體外檢測乙肝病毒c抗體的組合物的制作方法

專利名稱：體外檢測乙肝病毒c抗體的組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種體外檢測乙肝病毒抗體的組合物，尤其涉及一種體外檢測乙肝病 毒C抗體的組合物。用該組合物檢測乙肝病毒C抗體能使檢測更準確，且結果更直觀。
背景技術：
乙型(病毒性)肝炎是由乙型肝炎病毒(h印atitis B virus,HBV)引起的一種世 界性疾病。發展中國家發病率高，據統計，全世界無癥狀乙肝病毒攜帶者超過2. 8億。我國 約占9300萬，大多數人無癥狀，但其中的1/3會出現肝損害的臨床表現。目前通過三種途徑對乙型肝炎進行診斷，如檢測病毒的抗原、檢測體內抗體以及 檢測病毒的DNA。臨床上，通常使用五種標識物進行判斷，如乙肝表面抗原(h印atitis B surface antigen,HBsAg) > Zi 13^ Jfi{φ (antibodies to hepatitis B surface antigen, HBsAb)、乙月干 e 抗原(hepatitisB core antigen, HBeAg)、乙月干 e 抗體(antibodies to the' e' antigen, anti-Hbe/HBeAb)禾口乙月干核心抗體(antibodies to the core antigen, anti-Hbc/HBcAb)，又稱“兩對半”。乙肝病毒DNA則用來診斷和觀察慢性乙型肝炎。當血液 中病毒DNA數量穩定或增加較少時，說明病情較為穩定；當病毒DNA數量不斷增多，則說明 病情正在惡化。HBsAg出現于乙肝患者血清中谷丙轉氨酶升高之前，直至恢復期時，HBsAg的滴度 才會逐步降低乃至消失，但有部分患者HBsAg可持續存在。在絕大多數乙肝病毒感染者的 外周血中，含有5ng-600y g/ml的HBsAg。血清中的HBsAg僅僅是個體受到HBV感染的標 志，并不反映病毒復制與否、病毒復制程度以及病毒的傳染性強弱等。急性乙肝病人恢復期 后，隨著HBsiVg逐步降低乃至消失，血清中會出現對HBV感染具有保護性免疫作用的HBsAb。 一般情況下，血清中的HBsAb和HBsAg不會被同時檢出。HBV的前核心(pre-core) /核心(core)基因直接編碼兩種多肽，其為組成病毒核 殼體的21kD亞基p21c和經分泌過程產生的17kD亞基肽pl7e (切去定位于內質網的四個 氨基酸的pre-core信號肽)。p21c即為血清學上定義的HBcAg，pl7e即為血清學上定義的 HBeAgo也有文獻報道在血清分離出帶有-10—1前核區段的HBeAg(Virology 1988，163， 268-275)和含有全部四個氨基酸的 HBeAg(J. Immunol.，1991，147，3156-3160)。HBeAg 和 HBcAg約有75%的同源性，其在血清中的出現時間稍晚于HBsAg。一般情況下，若HBeAg檢 測為陽性時，HBsAg檢測亦為陽性，HBeAg陽性結果還表明病毒的傳染性強。若這種情況持 續3個月以上，則有慢性化傾向。當血清中的HBeAg標識物檢測結果為陰性后，體內會出現 HBeAb。血清檢測HBeAb陽性結果表明病毒復制減少，傳染性減弱。因此，對乙肝病人血清 中HBeiVg和HBeAb標識物的準確測定對乙型肝炎的診斷、預防和治療具有重要的指導作用。HBcAb是判斷乙肝病情的重要指標。隨著急性乙肝的恢復，HBcAb滴度會降低乃 至消失。若該標識物在血清中持續高滴度，則表明乙肝病情有向慢性化發展的傾向。在慢 性乙肝患者中，HBcAb的檢出率及滴度較高說明乙肝病毒復制活躍，還表明了病毒的傳染性 強。
在乙肝的臨床診斷和治療過程中，通常采用將HBsAg、HBsAb, HBeAg, HBeAb和 HBcAb等五種標識物中的幾種相結合的方式來判斷乙肝病情。若病人血清中HBsAg、HBeAg 和HBcAb三種標識物檢測均為陽性時，就可以確定該患者正受到乙肝病毒感染，且病毒正 在活躍復制，病毒數量較多，傳染性也較強。若病人血清中HBsAg、HBeAb和HBcAb三種標識 物檢測均陽性時，表明乙肝病情好轉，病毒復制數量減少。酶聯免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是目前用于HBsAg、 HBsAb, HBeAg, HBeAb和HBcAb五種標識物體外檢測的常用方法。其中，HBsAg、HBsAb和 HBeAg采用ELISA雙抗體(雙抗原)夾心法，如中國發明專利申請200610030783. 3公開 的對乙肝病毒核心抗原的體外檢測，HBeAb和HBcAb均采用ELISA競爭法，即在抗體結合抗 原的過程中，待測樣品中的抗體與標記抗體相競爭。使用“夾心法”檢測時，溶液顯色則表 明該標識物檢測結果呈陽性(+)，溶液無色表明檢測結果呈陰性(_)。這種判斷方式與人們 的習慣相一致。