專利名稱：一種同時多細胞捕獲的微流控細胞芯片的制作方法
技術領域：
本發明屬生物技術檢測領域，涉及微流控細胞芯片領域，具體涉及一種同時多細 胞捕獲的微流控細胞芯片。
背景技術：
腫瘤細胞從原位脫落進入血管形成血循環癌細胞，及早捕獲分選出這些細胞對癌 癥轉移的早期診斷及預后監測有著重大的臨床意義。但由于血循環中充滿了大量正常血 細胞，平均十億個血細胞中只有一個循環癌細胞，因此，捕獲及分選這些極微量的循環癌細 胞是極具挑戰的。傳統的細胞分選方法是利用流式細胞儀，對待測樣品進行特定的熒光標 記，然后利用復雜的光學檢測系統進行鑒定分選。然而，流式細胞儀設備昂貴，需要專業操 作人員，大多只能在大型醫療機構的中心實驗室進行，很難普及到廣大邊遠及落后地區。因 此，開發一種小型、廉價、操作簡單、甚至是一次性使用的循環癌細胞檢測器件是非常有必 要的。微流控芯片技術由于其制造成本低廉、檢測速度快、試劑消耗少等諸多優點正被 越來越多的研究者所關注，已發展出多種微流控細胞捕獲分選技術，如利用細胞直徑進行 物理分選，利用熒光或磁性標記進行分選等。由于芯片制備技術的局限，目前大多數研究仍 停留在單種細胞的捕獲，對于多種細胞的并行捕獲仍然缺乏良好的手段。Sunitha Nagrath 等在 Nature 上公開了 (Sunitha Nagrath, Lecia V. Sequist, Shyamala Maheswaran et al Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology Vol 450 | 20/27 December 2007)，在流道內設置微柱陣列，在微柱表面固定上 皮細胞粘附因子抗體(EpCAM)，以此來捕獲多種上皮來源的癌細胞。由于不同類型的癌細胞 上皮粘附因子的表達量相差很大，細胞捕獲的靈敏度及效率極大依賴于細胞的類型，因此 固定EpCAM抗體對于表達量小的癌細胞就很難獲得滿意的捕獲效率。Xuanhong Cheng等 (Xuanhong Cheng， Amit Gupta， Chihchen Chen etal Enhancing the performance of a point-of-care CD4+T~cellcounting microchip through monocyte depletion for HIV/ AIDSdiagnostics Lab on a Chip First published as an Advance Article on the web 4th February 2009)公開了將芯片上的抗體分子固定分成兩個區域，前段預先在PEG-水 凝膠玻片上點樣CD14抗體進行單核細胞捕獲，后端在流道內固定CD4抗體進行CD4陽性T 細胞的捕獲。該方法把點樣芯片與流道芯片簡單相加，操作過程比較復雜，且分步制造的方 法破壞了芯片設計的整體性，不利于芯片進一步的集成。Ye Xu等在Analytical Chemistry 發表文章(Ye Xu, JosephA. Phillips, Jilin Yan etal Aptamer-Based Micro IZIuidic Device for Enrichment, Sorting, and Detection of Multiple Cancer CellsAnal. Chem. 2009，81，74367442)，設計蛇形管道劃定不同檢測區域，在每個檢測區域的上下游設 置進出樣開孔，利用開孔的交替開放與封閉在不同區域固定上各自不同的核酸適體，以此 來達到在同一管道中并行捕獲多種癌細胞的目的。該方法設計較上兩種巧妙，但多次重復 的流道固定使芯片制備過程時間長、步驟多，又由于在同一管道內進行流動固定，容易產生3上下游的交叉污染，使假陽性增高，而為了控制假陽性率，必須加長各區域的長度，這又對 芯片的進一步集成造成了障礙。因此，臨床實踐中需要開發一種新的細胞捕獲分選芯片，期望其具備能夠同步完 成多種生物分子的固定，通過一次樣品進樣就能對多種癌細胞進行捕獲分選，同時還具有 操作簡便、集成度高的特點。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術存在的不足，提供一種新的細胞捕獲分選芯片， 具體涉及一種同時多細胞捕獲的微流控細胞芯片。