專利名稱：一種用于檢測阿特拉津的金納米通道膜及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及材料領域和傳感技術領域，具體地說，是一種基于納米通道膜材料上
的分子水平膜檢測技術。
背景技術：
近年來，隨著納米技術的飛速發展，納米技術與當前很多技術相互碰撞與結合，產 生了許多新興的課題與方向。納米通道膜技術將膜檢測的低能耗、操作簡單、靈敏度高、無 污染并可回收再利用的優點與納米技術的納米尺度操控相結合，能夠對目標物質進行分子 水平上的檢測。 在農業的發展中，農藥和除草劑發揮著重要的作用，據估計，全世界農業由于病、 蟲、草害每年糧食損失占產量的一半左右，使用農藥和除草劑大概可以奪回其中的30%，而 農藥和除草劑所帶來的收益大體為其費用的4倍。但是，由于長期使用農藥和除草劑，給環 境帶來嚴重污染。 阿特拉津(Atrazine，縮寫為八11 ，又名莠去津，2-氯-4-乙胺-6-異丙胺-1，3， 5-三嗪，C8H14C1N5)屬均三氮苯類化合物，為三嗪類除草劑，水溶性適中(33iig/L，22°C )， 對大部分一年生雙子葉雜草具有很好的防治作用，是近50年來世界上最為廣泛使用的除 草劑。其主要問題是具有淋溶性，易被雨水、灌溉水淋溶至較深土層，或是隨地表徑流進入 河流、湖泊和水庫，對地下水和地表水造成污染，大量污染物將由顆粒物吸附而蓄存在沉積 物中，在適當條件下重新釋放而成為二次污染源。它在土壤中殘留期長，易對后茬敏感作物 如小麥、大豆、水稻等產生藥害。ATR生態毒性表明，O. 1 ii g/L的ATR水溶液就能導致青蛙 產生雌雄同體現象；濃度為25y g/L的ATR水中觀察，雄性青蛙體內睪丸激素的濃度顯著下 降。長期接觸ATR會導乳腺癌和卵巢癌的發生，ATR已被美國環保局列為致癌物。ATR會影 響人體的內分泌系統以及動物的生殖繁衍，美國環保局的初步評價認為，ATR屬于環境內分 泌干擾物。德、法和比利時等國家已禁止使用ATR，美國限定一級飲用水中最大標準含量為 3. 0 ii g/L。加拿大飲用水中規定ATR及其代謝產物的最大濃度為5. 0 y g/L。我國ATR最 大殘留標準(GB16323-1996)中規定其在玉米、甘蔗中的含量《0. 05mg/kg，在地表水I、II、 III類水域中的特定項目標準值《3. 0 ii g/L(GHZB 1-999)。但地下水中ATR殘留標準及地 表水/地下水中降解物殘留標準至今仍未制定。 由于ATR長期使用殘留，及其它的有毒代謝物、降解物、轉化物的存在對人體的危 害是難以估量的。國際上對農藥最大殘留量要求越來越嚴格，這些都給農藥殘留檢測技術 提出了更高的要求。 為了控制和遏制這種危險污染物，迫切需要一種快速檢測這種有機毒素的方法。 一些既定的分析法，如薄層色譜法，氣相色譜，高效液相色譜法，氣質聯用，被廣泛用于在痕 量水平上檢測和定量分析農藥。然而，這些方法檢測農藥復雜、費時，儀器不易攜帶，需要試 樣量較多，在連續監測及現場測定中受到限制。因此，發展高靈敏、對ATR及其代謝物、降解 物、轉化物有特異性響應的檢測技術對國民健康和經濟發展無疑具有重要意義。
本專利嘗試基于金納米通道膜技術，實現阿特拉津的檢測，為分析檢測三嗪類除草劑提出了一個新的途徑，也為檢測其他類除草劑提供一個新的思路。
發明內容
本發明旨在提供一種用于檢測阿特拉津的金納米通道膜。 本方法的目的在于，將上述金納米通道膜技術用于分離檢測阿特拉津，可以更好的應用于農藥的分析檢測中。 技術方案為， 一種用于檢測阿特拉津的氯修飾的金納米通道膜，其特征在于，制備方法如下 (a)以多孔聚碳酸酯膜為基膜，采用化學沉積法在孔徑為80nm 150nm的多孔聚碳酸酯膜(PC膜)上沉積金將PC膜洗滌后在O. 01M 0. 05M SnCl2溶液浸泡30 120min，使Sn2+均勻地吸附在基膜及膜孔表面；取出清洗后在N2氣保護下將膜在0. 01M 0. 04MAg(NH3)2+溶液中浸沒5 30min，洗滌后浸入pH = 9. 5 10.5的6 X 10—3M 9 X 10—3M亞硫酸金鈉沉積溶液中，在0 l(TC下化學鍍金4 10h ;洗滌并用HN03除去未反應的Ag，即得到金納米通道陣列膜； (b)氯離子的修飾將所制得的金納米通道膜活化清洗后在含0. 005M 0. 02M
