專利名稱：高通量篩選結核分枝桿菌葡糖胺-1-磷酸乙酰基轉移酶抑制劑的方法
技術領域：
本發明涉及篩選抗結核藥物的方法，尤其是一種高通量篩選結核分枝桿菌葡糖 胺-1-磷酸乙酰基轉移酶抑制劑的方法。
背景技術：
結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起結核病(tuberculosis) 的病原菌，據WHO報道，目前全球有近1/3的人已感染結核分枝桿菌，每年新發結核病人約 9000 力。(multi drug resistant, MDR) Μ^&Γ&ΜΜ (extensive drug resistant, XDR)菌株的出現，現有一些一線及二線抗結核藥物都無法有效地治愈結核病， 導致每年約有200萬人死亡，結核病已成為全世界成人因傳染病而死亡的主要疾病之一。目前，新藥研制已由過去大多數隨機、偶然和被動的藥物發現過程變為主動的以 明確靶標為依據的新藥開發過程，以細菌代謝途徑中的酶或蛋白質作為靶標來篩選先導化 合物，是目前研發新的抗生素的一種策略。研究表明，分枝桿菌與革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽 性菌相比，具有特殊的細胞壁結構，其核心結構由分枝菌酸、聚阿拉伯半乳糖及肽聚糖三種 大分子所構成。分枝菌酸由含70-90碳原子的脂類分子組成，形成致密的低通透性外層，肽 聚糖位于細胞壁的最內層并與細胞質膜相連。分枝菌酸與中層的聚阿拉伯糖(由呋喃型阿 拉伯糖殘基聚合而成)及聚半乳糖(由呋喃型半乳糖殘基聚合而成)連接后再通過銜接二 糖(L-鼠李糖-N-乙酰葡糖胺L-Rhamnose-N-GlcNAc)共價連接到肽聚糖大分子上。因此， 銜接二糖是維持分枝桿菌細胞壁完整性的重要結構。N-乙酰葡糖胺既是二糖銜接分子的組成成分，又是肽聚糖的組成成分，其糖基供 體為UDP-N-乙酰葡糖胺。UDP-N-乙酰葡糖胺的生物合成途徑包括由三種酶所催化的四步 反應，其中以glmU基因編碼的GlmU蛋白酶是雙功能酶，其基因C端具有葡糖胺磷酸乙 酰基轉移酶活性，N端具有N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷轉移酶活性，分別催化第三步的轉乙 酰反應及第四步的轉尿苷反應。乙酰化作用將乙酰CoA中的乙酰基轉移給葡糖胺-1-磷酸， 生成N-乙酰葡糖胺-1-磷酸；轉尿苷反應將UTP的α -磷酸轉移給N-乙酰葡糖胺-1-磷 酸，生成UDP-乙酰葡糖胺。現有技術構建了 glmU基因敲除菌株，并通過測定其在允許溫度和非允許溫度條 件下的生長曲線，確定glmU是分枝桿菌生長必需基因[1]，與Sassetti等人的高密度突變實 驗的結果一致[2]。GlmU蛋白是N-乙酰葡糖胺賴以存在的必要條件，亦是維持分枝桿菌細 胞壁完整性的關鍵，尤其是葡糖胺-1-磷酸乙酰基轉移酶并不存在于人體細胞中，如以葡 糖胺-ι-磷酸乙酰基轉移酶為靶酶所研發的抗結核藥物既能殺滅結核分枝桿菌又不會對 人體產生毒副作用。但是，迄今為止還沒有以葡糖胺-ι-磷酸乙酰基轉移酶為抗結核藥物 的作用靶標，從已有組合化合物庫及中藥中篩選出有效的葡糖胺-1-磷酸乙酰基轉移酶抑 制劑的相關報道。
發明內容
