用于隨后通過基于核酸的傳感器檢測的衍生分析物方法

專利名稱：用于隨后通過基于核酸的傳感器檢測的衍生分析物方法
技術領域：
本發明涉及衍生分析物的方法，其用于隨后通過基于核酸的傳感器的檢測，以及
本發明涉及基于上述的傳感器。
背景技術：
自從上世紀80年代晚期的體外進化原理(通過指數富集的配體系統進化，SELEX) 提出以來，已建立了大量模仿針對數量種類繁多的靶分子的具有高特異性和高親和力的合 成衍生核酸分子。最近，這類分子(即下文的功能核酸，FNAs)已經在一些領域如環境監測 分析、診斷、藥物發現和抗疾病的治療中備受關注。 —般而言，傳感器主要由兩個主要單元組成信號接收器單元和信號傳導單元。化 學接收器單元包含與樣品或者分析物相互作用的合成衍生的材料。檢測低限是通過分析物 和接收器材料之間強烈而且直接的化學或者物理相互作用來達到。另一方面，包含生物衍 生材料的生物接收器單元，通過生物接收器和分析物分子之間的特定化學或物理相互作用 而表現出特異性識別。接收器材料和分析物之間的相互作用是通過各種物理或化學參數的 變化來衡量的，并且在傳導單元內部進行處理。這種變化會被轉化成與分析物分子濃度線 性相關的可測量信號。這可通過多種參數如導電率/電阻率、電容、電流、勢能、光吸收和熒 光的變化來實現。 像抗體或者酶一樣，在生物傳感器應用于靶分子如多肽、蛋白質、DNA、 RNA或者有 機、無機分子方面，FNAs已被用作高特異性生物接收器單元。原則上，由于FNA's不存在對 預想的靶分子有關于結構、大小或狀態的限制，我們可以發展針對包括那些抗體都難以獲 得的分析物(金屬離子、毒素或者揮發性化合物)的FNAs。此外，基于FNA的傳感器還能夠 應用于蛋白接收器無效的需求(高溫、非水相或者復雜環境)。 基于FNA的傳感器在過去已經顯示出非凡的選擇性。舉例來說，目前已經發現能 夠以10， 000倍選擇性識別茶堿和咖啡因的適體，其中茶堿和咖啡因之間僅有的區別就是 兩個分子中的一個單亞甲基(US5580737)。模塊設計的FNA，其中識別結構域是與信號產生 結構域分開的，為傳感器的設計提供了更大的自由度。因此，可通過相同的傳感原理(電 的、光的、熱量測定的或者重量測定的)檢測許多靶分子。基于FNA的生物傳感器接收器單 元的從頭體外設計使得它們在復雜環境中高度特異性的確定和檢測物質成分中非常有用。
除它們顯著的優勢之外，FNAs作為一種天然的材料也表現出一些較大的缺陷。它 們通常在生理環境中受到不可忽視的降解，上述降解可被加帽或者攙入非天然核苷酸例如 spiegelmere、氟化核糖殘基和硫代磷酸(phosphorthioate)抑制，這使得它們能夠更好的 對抗水解或酶解反應，并在體內和體外傳感器應用方面具有潛在的更好的用途。
—般而言，在生物樣品的痕量分析方面，信號放大步驟對于提高靈敏度是必須的。 就FNAs作為識別元件來說，DNA核酶已被證明能夠顯示出多重轉化活性，而且還能放大讀 出的信號。在通過分析物激活后，它能夠持續激活之前處于非活化狀態的報告分子(例如 形成莖-環的DNA)。
由于每個分析物分子可產生很多報告分子，這導致了顯著的信號增強。
