水化，13h ;250V 慢速，lh ;500V慢速，lh ;2000V線性，lh ;8000V線性，4h ;8000V快速，60000V. h ;500V快速， 保持。 13)膠條平衡將聚焦好后的固相pH梯度IPG膠條進行平衡I、 II，每次平衡時間 為20min，平衡緩沖液配制如下 膠條平衡緩沖液母液6M尿素，質量體積比2%十二烷基磺酸鈉SDS，O. 375MpH8. 8 的Tris-HCl，體積比20%甘油，溶劑為水。 膠條平衡緩沖液I :每10ml膠條平衡緩沖液母液加入0. 2g DTT ; 膠條平衡緩沖液II :每10ml膠條平衡緩沖液母液加入0. 25g碘乙酰胺； 14)第二向SDS-PAGE電泳將平衡好的膠條置于膠濃度為質量體積比12 %的
SDS-PAGE膠上，用質量體積比0. 5%、含有質量體積比0. 002%溴酚藍的低熔點瓊脂糖封膠
液封住頂部，按如下參數進行電泳16t:恒溫下，恒功率，先用1瓦/條，1. 5h ;再用15瓦/
條，4 6h ; 膠濃度質量體積比12 %的SDS-PAGE凝膠所用的溶液體積比含量為，水質量體 積比30%丙烯酰胺0. 375M pH8. 8的Tris-HCl :質量體積比10%十二烷基硫酸鈉質
量體積比10%過硫酸銨體積比10%四甲基乙二胺=33 : 40 : 25 : i : i : o. 15。 電極緩沖液配制如下按質量體積比0. 1%十二烷基硫酸鈉，0. 025mol/L三羥甲 基氨基甲烷和0. 192mol/L甘氨酸進行配制，溶劑為水，并調制pH值為8. 3。
15)中的染色方法程序如下 步驟1 :取50ml冰乙酸、200ml無水乙醇、加水至500ml固定，1. 5h ; 步驟2 :取lg硫代硫酸鈉，56. 36g三水合乙酸鈉，150ml無水乙醇，加水至500ml敏化，30min ; 步驟3 :500ml水漂洗三遍，5min/次； 步驟4 :1. 25g硝酸銀溶于500ml水，避光銀染，20min ; 步驟5 :500ml水漂洗二遍，lmin/次； 步驟6 :12. 5g碳酸鈉，0. 2ml甲醛，加水至500ml，顯色共2次；第一次待溶液變黃
后倒掉，第二次顯色到理想的背景和清晰度； 步驟7 :7. 3g Na2EDTA溶于500ml水終止，10min。 通過上述雙向電泳整個流程對室內培養的黃麻根系總蛋白進行分離，結果如圖1 所示，結果表明該黃麻根系總蛋白樣品分離效果較好，圖譜清晰，蛋白點圓且多，經PDQuest 軟件檢測，蛋白點多于1100個。圖l中橫向為等電聚焦，縱向為SDS-PAGE，縱向數字為蛋白 質分子量標準，單位是kD。舉例蛋白點1、2、3經質譜鑒定后分別為乙醇脫氫酶；黃酮醇合 成酶；RBAP2蛋白。
實施例2 采用美國Beckmen高速低溫離心機、雙向電泳PROTEAN IIXi/XL Cell(美國 BIO-膽) 1)采集江蘇省大豐市沿海灘涂所種植的黃麻根系，用超純水清洗干凈，用過濾紙 吸干根系表面水份，放入液氮罐迅速冷凍，運回，然后在實驗室-70°C以下冰箱保存備用；
2)將2g黃麻根系樣品迅速放入冰浴的研缽中加入液氮研磨，研磨過程中加入 0. 2g聚乙烯吡咯烷酮，直到研磨成細粉，轉入預冷-2(TC的50ml離心管；
3)加入3倍體積-2(TC預冷的三氯乙酸提取液，充分混合后，放在-2(TC 1.5h，三 氯乙酸提取液配制質量體積比10X三氯乙酸TCA，質量體積比0. 07X二硫蘇糖醇DTT， lmM 苯甲基磺酰氟PMSF，溶劑為丙酮； 4)35000g，4t:離心15min，取沉淀，加入25ml預冷的樣品洗滌液，充分混合后，放 在-20°C lh，期間間隔渦旋；樣品洗滌液配制質量體積比0. 07% DTT， lmM PMSF，溶劑為丙 酮； 5)20000g，4t:離心15min，取沉淀，加入25ml預冷的樣品洗滌液，充分混合后，放 在-2(TC lh，期間間隔渦旋;
6)重復步驟5) —次； 7)20000g，4。C離心15min，去掉上清后，用濾紙封口 ，真空干燥；
8)將粗蛋白溶于裂解液，室溫1. 5h ;裂解液配制7M尿素、2M硫脲、質量體積比 4% 3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-l-丙磺酸CHAPS、65mM DTT、lmM PMSF、體積比 0.2%載體兩性電解質； 9)離心，得到上清液用3倍體積預冷的樣品洗滌液-2(TC沉淀0. 5h后再20000g、 4t:、15min離心，棄上清液； 10)沉淀再次溶解于步驟8)中的500 iU裂解液，充分溶解后，離心，取上清；
