專利名稱：水泡性口炎病毒快速檢測試紙條及其制作方法
水泡性口炎病毒快速檢測試紙條及其制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種用于檢測水泡性口炎病毒 抗原的快速^f全測試紙條及其制作方法。
背景纟支術
水泡性口炎是由彈狀病毒科水泡病毒屬的水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis Virus, VSV)引起的人畜共患的重大動物疫病。其包括印第安 納(Indiana, IN型)和新澤西(New Jersey, NJ型)兩個血清型。牛、 豬、馬、羊和其它多種野生動物可感染，人感染后出現類似流感和登革熱 的癥狀。臨床癥狀與口蹄疫(FMD)不易區別，該病的存在及流行直接影響 人類及動物健康。水泡性口炎病毒的基因組編碼包含N, NS， M, G， L等5 種病毒蛋白，其中，N蛋白是該病毒核衣殼的主要蛋白，為VSV的群特異性 抗原。1950年證實此病為人畜共患病。目前，水泡性口炎病毒最常用的診 斷方法包括病毒分離鑒定、病毒中和試驗(VN)、補體結合試驗(CF)、液 相阻斷ELISA (LP-ELISA)、竟爭酶聯免疫吸附試驗(c-ELISA )、反轉錄聚 合酶鏈反應(RT-PCR )等。其中，病毒中和試驗(VN )和補體結合試驗(CF ) 兩種方法因試驗復雜、麻煩、耗時、不安全、需在生物安全三級(P3)實 驗室內進行，且有時產生非特異性反應，應用受到限制，且其它診斷方法 也各有其一定的局限性而無法用于快速診斷。目前，國內口岸檢疫中急需
VS的快速檢測方法和試劑。研制快速、便捷、適合于口岸檢疫和現場診斷 的檢測試紙條，在水泡性口炎的快速診斷、檢疫和流行病學調查中具有更重要的應用價值。
發明內容
本發明旨在解決水泡性口炎病毒抗原的快速^f企測問題，而提供一種無 須使用特殊的設備和專門的技術人員，即可直接、快速對水泡性口炎病毒 抗原做出4企測的水泡性口炎病毒快速^^測試紙條。
本發明還提供了該水泡性口炎病毒快速檢測試紙條的制作方法。 為實現上述目的，本發明提供一種水泡性口炎病毒快速檢測試紙條，
該試紙條包括
基板，它是由不透水材料制成的條形板狀體；
樣品吸收墊，它由多孔纖維制成，該樣品吸收墊內吸附有膠體金標記 的水泡性口炎病毒的單克隆抗體；
硝酸纖維膜，其上設有檢測線和對照線，其中，^r測線上包被或噴附 有水泡性口炎病毒多克隆抗體，對照線上包被或噴附有蛋白質A;
吸水墊，且
所述吸收墊、硝酸纖維膜及吸水墊沿基板的長度方向依次設置在基板 板面上。
形成基板的不透水材料為聚氯乙烯。 形成樣品吸收墊的多孔纖維為玻璃纖維。
本發明還提供了所述水泡性口炎病毒快速檢測試紙條的制作方法，該方 法包括如下步驟
a、制備水泡性口炎病毒單克隆抗體，其制備過程為(l)水泡性口炎 病毒的純化，用水泡性口炎病毒(VSV)接種BHK-21細胞長成單層，收獲 的細胞培養病毒液反復凍融3次，以8000轉/分離心30分鐘，取上清液， 超速離心和不連續蔗糖密度梯度離心，收獲提純的病毒條帶，用核酸蛋白 分析儀測定蛋白含量為2. 4g/L, -20。C保存備用；(2)用提純的水泡性口炎抗原加等體積弗氏完全佐劑乳化，和弗氏不完全佐劑乳化，免疫BALB/c小 鼠三次；(3)取免疫小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞在50%聚乙二醇