本發明是以參與結核分枝桿菌細胞壁中關鍵組分生物合成的葡糖胺-1-磷酸乙 酰基轉移酶為對象，提供一種高通量篩選結核分枝桿菌葡糖胺-1-磷酸乙酰基轉移酶抑制 劑的方法。本發明的技術解決方案是一種高通量篩選結核分枝桿菌葡糖胺-1-磷酸乙酰基 轉移酶抑制劑的方法，其特征在于依次按如下步驟進行a.用分子克隆技術從結核分枝桿菌H37Rv基因組中克隆glmU基因，從glmU基因 的5，端進行DNA序列刪除，獲得保留3，端的glmU基因片段glmU_C ；b.將基因片段glmU-C克隆到pET載體，構建出pET-glmU_C表達載體；c.將pET-glmU-C表達載體轉化到大腸桿菌中，構建出表達葡糖胺-1-磷酸乙酰轉 移酶的工程菌株 MTGC08 (Escherichia coli MTGC08)，保藏編號 CGMCC3419 ；d.將工程菌株MTGC08接種到卡那霉素的LB培養基中，在37°C培養4小時，用濃 度為0. 2mM的IPTG進行誘導表達GlmU-C蛋白；e.收獲細菌，超聲破碎細胞，離心后取上清，采用組氨酸-Ni2+親和層析技術純化 得到GlmU-C蛋白；f.將 2ug GlmU-C 蛋白與 pH 7. 5 的 50mM Tris-HCl、0. 4mM 乙酰 CoA 及 0. 4mM 葡糖 胺-1-磷酸構成50 μ 1的酶促反應體系，將被篩選物按0. 1 5ug/ml濃度加入酶促反應體 系中，在30°C孵育5分鐘，加入50 μ 1 6Μ鹽酸胍終止反應，再加入50 μ 1 DTNB顯色劑顯色 10分鐘，用酶標儀檢測405nm處的吸光度值；g.將所測吸光度值與反應條件同f步驟、酶促反應體系中無被篩選物時測得的 GlmU-C蛋白在405nm處的標準吸光度值進行對比，篩選結核分枝桿菌葡糖胺磷酸乙酰 基轉移酶抑制劑。本發明是以結核分枝桿菌葡糖胺-1-磷酸乙酰基轉移酶為靶標所建立的篩選新 型抗結核藥物的方法，可在小體積反應體系中對葡糖胺-1-磷酸乙酰基轉移酶的活性進行 測定，因此，可在96孔板中同時完成96個酶促反應，靈敏、快速準確地在現有組合化合物 庫、中藥及天然物中篩選出葡糖胺-ι-磷酸乙酰基轉移酶抑制劑，制備抗結核藥物。因葡 糖胺-1-磷酸乙酰基轉移酶是N-乙酰葡糖胺賴以存在的必要條件，亦是維持結核分枝桿 菌細胞壁完整性的關鍵，抑制葡糖胺-1-磷酸乙酰基轉移酶即抑制了銜接二糖的生物合成 途徑，從而破壞結核分枝桿菌細胞壁的完整性，導致細菌的死亡，具有高藥效性；另外，在人 體細胞中，UDP-乙酰葡糖胺的合成途徑與結核分枝桿菌有所不同，不存在葡糖胺-1-磷酸 乙酰基轉移酶，因此將編碼GlmU雙功能酶的glmU基因的5’端刪除，只保留glmU基因的 3’端，以編碼只有葡糖胺-1-磷酸乙酰基轉移酶活性的GlmU-C蛋白。結核分枝桿菌葡糖 胺-ι-磷酸乙酰基轉移酶所催化的反應在人體細胞中不存在，以葡糖胺-ι-磷酸乙酰基轉 移酶為靶酶所研發的抗結核藥物將對人體無害，克服了現有抗菌藥物也殺害正常細胞的缺 點ο菌株MTGC08 保藏日期2009-11-06。保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。保藏單位地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號 菌株保藏代號CGMCC 3419。分類命名大腸埃希氏菌Escherichia coli
具體實施例方式a.用分子克隆技術從結核分枝桿菌H37Rv菌株基因組DNA (購自AmericanType Culture Collection, ATCC# 為 25618D-5)中克隆 glmU 基因，從 glmU 基因的 5，端進行 DNA 序列刪除，獲得保留3’端的glmU基因片段glmU-C，該基因片段編碼的C端GlmU蛋白是葡 糖胺-ι-磷酸乙酰基轉移酶結構域；b.將基因片段glmU-C克隆到pET_29b⑴載體(購自Novagen公司，產品號為 69872)，構建出pET-glmU-C表達載體；c.將pET-glmU-C表達載體轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)(購自Novagen公司，產品 號為69450)中，構建出表達葡糖胺-1-磷酸乙酰轉移酶的工程菌株MTGC08 (Escherichia coli MTGC08)，保藏編號CGMCC 3419 (利用HPLC方法確定純化的GlmU-C蛋白具有葡糖 胺-1-磷酸乙酰基轉移酶活性)；d.