而在“競爭法”中，其是待測樣品中的抗體與標記抗體對結合抗原的競爭， 當標記抗體的濃度大于待測樣品中的抗體時，溶液色深，表明標識物呈陰性(_)；當待測樣 品中的抗體的濃度大于標記抗體時，溶液無色或色淺，表明檢測結果為陽性(+)。在應用于 ELISA檢測的酶標記結合物由于溫度、濕度或化學氧化等原因而使蛋白酶發生變性、失活或 降解時，就無法實現酶促反應使底物生色，這對于采用ELISA競爭法檢測的HBeAb和HBcAb 而言，其將直接導致假陽性(+)的檢測結果。這妨礙了醫生對患者采用正確的方法或藥物 進行治療，使醫療資源無法高效配置。此外，對受試者的心理狀態也會產生較大影響，還會 對其日常生活產生種種影響。另外，ELISA競爭法在檢測HBeAb和HBcAb標識物中檢測靈 敏度較低，因此，不能準確檢測待測標本中HBeAb和HBcAb標識物的含量。一方面，ELISA競爭法在檢測HBeAb和HBcAb標識物中存在諸多問題與缺陷。另一 方面，也由于HBeAg和HBcAg這兩種抗原的分子量比較小(小于20kDa)，當應用于ELISA時 很難通過物理吸附的方式有效包被于酶標板表面，而對相應抗體的準確檢測產生影響。目 前這些問題主要可以通過兩種方法進行解決，如雅培(Abbott)公司推出了一款將化學發 光技術應用于免疫檢測的系列產品——ARCHITECT。檢測過程中，先將稀釋的樣品和HBc/ HBe抗原包被的順磁顆粒混合，使樣品中的抗HBc/抗HBe與包被于微球的HBc/HBe抗原結 合。清洗后，加入對水解更為穩定的吖啶(acridinium) (US5，468，646)標記的抗人IgG抗 體結合物。之后，再次清洗，向反應容器中加入預觸發O^re-Trigger)和觸發(Trigger)溶 液。最后檢測化學發光反應產生的相對光單位(relative light imitS，RLUS)。該檢測的 專一性可以達到99. 37%-99. 73%。中國發明專利申請200510033411. 1和200610107394. 6 也公開了幾種化學發光法定量檢測乙肝病毒抗體的方法，比較后發現，其各自的原理是相 一致的。由于這類方法需要重新配置專用儀器，不僅將對現有儀器造成空置，該儀器也不能 適用于其它檢測。因此，其可替代性、通用性和普及性等諸多方面都存在一些缺陷。CORNING公司目前提供一種檢測表面處理技術(Corning AssaySurface)，對 普通的聚苯乙烯酶標板表面進行處理，使其表面產生官能基團，如羧基、巰基或氨基等， 然后再與特定的分子通過共價鍵、疏水相互作用或氫鍵等方式包被抗原。此外，還有NUNC 公司銷售的丹麥ExiqonA/S公司許可的ImmobilizerTM酶標板，其上共價固定有谷胱甘肽 (glutathione，GST)、鏈霉親和素(Sti^ptavidin)或鰲合鎳(Nickel-Chelate)等。這些技 術目前僅能滿足于科學研究的需要，還無法滿足于醫療和臨床觀察上大批量體外檢測的需要。

發明內容
本發明的一個目的在于提供一種體外檢測抗體的組合物，該組合物無需事先在檢 測介質，如96孔聚苯乙烯檢測板，表面包被抗原或抗體。避免了生產后對試劑盒檢測產生 的影響，更有利于在日常檢測中大規模應用。本發明的另一個目的在于提供一種體外檢測乙肝病毒C抗體的組合物，根據 ELISA “夾心法”原理，當HBcAb檢測溶液顯色時，則表明HBcAb呈陽性(+)，反之則為陰性 (-)，使檢測結果與人的認識習慣相一致，更便于操作和判斷。本發明的又一個目的在于提供一種體外檢測抗體，如乙肝病毒C抗體的定量檢 測方法，通過測定標準溶液所得曲線，對血清中特定抗體，如HBcAb，實現定量檢測。本發明體外檢測抗體的組合物，包括具有兩個以上抗體識別表位的抗原、抗體結 合蛋白和標記物標記的標記抗體。抗原，或稱目標抗原，具有兩個以上相同或不同的抗體識別表位(Epitope)。該識 別表位可以是由不相同抗體識別表位構成的蛋白或多肽；也可以是兩個以上相同抗體識別 表位構成的蛋白或多肽；還可以在有兩個以上相同抗體識別表位的抗原中加入一個以上另 一種或幾種抗體識別表位組成。對于第三種方式，本領域技術人員可以選擇抗原的組合方 式，如但不僅限于，在兩個以上相同抗體識別表位組成的抗原的N末端或C末端增加一個 以上另一種抗體識別表位；或在所述兩個以上相同抗體識別表位之間增加一個以上另一種 抗體識別表位；或一種抗體識別表位與另一種抗體識別表位互相間隔。這些抗原均能適用于本發明體外檢測抗體的組合物，即具有兩個以上抗原識別表 位，能同時識別或結合兩個以上抗體的抗原。與這些抗原相結合的抗體可以相同也可以不 相同，如但不僅限于，在檢測過程中，抗體通常分別為來自于血清中的待測抗體和結合有 標記物的標記抗體。組成抗原的蛋白或多肽可以是生物體中自身存在的，也可以是通過人工方式合成 的，還可以是將生物體中的抗原經水解得到的多肽。基因工程重組表達是一種可選擇的，通 過人工合成得到所述目標抗原的方式。