專利名稱：急性冠狀動脈綜合癥的生物標志物檢測法及診斷試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種體外診斷檢測方法及診斷試劑盒，特別是涉及多種急性冠狀動脈 綜合癥的生物標志物的液相芯片聯合并行檢測方法及其診斷試劑盒。
背景技術：
急性冠狀動脈綜合癥(Acute Coronary Syndrome，ACQ是以冠狀動脈粥樣硬化斑 塊不穩定為基本病理生理特點，以急性心肌缺血為共同特征，以胸痛為典型癥狀的一組臨 床綜合征。ACS是臨床上大多數心血管疾病患者就診和猝死的主要原因，嚴重危害人類的生 命健康。ACS的生物標志物(以下可簡稱為“ACS標志物”)不僅能夠準確診斷急性冠狀動 脈綜合癥，評價其嚴重程度，還能指導臨床治療和療效的監測，判斷急性冠狀動脈綜合癥的 預后。因此各種不同類型的ACS標志物的聯合并行檢測已成為必然，而多指標并行檢測的 高通量迅速性、準確性和穩定性就更加至關重要。肌酸激酶同工酶-MB (CK-MB)由于組織特異性好，一直被認為是診斷ACS的“金標 準”。近年來研究發現的與ACS相關的生物標志物還包括心肌肌鈣蛋白T(cTnT)、心肌肌鈣 蛋白I(cTnl)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心臟脂肪酸結合蛋白(H-FABP)、肌紅蛋白(Myo)、 髓過氧化物酶(MPO)等。目前，對于ACS標志物的測定已有多種檢測方法，包括免疫熒光分析、酶聯免疫分 析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、磁分離酶聯免疫分析(EIMA)等。但是這些技術一次只能 針對一種標志物進行檢測，且操作繁瑣、靈敏度較差，不能真正滿足臨床診斷檢測的需要。 而固相生物芯片技術存在著可重復性差、靈敏度不夠好以及操作繁瑣的缺點。液相芯片技術(xMAP)是一種可廣泛應用于蛋白質、基因、受體/配體等多種生物 反應的生物芯片技術平臺，主要包括微球、探針分子、被檢測物和報告分子四種成分。在微 球的制造過程當中，摻入了兩種不同的紅色分類熒光，根據這兩種熒光的比例不同，把球形 基質分為100種，可以標記上100種不同的探針分子，能同時對一個樣品中多達100種不同 的目標分子進行檢測。反應過程中，探針和報告分子都分別與目標分子特異性結合。反應 結束后，使單個的微球通過檢測通道，使用紅、綠雙色激光同時對微球上的紅色分類熒光和 報告分子上的綠色報告熒光進行檢測，可確定所結合的檢測物的種類和數量。本發明基于液相芯片技術的高靈敏度、高通量、檢測迅速等突出優點，對ACS的多 種生物標志物進行并行檢測，能夠在臨床檢測上得到更好的應用。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種用于急性冠狀動脈綜合癥生物標志物的 液相芯片聯合并行檢測方法及其診斷試劑盒，該檢測方法及試劑盒包括針對cTnT、cTnl、 CK-MB、H-FABP、Myo、MPO六種ACS標志物的聯合并行檢測，具有高靈敏度、高特異性、穩定性 好、檢測迅速等優點。為解決上述技術問題，本發明的一種急性冠狀動脈綜合癥生物標志物的液相芯片聯合并行檢測方法，包括以下步驟(1)將不同編號的、表面羧基修飾的微球(Beads，編號分別為11、15、21、33、35、 37)活化后，使相應的捕獲抗體(抗ACS標志物的抗體)與相應的微球偶聯，形成“捕獲抗 體-微球” 二聯復合體，所述的每一種捕獲抗體分別抗一種ACS標志物，從而使待測樣品中 的ACS標志物與捕獲抗體形成“ACS標志物-捕獲抗體-微球”三聯復合體；(2)將不同的檢測抗體進行生物素(Biotin)標記，其中所述的每一種檢測抗體分 別抗一種ACS標志物且對應于捕獲抗體，并與捕獲抗體分別結合于該標志物的不同抗原表 位；(3)將步驟(1)形成的三聯復合體與步驟O)中的含有生物素標記的檢測抗體混 合，從而形成“生物素標記的檢測抗體-ACS生物標志物-捕獲抗體-微球”四聯復合體；(4)將步驟(3)中的四聯復合體與鏈霉親和素-藻紅蛋白(Mi^ptavidin-PE)結 合后，檢測出不同微球的熒光信號，從而確定待檢測樣品中各種ACS標志物的存在及含量。