專利名稱：：一種針對血管內皮生長因子受體-2的光激化學發光藥物篩選試劑盒的制作方法
技術領域：
：—種針對血管內皮生長因子受體-2的光激化學發光藥物篩選試劑盒，屬于光激化學發光檢測技術(LICLIA)領域，用于血管內皮生長因子受體-2拮抗劑的高通量篩選。
背景技術：
：腫瘤的生長和轉移與新生血管有著密切的關系，新生血管的生長和成熟是一個復雜的多因子和多信號傳導過程的結果，其中涉及到很多血管生成因子，在眾多相關的因子中，血管內皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)及血管內皮生長因子受體一2(vascularendothelialgrowthfactorrec印tor—2，VEGFR—2)在月中瘤新生血管形成過程中起著十分重要的作用，因此VEGF/VEGFR-2成為抗腫瘤藥物研究的良好靶點。大量的研究結果表明VEGF/VEGFR-2信號傳導通路在許多癌癥的發生發展中起關鍵性作用，包括肝癌、肺癌、結腸癌、卵巢癌、乳腺癌等等。以該通路為靶點的抗腫瘤藥物與傳統的腫瘤治療藥物相比有很大的優勢使用抗血管生成藥物治療腫瘤，對人體毒副作用小；不易產生耐藥性；抗腫瘤血管治療具有一定的廣譜性；腫瘤血管內皮細胞與血液直接接觸，藥物更加容易到達血管內皮細胞。2000年，Sugen公司首先開發出了VEGFRTK抑制劑SU5416后，以VEGFR-2胞內部分的酪氨酸激酶為靶點設計及篩選小分子化學藥物(TKI)成為一個研究的熱點。其中最為引人注目的是索拉非尼和舒尼替尼。由于VEGFRTKI藥物的這些優點，因此開發以VEGFRTK為耙點的高通量藥物篩選試劑盒具有巨大的意義。目前，實際應用多采用RIA及ELISA等技術建立以VEGFRTK為靶點的高通量藥物篩選模型。RIA具有高度的特異性、靈敏度和實用性，但該方法存在放射性污染、半衰期短及試劑盒穩定性差等問題，而ELISA重復性和靈敏度較差，同時以上兩種方法耗時長，操作復雜。因此基于常規方法進行藥物篩選限制了篩選效率和篩選規模。光激化學發光檢測技術(LICLIA)是以納米級高分子微粒為基礎的新一代檢測技術，該項技術將被廣泛地應用于研究生物分子的相互作用。其主要原理是由光激發產生的均相化學發光技術。它具有快速、均相(免沖洗)、高靈敏和操作簡單的特點。LICLIA試劑由含有感光化合物的感光微粒和含有發光化合物的發光微粒組成，微粒直徑約188nm，表面覆蓋多糖水凝膠。水凝膠能減少非特異性結合，同時，增加微粒的懸浮性。微粒通過水凝膠表面的功能團與生物分子共價連接。納米級微粒大大增加了反應的表面積，每個微粒的表面包被著成百上千個生物分子，可捕獲目標分子。LICLIA技術的核心原理是單線態氧的產生和傳遞。在受到紅色激光(680nm)照射后，感光微粒能使周圍環境中的氧轉化為單線態氧，單線態氧的生存時間僅為4微秒。短暫的生存時間決定了單線態氧的傳播直徑很小(約為200nm)。如果發光微粒在200nm范圍之內就能接受單線態氧，并發出高能級的光(520nm-620nm)。相反，如果在200nm直徑范圍內沒有發光微粒，單線態氧就會回落到基態氧而沒有信號產生。這種依賴于兩種微粒相互接近的化學能量傳遞是LICLIA均相反應的基礎。通常在該反應體系中，微粒的濃度是很低的。兩種微粒相互隨機碰撞的幾率很低，因此，反應體系的本底非常微弱。如果包被在微粒表面的生物分子相互作用，拉近了兩個微粒的距離，形成免疫夾心或受體-配體復合物，這樣就便于產生能量的有效傳遞并發出光信號。