即將不同或相同抗體識別表位的DNA序列連接于表 達載體上(如表達質粒)，再轉導或轉化入基因工程菌后，再由發酵或細胞培養等方式進 行表達，最后經過分離和純化步驟得到。組成目標抗原的基因數量不同，所適用的表達載 體亦有不同。不同的表達載體也適用于不同的菌種或菌株。常用的基因工程表達體系如 大腸桿菌(Escherichia coli)、酵母菌(Saccharomycescerevisiae)和動物細胞等。本領 域普通技術人員根據教科書、實驗手冊、設備手冊(如GE Healthcare為AKTA系列純化系 統配置的純化指導手冊或光盤)、試劑手冊和相應的載體設計軟件(如=DNAMAN和Vector NTISuite)及其使用說明就能夠實現對目標重組抗原的制備。本領域技術人員所公知，一個 具備一般生物學常識的技術人員根據“《分子克隆實驗指南》(第三版)，科學出版社，2002” 一書所記載的各種方法，就能夠實現基因工程領域的分子生物學各項操作和相應的分離純 化。本發明所述抗原還可以采用化學方式(如有機合成)合成或連接。抗原的化學 合成可以參照多肽合成的常規方法實現。抗原的化學連接是將不同或相同抗體識別表位連接在一起而得到。由于抗體識別表位的分子量較小，將兩個相同或不同的抗體識別表位通 過化學方式連接于高分子聚合物所得到的抗原，其能夠避免分子間空間構想的干擾，更有 利于特異抗體與抗體識別表位的結合。抗體結合蛋白是能與抗體共價或非共價結合的多種氨基酸，如但不僅限于，色氨 酸、蛋氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、賴氨酸、組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、半胱氨 酸、精氨酸、甘氨酸、絲氨酸、酪氨酸、谷氨酸、天(門)冬氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺和天冬酰 胺，的聚合體。這些結合蛋白能與抗體的某些區域，如Fc片段和抗體輕鏈，非共價結合。這 些非共價鍵，如氫鍵、離子鍵、疏水相互作用和范德華力。根據抗體上結合標記物的類型，需要再次加入底物以完成檢測。檢測應當理解為 單獨或結合運用肉眼觀察和儀器識別顏色、在特定波長下的光吸收值或化學發光的方法。 如當結合于抗體的標記物為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶時，需要加入顯色反應物后先 使溶液顯色，再通過肉眼辨別顏色或在特定波長下通過儀器檢測吸收光值的方式確定樣品 中是否存在待測抗體；當結合于抗體的標記物為半乳糖苷酶時，加入的反應底物先發 出熒光，再通過儀器測定的方式確定樣品中是否存在待測抗體；當結合于抗體的標記物為 化學發光物時，直接通過儀器對標記抗體上結合的標記物進行測定，就能確定樣品中是否 存在待測抗體。用于體外檢測抗體的組合物，抗體結合蛋白包被于檢測板表面，抗體結合蛋白能 與待測抗體結合，抗原同時與待測抗體和結合有標記物的標記抗體相結合。根據標記物的 種類，加入必要的底物后完成對待測抗體的體外檢測。抗體結合蛋白能與抗體共價或非共價結合，如但不僅限于，抗人IgG抗體；葡萄 球菌蛋白A (Protein A)，其來自于葡萄球菌的細胞壁，分子量42kD，能夠與抗體的Fc非共 價結合；大消化鏈球菌蛋白UProtein L)，其能與抗體輕鏈非共價結合。此外，還可以使用 鏈球菌蛋白G(Protein G)，如65kD的G148蛋白G和58kD的C40蛋白G，或葡萄球菌蛋白 A和鏈球菌蛋白G的融合蛋白A/G(Protein A/G)。抗體結合蛋白選自于這些蛋白之一種或 幾種。抗體結合蛋白包被于檢測板表面的量為0. lng/Cm2-9，000ng/Cm2，通常為Ing/ cm2-5, 000ng/cm2，進一步選擇 lng/cm2_l，000ng/cm2，優先選擇 100ng/cm2_500ng/cm2。抗 體結合蛋白于檢測板包被量可以使用蛋白的定量檢測方法進行確定，如直接紫外吸收法、 Bradford法、Lorry法和BCA法等確定。本發明中優先使用BCA法確定抗體結合蛋白在檢 測板表面的包被量。檢測板為固相介質，選自于塑料或玻璃。塑料應當理解為全部或部份由碳與氧、氫、氮及其它有機及無機元素化合而成，在 制造的最后階段成為固體，在制造中某些階段是液體(塑料材料在成為最終產品以前，在 某些階段必需要能夠流動)，因而可以加熱或加壓力，或二者并用的方式，使其形成各種形 狀，此龐大而變化多端的材料族類中的任何一種，如樹脂、熱固性樹脂、纖維素衍生物等，在 一條長鏈的分子結構中存在眾多的重復原子或分子。塑料包括人工合成或自然界有機材 料。制成載體介質的所用的塑料或使用一種塑料材料，或使用幾種塑料材料在物理上的疊 加或相加后的復合，其具體形態為塑料板。