將工程菌株MTGC08接種到卡那霉素的LB培養基中，在37°C培養4小時，用濃 度為0. 2mM的IPTG進行誘導表達GlmU-C蛋白；e.收獲細菌，超聲破碎細胞，離心后取上清，采用組氨酸-Ni2+親和層析技術純化 得到GlmU-C蛋白；f.將 2ug GlmU-C 蛋白與 pH 7. 5 的 50mM Tris_HCl、0. 4mM 乙酰 CoA 及 0. 4mM 葡糖 胺-1-磷酸構成50 μ 1的酶促反應體系，將被篩選物按0. 1 5ug/ml濃度加入酶促反應體 系中，在30°C孵育5分鐘，加入50 μ 1 6Μ鹽酸胍終止反應，再加入50 μ 1 DTNB顯色劑(購 自Sigma公司，產品號為D8130)顯色10分鐘，用酶標儀檢測405nm處的吸光度值；g.將所測吸光度值與反應條件同f步驟、酶促反應體系中無被篩選物時測得 的GlmU-C蛋白在405nm處的標準吸光度值(0.452)進行對比，篩選結核分枝桿菌葡糖 胺-ι-磷酸乙酰基轉移酶抑制劑。葡糖胺-1-磷酸乙酰基轉移酶活性測定原理如下列反應式⑴、(2):
權利要求
一種高通量篩選結核分枝桿菌葡糖胺 1 磷酸乙酰基轉移酶抑制劑的方法，其特征在于依次按如下步驟進行a.用分子克隆技術從結核分枝桿菌H37Rv菌株基因組中克隆glmU基因，從glmU基因的5’端進行DNA序列刪除，獲得保留3’端的glmU基因片段glmU C；b.將基因片段glmU C克隆到pET載體，構建出pET glmU C表達載體；c.將pET glmU C表達載體轉化到大腸桿菌中，構建出表達葡糖胺 1 磷酸乙酰轉移酶的工程菌株MTGC08(Escherichia coli MTGC08)，保藏編號CGMCC3419；d.將工程菌株MTGC08接種到卡那霉素的LB培養基中，在37℃培養4小時，用濃度為0.2mM的IPTG進行誘導；e.收獲細菌，破碎細胞，離心后取上清，采用組氨酸 Ni2+親和層析技術純化得到GlmU C蛋白；f.將2ug GlmU C蛋白與pH 7.5的50mM Tris HCl、0.4mM乙酰CoA及0.4mM葡糖胺 1 磷酸構成50μl的酶促反應體系，將被篩選物按0.1～5ug/ml濃度加入酶促反應體系中，在30℃孵育5分鐘，加入50μl 6M鹽酸胍終止反應，再加入50μl DTNB顯色劑顯色10分鐘，用酶標儀檢測405nm處的吸光度值；g.將所測吸光度值與反應條件同f步驟、酶促反應體系中無被篩選物時測得的GlmU C蛋白在405nm處的標準吸光度值進行對比，篩選結核分枝桿菌葡糖胺 1 磷酸乙酰基轉移酶抑制劑。
全文摘要
本發明公開一種高通量篩選結核分枝桿菌葡糖胺-1-磷酸乙酰基轉移酶抑制劑的方法，是利用分子克隆技術從結核分枝桿菌H37Rv菌株基因組中克隆了全長glmU基因，并對全glmU基因進行改造，只保留編碼葡糖胺-1-磷酸乙酰基轉移酶的基因片段，同時建立了高表達葡糖胺-1-磷酸乙酰基轉移酶的大腸桿菌工程菌株。利用親和層析技術從工程菌株中純化得到葡糖胺-1-磷酸乙酰基轉移酶，建立了快速、準確測定葡糖胺-1-磷酸乙酰基轉移酶活性的方法，該酶活性測定方法是篩選葡糖胺-1-磷酸乙酰基轉移酶抑制劑的分子模型，用于高通量篩選組合化合物庫、中藥及天然產物的結核分枝桿菌葡糖胺-1-磷酸乙酰基轉移酶抑制劑。
文檔編號G01N21/31GK101942501SQ20091022016
公開日2011年1月12日 申請日期2009年11月26日 優先權日2009年11月26日
發明者周妍, 張文利, 辛毅, 馬郁芳 申請人:大連醫科大學