專利名稱：血細胞分析儀校準品及其制備工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及血細胞生物活性保護液和穩定劑的配制及其血細胞分析儀用校準品(物)制備工藝技術。
背景技術：
在血細胞分析儀質量控制過程中，儀器的校準或校正是必不可少的，新儀器安裝或每次維修后都應進行儀器的校準。血細胞分析儀用校準品是權威部門認可的標準物質。某一型號的校準品，只能用于校準同型號的儀器，不能用于其他品牌儀器的校準。全血細胞分析的檢測結果只有直接或間接地溯源至參考方法，才能保證結果的準確性和不同實驗室檢測結果的可比性。全血細胞校準
品是血細胞(液)分析儀溯源性必備的計量物質；作為血細胞分析儀測量結果的計量學溯源性，評價與確保臨床實驗結果準確性唯一依據。目前，血細胞分析儀校準通常采用兩種方法①新鮮血液作為校準品，②穩定血液或替代物。國內外全血才交準品大多數采用動物(如禽類)血細胞或高分子材料(如塑料粒子或納米物質)作為替代品較廣泛地應用于臨床檢驗。正在臨床上使用的全血細胞校準品，置2 ~ 8r保存有效期為1 ~ 3個月不等，開瓶后穩定性為1 ~ 3天。
發明內容
本發明利用多種細胞活性保護液和穩定劑的組合效應；包括Rb液、Wb,。和Wb22液;Rb液為全血細胞活性保護液(劑)，WbH)和Wt)22液按恰當比例組合為全血細胞穩定劑。1. 配方l且成
(1) 全血細胞活性保護液(Rb液)按以下組分和濃度范圍制成化學試劑為分析純，氯化鈉4. 0~6. Og/L、枸櫞酸O. 15~0. 3g/L、枸櫞酸鈉1. 0 ~ 2. Og/L、磷酸二氫鈉0. 5 ~ 1. 5g/L、腺噤呤0. 1 ~ 0. 6g/L、葡萄糖4. 0 ~ 10. Og/L 、甘露醇4. 2~15. Og/L、海藻糖5. 0~10g/L、 D-甘露糖0. 5 ~ 1. Og/L、丙三醇5. 0 ~10g/L 、 1.2-丙二醇0. 2~1. Og/L、 EDTAO. 1 ~ 0. 5g/L,生物抑菌劑適量(小于0. 5% )。
(2) 全血細胞穩定劑I (Wb,。液)按以下組分和濃度范圍制成化學試劑為分析純，其濃度范圍分別為Rb液lOO. OmL、 二曱亞砜0. 1 ~ 1. 0 mL、曱醛l. 0~3. 0 mL、戊二醛0. 01 ~ 0. 08mL、迭氮鈉0.1 ~ 0. 25g。
(3) 全血細胞穩定劑II (Wb22液)按以下組分和濃度范圍制成化學試劑為分析純，其濃度范圍分別為Rb液100.0mL、曱醛1.0 3.0mL、多聚曱醛0.05~0. 60g、乙醛0. 5 ~ 5. OmL、迭氮鈉0.1 ~ 0. 25g。
(4) A液、Wbw和Wb^液配制后，經過濾(4>0. 2 n )處理，置2 ~ 8'C冰箱保存使用。
2. 血細胞分析儀校準品制備工藝
(1) 血液來源血液中心健康人義務獻血或大型動物源性抗凝全血。規格為200mL/袋或400mL/袋血液成分。
(2) 質量要求RBC、 MCV、 HGB、 PLT和WBC及其分類值接近參考值范圍；生物源性病原體如乙型肝炎病毒(HBsAg)、抗-HCV、抗-HIV等傳染性指標均為陰性。
(3) 全血細胞分離取人類(或動物源性)新鮮抗凝全血("0"或"A"、 "B"、AB血型)225mL/袋，置水平離心機3000轉離心25 ~ 30min使血細胞成分與血漿分離，緩慢吸#漿，計其體積X mL,剩余血液體積為(225mL-X)待用。
(4) 全血細胞保護在約200mL全血中先緩慢加入Wb,。液18 20mL,輕輕搖勻置2 8'C24h保存待用。
(5) 全血細胞穩定經保護處理的全血細胞，再緩慢加入Wb22液1. 0~2. 5mL，邊加邊輕輕搖勻，充分混勻后密封置2 ~ 8'C保存，間隔4 ~ 8h輕輕顛倒2 ~ 4次使其充分混勻，待留樣觀察結果可行后按所需規定量(0. 5mL ~ 5 . 0 mL/支)分裝使用。
(6) 注意事項所使用的實驗器具必需潔凈并高壓消毒滅菌；全血校準品制備全過程必需無菌操作或在10萬級凈化環境中進行。
3. 質量監測
(1) 對照1號管取血液分離前輕輕充分混勻全血細胞2. OmL x 1支；