11)蛋白質定量采用Bradford法測定其蛋白濃度將蛋白質定量標準梯度稀釋 后用考馬斯亮藍G-250染色，在波長595nm下測定吸光值，做標準曲線，并計算出蛋白質含 12)第一向等電聚焦電泳按上樣量350iig，上樣體積330iil，對已定量好的蛋白
8樣品進行稀釋，上樣水化液同步驟8)中的裂解液，將樣品加入固相pH梯度IPG膠條聚焦 盤內后，再將PH 4-7， 17cm的IPG膠條膠面向下放入盤中，除去膠面與樣品液間的氣泡，用 2. 5ml礦物油/條，覆蓋膠條，進行等電聚焦，等電聚焦程序設置如下50V水化，13h ;250V 慢速，lh ;500V慢速，lh ;2000V線性，lh ;8000V線性，4h ;8000V快速，60000V. h ;500V快速，保持。 13)膠條平衡將聚焦好后的固相pH梯度IPG膠條進行平衡I、 II，每次平衡時間 為20min，平衡緩沖液配制如下 膠條平衡緩沖液母液6M尿素，質量體積比2%十二烷基磺酸鈉SDS，O. 375MpH8. 8 的Tris-HCl，體積比20%甘油，溶劑為水。 膠條平衡緩沖液I :每10ml膠條平衡緩沖液母液加入0. 2g DTT ; 膠條平衡緩沖液II :每10ml膠條平衡緩沖液母液加入0. 25g碘乙酰胺； 14)第二向SDS-PAGE電泳將平衡好的膠條置于膠濃度為質量體積比12 %的
SDS-PAGE膠上，用質量體積比0. 5%、含有質量體積比0. 002%溴酚藍的低熔點瓊脂糖封膠
液封住頂部，按如下參數進行電泳16t:恒溫下，恒功率，先用1瓦/條，1. 5h ;再用15瓦/
條，4 6h ; 膠濃度質量體積比12 %的SDS-PAGE凝膠所用的溶液體積比含量為，水質量體 積比30%丙烯酰胺0. 375M pH8. 8的Tris-HCl :質量體積比10%十二烷基硫酸鈉質
量體積比10%過硫酸銨體積比10%四甲基乙二胺=33 : 40 : 25 : i : i : o. 15。 電極緩沖液配制如下按質量體積比0. 1%十二烷基硫酸鈉，0. 025mol/L三羥甲 基氨基甲烷和0. 192mol/L甘氨酸進行配制，溶劑為水，并調制pH值為8. 3。
15)中的染色方法程序如下 步驟1 :取50ml冰乙酸、200ml無水乙醇、加水至500ml固定，1. 5h ; 步驟2 :取lg硫代硫酸鈉，56. 36g三水合乙酸鈉，150ml無水乙醇，加水至500ml敏
化，30min ; 步驟3 :500ml水漂洗三遍，5min/次； 步驟4 :1. 25g硝酸銀溶于500ml水，避光銀染，20min ; 步驟5 :500ml水漂洗二遍，lmin/次； 步驟6 :12. 5g碳酸鈉，0. 2ml甲醛，加水至500ml，顯色共2次；第一次待溶液變黃
后倒掉，第二次顯色到理想的背景和清晰度； 步驟7 :7. 3g Na2EDTA溶于500ml水終止，10min。 通過上述雙向電泳整個流程對江蘇省大豐市沿海灘涂地采集的黃麻根系總蛋白 進行分離，結果如圖2所示，結果表明該黃麻根系總蛋白樣品分離效果較好，圖譜清晰，蛋 白點圓且多，經PDQuest軟件檢測，蛋白點多于1100個。圖2中橫向為等電聚焦，縱向為 SDS-PAGE，縱向數字為蛋白質分子量標準，單位是kD。舉例蛋白點1、2、3經質譜鑒定后分別 為乙醇脫氫酶；黃酮醇合成酶；RBAP2蛋白。
權利要求
一種黃麻根系總蛋白雙向電泳方法，其特征在于按下列步驟進行1)采集黃麻根系，超純水清洗干凈，用液氮罐裝運回，在實驗室-70℃以下保存備用；2)將2g黃麻根系迅速放入冰浴的研缽中加入液氮研磨，研磨過程中加入0.2g聚乙烯吡咯烷酮，直到研磨成細粉，轉入預冷-20℃的50ml離心管；3)加入3倍體積-20℃預冷的三氯乙酸提取液，充分混合后，放在-20℃1.5h，三氯乙酸提取液配制質量體積比10％三氯乙酸TCA，質量體積比0.07％二硫蘇糖醇DTT，1mM苯甲基磺酰氟PMSF，溶劑為丙酮；4)35000g，4℃離心15min，取沉淀，加入25ml預冷的樣品洗滌液，充分混合后，放在-20℃1h，期間間隔渦旋；樣品洗滌液配制質量體積比0.07％DTT，1mMPMSF，溶劑為丙酮；5)20000g，4℃離心15min，取沉淀，加入25ml預冷的樣品洗滌液，充分混合后，放在-20℃1h，期間間隔渦旋；6)重復步驟5)一次；7)20000g，4℃離心15min，去掉上清后，用濾紙封口，真空干燥；8)將粗蛋白溶于裂解液，室溫1.5h；裂解液配制7M尿素、2M硫脲、質量體積比4％3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸CHAPS、65mM DTT、1mM