發明內容本發明的目的在于制備一種針對血管內皮生長因子受體_2的光激化學發光藥物篩選試劑盒，用于針對血管內皮生長因子受體-2的高通量藥物篩選。本發明原理為將含有PolyE4Y發光微粒、VEGFR-2激酶和ATP的反應緩沖液加到微孔板，加樣品稀釋緩沖液及樣品溶液，振蕩孵育；順序加入PY99單抗、生物素化羊抗鼠抗體避光反應，再加入包被有鏈霉親和素的感光微粒孵育后檢測。PolyE4Y在VEGFR-2激酶及ATP的作用下磷酸化，有拮抗作用的樣品抑制這種磷酸化反應；磷酸化的PolyE4Y與PY99單抗結合，再與生物素化羊抗鼠抗體及感光微粒形成復合體，光激發下通過單線態離子氧將能量傳遞給發光微粒產生熒光，用光激化學發光檢測儀檢測，計算樣品的IC50。本發明的技術方案一種針對血管內皮生長因子受體-2(VEGFR-2)的光激化學發光藥物篩選試劑盒，由白色不透明微孔板(1)，連接PolyE4Y人工多肽的發光微粒(2)，VEGFR-2激酶(購于CST)(3)，金屬離子反應緩沖液(4)，三磷酸腺苷(ATP)(5mmol/L)(5)，鼠抗磷酸化酪氨酸單抗凍干品(PY99)(購于SantaCruz)(6)，生物素化羊抗鼠抗體凍干品(購于華美生物)(7)和包被有鏈霉親和素的感光微粒(購于博陽生物)(8)組成。連接PolyE4Y人工多肽的發光微粒(2)的制備在離心管中加入lmg發光微粒(購于博陽生物)，加入由12.5iiL、l%Tween-20配制的0.05mgPolyE4Y人工多月太(購于Sigma)溶液，加入25mg/mL硼氫化氰鈉溶液lOyL，用pH6.0、0.lmol/L的2_(N_嗎啉)乙磺酸(MES)緩沖液將體積補充到200iiL，37。C避光振蕩反應48h，加入pH5.0、0.3mol/L的羧甲氧基胺半鹽酸鹽(CM0)溶液10iiL封閉未結合位點，37t:避光孵育lh，離心，分離得到已連接PolyE4Y人工多肽的發光微粒，稀釋后備用。金屬離子反應緩沖液(4)的配制金屬離子反應緩沖液按照如下濃度配制，pH7.5的60mmol/LHEPES、20mmol/LMgCl2、10mmol/LMnCl2、5iimol/LNa3V0^P2mmol/LDTT混合配制而成。—種用所述的試劑盒進行高通量藥物篩選的方法，將含有PolyE4Y人工多肽的發光微粒、VEGFR-2激酶和ATP的金屬離子反應緩沖液加入到白色不透明微孔板；接著加入樣品稀釋緩沖液蒸餾水或O.5X二甲基亞砜匿S0溶液，及不同濃度的樣品溶液，室溫振蕩孵育；然后各孔順序加入PY99單抗、生物素化羊抗鼠抗體進行標記免疫反應；接著加入包被有鏈霉親和素的感光微粒進行反應后用光激化學發光檢測儀檢測光信號，以樣品稀釋緩沖液的檢測數據為陰性對照，以加入被測樣品的檢測數據計算樣品的半數抑制濃度(IC50)。所述的高通量藥物篩選的方法，操作為取含有10iig/mLPolyE4Y人工多肽的發光微粒、100ngVEGFR-2激酶和40ymol/LATP的金屬離子反應緩沖液20yL，加入到白色不透明微孔板；加入樣品稀釋緩沖液2iiL及不同濃度的樣品2iiL到各自的微孔中，室溫振蕩孵育lh;加0.2iig/mL的PY99單抗20yL;繼續加入1yg/mL生物素化羊抗鼠抗體20iiL，37t:孵育30min;加10yg/mL包被有鏈霉親和素的感光微粒175yL，37。C孵育15min后在光激化學發光檢測儀上檢測光信號，以樣品稀釋緩沖液的檢測數據為陰性對照，從檢測數據計算被測樣品的IC50值。