玻璃應當被理解為易碎的非晶體物質，這些物質可以是透明的也可以是半透明的，通常由熔融硅和硅碳酸鹽融合組成。玻璃還可以認為是一類不具有結晶過程，而是由熔 化狀態固化而來的材料，大體上由Na20、Ca0和化學氧化物組成，具有光學屬性和各種 機械屬性。具體地說，所述的檢測板由聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚碳酸酯或玻璃等制成， 具有多孔構造，如96孔或48孔酶標板。抗原，應當具有兩個以上相同或不同的抗體識別表位，并可以選擇基因重組方式 實現。對于具有相同或不同抗體識別表位的蛋白或多肽融合后的抗原，其構建原則和方法 是本領域普通技術人員所周知。為了不影響待融合肽段的各自的功能，一般需要在不同肽 段之間添加一個接頭。文獻ftOtein Eng.，2001，14，5四-532中提供并詳細描述了多種用 于多肽或蛋白融合的接頭，這些內容可以作為本領域普通技術人員選擇適合接頭提供一些 參考。一般而言，用于將兩個以上相同或不同的抗原識別表位相連接而形成的重組抗原 所選擇的多肽或蛋白質，其序列長度一般為1-100個氨基酸，通常選擇長度為4-30個氨基 酸的多肽，優先選擇長度為4-15個氨基酸的多肽。組成這些多肽和蛋白質的氨基酸指既具 有共價連接氨基又共價連接羧基的不對稱中心碳原子的有機分子。化學方式(如有機合成)合成或連接是另一種得到本發明所述抗原的方式。抗 原的化學合成可以參照多肽合成的常規方法，如，但不僅限于，Fmoc多肽合成方法(J. Org. Chem.，1972，37，3404-3409 ；Eur. J. Immunol.，1994，24，3188-3193 ；黃惟德，陳常慶多肽合 成，北京科學出版社，198 。抗原的化學連接是將不同或相同抗體識別表位連接在一起而 得到。這些連接方式，如但不僅限于，將兩個相同或不同的抗原表位經化學過程直接連接； 或通過化學方式將兩個相同或不同的抗原表位均與一個長度為4-15個氨基酸的多肽接頭 相連；或通過化學方式將兩個相同或不同的抗原表位均與一個有機小分子或有機大分子相 連。此外，由于抗體識別表位分子量通常較小，還可以將兩個相同或不同的抗體識別 表位通過化學方式連接于高分子聚合物的方式得到目標抗原。高分子聚合物(polymer)是指分子量大于2，OOODa的化合物，分子間由結構單位 (structural unit)或單體經由共價鍵相互連接在一起。其結構可以為直線型(linear)、 分枝型(branch/multi-arm)或分叉型(dendrimer)。所述聚合物選自于，但不僅限于，聚乙 二醇、聚氨基酸、聚核苷酸、聚乳酸、聚賴氨酸、聚亞胺和10個以上單糖通過糖苷鍵形成的 多聚糖(polysaccharide)，如但不僅限于，淀粉及其水解產物、纖維素、甲殼素或葡聚糖。分叉型聚合物(dendrimer) —般為聚氨基胺(poly (amidoamine)，PAMAM)，可以分 別由氨或乙二胺為起始物制備(Clin. Chem.，1994，40，1845-1849)，也有使用氨基酸聚合而 成(J. Immuno. Method.，1996，196，17-32)，如賴氨酸和精氨酸。所得聚合物具有活性基 團，如氨基、羥基或羧基，聚合次數越多，其分子量越大，官能團也越多，所能結合的分子也 相應增加。聚乙二醇選自于兩端均未封閉或一端封閉的聚乙二醇，封閉基團選自于C1-C30 烷基，C1-C30脂肪酸或C3-C30糖基。聚乙二醇選自于分子量2，000-100，OOODa，可以選擇 2，000-50, OOODa, 一般選擇5，000-50, OOODa0進一步的，所述封閉基團選自于C1-C20烷基， 通常選擇Cl-ClO烷基，優先選擇甲基、乙基或丙基。
聚氨基酸包括由相同氨基酸聚合而成的寡聚分子，也包括由不同分子聚合而成的 多聚分子，蛋白質或多肽是其天然存在形式。這些蛋白質包括從生物體中分離得到的天然 產物及其水解產物，也包括基因工程重組的產物及其水解產物，還包括通過化學方式直接 合成的或將不同多肽片段連接而成的產物。多肽的長度應當15個氨基酸以上，包括從生物 體中分離得到的天然產物及其水解產物，也包括基因工程重組的產物及其水解產物，還包 括通過化學方式直接合成的或將不同多肽片段連接而成的產物。各種相同或不同的抗體識別表位與高分子聚合物共價結合 (covalentconjugate)，形成的共價鍵如但不僅限于，酰胺鍵(amide bond)、尿鍵(urine bond)、酯鍵或二硫鍵。抗體識別表位通過其氨基酸側鏈、N末端氨基或C末端羧基與高 分子聚合物相結合。這種結合可以通過如但不僅限于，N-羥基琥珀酰亞胺、馬來酸酐或 丙/乙醛基等試劑將氨基酸側鏈、N末端氨基或C末端羧基進行活化后與高分子聚合物相 結合，也可以適用前述相同或不同的方式，先活化高分子聚合物的基團后，再與目標抗原 (如乙肝病毒C抗原)相結合。