以上所述檢測方法，還包括步驟將步驟中測定的可檢測熒光信號與標準曲 線進行比較，從而確定待檢測樣品中各種ACS標志物的含量。所述的微球是平均直徑為5.6 μ m，且結合了不同熒光染料的聚苯乙烯微球，即色 彩編碼微球(color-coded beads)。所述步驟(1)中的微球活化是指微球在由1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙 基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)溶液、N-羥基硫代琥珀酰亞胺(S-MB)溶液和活化緩沖液組成的 3者混合液中進行活化，其中，3者混合液的用量比是當微球數量為2. 5X IO6個時，需要 50mg/mlEDC 溶液 10 μ 1 50mg/mlS_NHS 溶液 10 μ 1 IOOmM NaH2PO4, ρΗ6. 3 的活化緩沖 液80 μ 1，混合液的用量可以根據微球的數量進行相應的調整。所述的捕獲抗體和檢測抗體是針對以下6種可以自由組合的ACS標志物的捕獲抗 體和檢測抗體cTnT, cTnl, CK-MB, H-FABP, Myo, ΜΡ0。檢測方法中所述的步驟(4)中用液相芯片法(xMAP)進行檢測，所述的可檢測熒光 信號是紅色激光激發的微球上的紅色分類熒光信號和綠色激光激發的藻紅蛋白所產生的 報告熒光信號。本發明另一個解決的問題是，提供一種檢測多種急性冠狀動脈綜合癥生物標志物 的診斷試劑盒，主要包括以下組分(1)偶聯抗體的微球含有6種偶聯了捕獲抗體的羧基微球(微球編號為11，15， 21，33，35，37)，即分別是偶聯了 cTnT捕獲抗體的微球11，偶聯了 cTnl捕獲抗體的微球 15，偶聯了 CK-MB捕獲抗體的微球21，偶聯了 H-FABP捕獲抗體的微球33，偶聯了 Myo捕獲 抗體的微球35，偶聯了 MPO捕獲抗體的微球37，每種捕獲抗體分別抗一種ACS標志物并且 偶聯于不同編號的微球，形成“捕獲抗體-微球”的二聯復合體；(2)生物素標記的檢測抗體含有生物素標記的cTnT檢測抗體，生物素標記的 cTnl檢測抗體，生物素標記的CK-MB檢測抗體，含有生物素標記的H-FABP檢測抗體，含有生 物素標記的Myo檢測抗體，含有生物素標記的MPO檢測抗體，其中，所述的每一種檢測抗體 分別抗一種相應的ACS標志物且對應于捕獲抗體，并與捕獲抗體分別結合于該生物標志物 的不同抗原表位；
(3)鏈霉親和素-藻紅蛋白(Mi^ptavidin-PE)其中鏈霉親和素可與生物素特異 性結合，形成帶藻紅蛋白(PE)熒光素標記的檢測抗體，通過液相芯片儀的綠色激光激發藻 紅蛋白進行熒光檢測；(4)標準品包含各種ACS的生物標志物(抗原)的標準品；(5)質控品包含陽性對照和陰性對照。其中所述的捕獲抗體和檢測抗體是針對以下6種可以自由組合的ACS標志物的捕 獲抗體和檢測抗體cTnT, cTnl, CK-MB, H-FABP, Myo, MPO。本發明的一種檢測急性冠狀動脈綜合癥生物標志物的診斷試劑盒可用于檢測體 外樣品中ACS標志物的存在及含量，還可用于除ACS以外的其他心腦血管疾病的診斷檢測 或預測。由于本發明利用了液相芯片技術，使檢測方法及試劑盒具有高靈敏度、高特異性、 高通量、穩定性好、檢測迅速、準確等突出優點，能夠對多種急性冠狀動脈綜合癥的生物標 志物同時進行定性和定量檢測，能在臨床檢測上得到更好的應用。
下面結合附圖與具體實施方式
