一種重金屬汞間接競爭酶聯免疫吸附測定方法

文檔序號：6156482閱讀：312來源：國知局

專利名稱：一種重金屬汞間接競爭酶聯免疫吸附測定方法
技術領域：
本發明涉及一種重金屬汞的快速、準確、高通量測定方法，具體為一種基于重金屬汞單克隆抗體的間接競爭酶聯免疫吸附測定方法(ELISA方法)。
背景技術：
重金屬一般以天然濃度廣泛存在于自然界中，天然水體中含滎量極少，一般不超過0.1 pg/L，我國飲用水標準限值為0.001 mg/L。但由于人類對重金屬的開采、冶煉、加工及商業制造活動日益增多，造成不少重金屬如鎘、汞等進入大氣、水、土壤環境，引起嚴重的環境污染，以各種化學狀態或化學形態存在的重金屬，在進入環境或生態系統后就會存留、積累和遷移，造成危害，并能通過飲用水或者通過生物富集以及食物鏈等方式最終危害人類的健康。因此，建立準確、快速、便捷、高通量的重金屬汞的檢測方法，對汞污染進行長期監測，了解其在環境介質中的濃度，對控制污染，保護環境和人類生命安全與健康具有十分重要的意義。
文獻檢索結果表明，國外Willy等首次制備了能特異性識別重金屬汞的單克隆抗體(Wylie, D.E., et al. Monoclonal-antibodies specific for mercuric ions [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1992, 89(9): 4104-4108)，并初步用于水體中汞的檢測，但是檢測范圍相對比較窄，為0.5-10ppb (Wylie, D.E., et al. Detection of mercuric ions in water by Elisa with a mercury-specific antibody [J]. Analytical Biochemistry, 1991， 194(2): 381-387)。國內楊鳳麗等在《高技術通訊》(2008.5)上發表了題為"重金屬汞單克隆抗體的制備及鑒定"，該文介紹了制備汞單克隆抗體的方法及抗體鑒定。但這些都沒有用于建立標準化的免疫檢測方法。
當前，國際上對重金屬檢測的發展方向是靈敏、準確、實時、快速、選擇性好和適用范圍廣等。而傳統的汞的檢測技術大多需要大型或專門儀器(原子吸收光譜法、原子熒光光譜法和電感耦合等離子體-質譜法等)才能完成，且前處理過程復雜，耗時較多，分析工作只能在室內進行，難以滿足高通量快速和在線檢測的需要。因此，發展用于快速檢測重金屬汞的新方法和新技術極具現實意義。但是，目前國內外關于這方面的研究進展緩慢，尚未形成行之有效的成熟技術。基于抗原、抗體特異性結合作用的間接競爭酶聯免疫吸附測定方法具有檢測速度快、費用低廉、儀器簡單易攜、靈敏度高和選擇性強等優點，且能同時分析大量的環境樣本，已廣泛應用于臨床醫學、生命科學以及環境中有機有毒物質的檢測。
但在用于重金屬汞的檢測上一直未有所突破。

發明內容
1. 發明要解決的技術問題
針對現有的重金屬鎘汞檢測方法存在的問題，本發明提供一種重金屬汞間接競爭酶聯免疫吸附測定方法，基于高特異性、高效價的汞單克隆抗體快速、準確、高通量的間接競爭酶聯免疫吸附測定，可用于環境水樣的快速檢測。
2. 技術方案本發明是通過以下技術方案來實現的
一種重金屬汞間接競爭酶聯免疫吸附測定方法(即間接競爭酶聯免疫吸附測