其它還有通過腙(hydrazone)、肟(oxime)、巰基或噻唑烷 (thiazolidine)等方式結合(J. Immuno. Method, 1996，196，17-32)。各種相同或不同的抗體識別表位與糖類分子之間的結合方式參見J. Wiarma. Sci. 87,326-332 ；Adv.Drug deliv. Rev. ，6，103-131 ；Adv. Drugdeliv. Rev. ，13，251—267。 聚乙二醇與各種抗原表位的結合方式參見Adv. Drug deliv. Rev. ,28,275-299 ；Adv. Drug deliv. Rev.，54，453-609 ；Adv. Drug deliv. Rev.，60，1-88。由于抗原表位與高分子聚合物 結合所涉及的化學反應相同或相似，本領域普通技術人員在參考這些結合方式的情況下， 可以將其同樣應用于各種抗體識別表位與其它聚合物結合的反應當中以得到目標抗原。各種相同或不同的抗體識別表位還可以通過連接子(space linker)以化學連接 的方式與高分子聚合物間接連接。這種連接子選自于氨基酸長度1-500的多肽或蛋白質、 分子量在100-2，OOODa的聚合物或有機小分子。如但不僅限于，分子量為200-2，OOODa 的兩端活化的聚乙二醇(NOFCorporation)、NH2 (CH2)nC00H、SH(CH2)nCOOH或兩端活化的 C1-C30的脂肪酸(J. Gene. Med.，2005，7，604-612)。化學連接可以是抗體識別表位N末端 或C末端與上述連接子上的活化基團連接，也可以由抗體識別表位某一個氨基酸側鏈與連 接子上的活化基團連接。連接子與抗體識別表位之間形成共價鍵，如但不僅限于，酰胺鍵、 尿鍵、酯鍵、、硫醚鍵、腙鍵(-CH = N-NH-)、肟鍵(-CH = N-0-)和二硫鍵。所形成的共價鍵 選自于這些化學鍵之一種或幾種。本發明使用標記物的目的在于，當結合有標記物的抗體與已結合血清中抗體的 抗原相結合后，通過儀器可以將該標記直接檢測，或通過顯色反應檢測溶液吸光度，從而 對血清是否存在待測抗體進行判斷。這些標記物選自于，但不僅限于，熒光標記物(如 異硫氰基熒光素)、同位素標記、酶標記物(如堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶)和化學 發光標記物(美國專利5，468，646)等。以酶標記為為例，當使用辣根過氧化物酶(horse radishperoxidase, HRP，EC. 1. 11. 1.7)標記抗體時，所用的顯色反應物可以為3,3'，5， 5'-四甲基聯苯胺(3，3' ,5,5' -Tetramethylbenzidine, TMB) 在檢測過程中，標記物含量的差異，就使得檢測值產生高低差異，再配合一條標準 曲線，就可以實現對未知濃度的血清樣品中待測抗體進行定量檢測。為了提高檢測效果，可以在加入抗原和結合有標記物的抗體同時加入血清或純化的IgG蛋白。在總體積為100 μ L的反應體系中，血清的加入量> 1 μ L ；或純化的IgG蛋白 加入量> 50 μ go對于人特異抗體(如=Anti-HBc)的體外檢測中，優選的，使用健康人血清(含有 人IgG)或純化得到的人IgG蛋白來封閉抗體結合蛋白游離位點，以防止假陽性結果出現。本領域技術人員可以直接購買或委托定制已純化的人IgG蛋白試劑，也可以通 過教科書或實驗手冊中的方式從健康人血清中純化人IgG蛋白，如采用商品化的親和層 析試劑、商品化的IgG結合蛋白試劑(Pierce ，Thermo Scientific)對人IgG進行純
化；還可以使用硫酸銨鹽析和DEAE-纖維素層析法對人IgG純化，或由DEAE-纖維素或 DEAE-S印hadeXA50樹脂對人IgG直接提取。此外，還可以通過基因工程方式，通過動物細胞 及表達載體得到含有重組的人IgG蛋白(如單克隆IgG蛋白)的發酵液，再通過后續純化 得到人IgG蛋白。純化后產物純度的檢測方法，如但不僅限于，瓊脂雙相雙擴散法、免疫電 泳法或圓盤電泳法。當檢測結果為一條區帶時，認為已獲得人IgG蛋白純品。一種本發明體外檢測乙肝病毒C抗體的組合物，主要包括抗體結合蛋白包被的檢 測板、具有兩個以上抗體識別表位的乙肝病毒C抗原、健康人血清或純化的人IgG蛋白、結 合有標記物的乙肝病毒C抗體和顯色底物。另一種本發明體外檢測乙肝病毒C抗體的組合物，主要包括抗體結合蛋白包被的 檢測板、具有兩個以上抗體識別表位的乙肝病毒C抗原、健康人血清或純化的人IgG蛋白、 辣根過氧化物酶標記的乙肝病毒C抗原的抗體和TMB底物。抗體結合蛋白選自于抗人IgG抗體、Protein A、Protein L、Protein G和 Protein A/G之一種或幾種，優先選擇ftOtein Α。抗體結合蛋白包被于檢測板的量為Ing/ cm2-5, 000ng/cm2,通常為 lng/cm2_l，000ng/cm2,進一步選擇 lng/cm2_500ng/cm2，優先選擇 100ng/cm2-200ng/cm2。