(2) 實驗2 ~ 3號管吸取全血細胞穩定處理的混勻血液2. OmL x 2支作為留樣觀察；
(3) 1 ~ 3號血樣分別在校準好的血細胞分析儀(如Sysmex、 Cell-Dyn、 Coulter、MEK、 COBAS/ABX、 TEK、 BC、 AC、 CA等系列儀器)上，按1、 3、 5、 7、 9…的間隔日期連續測定8~10次結果。分析和觀察細胞變化過程，待全血細胞形態穩定后，采用真空釆血管進行穿刺式定量分裝，使分裝后的采血管仍然保持真空狀態。全血校準品置2-8。C保存有限期為6個月，開瓶使用2~8匸保存可穩定一周。該產品經過生物溯源性鏈接程序，ICSH或NCCLS提供的參考方法賦值；在有效期內全血細胞校準品可用于血細胞分析儀校準。
本發明采用具有對組織細胞保護及蛋白質、酶和脂類緩慢固定的化學物質，使新鮮抗凝全血細胞離體后，血細胞在較長時間內仍然保持一定代謝和生理活性。血液離心分離獲得血細胞成分，在適當比例(如4: l到5: 1)的細胞保護液和細胞穩定劑的協同作用下，生物試劑間的活性協調、互補和疊加作用與效果一方面，保護液提供了維持血細胞正常生理活性所需要的營養成分和生存環境利于進行無氧酵解；另一方面，穩定劑中含有較低濃度的細胞膜及細胞質固定物質，利用多種細胞活性保護液與穩定劑的組合效應，能夠緩慢地滲透細胞膜作用于細胞質，有效地與細胞成分-蛋白質、酶、脂類等生物分子牢固結合從而使白細胞、紅細胞、血小板不同程度地得到固定及有效保護；使血細胞保持其表觀形態特征。因此，處理好的血細胞，經過生物溯源性鏈接程序及其參考方法賦值；在有效期內全血質控物或校準品，可作為血細胞分析儀的校準品，當加入儀器配套的溶血劑和稀釋液時，校準品中的紅細胞能迅速溶解，而白細胞在受溶血劑中表面活性劑的作用下表觀體積及內部結構發生明顯變化，滿足血細胞分析儀計數及達到分類之效果。
本發明研制的全血細胞校準品粘稠度低，容易混勻，不存在基質效應；真空密閉后置2 ~ 8'C保存有限期至少為6個月，開瓶使用2 ~ 8C保存可穩定一周，室溫(15iC~25°C)可保存有效期為36h。
本發明釆用人類或動物源性全血細胞，利用多種細胞活性保護液與穩定劑的協同組合效應，經細胞保護和穩定技術處理好的全血細胞校準品有良好的穩定性，不僅可以細胞染色及顯微鏡計數，而且有效期較臨床現有全血校準品(物)或質控物(品)長。
具體實施例方式
本發明細胞活性保護液和穩定劑包括保護液(劑)、Wb,。和Wb22液。配方組成
(1)全血細胞活性保護液(Rb液)氯化鈉5. Og/L、枸櫞酸0. 2g/L、枸櫞酸鈉2. Og/L、磷酸二氫鈉0. 75g/L、腺嘌呤0. 3g/L、葡萄糖7. 5g/L 、甘露醇10. Og/L、海藻糖7. 8g/L、 D-甘露糖0. 6g/L、丙三醇8. Og/L 、 1. 2-丙二醇0. 4g/L、EDTAO. 25g/L,生物抑菌劑適量。2-8X:水箱保存備用。
(2 )全血細胞穩定劑I (Wb,。液)Rb液100. OmL、 二甲亞砜0. 5 raL、曱醛3. 0mL、戊二醛0. 05mL、迭氮鈉0.15g。 2 ~ 8'C水箱保存備用。
(3 )全血細胞穩定劑II (Wb22液):Rb液100， OmL、甲醛1. OmL、多聚甲醛0. 25g、乙醛4. 5mL、迭氮鈉0.2g。 2 ~ 8'C水箱j呆存備用。
本發明血細胞分析儀用校準品生產工藝如下(l)全血細胞分離取人類(或動物源性)新鮮抗凝全血("0"或"A"、 "B"、AB血型)225mL/袋，置水平離心機3000轉離心25 ~ 30min使血細胞成分與血漿分離，緩慢吸取血漿，計其體積XmL(X為為20-28mL )，剩余血液體積為(225mL-X)待用。混勻后取樣2. 0mL為1號對照管。
(2) 全血細胞保護在上述225mL-X全血中先緩'漫加入Wb,。液18 ~ 20 mL，輕輕搖勻置2 8。C24h保存待用。混勻后取樣2. OmL為2號管。
(3) 全血細胞穩定經保護處理的全血細胞，再緩慢加入Wb22液1. 0~2. 5mL，邊加邊輕輕搖勻，充分混勻后密封置2 ~ 8'C保存，間隔4 ~ 8h輕輕顛倒2 ~ 4次使其充分混勻，待留樣觀察結果可行后按所需規定量分裝使用。混勻后取樣2. OmL為3號管。