對本發明作進一步詳細的說明圖1是本發明中檢測ACS患者與正常對照組中cTnT的濃度分布圖；圖2是本發明中檢測ACS患者與正常對照組中cTnl的濃度分布圖；圖3是本發明中檢測ACS患者與正常對照組中CK-MB的濃度分布圖；圖4是本發明中檢測ACS患者與正常對照組中H-FABP的濃度分布圖；圖5是本發明中檢測ACS患者與正常對照組中Myo的濃度分布圖；圖6是本發明中檢測ACS患者與正常對照組中MPO的濃度分布圖。
具體實施例方式實驗材料本發明所用的6種ACS標志物(抗原)及相應抗體來源于Biodesign、 cellsciences 禾口 Abcam 公司；不同編號的微球(表面羧基修飾)、鏈霉親和素-藻紅蛋白均購置于QIAGEN公司；1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N_羥基硫代琥珀 酰亞胺(S-NHS)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺生物素(S-NHS-Biotin)購置于Pierce公司。緩沖液配制活化緩沖液(Activationbuffer) IOOmM NaH2PO4, ρΗ6· 3 ；偶聯緩沖液(Couplingbuffer) :50mM HEPES, pH7. 4 ；磷酸緩沖液(PBS)=IOmM NaH2PO4,150mM NaCl，pH7.4。實施例1 :3種急性冠狀動脈綜合癥標志物的液相芯片聯合并行檢測方法具體的檢測方法包括如下步驟1.所需微球的活化1. 1全速渦旋微球儲存液至少3min，形成均一的微球懸液；
1. 2分別稱取IOmg的EDC和S-NHS到兩個離心管中；1. 3用去離子水溶解使其終濃度為50mg/ml ；1. 4取Iml的微球懸液IOOOOg離心3min，小心移除上清；
1. 5加入80 μ 1的活化緩沖液將微球重懸；1. 6 分別加入 10 μ 1 的 EDC 溶液(50mg/ml)和 10 μ 1 的 S-NHS 溶液(50mg/ml)，混 合均勻，室溫(15-25°C )，避光，振蕩孵育20min。2.相應的捕獲抗體與活化的微球偶聯2. 1用偶聯緩沖液將捕獲抗體稀釋成體積為500 μ 1，濃度為0. lmg/ml的溶液； (抗體溶液中不能含有外源蛋白，疊氮化物，氨基乙酸，Tris或其他任何含有氨基的試劑。 如果含有這些試劑，通過透析或凝膠過濾層析除去。)2. 2將微球在IOOOOg離心3min，小心移除上清；2. 3加入步驟2. 1中已經稀釋好的抗體溶液(500 μ 1)；2. 4將活化的微球與抗體溶液，在室溫(15_25°C)下，避光，振蕩孵育池；(離心管 必須用錫紙包裹避光)
2. 5將微球在IOOOOg離心3min,小心移除上清；
2. 6加入500 μ 1 PBS將微球重懸，IOOOOg離心3min,小心移除上清；
2. 7加入Iml PBS/1% BSA(BSA 牛血清白蛋白)將微球重懸；
2.8通過血小板計數器對微球計數；
3.生物素標記檢測抗體
3.1將生物素試劑(S-NHS-Biotin)從冰箱的冷藏室中取出，在室溫下平衡，使其
恢復到室溫；3. 2依據檢測抗體的濃度，用PBS將抗體稀釋到lmg/ml ；如果抗體溶解在含有氨基的溶液中，應先除去氨基，置換成沒有氨基的緩沖液；3. 3用超純水配置IOmM的生物素溶液；3.4按摩爾比1 20(抗體生物素)，計算生物素所需要的量，加入到濃度為 lmg/ml的抗體溶液中；計算公式
Biotin (mmol) =(mg/ml) χ生物素與蛋白的摩爾比
抗體分子量(mg/mmol)3. 5將反應液在冰上孵育池，或是在室溫孵育30min ；3. 6將反應液轉移到透析盒，除去其中未反應的S-NHS-Biotin。4.抗原標準品的配置cTnT 按 31. 25，6. 25，1. 25，0. 25，0. 05，0. 01，0ng/ml 的濃度進行配制，Myo 和 MPO 按3125，625，125，25，5，l，0ng/ml的濃度進行配制，標志物混合液分別標記為STD6，STD5， STD4, STD3, STD2, STD1，STDO。5.