(MW4000 )融合劑下融合，HAT篩選培養基篩選雜交瘤細胞，用間接ELISA 方法檢測分泌抗VSV的陽性孔；(4)用有限稀釋法進行細胞克隆，經間接 ELISA篩選陽性克隆，獲得能穩定傳代并分泌抗VSV的特異性單克隆抗體的 雜交瘤細胞；(5)將獲得的分泌抗VSV的特異性單克隆抗體雜交瘤細胞注 射入BALB/c小鼠腹腔制備單抗腹水；(6 )采集單克隆抗體腹水，測定抗體 效價、蛋白含量和親和力，腹水ELISA效價高達為1: 1024000,用核酸蛋 白分析儀測定純化腹水IgG的含量為1.97 g/L,親和力分常數高達5.41
x 107mol/L。用間接ELISA方法鑒定制備的單克隆抗體僅與水泡性口炎病毒 有特異性免疫反應，而與其它相關病毒(如BTV、 AKV、 EHDV、 PPRV等)沒 有任何免疫反應。
b、 燒制膠體金，并準備待標記單抗，然后測定膠體金標記抗體的最適 穩定量，具體地說，是由檸檬酸鈉還原法燒制直徑20nm~ 50nm膠體金顆粒， 取-2(TC保存的純化好的水泡性口炎病毒的單克隆抗體，將其濃度調整為 lmg/mL, 4。C保存備用；將準備好的待標記單克隆抗體做系列稀釋為 g/mL~90jag/mL,分別取lmL,加入每管lmL分裝好金膠溶液中，以測定膠 體金標記抗體的最適穩定量。
c、 對抗體進行"交體金標記，接著對膠體金標記抗體進行純化，具體地 說，是將2mg水泡性口炎病毒的單克隆抗體溶于100mL膠體金溶液中，在 電磁攪拌器攪拌下，緩慢將單克隆抗體溶液加入膠體金溶液中進行標記。 然后在其中加入5。/。的牛血清白蛋白使其終濃度為1%， 4。C靜置2 4小時， 棄沉淀物，將膠體金溶液離心處理，棄去上清，將沉淀用含0. 01 ~ 0.06% 疊氮鈉，0. 02mol/L pH8. 2 Tris-HCl緩沖液稀釋為原體積的10%, 4。C保存 備用。
d、 將純化的膠體金標記抗體吸附于多孔纖維樣品吸收墊上，具體地說，是將Q. 02 mol/LpH8. 6 TBS稀釋金標單克隆抗體膠體金溶液浸入玻璃纖維 至液體開始滲出為止而形成金標抗體層，然后將玻璃纖維在室溫溫度干燥。 即制成了吸附有膠體金標記抗體的玻璃纖維。
e、 在硝酸纖維膜上形成由水泡性口炎多克隆抗體和蛋白質A包被或噴 附的檢測線和對照線，具體地說，是在硝酸纖維膜上設定出檢測線和對照 線位置，用噴膜機分別在其所在位置噴上2. 5mg/L的水泡性口炎多克隆抗 體和蛋白質A形成檢測線和對照線，按2jaL/lcm設置噴膜量，噴膜后在37 。C干燥2小時，再用O.Olmol/L pH7. 2含3%牛血清白蛋白的PBS，在37 。C下封閉45分鐘，用0. Olmol/L PH7. 0的PBS漂洗，再將硝酸纖維膜室溫 下干燥。
f、 在基板上沿長度方向將樣品吸收墊、吸附有膠體金標記單克隆抗體 的玻璃纖維、包被有檢測線和對照線的硝酸纖維膜和吸水墊依次設置在基 板板面上，形成檢測試紙條，并將其裝入塑料外殼的檢測卡內。具體地說， 是將硝酸纖維膜貼于不透水基板上，再將浸潤有金標記單克隆抗體混合溶 液的多孔纖維材料樣品吸收墊和另 一個多孔纖維材料樣品吸收墊墊分別貼 于不透水基板上，并使兩者位于硝酸纖維膜的兩端，在浸潤有金標單克隆 抗體混合溶液的多孔纖維材料樣品吸收墊上的不與硝酸纖維膜相連的一端 設置一塊多孔吸水材料，以形成手柄和吸水墊。
本發明的貢獻在于，它有效解決了水泡性口炎病毒抗原的快速檢測問 題。實驗數據表明，本發明的水泡性口炎病毒抗原快速檢測試紙條不僅特 異性強，敏感性高，穩定，操作簡便，而且制備方法簡單，使用快捷迅速， 可在10分鐘之內得出結果，安全簡便，不需任何儀器和設備，成本低廉， 所需試劑和樣本量少，因此特別適合用于出入境口岸和基層檢疫部門水泡 性口炎的現場快速診斷、檢測、檢疫和流行病學調查。