定方法(CI-ELISA))，以特異性識別汞-螯合劑EDTA復合物Hg-EDTA的單克隆抗體為基礎，首先將包被原汞-螯合劑-蛋白(Hg-ITCBE-BSA)包被在96孔酶標板上，4 'C孵育過夜后用含1%明膠的磷酸鹽緩沖液PBS封閉，洗板后加入特異性汞單克隆抗體與待測樣品的混合溶液，37t:孵育后洗版，加入酶標二抗， 37t孵育，洗板后加入酶反應底物，孵育后加入終止反應液終止反應，然后用酶標儀測定各孔吸光度值。
以下通過詳細的步驟對本發明做進一步的具體限定
預先將1000 mg/L金屬汞標準液稀釋成200 mg/L儲備液，調節pH至需要值。以稀釋緩沖液PBS配置一定濃度的EDTA溶液，即為PBSE溶液。用蒸餾水將儲備液稀釋成系列濃度的標準溶液。再和EDTA反應生成系列濃度的 Hg-EDTA復合物溶液作為競爭化合物，加入酶標板。在此過程中，保證每一濃度的標液中含EDTA的量是一致的。具體的實驗步驟如下
(1)包被以包被緩沖溶液CBS稀釋包被原至抗原工作濃度，100ijL/孔， 4'C過夜或37°C2小時。(2) 洗板以PBST為洗液，在洗板機上進行洗滌，每板洗三次，每次每
孔注液300(jL，拍干。
(3) 封閉以1%明膠為封閉液，200nL/ L， 37'C孵育1h。
(4) 洗板；同(2)，拍干。
(5) 預混合取系列濃度的Hg^溶液各100yL與900jjLEDTA混合后，將混合液與PBS稀釋后的抗體等體積混合至1mL，在室溫下作用一段時間。同時以EDTA與稀釋抗體混合液做陽性對照。
(6) 競爭將預混好的各濃度的標準樣品加入96孔酶標板中，100pU孔， 37。C孵育2 h。
(7) 洗板同(2)，拍干。
(8) 加羊抗鼠酶標二抗羊抗鼠IgG-HRP以封閉液稀釋(1:10000)， 100 jjL/ 孔，37'C孵育1 h。
(9) 洗板同(2)，拍干。
(10) 加底物液(100 |jL 10 mg/mL的TMB和25 口1_0.65%1"1202溶于9.875 mLCPBS，使用前現配使用)100pL/孔，37。C顯色15min。
(11) 終止反應加濃度為2 M的硫酸溶液終止顯色反應，50pL/孔。
(12) 測定、計算酶標儀測定OD45o值，以空白對照調零，以EDTA與抗體混合液孔作為陽性對照。陽性對照孔(不含競爭化合物)與加樣孔(含有一定濃
度競爭化合物)測得的od450的差值與陽性對照孔測得的OD450的比即為抑制率。
計算公式如下-
(9化-(9"c ，
通過對抑制率和標準樣品中汞的濃度的對數值作圖，得到標準競爭抑制曲線，再對曲線進行Logit轉換，即以各孔吸光度值的Logit值為縱坐標，以標準樣品中汞的濃度的負對數值為橫坐標，繪制出樣品中汞的標準曲線，各孔吸光度值的Logit值與標準樣品中汞的濃度的負對數值成直線相關，從而進行定量分析。
所述的汞單克隆抗體，是經Hg-ITCBE-KLH為免疫原，采取腹腔注射的方式免疫BALB/c鼠，并經雜交瘤技術獲得，此處并不是本發明所要保護的發明點，可以自己制備獲得，也可以通過汞單克隆抗體的制備方提供來獲得。本發明的基本原理是首先將包被原包被在酶標板上，然后將抗體與小分子半抗原混合物作為樣品加入，小分子半抗原與包被在酶標板上的包被抗原之間發生競爭性結合反應。樣品中小分子半抗原的濃度越高，與之結合的抗體的量相對就越多，結合在包被抗原上的抗體量就越少，加入酶標二抗后，發生的顯色反應就越淺，OD450值越低。反之亦然。通過OD450值的變化進行半定量或定量分析。
3.有益效果-
本發明提供的重金屬汞間接競爭酶聯免疫吸附測定方法，使得重金屬汞快速、準確、高通量測定，在高特異性汞單克隆抗體的基礎上，建立了測定環境水樣中汞含量的間接競爭酶聯免疫吸附測定方法。本方法適合環境水樣中痕量汞的測定。同時為重金屬污染突發事故的現場快速檢測提供技術支持，便于及時對污染事故進行補救和恢復工作，且可以發展成為環境中其他樣品和農產品食品安全檢測的重要檢測手段，具有重大的現實意義。

