專利名稱：煙草中水溶性糖的測定方法
技術領域：
本發明屬于檢測分析技術領域，具體涉及一種煙草中的水溶性糖的測定方法，尤
其涉及煙草中果糖、葡萄糖和蔗糖的測定方法。
背景技術：
煙草中的水溶性糖與煙草的口感、香味特征和焦油生成量關系密切，煙草水溶性 糖含量與其產地和種類都有關系，測定煙草中的水溶性糖對配方設計、工藝生產、煙草品質 監控以及巻煙降焦減害都具有十分重要的意義。 果糖、葡萄糖和蔗糖是煙草中重要的水溶性糖，占煙草水溶性糖的比例很大。液相 色譜法和離子色譜法是測定煙草中這三種糖的主要方法。YC/T 251規定的離子色譜法測定 煙草中水溶性糖，包括柱平衡在內的色譜運行時間較長，需60min以上，樣品處理時間相對 較長，不利于實驗室檢測效率的提高，而且色譜柱和檢測電極需要進行的維護工作較多。
YC/T 32-1996規定的芒森沃克法測定煙草及煙草制品水溶性糖無法對煙草中的 蔗糖和果糖進行單獨測定，只能間接計算得出試樣的還原糖(或水溶性總糖)含量。
劉君等建立了高效液相色譜同時測定煙草中鼠李糖、木糖、果糖、甘露糖、葡萄 糖、蔗糖、麥芽糖等7種水溶性糖的新方法，是以色譜柱ZORBAX糖分析柱(4. 6mmX 150mm， 5 ii m)，乙腈水=68 : 32作為流動相，流速為lml/min，檢測器為蒸發光散射檢測器；孫 雨安等采用水浴浸取法提取煙草中的糖，以Zorbax糖分析柱(柱溫為3(TC)、乙腈水 (80 : 20，V/V)為流動相和蒸發光散射檢測器分離測定煙草中果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖 的含量。以上報道的方法均使用蒸發光散射檢測器，而很多沒有蒸發光散射檢測器的實驗 室無法參照上述方法進行煙草糖的測定工作，三種糖的檢測限均高于或等于1. 6ii g/mL，且 需要使用大量的有毒有害試劑乙腈，不利于環保。
發明內容
本發明的目的是針對現有煙草中水溶性糖的測定技術的不足，提供一種新的測定 方法，采用高效液相色譜結合示差折光檢測方法實現大量樣品的簡單快速批量分析。
本發明的目的通過以下技術方案予以實現 提供一種煙草中水溶性糖的測定方法，采用高效液相色譜檢測方法，具體包括以 下步驟 (1)以提取溶劑對煙草樣品萃取后經過濾得到的濾液作為待測樣品液； (2)采用高效液相色譜結合示差折光檢測器進行樣品水溶性糖的分析測定。 上述步驟(2)是使用以陽離子交換樹脂為填料的色譜柱、以純水作為流動相對煙
草中的水溶性糖進行高效液相色譜分析測定。 所述陽離子交換色譜柱優選Metacarb 67C色譜柱。 本發明提供優選的色譜條件Varian公司Metacarb 67C色譜柱(300mmX6. 5mm)、 Metacarb 67C預柱柱芯。進樣量20 y L ;流速0. 5mL/min ;停泵時間40min ;柱溫箱80°C ;示差折光檢測器(RID)光學元件溫度4(TC ;流動相水，等梯度洗脫。
本發明的有益效果是 本發明方法使用結合有示差折光檢測器的高效液相色譜方法測定煙草中水溶性
糖，采用的是實驗室常用儀器，不使用蒸發光散射檢測器進行煙草糖的測定工作。本發明方法的檢測限在O. 39ii g/mL 0. 71 y g/mL之間，與現有技術相比，檢測限
更低，有利于含糖量低的樣品的果糖、葡萄糖和蔗糖檢測。 本發明使用以陽離子交換樹脂為填料的色譜柱同時以純水作為流動相對煙草中 的水溶性糖進行分析，避免了使用有毒有害的有機溶劑，只使用價格低廉的純水作為流動 相就可以對煙草中的水溶性糖進行很好的測定，靈敏度高、準確、簡便，滿足對各種煙草樣 品中果糖、葡萄糖和蔗糖的快速、準確、批量檢測要求，達到檢測限低、重復性好、樣品前處 理簡單、檢測成本低的效果，并可較快的完成對大量樣品的分析。
圖1果糖、葡萄糖和蔗糖標準色譜圖
圖2煙草樣品色譜圖
具體實施例方式
下面結合附圖和具體實施例進一步詳細說明本發明。
本發明實施例中使用的儀器和試劑如下