圖1為本發明示意圖。
具體實施方式
下列實施例是對本發明的進一步解釋和說明，對本發明不構成任何限制。
1、水泡性口炎病毒的單克隆抗體制備過程
(1) BHK-21細胞長成單層后接種水泡性口炎病毒(VSV)，在37。C的 溫度反應1小時。加入無血清的基礎培養基繼續培養，2 3d后細胞病變 (CPE)達75°/。以上時，收獲病毒。將收獲的病毒液反復凍融3次，以8000 轉/分離心30分鐘，取上清液。以28000轉/分，溫度4。C超速離心3小時。 沉淀用1/100原體積的PBS溶解，然后釆用20%、 60% (w/v)不連續蔗糖密 度梯度20000轉/分，溫度4。C超速離心3小時，收獲提純的病毒條帶作為 免疫抗原，用DU800核酸蛋白分析儀測定蛋白含量，-20。C保存備用。
(2 )用提純的水泡性口炎病毒首次免疫BALB/c鼠后，每隔2周免疫1 次，共免疫3次，注射劑量分別100pg、 100lug和200 ng。首免時加等體 積弗氏完全佐劑乳化，二免和三免時加等體積弗氏不完全佐劑乳化。三免 后第15d,斷尾采血分離血清，用間接ELISA檢測抗VSV血清抗體效價。于 融合前3d,通過尾靜脈注射VSV強化免疫一次，劑量為100jLig。
(3 )用間接ELISA篩選陽性克隆，分別用BHK細胞增殖的EHDV病毒 抗原和BHK細胞建立間接ELISA。首先用DU 800核酸蛋白分析儀測定各種 抗原的蛋白濃度。再用方陣滴定法確定最佳包被抗原濃度，并對包被時間 及溫度進行優化。兩種ELISA方法分別命名為VSV-ELISA和BHK-ELISA， 這兩種ELISA方法用于對雜交瘤細胞培養上清進行篩選，以獲得抗 的 單克隆抗體陽性克隆。(4 )雜交瘤細胞注射入BALB/c鼠腹腔制備大量單抗腹水取12周齡
左右BALB /C小鼠，腹腔注射0. 5ml降植烷，7d后腹腔注入5 ~ 10 x 105個
雜交瘤細胞，注射后7 10d可見小鼠腹部明顯膨大，采取腹水，2000轉/
分離心5分鐘，收集上清液，即為單克隆抗體腹水，測定抗體效價，分裝
后-8(TC溫度凍存備用。
(5 )采集單克隆抗體腹水，測定抗體的特異性、效價、蛋白含量和親
和力，腹水ELISA效價高達為1: 1024000，用核酸蛋白分析儀測定純化腹
水IgG的含量為2.13 g/L,親和力分常數高達8. 57 x l07raol/L。用
VSV-ELISA和BHK-ELISA同時進行特異性檢測，制備的單克隆抗體僅與VSV
病毒抗原有特異性免疫反應，而與其它相關病毒(如BTV、 AKV、 EHDV、 PPRV
等)沒有任何免疫反應。
(6 )采用硫酸銨沉淀法和柱層析法進行水泡性口炎病毒的單克隆抗體 純化。
2、水泡性口炎病毒抗原快速檢測試紙條制作
(1) 用去離子雙蒸水配制1 %的氯化金水溶液，取1 %的氯化金水溶 液lmL，加雙蒸水99mL配置成0. 01 %濃度的氯化金水溶液100mL。加熱至 沸騰，迅速加入濃度為1%檸檬酸三鈉水溶液lmL，繼續煮沸，同時觀察液 體顏色變化情況，當煮沸約5 ~ 8分鐘液體出現透明的酒紅色時終止反應。 用電鏡測定制備的膠體金顆粒的大小及其形狀，測得膠體金顆粒的直徑大 約為20nm~ 50nm。待冷卻后用0. lmol/LK2C02isL 0. IN HC1調整膠體金的pH 值至8. 2~8. 6, 4'C避光保存。