在總體積100 μ L的待測抗體-抗原-標記抗體的體系中(即反應體系)，健康人 血清加入量彡1 μ L，優先選擇5 μ L0在總體積100 μ L的待測抗體-抗原-標記抗體的體系中(即反應體系)，純化的 人IgG蛋白加入量> 50 μ g，優先選擇100 μ g。檢測中，需要先將抗體結合蛋白，如葡萄球菌蛋白A，包被于酶標板表面，加入稀 釋或未稀釋的待測血清樣品，使酶標板上的抗體結合蛋白與樣品中抗體相結合；清洗后，加 入HBcAg、HRP標記的抗HBcAg抗體(優先選擇單克隆抗體)和健康人血清或純化的人IgG 蛋白，使樣品中的乙肝病毒C抗體和HRP標記的抗HBcAg抗體都與HBcAg相結合。再次清洗 后，加入顯色底物TMB和反應終止液，最后在450nm波長下檢測。隨著樣品中所含HBcAb的 量不同，其顯色后溶液吸光度也有變化，這樣通過若干個檢測點就可以得到一條標準曲線， 用以血清中未知含量HBcAb的定量。另一種本發明所述的乙肝病毒C抗體的體外檢測方法，包括如下步驟1.將葡萄球菌蛋白A包被于多孔酶標板，4°C過夜；2.除去包被液，加入200 μ 1/孔封閉液(如:ρΗ7. 4，1 % (w/v) BSA的PBS溶液)， 4°C過夜或37°C孵育1-2小時；3.除去封閉液，清洗酶標板，將已知不同濃度的HBcAb標準品和稀釋或不稀釋的 待測血清樣品分別加入酶標板各個孔中，100 μ 1/孔，37°C孵育1小時；
4.清洗酶標板，加入HBcAg、HRP標記的抗HBcAg單克隆抗體和健康人血清或純 化的人IgG蛋白，混勻，37°C孵育30分鐘，再次清洗酶標板，加入顯色底物TMB，37°C孵育 15-30分鐘，加入終止液；5.在450nm波長下檢測各孔中溶液的吸光度值。通過建立不同濃度HBcAb與吸光度的坐標關系，得到一條標準曲線及其公式，然 后將未知濃度的血清樣品吸光度值代入公式中就可得到相應的HBcAb含量。最后結合樣品 稀釋度得出實際的定量結果。本發明所述的乙肝病毒C抗原，包括SEQ ID No :1所示的序列，也包括從其抗原序 列上獲取的具有70%以上同源性的2種以上抗體結合表位的多肽進行重組后得到的重組C 抗原。本發明所述的乙肝病毒C抗原還可以使用蛋白質表位預測軟件，如=BIOSUN(北京 基礎醫學研究所計算生物學中心)，選取抗原中具有一個或多個表位、尤其是優勢表位(能 夠激發較強的免疫反應的表位)的相應肽段，通過常規的分子生物學方法釣取其編碼序 列并表達出該抗原多肽；或依據功能區段對C抗原表位進行篩選(J. Immunol.，1988，141， 4376-4380 ；Immuno. Lett.，1991，30，59-68 J. Gen. Virol.，1993，74，1335-1340)。從特定 抗原表位中選擇適宜的抗體，可以采用免疫抗體庫的噬菌體展示技術進行篩選(J. Immunol Method,2008，329，176-183)。本發明所述的乙肝病毒C抗原可以為如SEQ ID No 1所示序列。也可以從SEQ ID No 1上選擇兩個以上的抗體識別表位，使用基因工程方法在體外進行重組，如以大 腸桿菌(Virus Res, 1989，14,27-48)、酵母(J Biotechnol.，1993，四，243-255 ；美國專利 6，277，631)、赤畢酵母(J Biotechnol.，2008，138，1-8)、哺乳動物細胞(Antiviral Res, 2006，72，116-124)或昆蟲細胞(Biotechnology, 1995,13, 261-264)為重組表達系統，使經 重組后表達的重組乙肝病毒C抗原(rifficAg)具有2個以上的抗體結合(識別)表位。本發明所述的乙肝病毒C抗原如SEQ ID No 1所示序列，或從SEQID No 1上選 擇兩個以上的抗體結合表位，通過化學方式連接后得到的抗原，或從SEQ ID No :1上選擇兩 個以上的抗體結合表位，通過化學方式與高分子聚合物連接后得到的抗原。本發明技術方案實現的有益效果本發明體外檢測抗體的組合物使用特定包被量的抗體結合蛋白的酶標板，使得抗 體的Fc片段與抗體結合蛋白相結合，有效提高檢測效果。當該組合物用于乙肝病毒C抗體體外檢測時，在加入抗原和結合有標記物的抗體 同時使用健康人血清或從血清中純化得到的人IgG蛋白，增強了檢測效果。本發明所涉及的術語與其一般概念相同。所述的“抗體識別表位通過化學方式連接于高分子聚合物”指抗原直接或通過連 接子間接與高分子聚合物共價結合。所述的“乙肝病毒C抗原與高分子聚合物共價結合”指乙肝病毒C抗原直接或通 過連接子間接與高分子聚合物共價結合。所述的“C1-C10烷基”、“C1-C20烷基”和“C1-C30烷基”指直鏈或支鏈烷基，如甲
基、乙基、丙基、異丙基、丁基或異丁基等。其中，字母C表示碳原子，其后數字為正整數，如 1、2、3、4或5等，表示基團所含的碳原子個數。
