專利名稱：：扶正化瘀五味子、蟲草菌絲粉中間體指紋圖譜質量檢測方法
技術領域：
：本發明屬五味子、發酵蟲草菌粉中間體質量檢測領域，特別是涉及一種扶正化瘀五味子、發酵蟲草菌粉中間體指紋圖譜質量檢測方法。
背景技術：
：扶正化瘀藥物組合物是由丹參、發酵蟲草菌粉、桃仁、松花粉、絞股藍、五味子六味藥組成。目前上市有兩種劑型(l)扶正化瘀膠囊2002年獲得中國國家新藥證書(國藥證字Z20020053)，并批準國家藥品標準WS3-459(Z-79)-2005(Z);(2)扶正化瘀片2005年獲得國家新藥證書(國藥證字Z20050564)，并批準國家藥品標準YBZ19332005-2009Z。扶正化瘀具有舒肝活血、益精養肝、化瘀解毒、軟堅散結、增強機體免疫功能等作用，主治慢性乙型肝炎肝纖維化、早期肝硬化。考慮到扶正化瘀制劑六味藥材的有效成分性質差異較大，因此在生產過程中針對不同藥味選用不同的提取方法。其中五味子和發酵蟲草菌粉采用醇提工藝，具體如下以約lg:2g比例，取五味子和發酵蟲草菌粉適量，用70X乙醇加熱回流提取2次，第一次1.5h，第二次lh，合并提取液，濃縮至相對密度1.1-1.2(50°C_55°C)，得醇提中間體。根據該提取工藝，醇提中間體中主要含五味子木質素成分，以及發酵蟲草菌粉中的核苷類成分。近年來，指紋圖譜技術已經成為中藥復方質量控制與評價的重要手段，查閱國內外發表的文獻，到目前為止沒有扶正化瘀制劑醇提中間體指紋圖譜分析的報道。因此本發明將彌補扶正化瘀制劑醇提中間體指紋圖譜研究的空白。
發明內容本發明所要解決的技術問題是提供一種扶正化瘀五味子、發酵蟲草菌粉中間體指紋圖譜質量檢測方法，該方法能全面控制扶正化瘀五味子、發酵蟲草菌粉醇提中間體的質量，以確保產品的質量穩定。本發明的一種扶正化瘀五味子、發酵蟲草菌粉中間體指紋圖譜質量檢測方法，包括(—)檢測方法A(1)五味子、發酵蟲草菌粉醇提中間體供試品制備稱取五味子、發酵蟲草菌粉醇提中間體1.00克，置10mL容量瓶中，加50%甲醇58ml，超聲處理20min，加50%甲醇至刻度，搖勻，過0.45um微孔濾膜，取續濾液作為五味子、發酵蟲草菌粉醇提中間體的供試品溶液；(2)梯度洗脫流動相用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，梯度洗脫條件為<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>色譜柱C18柱，流動相A相為0.05%磷酸-水，B相為乙腈；梯度洗脫A相0-60-120min，95-60-10%、B相5-40-90%，流速0.8-1.2ml/min，檢測波長254nm，柱溫20-40。C，進樣量10-20ul;(二)檢測方法B(1)五味子、發酵蟲草菌粉醇提中間體供試品制備稱取五味子、發酵蟲草菌粉醇提中間體0.50克，置10mL容量瓶中，加水58ml，超聲處理20min，加水至刻度，搖勻，過0.45um微孔濾膜，取續濾液作為五味子、發酵蟲草菌粉醇提中間體的供試品溶液；[OO17](2)梯度洗脫流動相用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，梯度洗脫條件為<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>色譜柱C18柱，流動相A相為水，B相為乙腈；梯度洗脫A相0_30min，100-93%、B相0-7%，流速0.8-1.2ml/min，檢測波長261nm，柱溫20-40。C，進樣量10_20ul;(三)標準指紋圖譜的建立選取10批不同批次的扶正化瘀藥物組合物五味子、發酵蟲草菌粉醇提中間體，根據上述兩種檢測方法進行高效液相色譜指紋圖譜分析，每個批次的藥品獲得2張不同波長下的指紋圖譜，對HPLC指紋圖譜中所有峰進行比較，確定了8個共有峰，并按出峰時間先后次序進行編號(圖1);其中，根據檢測方法A于254nm波長下獲取的指紋圖譜a中，確定了4個共有峰(14號峰)；根據檢測方法B于261nm波長下獲取的指紋圖譜b中，確定了4個共有峰(58號峰)；經對照品定性鑒定，確認共有峰中，2號峰五味子醇甲，3號峰為五味子醇乙，4號峰為五味子甲素，6號峰為尿苷，7號峰為鳥苷，8號峰為腺苷；(四)指紋圖譜的質量控制根據檢測方法A于254nm波長下獲取指紋圖譜a，采用中藥指紋圖譜計算機輔助相似度評價軟件(國家藥典委員會)，將樣品的HPLC指紋圖譜與標準指紋圖譜(或共有模式指紋圖譜)進行比較，以4個共有峰計算得到的相似度應不得小于0.8;根據檢測方法B于261nm波長下獲取指紋圖譜b，采用中藥指紋圖譜計算機輔助相似度評價軟件(國家藥典委員會)，將樣品的HPLC指紋圖譜與標準指紋圖譜(或共有模式指紋圖譜)進行比較，以4個共有峰計算得到的相似度應不得小于0.8。