(2) 膠體金顆粒平均直徑的測定用支持膜的鎳網(銅網也可)蘸取 金標蛋白試劑，自然干燥后直接在透射電鏡下觀察，或用醋酸鈾復染后觀 察。計算100個金顆粒的平均直徑，其平均直徑達到2Qnm 50nm。
(3 )待標記水泡性口炎病毒單克隆抗體的準備取-2(TC保存的純化好的水泡性口炎病毒的單克隆抗體，將其預先對0. 005mol/L pH7. ONaCl溶 液中4。C的溫度透析過夜，以除去多余的鹽離子，于15000轉/分離心20分 鐘，取上清，去除聚合物，測定蛋白質濃度，并將抗體濃度調整為lmg/mL, 4。C的溫度保存備用。
(4)膠體金與標記單克隆抗體最適用量之比的測定將用0. lmol/L ,2或0. 1NHC1調整好pH值(8. 2~8. 6)的膠體金，分裝10管，每管lmL; 將準備好的待標記單克隆抗體做系列稀釋為5 m g/mL ~ 90 iu g/mL )，分別取 lmL，加入以上分裝好金膠溶液的Eppendorf管中，混勻；對照管不加單克 隆抗體，只加lmL稀釋液。5分鐘后，在上述各管中加入0. lmL 10% (w/v) 的NaCl溶液，充分混勻后靜置2小時，觀察結杲。對照管(未加單克隆抗 體)和加入單克隆抗體的量不足以穩定膠體金的各管，均呈現出由紅變藍 的聚沉現象，而加入單克隆抗體量達到或超過最低穩定量的各管仍保持紅 色不變。以穩定lmL膠體金溶液紅色不變的最低單克隆抗體用量，即為該 標記單克隆抗體的最佳用量。取加入單克隆抗體濃度最低而染色沒有發生 變化的管為最適標記量，在此基礎上再補加10°/。(V/V)濃度為lmg/mL的單 克隆抗體溶液，即為穩定膠體金所需抗體實際用量。
(5 )膠體金與水泡性口炎病毒單克隆抗體的結合與標記將2mg水泡 性口炎病毒的單克隆抗體溶于lOOmL膠體金溶液中。在電磁攪拌器攪拌下， 緩慢將單克隆抗體溶液加入膠體金溶液中，2mg的抗體大約用IO分鐘加完， 加完后繼續攪動30分鐘，繼續加入過濾除菌的5%牛血清白蛋白溶液，使其 終濃度達到1%，再緩慢攪動20分鐘后，4。C溫度靜置2 ~ 4小時，棄沉淀物， 用0. 45 juM濾膜過濾膠體金標記的單抗溶液。
(6 )膠體金標記單克隆抗體的純化以1500轉/分將標記好單克隆抗 體的膠體金溶液進行離心15分鐘，棄去凝聚的沉淀留上清。上清移入新的 離心管后15000轉/分于4。C溫度離心30分鐘，棄上清留沉淀。沉淀物溶于含1%牛血清白蛋白和含0. 02。/。NaN3的0. 02mol/L pH8. 2 Tris-HC1緩沖液 中，將沉淀重懸為原體積的1/10， 4X:溫度保存備用。
(7) 膠體金標記抗體吸附玻璃纖維用0.02 mol/LpH8. 6 TBS稀釋金 標單克隆抗體，充分混勻后，將lcmx5cm大小玻璃纖維濾紙浸入金標單抗 溶液中，至液體開始從玻璃纖維中滲出為止而形成金標抗體層，取出后陰 干，即制成了吸附有膠體金標記抗體的玻璃纖維，裁成5mmx5cm的長條備 用。
(8) 基于硝酸纖維膜上的檢測線和控制線的印跡在硝酸纖維膜上設 定出檢測線和對照線位置，用噴膜機分別在其所在位置噴上2. 5mg/L的水 泡性口炎多克隆抗體和protein A形成檢測線和對照線，按2 |a L/lcm設置 噴膜量，噴膜后在37。C溫度干燥2小時，再用0. 01mol/L pH7. 2含3%牛 血清白蛋白的PBS,在37。C溫度下封閉45分鐘，0. 01mol/L pH7. 0的PBS 漂洗，再將硝酸纖維膜室溫下干燥，將硝酸纖維膜貼于不透水材料基板上， 再將浸潤有金標混合溶液的多孔纖維材料樣品吸收墊和另 一個多孔纖維材 料樣品吸收墊分別貼于不透水材料基板上，并使兩者位于硝酸纖維膜的兩 端，在浸潤有金標混合溶液的多孔纖維材料樣品吸收墊上且不與硝酸纖維 膜相連的一端設置另一塊多孔吸水材料，以形成手柄和吸水墊。