C1—的溶液中浸泡10 16h，通過金-氯鍵使氯離子共價鍵單層自組裝在金納米通道膜上。
步驟(b)中，利用體積濃度為60 % 80 %的硫酸雙氧水混合液浸泡5min對金納米通道膜進行活化。 上述方法所制備的氯修飾的金納米通道膜，孔徑為20 50nm。 —種檢測阿特拉津的方法，將上述所制備的氯修飾的金納米通道膜置于U形池的
進樣池和透過池之間，工作電極插入進樣池，參比電極插入透過池；在進樣池中加入含阿特
拉津抗體的緩沖液，在透過池中加入不含有阿特拉津抗體的緩沖液，維持兩池中的液面平
行，在參比電極和工作電極兩端施加電壓( 一般為0. 8 1. 5V)，測定基底電流；隨后向進
樣池中加入含有待測樣品的緩沖液，通過電化學工作站進行電流信號測試；發生電流突降
則說明待測樣品中含有阿特拉津。所述的緩沖液為pH為7 8、濃度為0. 005M 0. 02M的PBS溶液。 在一定電場下，電解質離子通過納米通道時，產生穩定的電流。阿特拉津加入后，
與進樣池中的抗體形成復合物，從而對電解質的流動產生一定的阻礙作用，引起相應的電
流降。而其他除草劑，如百草枯、敵草隆等，不與抗體結合，不會形成比抗體更大的分子，無
電流降的產生。 為提高靈敏度，可將待測樣品與BSA鍵合，使阿特拉津與BSA鍵合制成阿特拉津免疫原；制備方法為如下步驟 將阿特拉津與3-巰基丙酸在堿性條件下加熱回流，除去溶劑后酸化得到的沉淀為阿特拉津-巰基丙酸衍生物；再用雙環己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺將阿特拉津_巰基丙酸衍生物連接到牛血清白蛋白，得到阿特拉津免疫原。 當阿特拉津免疫原加入后，與進樣池中的抗體形成MPAD_BSA\抗體復合體，它較單獨的抗體在體積上要大，從而對電解質的流動產生一定的阻礙作用，引起相應的電流降。而其他除草劑，如百草枯、敵草隆等，不與抗體結合，不會形成比抗體更大的分子，無電流降的產生。這樣可以檢測阿特拉津含量較低的樣品。 本發明的方法檢測阿特拉津，檢測效率高，特異性強，可測定濃度下限為 1.7X10—"M的阿特拉津，具有較好的應用前景。
圖1為阿特拉津免疫原制備路線圖 圖2為檢測裝置簡圖，修飾了氯離子的Au納米通道膜置于U形池中間，阿特拉津 免疫原或阿特拉津與抗體結合后，形成更大體積的大分子，對電解質的流動產生阻礙作用， 引起電流的降低。其他除草劑如百草枯、敵草隆不與抗體結合，不會形成比抗體更大的分 子，無電流降的產生。
圖3為實施例1產品場發射掃描電子顯微鏡圖；(a)為聚碳酸酯膜化學鍍金7h后 的場發射掃描電子顯微鏡圖；(b)為將膜用二氯甲烷溶解后的透射電子顯微鏡圖。
圖4為含有阿特拉津抗體的進樣池中逐次加入阿特拉津免疫原后測得電流_時間 圖。插圖為阿特拉津免疫原加入前電流響應，加入前電流可達到穩定態，免疫原加入后引起 明顯的電流降低。 圖5為實施例4中阿特拉津免疫原(A)、阿特拉津(B)、百草枯(C)、敵草隆(D)分 別加入時電流-時間的比較。加入阿特拉津免疫原及阿特拉津時電流即出現突然降低，并 且，加入阿特拉津免疫原時產生比加入單獨的阿特拉津大的電流降；而加入的百草枯、敵草 隆不與阿特拉津抗體結合，無更大體積分子形成，故不會出現電流的突降。
具體實施例方式