本發明采用兩種樣品前處理方法和色譜條件，建立了2張HPLC指紋圖譜。其中指紋圖譜1著重表達了扶正化瘀制劑醇提中間體中五味子木質素類成分的分布，指紋圖譜2著重表達了扶正化瘀制劑醇提中間體中蟲草核苷類成分的分布。通過色譜條件的優化，確定了色譜柱、流動相種類、流動相梯度、檢測波長、柱溫等色譜條件。有益效果1、用色譜的指紋特征，通過指紋圖譜得到的量化參數，更有效地控制產品中間體的質量；2、考察了供試品溶液的穩定性，結果表明，在室溫下，24小時之內，扶正化瘀藥物組合物五味子、發酵蟲草菌粉提中間體供試品溶液保持穩定，精密度和重復性試驗，都表明相似度在0.8以上；3、經過對10批扶正化瘀制劑五味子、發酵蟲草菌粉醇提中間體的指紋圖譜相似度進行計算，發現五味子、發酵蟲草菌粉醇提中間體的相似度在0.8-1.O之間。說明建立的扶正化瘀制劑五味子、發酵蟲草菌粉醇提中間體指紋圖譜質控方法，重復性好，專屬性強，操作簡便，方法可靠，可以對扶正化瘀五味子、發酵蟲草菌粉醇提中間體質量進行科學、有效地評價，并且證實能夠運用于實際生產中質量控制，滿足企業對產品質量控制的需求。4、為扶正化瘀制劑進行指紋圖譜質量控制提供了條件，同時也保證了扶正化瘀制劑的質量穩定。圖1為扶正化瘀制劑五味子、發酵蟲草菌粉醇提中間體標準HPLC指紋圖譜；其中，a為254nm，b為261nm;其中，2號峰五味子醇甲，3號峰為五味子醇乙，4號峰為五味子甲素，6號峰為尿苷，7號峰為鳥苷，8號峰為腺苷；圖2為扶正化瘀五味子、發酵蟲草菌粉醇提中間體樣品HPLC指紋圖譜圖；其中，a為254nm，b為261nm。具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。實施例1成品、試劑及儀器的準備成品扶正化瘀醇提中間體來源上海黃海制藥有限責任公司提取工藝以約lg:2g比例，取五味子和發酵蟲草菌粉適量，用70X乙醇加熱回流提取2次，第一次1.5h，第二次lh，合并提取液，濃縮至相對密度1.1-1.2(50°C_55°C)，得醇提中間體。根據該提取工藝，醇提中間體中主要含五味子木質素成分，以及發酵蟲草菌粉中的核苷類成分；試劑甲醇(分析純)來源上海振興化工一廠；磷酸(分析純)來源上海聯合化工廠；乙腈(色譜純)來源TediacompanyInc^水為純凈水。標準3]n:五味子酯甲來源成都思科華生物技術有限公司五味子醇乙來源成都思科華生物技術有限公司五味子醇甲來源中國藥品生物制品檢定所；腺苷來源中國藥品生物制品鑒定所；尿苷來源中國藥品生物制品鑒定所；鳥苷來源新鄉拓新生化科技有限公司。儀器<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>[OO57](—)指紋圖譜(254nm)的檢測方法稱取五味子、發酵蟲草菌粉醇提中間體1.00克，置10mL容量瓶中，加50%甲醇58ml，超聲處理20min，加50%甲醇至刻度，搖勻，過0.45um微孔濾膜，取續濾液作為五味子、發酵蟲草菌粉醇提中間體的供試品溶液；色譜條件柱溫30。C，檢測波長254nm，進樣量10ii1，色譜柱Alltima(250mmX4.6mm，洗脫條件見表l，表1指紋圖譜1的洗脫條件5iim)c<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(二)指紋圖譜(261nm)的檢測方法稱取五味子、發酵蟲草菌粉醇提中間體0.50克，置10mL容量瓶中，加水58ml，超聲處理20min，加水至刻度，搖勻，過0.45um微孔濾膜，取續濾液作為五味子、發酵蟲草菌粉醇提中間體的供試品溶液；色譜條件柱溫30。C，檢測波長261nm，進樣量:10ii1，色譜柱Alltima(250mmX4.6mm，5ym)。洗脫條件見表2，表2指紋圖譜2的洗脫條件<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>在指紋圖譜1測定條件確定后，通過對至少三批樣品進行測定，計算相關參數，并在此基礎上提出高效液相色譜系統的適用參數條件。即五味子醇甲對照品溶液(100yg/ml)的色譜峰面積重現性(RSD)不高于3%，保留時間重現性(RSD)不高于2%;色譜柱柱效以五味子醇甲計不少于15，000塊理論塔板數。