儀器與試劑 儀器1200HPLC，配備G1378B脫氣機、G1311A四元泵、G1329A自動進樣器、G1316A 柱溫箱和G1362A示差折光檢測器(美國Agilent公司)；Milli-Q ElementAlO純水機 (美國Millipore公司)；富華HY-5回旋振蕩器(國產，金壇市富華電器有限公司)，德國 Sartorious電子天平CP 224S。 試劑蔗糖，D(-)-果糖，D-(+)-無水葡萄糖(美國Sigma-Aldrich公司)；氫氧化 鈉(比利時Pure Chemical Analysis Co. ，Ltd.)，乙腈(□ 99. 9% GC，德國MERCK公司)； Milli-Q級水，由Milliore Element A10制備，本實施例中若不經特別說明，實驗用水均為 Milli-Q級水。 實施例1高效液相色譜分析色譜條件的選擇
(1)色譜柱的選擇 實驗對比了測糖常用的Metacarb 67C和Sugar-PAK I兩種鈣型式的陽離子交換 色譜柱。 Sugar-PAK I色譜柱的流動相為0. 001M的Ca EDTA，分析時間大于1天的時候，并
需要用加熱裝置把流動相溫度維持在70 90°C ，以防止C02等氣體溶入，操作較麻煩，而且
加熱時伴隨水分的少量蒸發，Ca EDTA在流動相中的濃度增大，使待測糖的保留時間發生改
變，RID對流動相的濃度變化敏感，引起基線的波動，從而影響檢測條件的恒定。 Metacarb 67C只需用純水作為流動相，方便隨時更換流動相，且待測糖的保留時
間能長時間保持一致，在123天內的三種糖保留時間的相對標準偏差小于0. 07% ，見表1所示。
Sugar-PAK I色譜柱的再生操作也比Metacarb 67C頻繁。Metacarb 67C的使用 簡便、分析效果和重現性好，選作實驗使用。 表1蔗糖、果糖和葡萄糖在Metacarb 67C色譜柱上的保留時間
保留時間(min)
第l天第2天第41天第123天RSD (%)
7.506 7.504 7.507 7.507 0鄉 9.420 9.410 9.415 9.420 0.05% 11.27811.279 11.293 11.290 0.07% (2)柱溫和分析時間條件 當柱溫為80°C 9(TC時，有利于降低Metacarb 67C色譜柱柱壓的同時獲得較佳
的柱效。實驗結果見附圖l和附圖2所示，圖中1為蔗糖，2為葡萄糖，3為果糖，將柱溫設
為8(TC，葡萄糖、果糖和蔗糖與鄰近的雜峰分離干凈，保留時間在12min以內。 為了充分洗脫煙草樣品中的其他物質，將色譜運行時間設定為40min。 本發明確定的色譜條件為Metacarb 67C色譜柱(300mmX6. 5mm) 、 Metacarb 67C
預柱柱芯(Varian公司)。進樣量20y L ;流速0. 5mL/min ;停泵時間40min ;柱溫箱
80°C ;示差折光檢測器(RID)光學元件溫度4(TC ;流動相水，等梯度洗脫。
實施例2煙草樣品中水溶性糖的測定實驗
應用本方法對煙草樣品進行水溶性糖的測定。
(1)樣品前處理稱取lg煙草粉末，精確至O. OOOlg，置于100mL三角瓶中，加入50mL0. OIM氫氧化 鈉溶液，具塞振蕩萃取60min，經0. 45 ii m水相濾膜過濾后待測；
(2)標準溶液的配制 稱取葡萄糖O. 25g、果糖0. 25g、蔗糖0. 15g，精確至0. OOOlg，置于100mL容量瓶 中，用水定容，得葡萄糖、果糖和蔗糖濃度分別為2500ii g/mL、2500ii g/mL和1500ii g/mL的 標準儲備液。再逐級用水稀釋至所需要的濃度。
(3)高效液相色譜分析 色譜條件Varian公司Metacarb 67C色譜柱(300mmX6. 5mm) 、 Metacarb 67C預 柱柱芯。進樣量:20ii L ;流速0. 5mL/min ;停泵時間:40min ;柱溫箱:80。C ;示差折光檢測
器(RID)光學元件溫度4(TC ;流動相水，等梯度洗脫。
測定結果見表2所示。 表2實際樣品的果糖、葡萄糖和蔗糖含量(％， w/w)
蔗考糖 線性方程 相關系數 LOD(ng/mL)精密度(RSD, %)
果糖y = 326.330x -157.5851.000000.600.16
葡萄糖y = 357.652x + 7.6940.999990.710.14
蔗糖y = 352.240x + 94.1980.999990.390.85 由表3可見，本發明方法的線性良好，相關系數均大于0.9999 ;果糖、葡萄糖和蔗 糖的精密度在0. 14% 0. 86%之間，方法的精密度良好；方法的檢出限低，可滿足對各類