所述的高通量藥物篩選的方法，所加入的樣品稀釋緩沖液水溶性樣品的樣品稀釋緩沖液選用蒸餾水，水溶性樣品直接用蒸餾水溶解稀釋，蒸餾水作為陰性對照；脂溶性樣品的樣品稀釋緩沖液選用0.5%匿SO溶液，脂溶性樣品用0.5%的二甲基亞砜(DMS0)溶解稀釋，0.5%的匿SO作為陰性對照。本發明的有益效果本發明用于針對血管內皮生長因子受體-2的高通量藥物篩選，試劑盒結構簡單，操作簡便、檢測時間短、靈敏度高。圖1:VEGFR-2高通量藥物篩選試劑盒示意圖。1、白色不透明微孔板，2、連接PolyE4Y人工多肽的發光微粒，3、VEGFR-2激酶，4、金屬離子反應緩沖液，5、5mmol/LATP，6、鼠抗磷酸化酪氨酸單抗凍干品PY99，7、生物素化羊抗鼠抗體凍干品，8、包被有鏈霉親和素的感光微粒。圖2:LICLIA反應示意圖。圖3:VEGFR-2激酶活性檢測曲線圖。具體實施例方式實施例l試劑盒的制備發光微粒、包被有鏈霉親和素的感光微粒購于博陽生物科技(上海)有限公司。包被有PolyE4Y人工多肽的發光微粒制備在離心管中加入lmg發光微粒，加入由12.5iiL、l%Tween-20配制的0.05mgPolyE4Y人工多肽溶液，加人25mg/mL硼氫化氰鈉溶液10yL，用pH6.0、0.lmol/L的2_(N_嗎啉)乙磺酸MES緩沖液將體積補充到200yL，37。C避光振蕩反應48h，加入pH5.0、0.3mol/L的羧甲氧基胺半鹽酸鹽CM0溶液10yL封閉未結合位點，37t:避光孵育lh后離心，分離得到已連接PolyE4Y人工多肽的的發光微粒，1:100稀釋后備用。金屬離子反應緩沖液的配制由pH7.5的60mmol/LHEPES、20mmol/LMgCl2、10mmol/LMnCl2、5iimol/LNa3V04禾P2mmol/LDTT混合配制而成。試劑盒的組成(1)、白色不透明微孔板(12條X8L可以拆分為單孔)。(2)、1X包被有PolyE4Y人工多肽的發光微粒2mL。(3)、1XVEGFR-2激酶5iig。(4)、1X反應緩沖液(pH7.5的60mmol/LHEPES、20mmol/LMgCl2、10mmol/LMnCl2、5iimol/LNa3V04禾卩2,1/LDTT):50mL。(5)、ATP(5,1/L):20iiL。(6)、1X鼠抗磷酸化酪氨酸單抗凍干品(PY99)，用時以lmL蒸餾水溶解。(7)、1X生物素化羊抗鼠抗體凍干品，用時以2mL蒸餾水溶解。(8)、1X包被有鏈霉親和素的感光微粒20mL。測定時注意事項1、VEGFR-2激酶和ATP保存于-20。C，使用時置冰上操作。52、使用之后立即將其余試劑放回2_8°C。3、在37°。恒溫孵育過程中避免光線照射。實施例2試劑盒的應用制備的試劑盒檢測已知VEGFR-2拮抗劑SU11248及PTK787的拮抗活性。具體檢測步驟如下樣品處理將樣品SU11248及PTK787用0.5%的DMS0溶液溶解，分別稀釋至1000nmol/L，500nmol/L，250nmol/L，100nmol/L，50nmol/L，25nmol/L，10nmol/L，0nmol/L，備用。取含有10iig/mLPolyE4Y人工多肽的發光微粒、lOOngVEGFR-2激酶和40ymol/LATP的金屬離子反應緩沖液20yL，加入到白色不透明微孔板；加入樣品稀釋緩沖液2iiL及不同濃度的樣品溶液2L到各自的微孔中，室溫振蕩孵育lh;加0.2g/mL的PY99單抗20iiL;繼續加入1yg/mL生物素化羊抗鼠抗體20yL，37。