通過將這些FNA的特性與使用FNAs作為識別元件的傳導原理(電的、光的、熱量 測定的或者重量測定的)相結合，多肽、蛋白質、DNA、 RNA或有機和無機分子可從復雜環境 中以高特異性和靈敏度被檢測出。 許多的缺陷和不足限制了 FNAs在復雜環境中對小的、帶電的或者非極性有機或 無機分子進行傳感應用和痕量分析中作為識別元件的使用 FNAs的目標評估通常是通過SELEX過程進行的，在該過程中特定的目標分子被 固定在固相上，并且使用包含大約1014的隨機突變分子復雜性的文庫來選擇特異性的接收 器和目標之間的相互作用。然而，對于目標分子的識別效果會由于目標分析物的分子量和 化學性質而受到嚴重影響，使得幾乎不可能得到針對小的有機或無機化合物的高特異性的 FNAs。 另一個限制是基于FNA在生理條件下可被快速降解的事實。當操作是在RNA/DNA 能夠被水解或者受到酶解的條件下中進行時，這種降解限制了 FNAs作為識別單元在生物 傳感器中的使用操作時間。為了克服上述缺陷，通常使用非天然核苷酸，例如spiegelmere、 氟化核糖殘基和硫代磷酸，這意味著復雜而昂貴的合成方法的使用，而且結果并不滿足對 選擇性和靈敏性傳感器應用所必要的需求。 現有技術中，DNA核酶放大的分子信標信號的讀出是通過熒光報告分子實現的。這 需要復雜的照明、光學和檢測系統，因而這些系統無法容易地被植入到小型設備中。

發明內容
因此，本發明的一個目的就是提供一種增加基于核酸的傳感器靈敏度的改進的方 法，特別是用于小分析物的傳感器。 所有這些目標都是通過衍生分析物的方法來實驗的，所述方法是為隨后對所述分 析物進行檢測而進行的，所述檢測是通過基于核酸對所述衍生分析物的特異性識別的傳感 器進行的，所述方法包括-以任何順序提供，具有第一官能團的分析物，以及具有第二官能團的衍生試劑， 其中所述第一和第二官能團能夠相互反應以在所述分析物和衍生試劑之間形成鍵，所述的 衍生試劑進一步具有允許在所述衍生試劑和所述核酸之間進行堿基堆積或形成氫鍵的取 代基，-使所述衍生試劑和所述分析物進行反應以形成衍生分析物。 在一個實施方案中，所述分析物是分子量在l-500Da范圍內，優選在10_300Da范
圍內，更優選在50-250Da范圍內的分子。 在一個實施方案中，所述第一官能團選自苯基、醇、酮、醛、羧酸、羧酸酯、醚、環氧 化物、硫醇、胺、酰胺和鹵化物。 在一個實施方案中，所述第二官能團選自醛、異硫氰酸酯、活化酯、馬來酰亞胺、碘 乙酰胺、苯汞基團、三嗪、肼、羥胺和二醛。 在一個實施方案中，所述取代基團選自吡啶，嘌呤，芳香胺，酰胺，羧酸，含有酪氨 酸、色氨酸和/或苯丙氨酸的多肽。 在一個實施方案中，所述的衍生分析物的分子量在50-10， OOODa范圍內，優選在100-5000Da范圍內，更優選在250-2000Da范圍內。 在一個實施方案中，本發明的方法進一步包括通過傳感器檢測所述衍生分析物的 步驟，其中所述傳感器基于核酸對所述衍生分析物的特異性識別。 在一個實施方案中，本發明的方法進一步包括在檢測前對所述衍生分析物進行排 阻過程，從而將分子量> 10，000Da的分子從所述衍生分析物中分離的步驟，優選利用半透 膜，其中所述半透膜僅允許分子量< 10，000Da的分子從所述膜的第一側穿過到與所述第 一側相對的所述膜的第二側。 本發明的目標也可以通過檢測分析物的傳感器來實現，分析物優選為根據權利要 求1-8中任一項所述的方法制備的衍生分析物，所述傳感器是基于核酸對所述分析物的特 異性識別，所述傳感器包含檢測室包括，該檢測室包括 a)第一核酸，其能夠特異性識別并結合分析物，例如衍生分析物，所述的第一核酸 包括-可激活的酶結構域，所述酶結構域處于非活化狀態，具有位點特異性的核酸切割 活性，-能特異性識別并結合分析物的分析物結合結構域-連接所述可激活的酶結構域和所述分析物結合結構域的通信結構域，其中所述 可激活的酶結構域在所述分析物結合到所述分析物結合結構域上時被由非活化狀態激活 為活化狀態。 b) —套可連接到電源上的至少第一和第二電極， c)第二核酸，其具有部分雙鏈結構而且包括能夠結合所述第二核酸的嵌入性、氧
