專利名稱：一種表面增強拉曼散射探針的制備方法
技術領域：
本發明涉及 一 種具有高表面增強拉曼散射(Surface enhanced RamanScattering， SERS)活性的聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone, PVP)包裹的聚 集銀納米探針的制備方法，及其應用于調控銀納米粒子的聚集程度和細胞內的SERS檢測。 更一般地涉及金屬納米材料，聚合物材料。
背景技術：
近年來，通過設計具有一定功能的光學探針來檢測生物樣品一直是研究的熱點。 熒光探針是傳統的光學探針，經過長時間的發展，熒光探針已經得到了廣泛應用。然而熒 光探針具有激發光譜較窄，樣品容易光漂白，熒光染料濃度過高對生物樣品有毒性等缺 點。與傳統的熒光光譜檢測手段相比，表面增強拉曼散射技術(Surface enhanced Raman scattering, SERS)具有譜線窄，有效淬滅熒光背景干擾，能夠提供探測樣品的指紋信息，以 及樣品不易光漂白等優點。不僅如此，由于表面增強拉曼散射對拉曼信號巨大的增強效應 (105-106倍甚至更高，使得樣品的檢測濃度可以很低甚至達到單分子量級。目前基于表面增 強拉曼散射技術的納米結構和納米器件已經成為探測和分析生物樣品的有利工具。盡管有 許多具有很高靈敏度的SERS探針被報道，具有良好穩定性和生物兼容性的探針卻不多見。 使金屬納米粒子聚集可以提供更多"熱點"從而顯著提高SERS強度，然而過度的聚集會導 致金屬納米粒子形成大的不穩定團簇并且迅速沉淀。在細胞、組織乃至活體的應用對SERS 探針的要求更高，不但要求探針具有很高的SERS增強效果，能在較小的激發光功率條件下 采集到SERS信號，而且要求金屬納米粒子的大小尺寸不能過大，否則會引起細胞損傷。而 且需要探針具有良好的化學穩定性和生物兼容性。要滿足上述要求，SERS探針通常會進行 表面修飾來提高性能。目前SERS探針的表面修飾主要有兩種方法包裹二氧化硅和包裹聚 合物。包裹聚合物的方法也有很多種，相比于其他的包裹聚合物的方法，包裹聚乙烯吡咯烷 酮的方法操作簡單，成本低廉，可重復性好，可以有效控制探針尺寸，優化SERS信號強度， 而且具有良好的化學穩定性以及生物兼容性。
發明內容
技術問題本發明的目的是提供一種尺寸大小可控、SERS信噪比高、化學穩定性
好、制備簡單以及具有很好的生物兼容性的表面增強拉曼散射探針的制備方法。
技術方案為了實現上述目的，本發明的制備工藝流程為選用銀膠溶液作為原
料，氯化鈉作為聚集劑，將聚乙烯吡咯烷酮包裹在銀聚集體表面；具體方法是通過將拉曼標
記物按照與銀膠溶液體積比i : iooo-i : ioo加入銀膠溶液中在攪拌條件下混合均勻，再
加入氯化鈉溶液使混合了拉曼標記物的銀膠溶液聚集成二至五個粒子的聚集體，最后加入
聚乙烯吡咯烷酮溶液，繼續攪拌5-15分鐘后用孔徑規格為100-220nm的濾器將所得的溶液 過濾即得到表面增強拉曼散射探針；該探針為水溶性膠體溶液。所述的拉曼標記物為能夠 以靜電吸附或者共價鍵結合的方式處于銀納米粒子的表面，在激發光的照射下產生強烈的
3拉曼散射信號的分子。所述的拉曼標記物的濃度為10—2M 10—6M。
有益效果本發明的優點如下 其一是本發明的SERS探針的尺寸大小可控，既使得銀納米粒子聚集產生熱點保 證了表面拉曼散射的巨大增強效應又使得了探針的聚集程度在2-5個銀納米粒子之間，整 體的尺寸在220納米以內，從而保證了該探針在細胞中的應用不會引起細胞膜的機械性損 傷。 其二是本發明的SERS探針具有優良的化學穩定性。制備好探針溶液在避光室溫 靜置的條件下至少可以保持穩定長達兩個月，即使在更長的保存時間中出現了少量沉淀， 經過簡單的用手搖晃探針溶液可以立刻恢復均勻。 其三是本發明的SERS探針制備過程操作簡單，可重復性好，成本低廉，環境友好。 探針的制備所需原料中，聚乙烯吡咯烷酮是一種價格低廉的高分子聚合物，無毒，被廣泛應 用于工業以及醫藥領域。銀納米粒子和拉曼標記物也只需要極少量就可以完成探針的制 備。 其四是本發明的SERS探針具有很高的靈敏度，在較小的激發光功率(2. 3毫瓦) 入射下可以實現細胞內SERS檢測。探針還具有良好的生物兼容性，對細胞的毒性很小。