(9 )水泡性口炎病毒抗原快速檢測試紙條的組裝揭開PVC基板1上 的不干膠后，貼上噴涂有水泡性口炎多克隆抗體"企測線4， T線)和蛋白 質A (對照線5, C線)的硝酸纖維膜3,將制備好的吸附有膠體金標記單 克隆抗體的玻璃纖維與硝酸纖維膜的檢測線一端連接并壓在硝酸纖維膜3 上后，粘貼在PVC基板1上，在膠體金墊上覆蓋未吸附有膠體金的玻璃纖 維作為樣品吸收墊2，然后用厚的吸水墊6作手柄，并壓在硝酸纖維膜3靠 對照線線5的一端，最后用切割機將試紙條切成5mmx5cm即可(參見圖1 )。 檢測試紙條裝入塑料外殼的檢測卡內，檢測卡上貼上試紙條名稱標簽，裝入鋁箔袋，放入干燥劑，抽氣密封，在鋁箔袋上貼上產品說明書。
(10)試劑組成和使用方法該水泡性口炎病毒快速檢測試紙條包括 檢測卡一塊、緩沖液一瓶、干燥劑lg、說明書一份、外包裝鋁箔袋一個。 使用方法撕開外包裝，取出檢測板。取50jliL~100|uL樣品加入孔中， 再滴加入緩沖液3滴，IO分鐘后觀察結果。陽性結果；險測線4和對照線 5均出現有紫紅色條帶，說明血清中有水泡性口炎病毒抗原；陰性結果檢 測線4無條帶出現，而且對照線5出現有紫紅色條帶，說明血清中無水泡 性口炎病毒抗原；無效結果如果對照線5無色帶，則^r測結果無效，標 本應重新檢測。
(11 )該水泡性口炎病毒快速檢測試紙條對出入境檢驗檢疫相關實驗 室提供的30份樣品進行檢測，結果顯示，陰陽性成立，陽性兩條帶，陰性 一條帶，結果與其它經典方法檢測結果基本一致。
上述具體實施例的實驗數據表明，本發明的水泡性口炎病毒抗原快速 檢測試紙條，不僅特異性強，敏感性高，穩定，操作簡便，而且制備方法 簡單。使用快捷迅速，可在IO分鐘之內得出結果，安全簡便，不需任何儀 器和設備，成本低廉，所需試劑和樣本量少。特別適合用于出入境口岸和 基層檢疫部門水泡性口炎的現場快速診斷、檢測、檢疫和流行病學調查。
權利要求
1、一種水泡性口炎病毒快速檢測試紙條，其特征在于，該試紙條包括基板(1)，它是由不透水材料制成的條形板狀體；樣品吸收墊(2)，它由多孔纖維制成，該樣品吸收墊內吸附有膠體金標記的水泡性口炎病毒的單克隆抗體；硝酸纖維膜(3)，其上設有檢測線(4)和對照線(5)，其中，檢測線(4)上包被或噴附有水泡性口炎病毒多克隆抗體，對照線(5)上包被或噴附有蛋白質A；吸水墊(6)，且所述吸收墊(2)、硝酸纖維膜(4)及吸水墊(6)沿基板(1)的長度方向依次設置在基板(1)板面上。
2、 如權利要求1所述的水泡性口炎病毒快速檢測試紙條，其特征在于， 形成基板(1)的不透水材料為聚氯乙烯。
3、 如權利要求1所述的水泡性口炎病毒快速檢測試紙條，其特征在于， 形成樣品吸收墊(2)的多孔纖維為玻璃纖維。
4、 如權利要求1所述的水泡性口炎病毒快速檢測試紙條的制作方法， 其特征在于，該方法包括如下步驟a、 制備水泡性口炎病毒單克隆抗體；b、 燒制膠體金，并準備待標記單抗，然后測定膠體金標記抗體的最適 穩定量；c、 對抗體進行膠體金標記，接著對膠體金標記抗體進行純化；d、 將純化的膠體金標記抗體吸附于多孔纖維樣品吸收墊上；e、 在硝酸纖維膜上形成由水泡性口炎多克隆抗體和蛋白質A包被或噴 附的檢測線和對照線；f、 在基板上沿長度方向將樣品吸收墊、吸附有膠體金標記單克隆抗體的玻璃纖維、包被有檢測線和對照線的硝酸纖維膜和吸水墊依次設置在基 板板面上，形成檢測試紙條，并將其裝入塑料外殼的檢測卡內。