化還原活性的化合物，所述化合物或者是在其非結合狀態下電化學可檢測并且在結合狀態
下電化學無法檢測，或者所述化合物是在結合狀態下電化學可檢測并且在非結合狀態下電
化學無法檢測，其中所述第二核酸進一步包括能夠被所述處于活化狀態的第一核酸的所述
酶結構域識別的切割位點，其中在所述的切割位點被切割之后，所述嵌入性氧化還原活性
化合物在結合在所述第二核酸上時，會從所述的第二核酸上被釋放出來。 在一個實施方案中，所述第一核酸是DNA核酶，優選選自8-17DNA核酶和10-23DNA
核酶。如本文中所使用的，術語"DNA核酶(DNAzyme)"意指具有催化活性的DNA，該術語
在使用中與"酶性DNA(DNA ezyme)"同義。關于這類DNA核酶(酶性DNA)的綜述可在
例如S. W. Santoro， G.F.Joyce, Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 94 (1997) ， 4262中找到。術語
"8-17DNA核酶"和"10-23DNA核酶"，如本文中所使用的，指前述文獻中所描述的DNA核酶。
這些術語因此也都是本領域技術人員所熟知的。 在一個實施方案中，所述的第二核酸是形成莖_環的DNA探針，優選選自具有21 個核苷酸的序列并且形成莖_環結構的核酸，例如CCTGAGAGAGrArUGGGTGCAGG其中的切割 位點以粗體強調(r代表核苷酸的來源，這里是指RNA)。 在一個實施方案中，所述嵌入性氧化還原活性的化合物選自亞甲基藍，菁藍衍生 物，吖啶衍生物，溴化乙啶，碘化丙啶，羥基脒衍生物，蒽醌衍生物，雙苯甲亞胺衍生物比如 Hoechst 34580， 33258， 33342， 二茂鐵基萘二酰亞胺，柔紅霉素，蒽醌二磺酸，Co (bpy) 33+和 Co (phen)^+，其中bpy是聯吡啶，以及其中phen是1， 10-鄰菲咯啉。
在一個實施方案中，所述的傳感器具有下列結構之一
6
a)所述第一核酸結合到至少一個所述電極的表面，所述第二核酸處于覆蓋、接觸 或者環繞所述表面的溶液中，其中，將被認為包含分析物的樣品加入到所述溶液中，用于檢 b)所述第二核酸結合到至少一個所述電極的表面，所述第一核酸處于覆蓋、接觸 或者環繞所述表面的溶液中，其中，將被認為包含分析物的樣品加入到所述溶液中，用于檢 c)所述第一和第二核酸都處于覆蓋、接觸或者環繞至少一個所述電極表面的溶液
中，其中，將被認為包含分析物的樣品加入到所述溶液中，用于檢測，或者 d)所述第一和第二核酸都結合到至少一個所述電極的表面，其中，加入被認為包
含分析物的樣品以使其與所述表面接觸，用于檢測。 在一個實施方案中，本發明的傳感器還包括一個位于所述檢測室上游的分離室， 所述分離室通過半透膜與所述的檢測室分開，所述半透膜僅允許分子量< 10，000Da的分 子從所述分離室通過，進入所述的檢測室，所述半透膜是聚合物膜，優選由纖維素、甲基纖 維素、右旋糖苷，特別是交聯的右旋糖苷、賽璐玢、聚四氟乙烯、聚酰胺、聚醚砜、聚丙烯或沸 石、氧化鋁中的一種或其組合制成的膜。 本發明的另一個目標也是通過檢測樣品中的分析物的方法來實現的，所述方法包 含以下步驟-以任何順序提供根據本發明的傳感器，以及含有分析物的樣品，特別是本發明所 述的衍生的分析物-將所述傳感器暴露于所述樣品，并且-測量電化學響應，其中所述電化學響應的存在和強度指示所述樣品中所述分析 物的存在和含量。 