現結合附圖對本發明做出說明。附圖中采用以羅丹明6G和4巰基苯甲酸作為拉 曼標記物為例進行說明。 圖1本發明制備的PVP包裹聚集銀納米粒子的SERS生物探針的制備示意圖i 為在銀納米粒子中加入拉曼標記物；ii為加入氯化鈉引起銀納米粒子的聚集；iii為加入 PVP，形成保護層。 圖2為本發明制備的以羅丹明6G作為拉曼標記物探針的SERS光譜。 圖3-l從a至h，分別為純銀膠溶液，加入羅丹明6G后的銀膠溶液以及第一組溶液
在加入氯化鈉之后1分鐘，30分鐘，60分鐘，90分鐘，2小時以及5小時的吸收光譜。 圖3-2從a至g分別為純銀膠溶液，加入羅丹明6G的銀膠溶液以及第二組溶液在
加入氯化鈉之后30分鐘，60分鐘，90分鐘，2小時，5小時的吸收光譜。 圖3-3包裹PVP(圓型圖例)羅丹明6G探針溶液和未包裹PVP(方形圖例)的羅
丹明6G吸附銀膠溶液的SERS光譜在1510波數處的強度隨氯化鈉溶液加入量的關系圖。 圖4為4巰基苯甲酸探針在(a)Hela細胞中；(b)探針溶液中的SERS光譜。
具體實施例方式
實施例一探針制備(以羅丹明6G探針為例) 第一步實驗采用Lee和Meisel報道的方法制備銀膠溶液。將1. 0X 10—21硝酸銀 溶液按照與銀膠溶液體積比l : IO加入去離子水中，攪拌并加熱至沸騰。將1%檸檬酸鈉 溶液按照與銀膠溶液體積比1 : 50加入到沸騰的硝酸銀溶液中，持續攪拌并加熱沸騰40 分鐘得到銀膠溶液。制成的銀膠溶液避光、密閉保存備用。 第二步配制lmM的羅丹明6G水溶液，取羅丹明6G溶液在磁力攪拌下按照與銀膠
溶液體積比i : iooo-i : 100加入到銀膠溶液中，反應5分鐘。將o. 5M氯化鈉溶液按照與銀膠溶液體積比l : 150加入羅丹明6G和銀膠溶液的混合溶液中引起銀納米粒子的聚 集，然后迅速按照與銀膠溶液體積比1 : 75加入1%的分子量為50000的PVP水溶液。反 應在磁力攪拌下持續10分鐘，然后用孔徑規格為100-220nm的濾器將所得的膠體溶液過 濾，以除去少量過大的聚集體。過濾后SERS探針即制得。SERS活性如圖2。
實施例二探針的化學穩定性檢測(以羅丹明6G探針為例) 第一步做一組吸收光譜穩定性的對比實驗，第一組先配制lmM的羅丹明6G水溶 液，取羅丹明6G溶液在磁力攪拌下按照與銀膠溶液體積比1 : 500加入到銀膠溶液中反應 5分鐘。再按照與銀膠溶液體積比l : 750加入濃度為0.5M氯化鈉溶液；第二組在第一組 基礎上按照與銀膠溶液體積比1 : 150加入1%分子量為50000的PVP水溶液。將第一組 和第二組的溶液隨著時間的變化分別記錄其吸收光譜。由吸收光譜強度的變化可以得知， 如果沒有PVP的保護，如圖3-l，加入氯化鈉后，位于429nm處的銀鈉米粒子的等離子吸收峰 強度迅速下降，并最終趨于消失。這說明銀鈉米粒子在短時間內過度聚集并最終形成不可 逆轉的沉淀。如圖3-2，在有PVP包裹的銀膠的吸收光譜則在較長時間內基本維持在加入氯 化鈉之后的狀態。這說明PVP確實可以控制銀鈉米粒子的聚集程度，從而達到控制探針的 尺寸的目的。探針具有良好的化學穩定性。 第二步做一組SERS光譜穩定性對比實驗，第一組先配制lmM的羅丹明6G水溶液， 取15 ii L羅丹明6G溶液在磁力攪拌下加入到15mL銀膠溶液中，反應5分鐘。然后不斷加 入0. 5M濃度的氯化鈉溶液，加入量從0 ii L至30 ii L。第二組在羅丹明6G和銀膠溶液的混 合溶液中先加入PVP溶液形成保護層，再加入0 ii L至30 ii L的氯化鈉溶液。測量兩組溶液 的SERS新信號。結果表明沒有包裹PVP的銀膠溶液的SERS強度隨著氯離子量的增加在達 到一個最大值后迅速下降。而包裹了 PVP的探針溶液SERS強度在達到最大值后基本保持 穩定，如圖3-3。該對比實驗也說明PVP包裹的SERS探針具有良好的化學穩定性。