偶聯捕獲抗體的微球混合液(I混合液)的配制分別取偶聯了 3種ACS標志物的捕獲抗體的微球，如下列cTnT捕獲抗體微球11， Myo捕獲抗體微球35，MPO捕獲抗體微球37，等比例混合，使每種微球的終濃度分別為200個/μ 1，4°C避光保存。6.含生物素標記的檢測抗體混合液(II混合液)的配制分別取進行了生物素標記的CTnT檢測抗體，Myo檢測抗體，MPO檢測抗體，加入 PH7. 4的PBS，使每種檢測抗體的終濃度分別為10 μ g/ml。7.質控品質控品包括陽性對照和陰性對照。8.血清樣品中3種ACS生物標志物的含量檢測8. 1血清樣品包括正常人血清樣本12份，ACS患者血清樣本12份。8. 2分別加入偶聯捕獲抗體的微球混合液(I混合液)于96孔酶標板，25 μ 1/孔；8. 3 加入標準品(STD0、STD1、STD2、STD3、STD4、STD5、STD6)、質控品(陽性對照和 陰性對照)、病人血清樣本1-12號、正常人血清樣本1-12號，25 μ 1/孔；8. 4用排槍溫柔的上下混勻混合物，蓋上蓋子，在室溫下避光孵育30min ；8. 5加入含生物素標記的檢測抗體混合液(II混合液)，25 μ 1/孔；用排槍溫柔的 上下混勻混合物，蓋上蓋子，在室溫下避光孵育30min ；8. 6用PBS/1 % BSA將鏈霉親和素-藻紅蛋白稀釋成濃度為200 μ g/ml的溶液，加 稀釋好的鏈霉親和素藻紅蛋白25μ 1到每個孔中，用排槍溫柔的上下混勻混合物，蓋上蓋 子，在室溫下避光孵育15-30min ；8. 7在液相芯片儀(LiquiChip 200, QIAGEN公司)上，對反應的混合物進行分析， 可自動繪制標準曲線，并根據標準曲線計算出檢測樣品中3種ACS標志物的含量。8. 8檢測結果及分析具體參見表1-3。表IACS組生物標志物的濃度值
權利要求
1.一種急性冠狀動脈綜合癥的生物標志物的聯合并行檢測方法，包括以下主要步驟(1)將不同編號的微球Beads活化后，使捕獲抗體與相應的微球偶聯，形成“捕獲抗 體-微球”二聯復合體，所述的每一種捕獲抗體分別抗一種急性冠狀動脈綜合癥的生物標志 物，從而使待測樣品中的急性冠狀動脈綜合癥生物標志物與捕獲抗體形成“急性冠狀動脈 綜合癥生物標志物-捕獲抗體-微球”三聯復合體；(2)將不同的檢測抗體進行生物素Biotin標記，其中所述的每一種檢測抗體分別抗一 種急性冠狀動脈綜合癥生物標志物且對應于捕獲抗體，并與捕獲抗體分別結合于該生物標 志物的不同抗原表位；(3)將步驟⑴形成的三聯復合體與步驟(2)中的含有生物素標記的檢測抗體混合，從 而形成“生物素標記的檢測抗體-急性冠狀動脈綜合癥生物標志物-捕獲抗體-微球”四 聯復合體；(4)將步驟C3)中的四聯復合體與鏈霉親和素-藻紅蛋白Mi^ptavidin-R-PE結合后， 檢測出不同微球的熒光信號，確定待檢測樣品中各種急性冠狀動脈綜合癥生物標志物的存在及含量。
2.如權利要求1所述的急性冠狀動脈綜合癥的生物標志物的聯合并行檢測方法，其特 征在于，所述檢測方法還包括將步驟(4)中測定的熒光信號與標準曲線進行比較，確定待 檢測樣品中各種急性冠狀動脈綜合癥生物標志物的含量。
3.如權利要求1所述的急性冠狀動脈綜合癥的生物標志物的聯合并行檢測方法，其特 征在于，所述的微球是一種色彩編碼微球color-coded beads，平均直徑為5. 6 μ m，且結合 了不同熒光染料的表面羧基修飾的聚苯乙烯微球。
4.如權利要求1所述的急性冠狀動脈綜合癥的生物標志物的聯合并行檢測方法，其 特征在于，所述步驟(1)微球活化是在由1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞 胺鹽酸鹽EDC溶液、N-羥基硫代琥珀酰亞胺S-NHS溶液和活化緩沖液組成的3者混合液 中進行活化，混合液的具體用量比是當微球數量為2. 5X IO6個時，需要50mg/ml的1-乙 基-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽EDC溶液10 μ 1 50mg/ml的N-羥基 硫代琥珀酰亞胺S-NHS溶液10 μ 1 IOOmM NaH2PO4,ρΗ6. 3的活化緩沖液80 μ 1 ；混合液的 用量根據微球的數量進行相應的調整。