本發明的另一個目標是通過將本發明所述的衍生方法，或本發明所述的檢測方 法，或者本發明所述的傳感器用于醫藥和/或醫療診斷，食品質量檢測，農業檢測，爆炸物、 毒素或有害化學物質安全檢測，職業或環境監測來實現的。 如本文中所使用的，術語"基于核酸對所述分析物特異性識別的傳感器"在這里有 時候也是指"基于功能性核酸的傳感器"或者"基于FNA的傳感器"。 本發明所述的分析物優選"小分子"。這里使用的術語"小分子"是指分子量優選 在l-500Da范圍內的，更加優選在10-300Da范圍內，最優選在50-250Da范圍內的分子。
—旦分析物依據本發明所述被衍生，它的分子量優選在50-10， 000Da范圍內，更 優選在100-5000Da范圍內，最優選在250-2000Da范圍內。盡管這樣的衍生過程在抗體制備 方面是已知的，就發明人所知，這樣的衍生還沒有被用于提高基于核酸的傳感器的靈敏度。
在本發明所述的傳感器的一個實施方案中，第一核酸能夠特異性識別并結合分析 物并且包含分析物可激活的酶結構域，能夠特異性識別并結合分析物的分析物結合域，以 及連接所述可激活的酶結構域和所述分析物結合結構域的通信結構域。而且，傳感器包含 具有部分雙鏈結構的第二核酸，以及包含與所述第二核酸結合的嵌入性氧化還原活性的化 合物。這類第二核酸優選是形成莖-環的DNA。這里使用的術語"形成莖-環的DNA"是指 能夠報告溶液中特定核酸的存在或其活性的核酸，并且它在給定條件下能夠形成莖_環結 構。根據本發明，形成莖_環的DNA包含嵌入性、氧化還原活性的化合物和被分析物激活的
7第一核酸的酶結構域特異性識別的切割位點。在切割了切割位點之后，嵌入性、氧化還原活 性的化合物就結合到形成莖_環的DNA上，或者更普遍的是第二核酸釋放到溶液中，變成電 化學可檢測的，或者失去其可檢測性，這取決于設置(參見圖4-6)。 第一核酸優選的實例是DNA核酶，更優選的是以下序列5' -GCGTCCTTCAGAGAGAGT GGGTGCTTTTGCACCCAGGCTAGCTACAACGACTCTCTC-3'，其中粗體字母代表了酶活性結構域。
本發明所述第二核酸的優選實例是形成莖_環的DNAs，或者形成 莖-環的DNA探針，其選自具有21個核苷酸并且形成莖-環結構的的序列，例如 CCTGAGAGAGrArUGGGTGCAGG-3'，其中的切割位點以粗體強調(r代表核苷酸的來源，這里指 RNA ;參見例如Tian Y. ， Mao C. ， Talanta 67 (2005) ， 532)。 —般本發明所述的基于FNA的接收器單元可以包括天然或者合成材料，具體如 下 含有天然或非天然核苷的RNA/DNA，適體，核酶，適體酶，DNA核酶，PNA (肽核酸)
本發明還公開了通過衍生試劑將小分子轉化成在FNA識別通路中更易感知的分 子的技術方案。其可允許使用帶有FNA單元作為中心識別元件的傳感器對于多種來源例如 固體、液體、氣體和它們的混合物產生或者發出的小分子進行檢測。特異性反應可在分析物 分子和衍生試劑之間直接產生，或者也可通過第三類有機/無機分子，多肽、酶、DNA/RNA催 化產生。所述衍生方法也可將目標分子從其自然狀態和環境(固體、液體、氣體)轉化成傳 感材料本身(主要是液相)。(參見圖1，圖示1) 然而，FNA接收器必須特異性地只和衍生分析物反應。它們不能顯示對于非衍生 分析物或者衍生分子本身任何或者至少顯著降低的敏感性。 令人驚異的是，由于增強的化學和物理作用力，隨著衍生后的分子之間的相似性 顯著增加，FNAs識別的特異性也顯著增加了。而這與傳統檢測方法中分子之間的相似度實 際上降低識別的特異性相矛盾。