煙草樣品果糖、葡萄糖和蔗糖的檢測要求。
方法回收率 取煙草樣品，以其平行5次測定的平均值作為計算其果糖、葡萄糖和蔗糖的原始 含量的依據，添加高低兩個濃度水平的標準進行回收試驗，實驗結果見表4所示。
表4方法回收率實驗結果
「ms7， 糖 加標濃度(Hg/mL)測定值(pg/mL) 回收率(％)
121212
果糖193. 201207. 50192.721210.2499.8100.2
葡萄糖186. 001162. 50184.581165.0199.2100.2
蔗糖113. 76711. 00115.64706.70101.799.4 由表4可見，果糖、葡萄糖和蔗糖的回收率在99.2% 101. 7%之間，結果理想。
實施例3本發明方法與離子色譜方法的測試數據對比
田_被
苗翁被
並被 由表2可知，大多數煙草和煙草制品以果糖和葡萄糖含量最高，蔗糖含量相對較 低。 標準曲線線性、檢出限和方法精密度采用外標法定量。以濃度(P g/mL)為橫坐標x，峰面積為縱坐標y進行線性回歸。 以信噪比為3，用逐級稀釋低濃度標準溶液的方法確定檢出限。按照本發發明方法對煙草樣 品A進行5次平行測定，得方法精密度，以RSD表示，結果見表3所示。
表3標準曲線的線性方程、相關系數、檢出限和方法精密度
6 o 5 o 5
1 1 o o 1
7 4 5 8 o
2 3 1 2 o
義1 1 06 od
品
樣
1 2 3 4 5
o o o o o
草草草煙煙
煙煙煙巻巻
本方法和離子色譜法YC/T 251方法進行了檢測數據對比，檢測結果見表5。
表5本方法(LC)和離子色譜方法(IC)的測試數據比較(％， w/w)
樣品果糖葡萄糖蔗糖
ICLCICLC IC
煙草B 煙草C 煙草D9.80 5.94 7.869.67 5.94 7.717.12 3.49 6.587.24 3.58 6.631.27 1.22 1.07 1.06 0.41 0.42 由表5可見，本發明方法與YC/T 251方法的測試數值的相對平均偏差均小于 4. 1%，方法間的一致性較好。 綜上所述，本發明方法線性良好，r > 0.9999，回收率在99. 2% 101. 7%之間， 精密度在O. 14% 0.86%之間，果糖、葡萄糖和蔗糖的檢出限(L0D)分別為0.60、0. 71和
0. 39iig/mL(S/N = 3 : 1)。經實驗對比，本方法和離子色譜法的檢測結果一致。而且本發 明方法檢測限低，重復性好，回收率理想，樣品前處理簡單，分析效率比YC/T 251方法提高 一倍以上，有效的提高了實驗室的日常檢測效率，可較快的完成對大量樣品的分析。
權利要求
一種煙草中水溶性糖的測定方法，其特征在于采用高效液相色譜法，包括以下步驟(1)以提取溶劑對煙草樣品萃取后經過濾得到的濾液作為待測樣品液；(2)采用高效液相色譜結合示差折光檢測器進行樣品水溶性糖的分析測定。
2. 根據權利要求l所述煙草中水溶性糖的測定方法，其特征在于步驟(2)所述高效液 相色譜采用的色譜柱為Metacarb 67C色譜柱。
3. 根據權利要求1所述煙草中水溶性糖的測定方法，其特征在于所述高效液相色譜 分析色譜條件為Metacarb 67C色譜柱、Metacarb67C預柱柱芯；進樣量為20 ii L ;流速為 0. 5mL/min ;停泵時間為40min ;柱溫箱為8(TC示差折光檢測器光學元件溫度為40°C ;流動 相為水，等梯度洗脫。
全文摘要
本發明公開了一種煙草中的水溶性糖的測定方法。本發明建立了高效液相色譜結合示差折光檢測器測定煙草中水溶性糖的方法。本發明方法線性良好，回收率在99.2％～101.7％之間，精密度在0.14％～0.86％之間，果糖、葡萄糖和蔗糖的檢出限在0.39μg/mL～0.71μg/mL之間。本方法不使用有毒試劑，經實驗對比，和現有離子色譜法檢測標準的檢測結果一致，可用于各種煙草樣品中水溶性糖的快速、批量檢測。
文檔編號G01N30/02GK101701946SQ200910194169
公開日2010年5月5日 申請日期2009年11月26日 優先權日2009年11月26日
發明者黃翼飛, 黃菲 申請人:廣東中煙工業有限責任公司