下面結合具體實例，進一步闡述本發明。應該指出的是，這些實例僅用于說明本發 明而不限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明描述的內容之后，本領域技術人員 可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的 范圍。 下列實例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如操作手冊，或按照
制造廠商所建議的條件。 實施例1金納米通道膜的制備 以多孔聚碳酸酯膜為基膜，采用化學沉積法在100nm的多孔聚碳酸酯(PC)膜上沉 積金。將PC膜浸入無水甲醇中，超聲震蕩5min，洗去基膜上吸附的雜質；然后將清洗后的 PC膜浸入0. 025M SnCl2溶液45min，不斷輕微搖動溶液使Sn2+均勻地吸附在基膜及膜孔表 面，取出用甲醇漂洗2次；在^氣保護下將膜浸入0. 029MAg(NH》/溶液中15min，取出用甲 醇洗3次，然后再水洗3次，浸入濃度為7. 9 X 10—3M亞硫酸金鈉沉積溶液(pH = 10. 00)中。 在fC下化學鍍金7h后取出用水洗4次，再用25% HN03浸12h除去未反應的Ag，即得到Au 納米通道陣列膜。 圖3(a)為化學鍍金7h后的場發射掃描電子顯微鏡圖，可見其內徑約為35nm;圖 3(b)為將膜Au納米通道陣列用二氯甲烷溶解后的透射電子顯微鏡圖，表明化學鍍金7h后， 可以得到形狀良好的金納米通道。
實施例2氯離子的修飾
將所制得的Au納米通道膜利用piranha溶液(Vh2o2:Vh2so4 - 3:7 )浸泡5min活化，取出用水沖洗三次，浸入0. 01M的KC1水溶液中12h，氯離子即通過金_氯鍵自組裝在Au納米通道膜上，修飾完畢后將膜取出用甲醇清洗三次，N2吹干，得到氯修飾的金納米通道。
實施例3阿特拉津免疫原的制備 首先制備阿特拉津-巰基丙酸衍生物(MPAD)，再進一步制備阿特拉津免疫原，途徑見圖1。 將含有5. OmM阿特拉津的50ml乙醇在攪拌條件下慢慢加入含0. 48M 3_巰基丙酸和10. 8mM KOH的10mL乙醇中，ll(TC下加熱回流6h。溶劑進行減壓蒸發，剩余物加入25mL含5 % (質量分數)NaHC03的水溶液，用10mLCHCl3清洗三次，然后用6M鹽酸酸化至pH為2，以促使得到的衍生物立即沉淀。 傾出上清液，將經真空干燥后的沉淀用lmL乙醇再次溶解，進一步提純，然后37°C下真空干燥，得到MPAD晶體。將50 ii molMPAD、 125 y mol雙環己基碳二亞胺(DCC) 、 125 y molN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和lmL二甲基亞砜(DMF)混合，室溫下反應4h，然后10000r/pm離心5min。取150 ii L上清液加入到850 y L含1. 47X 10—4M牛血清白蛋白(BSA)硼酸液(pH=9. 00)中，4。C下反應22h。然后將上述混合物裝入透析袋內用PBS(pH = 7. 40)透析。
實施例4電流信號的測定 采用U形池作為阿特拉津分離測定的裝置，U形池分進樣池、透過池兩部分，將Au納米通道膜置于進樣池和透過池中間，膜的有效透過面積為1. 96cm、進樣池和透過池容積分別為6mL。以鉑絲電極作為工作電極和參比電極，工作電極插入進樣池，參比電極插入透過池，工作電極和參比電極連接到電化學工作站，并通過電化學工作站進行電流信號測試。如圖2所示。 在U形連通池的進樣池中加入0. OIM、 pH為7. 40的PBS溶液4. OmL、1. OmL含阿特拉津抗體的PBS(O. 585mg/L)，同時透過池中加入PBS溶液5mL，維持兩池中的液面平行，在參比電極和工作電極兩端施加l.OV電壓，室溫下測定基底電流。隨后加入阿特拉津免疫原，每60s向進樣池中加入2. 5X 10—8mol阿特拉津免疫原(以阿特拉津含量計)，測定電流_時間曲線；然后分別用除草劑阿特拉津、百草枯、敵草隆依次代替阿特拉津免疫原進行試驗，每次都加入量也是2. 5X 10—8mol，測定相應的電流響應情況。結果如圖4、5所示。