另外，參考附圖，其中 圖1顯示通過核酸(圖示1)被衍生試劑("分子輔因子")所衍生的小分子分析 物("小靶標")的特異識別，衍生反應的實施方案(圖示2)，以及本發明所述的分子大小 排阻過程(圖示3所示的實施方案)； 圖2顯示本發明所述的第一核酸的實施方案；圖2中的"配體"可以是例如按照本 發明所述方法產生的衍生后的分析物； 圖3顯示使用本發明所述第一和第二核酸的檢測反應；第一核酸是在結合到分析 物例如衍生分析物之后，會被激活的DNA核酶；第二核酸是包含氧化還原活性嵌入劑的形 成莖_環的DNA。第二核酸被活化的第一核酸切割，并釋放出嵌入劑。 圖4-6顯示本發明所述的各種結構的傳感器的實施方案，其中形成莖_環的DNA 帶有嵌入劑并且電極表面既可以具有互相排斥的相互作用也可以具有互相吸引的相互作 用。 另外參考以下實施例，所述實施例僅用于解釋本發明，并不構成對本發明的限制。
具體實施方式

實施例 a)本發明所述的分析物/小分子是具有低分子量(優選在l-500Da范圍內，更加 優選在10-300Da范圍內，最優選在50-250Da范圍內)的分子且具有以下分類的第一官能
團 脂肪族或者芳族伯胺、仲胺、單胺、二胺、三胺
脂肪族或者芳族單硫醇、二硫醇、三硫醇
脂肪族或者芳族單醇、二醇、三醇
脂肪族或者芳族單酮、二酮、三酮
脂肪族或者芳族單醛、二醛、三醛
脂肪族或者芳族單羧酸、二羧酸、三羧酸
脂肪族或者芳族單羧酸酯、二羧酸酯、三羧酸酯
脂肪族或者芳族單醚、二醚、三醚 脂肪族或者芳族單環氧化物、二環氧化物、三環氧化物 脂肪族或者芳族單鹵化物、二鹵化物、三鹵化物 以及它們的混合物。 衍生試劑可以例如是 取代的醛，異硫氰酸，活化酯 取代的馬來酰亞胺，碘乙酰胺，苯基汞化合物 二氯三嗪，肼，羥胺 正二醛 分析物分子衍生反應的典型實例是伯胺和芳香醛之間形成席夫氏堿 (schiffsbase)的反應(參見圖1，圖示2) 衍生試劑的取代基結構允許其與FNA分子之間發生特異性反應以最大化信號的 傳導。這可以通過堿基堆積或氫鍵形成來實現。
取代基可以例如是 單環或多環芳族化合物和諸如吡啶、嘌呤、嘧啶、苯基呋喃、苯并咪唑、吲哚、苯并
噁唑、噴唑及它們的衍生物的芳香雜環化合物， 芳香胺，酰胺羧酸，禾口 含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸的小肽 進一步來說，根據本發明，那些能夠快速降解DNA/RNA的酶(DNase， RNase)被排 除在識別單元和分析物分子相互作用的區域之外。例如RNase的分子量在40-80kDa，而指 定的分析物分子量不大于50-10， OOODa。目前已有很多技術可以用于分離包含大分子分散 物的分子混合物，例如薄層多孔聚合物膜(乙基纖維素)已廣泛應用于從蛋白質溶液中除 去小分子的蛋白質純化。與FNA相連的上游包括接收器單元，這些膜必須具有從有酶活性 的分子中分離出分析物，并且阻止基于傳感器分子的FNA快速降解的能力(參見圖l，圖示 3)。 聚合物可以例如由下列材料之一制成
-纖維素，甲基纖維素
9
-交聯右旋糖苷
-賽璐玢
-聚四氟乙烯
-聚酰胺
_聚醚砜
_聚丙烯
-沸石