本發明在微流控芯片內通過一次進樣能 同時捕獲多種癌細胞。本發明的同時多細胞捕獲的微流控細胞芯片包括微流細胞芯片載體和不同的生 物分子抗體溶液，不同的生物分子抗體溶液固定在芯片載體的不同特定區域。本發明中，所述生物分子可與特異性的靶細胞進行反應，選自蛋白質、核酸、脂類、 糖類中的一種或多種。本發明的同時多細胞捕獲的微流控細胞芯片通過下述方法制備，首先制作微流細 胞芯片模具，在模具表面涂覆防粘涂層，例如Teflon層，再將不同的生物分子抗體溶液鋪 展于芯片模具表面特定的位置，隨后澆鑄PDMS，熱烘后脫模，生物抗體分子在脫模過程中轉 移到PDMS芯片上，從而使細胞捕獲芯片的不同位置固定上不同的抗體，且相互獨立，不會 交叉污染。本發明的制備方法包括如下步驟第一步，首先制作芯片模具，可采用微機電加工中的硅深刻蝕技術制作硅模具，或 在基底片上旋涂光刻膠，通過光刻顯影后形成光刻膠模具；也可通過激光加工、精機械加工 的方法制作金屬模具等。第二步，在陽版模具表面均勻滴加Teflon溶液，甩涂機適當轉速進行甩涂。第三步，表面甩涂Teflon的芯片模具進行熱烘，自然冷卻。第四步，在芯片特定位置鋪展不同的生物分子抗體溶液。第五步，將PDMS的預聚體與固化劑混合，經超聲、攪拌、真空脫氣等步驟后澆鑄在 陽版模具上，適當溫度熱烘，自然冷卻。第六步，PDMS芯片從模具上脫模同時抗體分子隨之轉移至PDMS芯片表面，適當鍵 合后形成多種細胞捕獲芯片。本發明方法制得的細胞捕獲芯片可用于從含有復雜細胞成份的樣本，如全血或組 織中，通過一次樣品進樣進行多種細胞尤其是癌細胞的捕獲和分選。同時還具有操作簡便、 集成度高的特點。本發明中，所述的癌細胞包括宮頸癌、乳腺癌及結腸癌循環癌細胞及其他癌細胞。本發明的芯片制備方法與現有技術方法相比較，具有下述特點制備快速，多種生 物分子抗體的固定一次完成，無須重復固定，檢測靈敏度高，能根據不同的待檢細胞涂布針 對性的抗體，特異性好，極大減少了上下游交叉污染的可能，制備成本低，模具可重復使用， 且無需復雜的表面修飾過程，具有廣泛的應用前景。為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發明的進行詳細地描述。需要特別指出的是，具體實例和附圖僅是為了說明，顯然本領域的普通技術人員可以根據本 文說明，在本發明的范圍內對本發明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入 本發明的范圍內。
圖1本發明的工藝路線示意圖，其中顯示了根據本發明的方法制備的微流控芯片 在各個步驟中的剖面結構。
具體實施例方式實施例1 如圖1所示，根據本發明的方法主要包括如下步驟第一步，首先是制作模具，可采用微機電加工中的硅深刻蝕技術制作硅模具，或在 基底片上旋涂光刻膠，通過光刻顯影后形成光刻膠模具；也可通過激光加工、精機械加工的 方法制作金屬模具等。第二步，在模具表面均勻滴加Teflon溶液，甩涂機適當轉速進行甩涂。第三步，表面甩涂Teflon的芯片模具進行熱烘，自然冷卻。第四步，在芯片特定位置鋪展不同的抗體溶液。第五步，將PDMS的預聚體與固化劑混合，經超聲、攪拌、真空脫氣等步驟后澆鑄在 陽版模具上，適當溫度熱烘，自然冷卻。第六步，PDMS芯片從模具上脫模同時抗體分子隨之轉移至PDMS芯片表面，適當鍵 合后形成多種細胞捕獲芯片。本實施例以制得的宮頸癌、乳腺癌及結腸癌循環癌細胞捕獲分選微流控芯片為 例(1)制備光刻膠模板采用SU-8負性光刻膠(美國Micro Chem公司)，以3000r/min的轉速在單面拋 光的硅片上甩膠，獲得厚度為50 μ m的光刻膠；前烘條件為IOmin從室溫升至65°C，保溫 lOmin，然后IOmin升至95°C，并保溫35min，隨爐冷；曝光采用德國Karl Suss公司MA6型 光刻機，曝光時間為60s ；后烘條件為IOmin從室溫升至90°C，并保溫lOmin，隨爐冷；采用 Micro Chem公司專用的SU-8顯影液，顯影時間為6min，顯影后用異丙醇清洗，氮氣吹干，獲 得所需的光刻膠模板。