所述的“C1-C30的脂肪酸”指飽和或不飽和的直鏈或支鏈碳鏈，其上至少有一個羧 基，如甲酸、乙酸、丙酸、油酸、亞油酸、軟脂酸，十八碳四烯酸、琥珀酸和蘋果酸等。其中，字 母C表示碳原子，其后數字為正整數，如1、2、3、4或5等，表示基團所含的碳原子個數。所述的“C3-C30的糖基”，如丙糖基、丁糖基、戊糖基和己糖基等。其中，字母C表 示碳原子，其后數字為正整數，如3、4或5等，表示基團所含的碳原子個數。所述的“血清”指血清來源于經診斷為健康的個體的血液，且不含有待測抗體以及 對檢測產生交叉反應(假陽性)的抗體。健康的個體為臨床診斷為健康的人、獸醫診斷為健康的野生動物和家畜 (Livestock) 0野生動物為自然狀態下未經人工馴化的動物。家畜是為了提供食物來源而 人工飼養的動物，如狗、鼠、倉鼠、豬、兔、奶牛、水牛、公牛、綿羊、山羊、鵝和雞等。所述的“健康人血清”指血清來源于臨床診斷為健康人體的血液，且不含有待測抗 體以及對檢測產生交叉反應(假陽性)的抗體。以體外檢測患者的乙肝抗體為例，健康人 血清應當理解為乙肝表面抗原(HBsAg)、抗HCV抗體和抗HIV抗體檢測均為陰性的血清。在 檢測乙肝病毒C抗體，同時應不含有待測抗體的血清。如當組合物是檢測乙肝病毒C抗體 時，健康人血清為來自于非肝炎和艾滋病患者的血液。
具體實施例方式以下詳細描述本發明的技術方案。本發明實施例僅用以說明本發明的技術方案而 非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解， 可以對發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍， 其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍中。本發明所用的試劑若未明確指明，則均購自于西格瑪-奧德里奇 (Sigma-Aldrich)。實施例IProtein A包被于酶標板選擇未經處理的聚苯乙烯酶標板，加入1.2 μ g/ml Protein A溶于碳酸鹽緩沖 液，ρΗ9. 2-9.8，100μ 1/孔，4°C過夜。去除包被液，每孔加入1 % (w/v)BSA溶液(PBS， PH7. 4) 200 μ 1進行封閉，4°C過夜(12-18小時)或37°C 1-2小時，所得酶標板表面包被有 100-200ng/cm2Protein A。實施例2血清樣品檢測方法用PBST (含有0. 05% Tween-20的PBS緩沖液)清洗酶標板1_2次，每次拍干。每孔加入90 μ 1 PBS后，每孔加入待測血清10 μ 1，混勻后于37°C孵育60分鐘。去除反應液并拍干后，用PBST洗板4次，每次均拍干。每孔加入40 μ 1重組HBcAg(SEQ ID NO :1，由上海榮盛生物藥業有限公司提供) (用PBS稀釋1 2000)、40 μ 1經HRP標記的抗HBcAg抗體(用PBS稀釋1 20000)以及 20 μ 1含有健康人血清(25 %，ν/ν)。每孔分別加入底物A和B液各50 μ 1，混勻，37°C孵育15分鐘，然后加入終止液， 450nm酶標儀測定。底物A液配制稱取檸檬酸17. 9g和Na2HPO4 · 1220 4. 67g溶解于400ml去離子水中，然后緩慢加入30% (w/w)H2A330yL，攪拌均勻后，加水至500ml。分裝成IOml/瓶，2 8°C下保存。底物B液配制稱取TMB 0. Ig于IOOml去離子水中，加入DMSO 2. 5ml，在攪拌的同時，緩慢加入 0. 5ml 6M HCl，直至完全溶解，最后加水至500ml。分裝成IOml棕色小瓶，2 8°C下保存。底物反應終止液的配制分別量取98% H2S0455ml和去離子水445ml，然后將濃硫酸緩慢加入到去離子水 中，混勻，分裝成IOml/瓶，2 8°C下保存。在酶標板中加入5種不同濃度的已知HBcAb標準品和稀釋的待測血清樣品分別加 入酶標板各個孔中，使用相同的檢測方法就能實現HBcAb的定量檢測。實施例3HBcAb檢測平行對照以目前使用的HBcAb競爭ELISA檢測試劑盒(上海榮盛生物藥業有限公司)進行 對照。共有350例標本用于此實驗，其中，大三陽(HBsAg、HBeAg和 HBcAb 陽性):110 例;小三陽(HBsAg、HBeAb和 HBcAb 陽性):100 例；健康人血清(來自血庫)140例。檢測結果見表1。表IHBcAb檢測平行對照
權利要求
1.一種體外檢測乙肝病毒C抗體的組合物，包括具有兩個以上抗體識別表位的抗原、 包被有抗體結合蛋白的檢測板、標記物標記的標記抗體和血清或純化的IgG蛋白。
2.根據權利要求1所述的體外檢測乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所述的檢測 板表面包被的抗體結合蛋白量為0. lng/cm2-9, OOOng/cm2。