C孵育30min;加10yg/mL包被有鏈霉親和素的感光微粒175iiL，37t:孵育15min后在光激化學發光檢測儀上檢測光信號，以樣品稀釋緩沖液的檢測數據為陰性對照，從檢測數據計算被測樣品的IC50值，如表1、表2所示。表lSU11248IC50(nM)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權利要求一種針對血管內皮生長因子受體-2，簡稱VEGFR-2，的光激化學發光藥物篩選試劑盒，其特征是由白色不透明微孔板(1)，連接PolyE4Y人工多肽的發光微粒(2)，VEGFR-2激酶(3)，金屬離子反應緩沖液(4)，三磷酸腺苷ATP(5)，鼠抗磷酸化酪氨酸單抗凍干品PY99(6)，生物素化羊抗鼠抗體凍干品(7)和包被有鏈霉親和素的感光微粒(8)組成。2.—種用權利要求l所述的試劑盒進行高通量藥物篩選的方法，其特征是將含有PolyE4Y人工多肽的發光微粒、VEGFR-2激酶和ATP的金屬離子反應緩沖液加入到白色不透明微孔板；接著加入樣品稀釋緩沖液蒸餾水或O.5X二甲基亞砜匿S0溶液，及不同濃度的樣品溶液，室溫振蕩孵育；然后各孔順序加入PY99單抗、生物素化羊抗鼠抗體進行標記免疫反應；接著加入包被有鏈霉親和素的感光微粒進行反應后用光激化學發光檢測儀檢測光信號，以樣品稀釋緩沖液的檢測數據為陰性對照，以加入被測樣品的檢測數據計算樣品的半數抑制濃度IC50。3.根據權利要求2所述的高通量藥物篩選的方法，其特征是操作為取含有10i!g/mLPolyE4Y人工多肽的發光微粒、100ngVEGFR-2激酶和40ymol/LATP的金屬離子反應緩沖液20iiL，加入到白色不透明微孔板；加入樣品稀釋緩沖液2iiL及不同濃度的樣品溶液2iiL到各自的微孔中，室溫振蕩孵育lh;加0.2iig/mL的PY99單抗20yL;繼續加入1yg/mL生物素化羊抗鼠抗體20iiL，37t:孵育30min;加10yg/mL包被有鏈霉親和素的感光微粒175iiL，37t:孵育15min后在光激化學發光檢測儀上檢測光信號，以樣品稀釋緩沖液的檢測數據為陰性對照，從檢測數據計算被測樣品的IC50值。4.根據權利要求2所述的高通量藥物篩選的方法，其特征是所加入樣品稀釋緩沖液水溶性樣品的樣品稀釋緩沖液選用蒸餾水，蒸餾水作為陰性對照；脂溶性樣品的樣品稀釋緩沖液選用0.5%匿S0溶液，以0.5%的匿S0作為陰性對照。全文摘要一種針對血管內皮生長因子受體-2的光激化學發光藥物篩選試劑盒，屬于光激化學發光檢測技術(LICLIA)領域。將含有PolyE4Y發光微粒、VEGFR-2激酶和ATP的反應緩沖液加到微孔板，加樣品稀釋緩沖液及樣品溶液，振蕩孵育；順序加入PY99單抗、生物素化羊抗鼠抗體避光反應，再加入包被有鏈霉親和素的感光微粒孵育后檢測。PolyE4Y在VEGFR-2激酶及ATP的作用下磷酸化，有拮抗作用的樣品抑制這種磷酸化反應；磷酸化的PolyE4Y與PY99單抗結合，再與生物素化羊抗鼠抗體及感光微粒形成復合體，光激發下通過單線態離子氧將能量傳遞給發光微粒產生熒光，用光激化學發光檢測儀檢測，計算樣品的IC50。本發明藥物篩選試劑盒結構簡單，操作簡便、檢測時間短、靈敏度高。文檔編號G01N33/52GK101713781SQ20091021342公開日2010年5月26日申請日期2009年10月27日優先權日2009年10月27日發明者張藝,徐娟,李文新,楊潤琳,王柯,黃飚申請人:江蘇省原子醫學研究所