(4) 質量監測1 ~ 3號管在校準好的Sysmex kx-21血細胞分析儀上，按1、 3、 5、7、 9...的間隔日期連續測定8~10次結果。直方圖和WBC、 RBC、 MCV/HCT、 HGB、PLT等血液分析5項指標結果及直方圖質檢合格或符^L定要求即可真空分裝成產品。
(5) 真空分裝根據實際需要制作一套穿刺式定量分裝工裝，全血校準品充分混勻后，采用真空采血管(2. 0~5. OmL規格)進行穿刺式定量分裝，使分裝后的#管仍然保持真空狀態。
(6) 溯源性賦值通過一條具有規定不確定度的不間斷的比較鏈，使測量結果或測量標準的值能夠與規定的參考標準或方法聯系起來的特性。通常是建立一套參考測量程序，依據ICSH或NCCLS提供的參考方法對全血校準品進行賦值。
(7) 保存與臨床使用全血校準品真空密閉后置2 8。C保存，供臨床血細胞分析儀校準使用，有限期至少為6個月，開瓶使用2 ~ 8'C保存可穩定一周，室溫(15°C ~ 25匸)可保存有效期為36h。
權利要求
1、一種血細胞分析儀校準品，其特征在于利用多種細胞活性保護液和穩定劑的協同組合效應，包括Rb液、Wb10和Wb22液；Rb液為全血細胞活性保護液，Wb10和Wb22液按比例組合為全血細胞活性穩定劑；(1)、Rb液按以下組分和濃度范圍制成氯化鈉4.0～6.0g/L、枸櫞酸0.15～0.3g/L、枸櫞酸鈉1.0～2.0g/L、磷酸二氫鈉0.5～1.5g/L、腺嘌呤0.1～0.6g/L、葡萄糖4.0～10.0g/L、甘露醇4.2～15.0g/L、海藻糖5.0～10g/L、D-甘露糖0.5～1.0g/L、丙三醇5.0～10g/L、1.2-丙二醇0.2～1.0g/L、EDTA0.1～0.5g/L，生物抑菌劑適量；(2)、全血細胞穩定劑按以下組分和濃度范圍制成Wb10液Rb液100.0mL、二甲亞砜0.1～1.0mL、甲醛1.0～3.0mL、戊二醛0.01～0.08mL、迭氮鈉0.1～0.25g；Wb22液Rb液100.0mL、甲醛1.0～3.0mL、多聚甲醛0.05～0.60g、乙醛0.5～5.0mL、迭氮鈉0.1～0.25g。
2、 一種如權利要求1所述的血細胞分析儀校準品的制備工藝，其特征在于，由以下生產工藝制成(1) 全血細胞分離取人類(或動物源性)新鮮抗凝全血細胞("0"或"A"、"B"、 AB血型)225ml/袋，置水平離心機3000轉離心25 ~ 30min使血細胞成分與血漿分離后，緩慢吸取少量血漿，計其體積X ml，剩余血液體積為225ml-X待用；(2) 、全血細胞保護在上述225ml-X全血中先緩慢加入Wb,。液18 20 mL,輕輕搖勻置2 ~ 8 °C 24h保存待用；(3 )全血細胞穩定經保護處理的全血細胞，再緩慢加入Wb22液1. 0 ~ 2. 5mL，邊加邊輕輕搖勻，充分混勻后密封置2 ~ 8。C保存，間隔4 ~ 8h再輕輕顛倒2 ~4次使其充分混勻，后真空分裝#_用；(4 )血細胞分析儀校準品效期穩定性真空密閉后的全血校準品置2 ~ 8XM呆存有限期至少為6個月，開瓶4吏用后置2 ~ 8'C保存可穩定一周，室溫(15°C ~25'C)可保存有效期為24h。
全文摘要
本發明利用多種細胞活性保護液與穩定劑的協同組合效應，保護劑提供了維持血細胞正常生理活性所需要的營養成分和生存環境進行無氧酵解；穩定劑中含有較低濃度的細胞膜及細胞質固定物質，能夠緩慢地滲透細胞膜作用于細胞質，有效地與細胞成分--蛋白質、酶、脂類等生物分子牢固結合從而使白細胞、紅細胞、血小板不同程度地得到固定及有效保護；使血細胞保持其表觀形態特征。經保護和穩定處理好的血細胞，依據溯源性鏈接傳遞程序及其參考方法進行賦值；可作為血液分析儀用校準品(物)在臨床使用，本發明采用人類或動物源性全血細胞，有良好的穩定性，不僅可以顯微鏡人工計數及細胞染色分析，而且效期較現有全血校準品長。
文檔編號G01N33/96GK101672853SQ200910186118
公開日2010年3月17日 申請日期2009年9月28日 優先權日2009年9月28日
發明者簫 顏, 菲 顏 申請人:江西特康科技有限公司