PMSF、體積比0.2％載體兩性電解質；9)離心，得到上清液用3倍體積預冷的樣品洗滌液-20℃沉淀0.5h后再20000g、4℃、15min離心，棄上清液；10)沉淀再次溶解于步驟8)中的500μl裂解液，充分溶解后，離心，取上清；11)蛋白質定量采用Bradford法測定其蛋白濃度；12)第一向等電聚焦電泳按上樣量350μg，上樣體積330μl，對已定量好的蛋白樣品進行稀釋，上樣水化液同步驟8)中的裂解液，將樣品加入固相pH梯度IPG膠條聚焦盤內后，再將pH 4-7，17cm的IPG膠條膠面向下放入盤中，除去膠面與樣品液間的氣泡，用2.5ml礦物油/條，覆蓋膠條，進行等電聚焦；13)膠條平衡將聚焦好后的固相pH梯度IPG膠條進行平衡I、II，每次平衡時間為20min，平衡緩沖液配制如下膠條平衡緩沖液母液6M尿素，質量體積比2％十二烷基磺酸鈉SDS，0.375MpH8.8的Tris-HCl，體積比20％甘油，溶劑為水。膠條平衡緩沖液I每10ml膠條平衡緩沖液母液加入0.2g DTT；膠條平衡緩沖液II每10ml膠條平衡緩沖液母液加入0.25g碘乙酰胺；14)第二向SDS-PAGE電泳將平衡好的膠條置于膠濃度為質量體積比12％的SDS-PAGE膠上，用質量體積比0.5％、含有質量體積比0.002％溴酚藍的低熔點瓊脂糖封膠液封住頂部，按如下參數進行電泳16℃恒溫下，恒功率，先用1瓦/條，1.5h；再用15瓦/條，4～6h；15)染色方法采用硝酸銀法進行染色。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，整個過程的溶液配制均需用超純水。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，裂解液與上樣水化液均需現用現配。
4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，整個過程所需的DTT均需現用現加。
5. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟12)中的等電聚焦參數設置如下50V水化，13h ;250V慢速，lh ;500V慢速，lh ;2000V線性，lh ;8000V線性，4h ;8000V快速， 60000V. h ; 500V快速，保持。
6. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟14)中膠濃度質量體積比12%的 SDS-PAGE凝膠所用的溶液體積比含量為，水質量體積比30%丙烯酰胺0.375M pH8. 8的Tris-HCi :質量體積比10%十二烷基硫酸鈉質量體積比10%過硫酸銨體積比10% 四甲基乙二胺=33 : 40 : 25 : i : i : o. 15。
7. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟14)中電極緩沖液配制如下按質量體積比O. 1%十二烷基硫酸鈉，0. 025mol/L三羥甲基氨基甲烷和0. 192mol/L甘氨酸進行配 制，溶劑為水，并調制pH值為8.3。
8. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟15)中的染色方法程序如下 步驟1 :取50ml冰乙酸、200ml無水乙醇、加水至500ml固定，1. 5h ;步驟2 :取lg硫代硫酸鈉，56. 36g三水合乙酸鈉，150ml無水乙醇，加水至500ml敏化， 30min ;步驟3 :500ml水漂洗三遍，5min/次；步驟4 :1. 25g硝酸銀溶于500ml水，避光銀染，20min ;步驟5 :500ml水漂洗二遍，lmin/次；步驟6 :12. 5g無水碳酸鈉，0. 2ml甲醛，加水至500ml，顯色共2次；第一次待溶液變黃后倒掉，第二次顯色到理想的背景和清晰度；步驟7 :7. 3g Na2EDTA溶于500ml水終止，10min。
全文摘要
本發明涉及一種黃麻的總蛋白質雙向電泳方法，屬于生物技術領域。是針對能夠生存在沿海灘涂的黃麻根系總蛋白采用雙向電泳技術進行分離，采用本技術方案對生長在沿海灘涂地的黃麻根系進行實驗取得了很好的效果。目前，經過反復實驗證明，采用雙向電泳方法對其進行分離，分離得到蛋白點多，經PDQuest軟件檢測，蛋白點多于1100個，圖譜清晰，無橫縱紋現象，蛋白點圓，重復性好，是一套適用于黃麻根系總蛋白組分析的雙向電泳方法。
文檔編號G01N1/28GK101718745SQ20091023252
公開日2010年6月2日 申請日期2009年12月7日 優先權日2009年12月7日
發明者何小玲, 王顯生, 馬洪雨, 麻浩 申請人:南京農業大學