3.根據權利要求1所述的體外檢測乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所述血清使 用量彡1 μ 1/100 μ 1反應體系。
4.根據權利要求1所述的體外檢測乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所述純化的 IgG蛋白使用量彡50μδ/100μ 1反應體系。
5.一種體外檢測乙肝病毒C抗體的組合物，主要包括抗體結合蛋白包被的檢測板、具 有兩個以上抗體識別表位的乙肝病毒C抗原、健康人血清或純化的人IgG蛋白、結合有標記 物的乙肝病毒C抗體和顯色底物。
6.根據權利要求5所述的體外檢測乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所述檢測板 的表面包被的抗體結合蛋白量為lng/cm2-5，OOOng/cm2。
7.根據權利要求5所述的體外檢測乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所述檢測板 的表面包被的抗體結合蛋白量為lng/Cm2-500ng/Cm2。
8.根據權利要求5所述的體外檢測乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所述血清使 用量彡1 μ 1/100 μ 1反應體系。
9.根據權利要求5所述的體外檢測乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所述純化的 IgG蛋白使用量彡50μδ/100μ 1反應體系。
10.根據權利要求5所述的體外檢測乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所述的抗體 結合蛋白選自于Protein A、Protein G、Protein A/G、Protein L和抗人IgG抗體之一種 或幾種。
11.根據權利要求5所述的體外檢測乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所述的抗原 為乙肝病毒C抗原。
12.根據權利要求5所述的體外檢測乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所述的乙肝 病毒C抗原為重組乙肝病毒C抗原。
13.根據權利要求5所述的體外檢測乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所述的乙肝 病毒C抗原氨基酸序列選自于SEQ ID No:l。
14.根據權利要求5-13之一所述的體外檢測乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所 述的乙肝病毒C抗原由赤畢酵母重組表達。
15.根據權利要求5所述的體外檢測乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所述的乙肝 病毒C抗原為將兩個相同或不同的抗體識別表位通過化學方式連接于高分子聚合物所得 到的抗原。
16.根據權利要求15所述的體外檢測乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所述抗體 識別表位與所述高分子聚合物之間的共價鍵選自于酰胺鍵、尿鍵、酯鍵、、硫醚鍵、腙鍵、肟 鍵和二硫鍵之一種或幾種。
17.根據權利要求5所述的體外檢測乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所述的乙肝 病毒C抗原為從SEQ ID No :1上選擇兩個以上的抗體結合表位，通過化學方式連接后得到 的抗原。
18.根據權利要求5所述的體外檢測乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所述的乙肝 病毒C抗原為從SEQ ID No :1上選擇兩個以上的抗體結合表位，通過化學方式與高分子聚 合物連接后得到的抗原。
19.根據權利要求5所述的體外檢測乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所述的標記 物選自于熒光標記物、同位素標記、酶標記物或化學發光標記物。
全文摘要
一種體外檢測乙肝病毒C抗體的組合物，包括具有兩個以上抗體識別表位的乙肝病毒C抗原、抗體結合蛋白和標記物標記的標記抗體。通過在檢測介質上包被特定量的抗原結合蛋白，使其對待測抗體更有效的結合從而增強檢測效果。
文檔編號G01N33/576GK102062779SQ20091019883
公開日2011年5月18日 申請日期2009年11月17日 優先權日2009年11月17日
發明者朱紹榮 申請人:上海榮盛生物藥業有限公司