5、 如權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(a)中，水泡性口 炎病毒單克隆抗體的制備是將純化的水泡性口炎病毒免疫BALB/c小鼠三 次，然后取免疫小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，并由間接ELISA 方法檢測分泌抗VSV的特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞，再由BALB/c小鼠 制備單抗腹水。
6、 如權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(b)中，膠體金的 燒制和待標記單抗的準備是由檸檬酸鈉還原法燒制直徑20nrn 50nm膠體金 顆粒，取-2(TC保存的純化好的水泡性口炎病毒的單克隆抗體，將其濃度調 整為lmg/mL， 4。C保存備用；將準備好的待標記單克隆抗體做系列稀釋為5 jig/mL 90iag/mL,分別取lmL,加入每管lmL分裝好金膠溶液中，以測定 膠體金標記抗體的最適穩定量。
7、 如權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(c)中，抗體的膠 體金標記是將2mg水泡性口炎病毒的單克隆抗體溶于100mL膠體金溶液， 在電磁攪拌器攪拌下，緩慢將單克隆抗體溶液加入膠體金溶液中進行標記， 然后進行膠體金標記抗體的純化標記好單克隆抗體的膠體金溶液純化后， 于含1%牛血清白蛋白和含0. 02。/。NaN3的0. 02mol/L pH8. 2 Tris-HC1緩沖 液中重懸為原體積的1/10， 4tM呆存備用。
8、 如權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(d)中，將0.02 mol/LpH8. 6 TBS稀釋金標單克隆抗體吸附于玻璃纖維濾紙上，形成吸附有 膠體金標記抗體的玻璃纖維:。
9、 如權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(e)中，在硝酸纖 維膜上設定出檢測線和對照線位置，用噴膜機分別在其所在位置噴上 2. 5mg/L的水泡性口炎多克隆抗體和蛋白質A,形成檢測線和對照線。
全文摘要
一種水泡性口炎病毒快速檢測試紙條及其制作方法，試紙條包括基板(1)、吸附有膠體金標記的水泡性口炎病毒的單克隆抗體的樣品吸收墊(2)、設有檢測線(4)和對照線(5)的硝酸纖維膜(3)及吸水墊(6)，且所述吸收墊(2)、硝酸纖維膜(3)及吸水墊(6)沿基板(1)的長度方向依次設置在基板(1)板面上。制作方法包括a.制備水泡性口炎病毒單克隆抗體；b.燒制膠體金，并準備待標記單抗；c.對抗體進行膠體金標記和純化；d.將純化的膠體金標記抗體吸附于多孔纖維樣品吸收墊上；e.在硝酸纖維膜上形成由水泡性口炎多克隆抗體和蛋白質A包被或噴附的檢測線和對照線；f.將樣品吸收墊、硝酸纖維膜和吸水墊依次設置在基板板面上，形成檢測試紙條。本發明無須使用特殊的設備和專門的技術人員，即可直接、快速對水泡性口炎病毒抗原做出檢測。
文檔編號G01N33/569GK101666800SQ20091019043
公開日2010年3月10日 申請日期2009年9月16日 優先權日2009年9月16日
發明者呂建強, 潔 孫, 張彩虹, 曾少靈, 楊云慶, 楊俊興, 秦智鋒, 花群義, 阮周曦, 虹 陶 申請人:花群義