-氧化鋁， 此外，本發明使用電化學信號讀出的方式來克服熒光檢測所必需的復雜系統設置 問題。基于這個原因，帶有嵌入性氧化還原活性的化合物，并且具有DNA核酶介導的酶切所 針對的特定限制性酶切位點的形成莖-環的DNA與帶有負電荷的電極共同使用。在未被切 割的狀態下，帶有負電荷并且載有氧化還原活性化合物的形成莖-環的DNA受到電極帶有 負電荷的表面的排斥，因而無法檢測到信號。分析物激活的DNA核酶的切割作用會釋放出 具有氧化還原活性嵌入劑，并在電極表面發生氧化還原反應，所述氧化還原反應將產生可 讀出的信號(參見圖3，圖示5)。由于DNA核酶具有多重轉化活性，許多帶有嵌入劑的形成 莖-環的DNAs可以被由單個分析物激活的DNA核酶切割(參見圖2，圖示4)。這通過放大
作用顯著增加了讀出信號，并最終提高了傳感器的靈敏度。
可用的DNA核酶的實例有8-17DNA核酶10-23DNA核酶嵌入性氧化還原活性的化合物的實例有亞甲基藍菁藍衍生物吖啶衍生物溴化乙啶碘化丙啶羥基脒衍生物蒽醌衍生物雙苯甲亞胺衍生物比如Hoechst 34580,33258,33342，二茂鐵基萘二酰亞胺，柔紅霉素蒽醌二磺酸Co (bpy) 33+Co (phen) 33+可用的電極材料的實例有金屬氧化物(Zn0，Sn02，Ti02…)，金屬(Au， Ag， Pt， Pd...)，導電性聚合物(碳糊，
聚苯胺，多吡咯，聚噻吩)
根據本發明所述的可能的傳感器結構實施例的實例有
:0119] 出于信號傳導的目的，傳感器元件有4種可能的結構(參見圖4-6，圖示6)。其中的兩個具有"信號打開"構造，另兩個具有"信號關閉"構造。 -FNA結合在電極表面。衍生分析物和載有氧化還原活性嵌入劑的形成莖_環的 DNA都在溶液中。由于電極和莖_環結構DNA之間的空間位阻或電學阻礙，來自嵌入劑的信 號受到抑制。在FNA激活后，具有氧化還原活性嵌入劑就會被釋放出來，而且由于嵌入劑分 子通過化學或物理吸附作用吸附到電極上，使得信號的增強可被檢測(信號打開)(1)(圖 5)。-載有氧化還原活性嵌入劑的形成莖_環的DNA結合在電極表面(通過化學或物 理吸附)。衍生分析物和FNA都在溶液中，在FNA被激活后，具有氧化還原活性嵌入劑就會 被釋放出來，信號的減弱在電極上可被檢測(信號關閉)(2)(圖5)。 -FNA，衍生分析物和載有氧化還原活性嵌入劑的形成莖_環的DNA都處于溶液中。
由于電極和形成莖-環的DNA之間的空間位阻或電學阻礙，來自嵌入劑的信號受到抑制。在
FNA被激活后，具有氧化還原活性嵌入劑就會被釋放出來，而且由于嵌入劑分子通過化學或
物理吸附作用吸附到電極上，使得信號的增強可被檢測(信號打開)(3)(圖6)。 -FNA和載有氧化還原活性嵌入劑的形成莖-環的DNA都通過化學或物理吸附作用
吸附到電極上。在FNA被激活后，具有氧化還原活性嵌入劑就會被釋放出來，信號的減弱在
電極上可被檢測(信號關閉)(4)(圖6)。 本發明所述的方法和傳感器對于使小分子可用基于核酸的傳感器進行檢測提供 了一種獨特的方法學。其也為利用基于核酸的傳感器以高度特異性和選擇性在復雜環境中 (氣相，液相)追蹤小分子提供了可能。另外，本發明允許設計可適用于許多分析物的傳感 器策略。其通過包含分子大小排阻步驟進一步抑制核酸降解。本發明所述信號的增強通過 使用特定的衍生技術和使用形成莖-環的DNA樣的第二核酸的放大手段以及隨后的電化學 檢測來實現。 本發明的說明書、權利要求書和/或隨后的附圖中公開的技術特征，既可以分開， 也可以以任意方式組合，用作以多種方式實現本發明的材料。序列表〈110〉索尼公司〈120〉用于隨后通過基于核酸的傳感器檢測的分析物衍生方法〈130>FB20740〈160>2〈170>PatentIn version 3.3〈210>1〈211>57〈212>DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223>DNA核酶〈400>1gcgtccttca gagagagtgg gtgcttttgc acccaggcta gctacaacga ctctctc 57〈210>2