實施例三探針在活細胞中的SERS活性以及探針的生物兼容性(活細胞內SERS 活性以4巰基苯甲酸探針為例，細胞成活率以羅丹明6G探針為例)第一步將宮頸癌細胞 (Hela)置于培養基中進行體外培養(37°C，5% C02)。 24小時后，將4巰基苯甲酸SERS探 針溶液(制備方法與羅丹明6G探針溶液一致)按體積比(3 : 1)加入細胞培養基中，輕輕 搖勻，并且重新置于培養箱內。SERS探針通過被細胞吞噬而進入細胞內部。1.5小時之后， 吸出培養基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞3次以去除未被細胞吞噬而殘留在培養基中 的SERS探針，待用。 第二步將用緩沖液沖洗過的細胞置于共焦顯微鏡的載物臺上，選定一個細胞區域 測量細胞內的SERS光譜，并成像。細胞在吞噬PVP包裹的SERS探針之后仍然保持良好的 形態。而吞噬未包裹PVP的SERS探針的Hela細胞則出現細胞質收縮現象，細胞活力減弱。 在活細胞內，包裹PVP的探針仍然保持了很高的SERS靈敏度，較之在液在溶液中的SERS信 號，強度和信噪比均有很大提高如圖4。 第三步測定細胞成活率。將體外培養的宮頸癌細胞(細胞密度10Vcm3)接種于96 孔板中并在培養箱中培養24小時。每孔加入20 ii L羅丹明6G探針溶液并置于培養箱中培 養，14小時后每孔加入3- (4， 5- 二甲基噻唑-2) -2， 5- 二苯基四氮唑溴鹽(MTT)溶液50 y L， 再置于培養箱培養4小時。吸出每孔上清液，然后每孔加入150iiL二甲基亞砜(匿SO)，搖 勻后用酶標儀在490nm波長下讀出吸光度，并換算成細胞的成活率。同時以空白細胞作對比。結果顯示孵育了 PVP包裹的羅丹明SERS探針的Hela細胞成活率約為80%，說明PVP 包裹的SERS探針具有良好的生物兼容性。
權利要求
一種表面增強拉曼散射探針的制備方法，其特征在于該方法選用銀膠溶液作為原料，氯化鈉作為聚集劑，將聚乙烯吡咯烷酮包裹在銀聚集體表面；具體方法是通過將拉曼標記物按照與銀膠溶液體積比1∶1000-1∶100加入銀膠溶液中，在攪拌條件下混合均勻。再加入氯化鈉溶液使混合了拉曼標記物的銀膠溶液聚集成二至五個粒子的聚集體。最后加入聚乙烯吡咯烷酮溶液，繼續攪拌5-15分鐘后用孔徑規格為100-220nm的濾器將所得的溶液過濾即得到表面增強拉曼散射探針；該探針為水溶性膠體溶液。
2. 根據權利要求1所述的表面增強拉曼散射探針的制備方法，其特征在于所述的拉 曼標記物為能夠以靜電吸附或者共價鍵結合的方式處于銀納米粒子的表面，在激發光的照 射下產生強烈的拉曼散射信號的分子。
3. 根據權利要求1所述的表面增強拉曼散射探針的制備方法，其特征在于所述的拉 曼標記物的濃度為10—2M 10—6M。
全文摘要
一種表面增強拉曼散射探針的制備方法涉及一種具有高表面增強拉曼散射活性的聚乙烯吡咯烷酮包裹的聚集銀納米探針的制備方法，及其應用于調控銀納米粒子的聚集程度和細胞內的SERS檢測，該方法選用銀膠溶液作為原料，氯化鈉作為聚集劑，將聚乙烯吡咯烷酮包裹在銀聚集體表面；具體方法是通過將拉曼標記物按照與銀膠溶液體積比1∶1000-1∶100加入銀膠溶液中在攪拌條件下混合均勻，再加入氯化鈉溶液使混合了拉曼標記物的銀膠溶液聚集成二至五個粒子的聚集體，最后加入聚乙烯吡咯烷酮溶液，繼續攪拌5-15分鐘后用孔徑規格為100-220nm的濾器將所得的溶液過濾即得到表面增強拉曼散射探針；該探針為水溶性膠體溶液。
文檔編號G01N21/63GK101694467SQ20091018486
公開日2010年4月14日 申請日期2009年10月16日 優先權日2009年10月16日
發明者宋春元, 崔一平, 張若虎, 楊晶, 王著元, 談學斌 申請人:東南大學;