在指紋圖譜測定條件2確定后，通過對至少三批樣品進行測定，計算相關參數，并在此基礎上提出高效液相色譜系統的適用參數條件。即腺苷對照品溶液(100iig/ml)的色譜峰面積重現性(RSD)不高于3%，保留時間重現性(RSD)不高于2%;色譜柱柱效以腺苷計不少于15，000塊理論塔板數。扶正化瘀藥物組合物五味子、發酵蟲草菌粉醇提中間體樣品指紋圖譜圖見圖2。對10個批次的扶正化瘀醇提中間體進行指紋圖譜分析，每個中間體獲得2張HPLC指紋圖譜。采用中藥指紋圖譜計算機輔助相似度評價軟件(2004A版，中國藥典委員會)分別對2種指紋圖譜的相似度進行計算。采用共有峰模式，設定時間窗寬度為0.lmin，以平均數法生成對照指紋圖譜，分別將樣品的2張HPLC指紋圖譜與相應的標準指紋圖譜進行比較，結果表明，10批扶正化瘀醇提中間體的2張指紋圖譜與相應的標準指紋圖譜的相似度均在O.8-1.0之間。說明建立的扶正化瘀醇提中間體指紋圖譜質控方法，操作簡便，方法可靠，證實能夠運用于實際生產中質量控制，滿足企業對產品質量控制的需求。權利要求一種扶正化瘀五味子、發酵蟲草菌粉中間體指紋圖譜質量檢測方法，包括(一)檢測方法A(1)五味子、發酵蟲草菌粉醇提中間體供試品制備稱取五味子、發酵蟲草菌粉醇提中間體1.00克，置10mL容量瓶中，加50％甲醇5～8ml，超聲處理20min，加50％甲醇至刻度，搖勻，過0.45um微孔濾膜，取續濾液作為五味子、發酵蟲草菌粉醇提中間體的供試品溶液；(2)梯度洗脫流動相用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，梯度洗脫條件為流動相A相為0.05％磷酸-水，B相為乙腈；梯度洗脫A相0-60-120min，95-60-10％、B相5-40-90％，流速0.8-1.2ml/min，檢測波長254nm，柱溫20-40℃，進樣量10-20ul；(二)檢測方法B(1)五味子、發酵蟲草菌粉醇提中間體供試品制備稱取五味子、發酵蟲草菌粉醇提中間體0.50克，置10mL容量瓶中，加水5～8ml，超聲處理20min，加水至刻度，搖勻，過0.45um微孔濾膜，取續濾液作為五味子、發酵蟲草菌粉醇提中間體的供試品溶液；(2)梯度洗脫流動相用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，梯度洗脫條件為流動相A相為水，B相為乙腈；梯度洗脫A相0-30min，100-93％、B相0-7％，流速0.8-1.2ml/min，檢測波長261nm，柱溫20-40℃，進樣量10-20ul；(三)標準指紋圖譜的建立選取10批不同批次的扶正化瘀藥物組合物五味子、發酵蟲草菌粉醇提中間體，根據上述兩種檢測方法進行高效液相色譜指紋圖譜分析，每個批次的藥品獲得2張不同波長下的指紋圖譜，對HPLC指紋圖譜中所有峰進行比較，確定了8個共有峰，并按出峰時間先后次序進行編號；其中，根據檢測方法A于254nm波長下獲取的指紋圖譜a中，確定了4個共有峰(1～4號峰)；根據檢測方法B于261nm波長下獲取的指紋圖譜b中，確定了4個共有峰(5～8號峰)；確認共有峰中，2號峰五味子醇甲，3號峰為五味子醇乙，4號峰為五味子甲素，6號峰為尿苷，7號峰為鳥苷，8號峰為腺苷；(四)指紋圖譜的質量控制根據檢測方法A于254nm波長下獲取指紋圖譜a，，將樣品的HPLC指紋圖譜與標準指紋圖譜進行比較，以4個共有峰計算得到的相似度應不得小于0.8；根據檢測方法B于261nm波長下獲取指紋圖譜b，，將樣品的HPLC指紋圖譜與標準指紋圖譜進行比較，以4個共有峰計算得到的相似度應不得小于0.8。全文摘要本發明涉及一種扶正化瘀五味子、發酵蟲草菌粉中間體指紋圖譜質量檢測方法，包括將制備的五味子、發酵蟲草菌粉醇提中間體供試品分別于254nm和261nm下進行流動相的梯度洗脫；選取10批不同批次的扶正化瘀藥物組合物五味子、發酵蟲草菌粉醇提中間體，根據上述兩種檢測方法進行高效液相色譜指紋圖譜分析，每個批次的藥品獲得2張不同波長下的指紋圖譜，確定了8個共有峰；將樣品的HPLC指紋圖譜分別與254nm和261nm下的標準指紋圖譜進行比較，以8個共有峰計算得到的相似度應不得小于0.8。本發明的檢測方法能全面控制扶正化瘀五味子、發酵蟲草菌粉醇提中間體的質量，以確保產品的質量穩定。文檔編號G01N30/36GK101708234SQ20091020148公開日2010年5月19日申請日期2009年12月18日優先權日2009年12月18日發明者潘一峰,胡坪申請人:上海現代中醫藥技術發展有限公司