〈211>21〈212>DNA〈213〉人工〈220〉<223>形成莖-環的DNA〈220〉〈221〉misc feature〈222>(11). (12)〈223>RNA殘基〈400>2CCtgElg卿g augggtgc3g g
權利要求
衍生分析物用于隨后通過傳感器對所述分析物進行檢測的方法，所述傳感器基于核酸對所述衍生分析物的特異性識別，所述方法包括-以任何順序提供，具有第一官能團的分析物，以及具有第二官能團的衍生試劑，其中所述第一和第二官能團能夠相互反應以在所述分析物和衍生試劑之間形成鍵，所述衍生試劑進一步具有允許在所述衍生試劑和所述核酸之間進行堿基堆積或形成氫鍵的取代基，-使所述衍生試劑和所述分析物進行反應以生成衍生分析物。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中所述分析物是分子量在l-500Da范圍內，優選在 10-300Da范圍內，更加優選在50-250Da范圍內的分子。
3. 根據權利要求1-2中任一項所述方法，其中所述第一官能團選自苯基、醇、酮、醛、羧 酸、羧酸酯、醚、環氧化物、硫醇、胺、酰胺和鹵化物。
4. 根據權利要求1-3中任一項所述方法，其中所述第二官能團選自醛、異硫氰酸酯、活 化酯、馬來酰亞胺、碘乙酰胺、苯汞基團、三嗪、肼、羥胺和二醛。
5. 根據權利要求1-4中任一項所述方法，其中所述取代基選自吡啶，嘌呤，芳香胺，酰 胺，羧酸，含有色氨酸、酪氨酸和/或苯丙氨酸的多肽。
6. 根據前述任一項權利要求所述的方法，其中所述衍生分析物的分子量在 50-10， 000Da范圍內，優選在100-5000Da范圍內，更加優選在250-2000Da范圍內。
7. 根據前述任一項權利要求所述的方法，其進一步包括通過傳感器檢測所述衍生分析 物的步驟，其中所述傳感器基于核酸對所述衍生分析物的特異性識別。
8. 根據前述任一項權利要求所述的方法，其進一步包括在檢測前對所述衍生分析物進 行排阻過程，從而將分子量> 10，000Da的分子從所述衍生分析物中分離的步驟，優選利用 半透膜，其中所述半透膜僅允許分子量< 10，000Da的分子從所述膜的第一側穿過到與所 述第一側相對的所述膜的第二側。
9. 用于檢測分析物的傳感器，所述分析物優選為根據權利要求1-8中任一項所述的方 法制備的衍生分析物，所述傳感器是基于核酸對所述分析物的特異性識別，所述傳感器包 含檢測室，該檢測室包括a) 第一核酸，其能夠特異性識別并結合分析物，例如衍生分析物，所述第一核酸包括 -可激活的酶結構域，所述酶結構域處于活化狀態，具有對核酸的位點特異性切割活性，_能夠特異性識別并結合分析物的分析物結合結構域，-連接所述可激活的酶結構域和所述分析物結合結構域的通信結構域，其中所述可激 活的酶結構域在所述分析物結合到所述分析物結合結構域上后，被由非活化狀態激活為活 化狀態，b) —套可連接到電源上的至少第一和第二電極，c) 第二核酸，其具有部分雙鏈結構而且包括能夠結合所述第二核酸的嵌入性氧化還原 活性的化合物，所述化合物或者在其非結合狀態下電化學可檢測并且在結合狀態下電化學 無法檢測，或者所述化合物在結合狀態下電化學可檢測并且在非結合狀態下電化學無法檢 測，其中所述第二核酸進一步包括能夠被所述處于活化狀態的第一核苷酸的所述酶結構域 識別的切割位點，其中在所述切割位點被切割之后，所述嵌入性氧化還原活性化合物在結 合在所述第二核酸上時，會從所述第二核酸上釋放出來。