5.如權利要求1所述的急性冠狀動脈綜合癥的生物標志物的聯合并行檢測方法，其特 征在于，所述的捕獲抗體和檢測抗體是針對以下6種自由組合的急性冠狀動脈綜合癥生物 標志物的捕獲抗體和檢測抗體心肌肌鈣蛋白T cTnT、心肌肌鈣蛋白I cTnl、肌酸激酶同工酶CK-MB、心臟脂肪酸結合 蛋白H-FABP、肌紅蛋白Myo、髓過氧化物酶MPO。
6.如權利要求1所述的急性冠狀動脈綜合癥的生物標志物的聯合并行檢測方法，其特 征在于，所述步驟中用液相芯片法xMAP進行檢測，可檢測熒光信號是紅色激光激發的 微球上的紅色分類熒光信號和綠色激光激發的藻紅蛋白所產生的報告熒光信號。
7.—種檢測多種急性冠狀動脈綜合癥生物標志物的診斷試劑盒，其特征在于，包括以 下主要組成成分(1)偶聯抗體的微球含有分別偶聯了不同捕獲抗體的6種微球，分別是偶聯了心肌 肌鈣蛋白T cTnT捕獲抗體的微球，偶聯了心肌肌鈣蛋白I cTnl捕獲抗體的微球，偶聯了肌酸激酶同工酶CK-MB捕獲抗體的微球，偶聯了心臟脂肪酸結合蛋白H-FABP捕獲抗體的 微球，偶聯了肌紅蛋白Myo捕獲抗體的微球，偶聯了髓過氧化物酶MPO捕獲抗體的微球，每 種捕獲抗體分別抗一種急性冠狀動脈綜合癥生物標志物并且偶聯于不同編號的微球，形成 “抗體-微球”的二聯復合體；(2)生物素標記的檢測抗體含有生物素標記的心肌肌鈣蛋白TcTnT檢測抗體，含有 生物素標記的心肌肌鈣蛋白I cTnl檢測抗體，生物素標記的肌酸激酶同工酶CK-MB檢測抗 體，生物素標記的心臟脂肪酸結合蛋白H-FABP檢測抗體，生物素標記的肌紅蛋白Myo檢測 抗體，生物素標記的髓過氧化物酶MPO檢測抗體，其中所述的每一種檢測抗體分別抗一種 相應的急性冠狀動脈綜合癥生物標志物且對應于捕獲抗體，并與捕獲抗體分別結合于該生 物標志物的不同抗原表位；(3)鏈霉親和素-藻紅蛋白Mi^ptavidin-R-PE其中鏈霉親和素能與生物素特異性結 合，形成帶藻紅蛋白熒光素標記的檢測抗體；(4)標準品包含各種急性冠狀動脈綜合癥的生物標志物的標準品；(5)質控品包含陽性對照和陰性對照。
8.如權利要求7所述的檢測多種急性冠狀動脈綜合癥生物標志物的診斷試劑盒，其特 征在于，所述的捕獲抗體和檢測抗體是針對以下6種自由組合的急性冠狀動脈綜合癥生物 標志物的捕獲抗體和檢測抗體心肌肌鈣蛋白T cTnT、心肌肌鈣蛋白I cTnl、肌酸激酶同工酶CK-MB、心臟脂肪酸結合 蛋白H-FABP、肌紅蛋白Myo、髓過氧化物酶MPO。
9.一種如權利要求7或8所述的診斷試劑盒是在檢測體外樣品中急性冠狀動脈綜合癥 生物標志物的存在及含量中應用。
10.一種如權利要求7或8所述的診斷試劑盒是在除急性冠狀動脈綜合癥以外的其他 心腦血管疾病的診斷檢測或預測中應用。
全文摘要
本發明公開了一種急性冠狀動脈綜合癥的生物標志物檢測法及診斷試劑盒，該檢測法的特征是能夠一次性檢測同一個樣品中的多種生物標志物，即通過液相芯片的制備，形成“生物素標記的檢測抗體-急性冠狀動脈綜合癥生物標志物-捕獲抗體-微球”的四聯復合體，將四聯復合體與鏈霉親和素-藻紅蛋白結合后，可檢測出不同微球的熒光信號，從而確定待檢測樣品中各種不同的急性冠狀動脈綜合癥生物標志物的存在及含量。本發明還公開了該診斷試劑盒的組成成分。本發明所述的方法及試劑盒具有高靈敏度、高通量性、檢測快速、準確等優點，能夠對多種急性冠狀動脈綜合癥的生物標志物同時進行定性和定量檢測。
文檔編號G01N33/70GK102062735SQ20091020182
公開日2011年5月18日 申請日期2009年11月18日 優先權日2009年11月18日
發明者吳杰, 孫黎, 邵棠 申請人:江蘇邁迪基因生物科技有限公司