在一定電場下，電解質離子通過納米通道時，產生穩定的電流。逐步加入阿特拉津免疫原及阿特拉津時電流即出現突然降低，并且加入阿特拉津免疫原時產生比加入單獨的阿特拉津更大的電流降。 由圖4可見，加入阿特拉津免疫原后，由于阿特拉津免疫原\抗體復合體的形成，
產生更大體積的分子，對電解質的流動產生阻礙作用，與單獨加入阿特拉津相比，電流出現
明顯的降低。圖4中的插圖為阿特拉津免疫原加入前電流響應，由此可見，阿特拉津免疫原
加入前電流可達到穩定態，阿特拉津免疫原加入后引起明顯的電流降低。 由圖5可見，加入阿特拉津免疫原(A)和阿特拉津(B)引起明顯電流降，而加入的
百草枯(C)、敵草隆(D)因為不與阿特拉津抗體結合，無更大體積分子形成，故不會出現電
流的突降。
權利要求
一種用于檢測阿特拉津的氯修飾的金納米通道膜，其特征在于，制備方法如下(a)以多孔聚碳酸酯膜為基膜，采用化學沉積法在孔徑為80nm～150nm的多孔聚碳酸酯膜上沉積金將多孔聚碳酸酯膜洗滌后在0.01M～0.05M SnCl2溶液浸泡30～120min，使Sn2+均勻地吸附在基膜及膜孔表面；取出清洗后在N2氣保護下將膜在0.01M～0.04M Ag(NH3)2+溶液中浸沒5～30min，洗滌后浸入pH＝9.5～10.5的6×10-3M～9×10-3M亞硫酸金鈉沉積溶液中，在0～10℃下化學鍍金4～10h；洗滌并用HNO3除去未反應的Ag，即得到金納米通道陣列膜；(b)氯離子的修飾將所制得的金納米通道陣列膜活化清洗后在含0.005M～0.02M Cl-的溶液中浸泡10～16h，通過金-氯鍵使氯離子共價鍵單層自組裝在金納米通道陣列膜上，得到氯修飾的金納米通道膜。
2. 權利要求1所述的一種用于檢測阿特拉津的氯修飾的金納米通道膜，其特征在于， 其孔徑為20 50nm。
3. 權利要求1所述的一種用于檢測阿特拉津的氯修飾的金納米通道膜，其特征在于， 步驟(b)中，利用體積濃度為60% 80%的硫酸雙氧水混合液浸泡2 20min對金納米通 道陣列膜進行活化。
4. 一種檢測阿特拉津的方法，其特征在于，將權利要求1 3任一項所述氯修飾的金納 米通道膜置于U形池的進樣池和透過池之間，工作電極插入進樣池，參比電極插入透過池；在進樣池中加入含阿特拉津抗體的緩沖液，在透過池中加入不含有阿特拉津抗體的緩 沖液，維持兩池中的液面平行，在參比電極和工作電極兩端施加電壓，測定基底電流；隨后向進樣池中加入含有待測樣品的緩沖液，通過電化學工作站進行電流信號測試； 發生電流突降則說明待測樣品中含有阿特拉津。
5. 權利要求4所述一種檢測阿特拉津的方法，其特征在于，所述的緩沖液為pH為7 8、濃度為0. 005M 0. 02M的PBS溶液。
6. 權利要求4所述一種檢測阿特拉津的方法，其特征在于，所述將待測樣品與BSA鍵合 得到阿特拉津免疫原。
全文摘要
本發明提供了一種用于檢測阿特拉津的氯修飾的金納米通道膜，及利用該金納米通道膜檢測阿特拉津的方法。以聚碳酸酯膜為基膜，采用化學沉積法制備直徑20～50nm的Au納米通道膜，氯離子通過金-氯共價鍵自組裝至金納米通道孔壁上。檢測方法為，將上述氯修飾的金納米通道膜置于進樣池和透過池之間，進樣池中加入含阿特拉津抗體的緩沖液，透過池中加入緩沖液，維持兩池液面平行，施加電壓，測定基底電流；向進樣池中加入含待測樣品的緩沖液，通過電化學工作站進行電流信號測試；發生電流突降則說明待測樣品中含有阿特拉津。本發明檢測效率高，特異性強，可測定濃度下限為1.7×10-10M的阿特拉津，具有較好的應用前景。
文檔編號G01N33/531GK101718742SQ200910199159
公開日2010年6月2日 申請日期2009年11月20日 優先權日2009年11月20日
發明者岳增連, 彭斌, 趙國慶, 黃杉生 申請人:上海師范大學