(2)模板表面Teflon處理將光刻膠模板置于甩涂機上(美國Micro Chem公司)，均勻滴加Teflon溶液， 200rpm 預轉 10s, 500rpm 轉 30s。(3) 1Tef Ion 處理后熱烘將Teflon處理后的光刻膠模板置于烘箱內，180°C熱烘2小時，自然冷卻。(4)涂布細胞表面標志物特異性抗體將人乳腺癌細胞特異性結合物(雌二醇復合物)、人宮頸癌細胞特異性抗體(抗人 a6整合素受體抗體)、人結腸癌細胞特異性抗體(抗人CEA抗體)用PBS適當稀釋，涂布于 芯片流道的不同區域，37°C適當干燥。(5) PDMS 澆鑄5
PDMS前體與固化劑(牌號=Sygard 184，美國道康寧公司的產品)按10 1質量 比進行物理混合，充分攪拌，真空脫氣20min后澆鑄在陽版模具上，90°C熱烘20min，自然冷卻。(6) PDMS芯片脫模與鍵合將PDMS芯片從模具上小心揭下，與潔凈玻片加壓鍵合。(7)多種癌細胞的捕獲分選取適量全血，注入芯片，37°C濕盒內孵育30min，PBST(含Tween-20 0. 1% )沖洗 15min后在熒光顯微鏡下進行不同區段的檢測和計數。結果顯示，本發明芯片檢測靈敏度高，能檢測出不同的待檢細胞，且特異性好，上 下游交叉污染少，模具可重復使用，無需復雜的表面修飾過程。本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體 的操作過程，但本發明的保護范圍不限于上述的實施例。
權利要求
1.一種同時多細胞捕獲的微流控細胞芯片，其特征在于，其包括微流細胞芯片載體和 不同的生物分子抗體溶液，所述的不同的生物分子抗體溶液固定在芯片載體的不同特定區 域。
2.按權利要求1所述的同時多細胞捕獲的微流控細胞芯片，其特征在于，所述生物分 子選自蛋白質、核酸、脂類、糖類中的一種或多種。
3.按權利要求1所述的同時多細胞捕獲的微流控細胞芯片，其特征在于，所述生物分 子抗體可與特異性的靶細胞進行反應。
4.按權利要求3所述的同時多細胞捕獲的微流控細胞芯片，其特征在于所述的靶細胞 包括宮頸癌、乳腺癌及結腸癌循環癌細胞及其他癌細胞。
5.權利要求1的同時多細胞捕獲的微流控細胞芯片的制備方法，包括在芯片模具表面 不同區域固定不同的生物分子的步驟，其特征在于，在所述定點固定步驟中，首先利用防粘 涂料涂覆在芯片模具表面；再將不同的生物分子溶液涂布于于特定區域；然后澆鑄PDMS ； 待PDMS澆注層固化后進行脫模，同時揭下所固定的生物分子。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，其中芯片模具采用微機電加工中的硅深 刻蝕技術制作硅模具，或在基底片上旋涂光刻膠，通過光刻顯影后形成光刻膠模具；或通過 激光加工、精機械加工的方法制作金屬模具。
7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述防粘涂料為Teflon材料。
8.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述生物分子選自蛋白質、核酸、脂類、糖 類中的一種或多種，可與特異性的靶細胞進行反應。
9.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，其中經過防粘處理的芯片模具表面點樣 生物分子采用手工點樣，或機械點樣；所述點樣類型為接觸式點樣，半接觸式點樣或非接觸 點樣。
10.權利要求1所述的同時多細胞捕獲的微流控細胞芯片在從含有復雜細胞成份的樣 本中通過一次樣品進樣進行多種細胞的捕獲和分選中的用途。
11.按權利要求10所述的用途，其中所述的含有復雜細胞成份的樣本是全血樣本或組 織樣本。
全文摘要
本發明屬生物技術檢測領域，具體涉及一種同時多細胞捕獲的微流控細胞芯片，包括微流細胞芯片載體和不同的生物分子抗體溶液，所述的不同的生物分子抗體溶液固定在芯片載體的不同特定區域。所述生物分子抗體可與特異性的靶細胞進行反應。本發明的芯片多種生物分子抗體的固定一次完成，模具可重復使用，能實現一次樣品進樣可同時捕獲分選出多種癌細胞，具有較高的靈敏度和特異性，減少了上下游交叉污染的可能，且無需復雜的表面修飾過程，且制備快速，成本低，價格低廉，具有廣泛應用前景。
文檔編號G01N33/68GK102053160SQ20091019849
公開日2011年5月11日 申請日期2009年11月6日 優先權日2009年11月6日
發明者周崇治, 夏駿, 彭志海, 陳翔 申請人:上海交通大學附屬第一人民醫院