10. 根據權利要求9所述的傳感器，其中所述第一核酸是DNA核酶，優選選自8-17DNA核酶和10-23DNA核酶。
11. 根據權利要求9-10中任一項所述的傳感器，其中所述第二核酸是形成莖-環的DNA探針，優選選自具有21個核苷酸并且形成莖環結構的核酸，例如CCTGAGAGAGrArUGGGTGCAGG 。
12. 根據權利要求9-11中任一項所述的傳感器，其中所述嵌入性氧化還原活性的化合 物選自亞甲藍，菁藍衍生物，吖啶衍生物，溴化乙啶，碘化丙啶，羥基脒衍生物，蒽醌衍生物，雙苯甲亞胺衍生物比如Hoechst 34580， 33258， 33342， 二茂鐵基萘二酰亞胺，柔紅霉素，蒽醌二磺酸，Co (bpy) 33+和Co (phen) 33+，其中bpy是聯吡啶，以及其中phen是1， 10-鄰菲咯啉。
13. 根據權利要求9-12中任一項所述的傳感器，其中所述傳感器具有下列之一的結構a) 所述第一核酸結合到至少一個所述電極的表面，所述第二核酸處于覆蓋、接觸或者環繞所述表面的溶液中，其中，將被認為包含分析物的樣品加入到所述溶液中，用于檢測；b) 所述第二核酸結合到至少一個所述電極的表面，所述第一核酸處于覆蓋、接觸或者環繞所述表面的溶液中，其中，將被認為包含分析物的樣品加入到所述溶液中，用于檢測；c) 所述第一和第二核酸都處于覆蓋、接觸或者環繞至少一個所述電極表面的溶液中，其中，將被認為包含分析物的樣品加入到所述溶液中，用于檢測；或者d) 所述第一和第二核酸都結合到至少一個所述電極的表面，其中，加入被認為包含分析物的樣品以使其與所述表面接觸，用于檢測。
14. 根據權利要求9-13中任一項所述的傳感器，其進一步包括位于所述檢測室上游的分離室，所述分離室通過半透膜與所述檢測室分開，所述半透膜僅允許分子量< 10， 000Da的分子從所述分離室通過，進入所述檢測室，所述半透膜是聚合物膜，優選由纖維素、甲基纖維素、右旋糖苷，特別是交聯右旋糖苷、賽璐玢、聚四氟乙烯、聚酰胺、聚醚砜、聚丙烯或沸石、氧化鋁中的一種或其組合制成的膜。
15. 檢測樣品中的分析物的方法，其包括以下步驟_以任何順序提供根據權利要求9-14中任一項所述的傳感器，以及含有分析物的樣品，特別是根據權利要求1-8中任一項的衍生分析物，_將所述傳感器暴露于所述樣品，并且-測量電化學響應，-其中所述電化學響應的存在和強度指示所述樣品中所述分析物的存在和含量。
16. 權利要求9-14中任一項所述的傳感器或者權利要求1-8或14中任一項所述的方 法在醫藥和/或醫療診斷，食品質量檢測，農業檢測，爆炸物、毒素或有害化學物質安全檢測，職業或環境監測中的應用。
全文摘要
用于隨后通過基于核酸的傳感器檢測的衍生分析物方法。本發明涉及衍生分析物的方法，其用于隨后通過基于核酸的傳感器的檢測，以及本發明涉及基于上述的傳感器。
文檔編號G01N27/00GK101724695SQ200910211650
公開日2010年6月9日 申請日期2009年9月30日 優先權日2008年10月6日
發明者G·內爾斯, I·霍斯帕克, J·厄爾默, M·休爾科 申請人:索尼株式會社