圖1間接競爭酶聯免疫吸附測定方法標準抑制曲線
圖2間接競爭酶聯免疫吸附測定方法Logit定量曲線
具體實施例方式
以下通過實例進一步說明本發明。
實施例1:用于檢測重金屬汞單克隆抗體的制備
采用異硫氰酸酯法合成重金屬汞完全抗原，通過半抗原復合物中雙功能螯合劑上的硫氰根與大分子載體蛋白上游離的氨基進行結合，從而生成了完全抗原。
具體為以異硫氰基-苯甲基-乙二胺四乙酸(ITCBE)作為雙功能螯合劑劑，與重
金屬鎘形成汞-螯合劑(Hg-ITCBE)復合物，再分別以牛血清白蛋白(BSA)和
匙孔戚血藍蛋白(KLH)作為載體蛋白與Hg-ITCBE復合物偶聯，最終形成
Hg-ITCBE-BSA和Hg-ITCBE-KLH完全抗原，即包被原與免疫原。
取4只6周齡的雌性BALB/c鼠，于免疫前一周斷尾采血，作為陰性血清。
一周后，以Hg-ITCBE-KLH為免疫原進行免疫，釆取腹腔注射的方式共進行五
次免疫。每次免疫抗原用量為200 jjg/只(以蛋白濃度計)，初次免疫將免疫抗原
用等量弗氏完全佐劑乳化，二、三、四、五次免疫與等量弗氏不完全佐劑乳化，每次免疫間隔2周。融合前3天，用抗原直接加強免疫一次，劑量同前。第三、四、五次免疫后第10天采用斷尾方式采集血清，通過間接非競爭ELISA法測抗體效價，以Hg-ITCBE-BSA與ITCBE-BSA分別作為包被原包被酶標板，比較小鼠抗血清對兩種包被原的親合性，測定抗血清與它們的結合效價。最后選擇抗
體效價較高且二者OD450差異較大的小鼠用于細胞融合。
以雜交瘤技術對抗體效價較高且二者OD450差異較大的小鼠的脾細胞與 sp2/0骨髓瘤細胞進行融合，獲取雜交瘤細胞，對雜交瘤細胞進行篩選，得到能穩定分泌對Hg-EDTA具有特異性識別功能的單克隆抗體。
取10周齡健康雌性Balb/C小鼠，以0.5 mL液體石蠟對每只小鼠進行腹腔注射，使小鼠產生致敏效應，7H4天后，每只小鼠腹腔注射1 2xloe個雜交瘤細胞，觀察小鼠狀態，7~10天后，待小鼠腹腔明顯膨大后無菌收集腹水，4000 rpm離心15min，上清液即為腹水，分裝、標記，于-20。C保存備用；間隔2~3 天，待腹水再生積聚后，同法再取，一般一只小鼠可抽取2~3次。待小鼠腹水全部取出后純化腹水，間接非競爭ELISA方法測其效價。腹水效價達到1: 300000。
實施例2:汞單克隆抗體特異性的鑒定
本實施例選擇了環境中常見的一些重金屬離子進行交叉反應率測定，考察汞
單克隆抗體的特異性。選擇的金屬離子有Zn2+， Pb2+， Cd2+， AI3+， Ni2+, Mg2+， Ca2+， Co2+， Ci^+等9種。按照發明內容中間接競爭酶聯免疫吸附測定方法的具體實驗步驟進行操作。以濃度為0.1， 1， 10， 20， 50， 100， 500， 1000|jg/L Hg2+標準溶液以及濃度為0.01， 0.1， 1， 5， 10， 50mg/L的Zn2+， Pb2+， Cd2+， AI3+， Ni2+， Mg2+， Ca2+， Co2+， Cu&系列標準溶液作為樣品加入酶標板中，測定板中各孔的OD45o的值。根據抑制曲線產生50%抑制或結合的各競爭物濃度 IC50(mg/L)，比較它們對抗體的親和性。同時用下式計算其他競爭物對Hg的交叉反應率(Cross-Reactivity)，以考察抗體的特異性。
交叉反應率CR%=[IC50(CP)/IC50(competitor)xl00%
交叉反應率的高低決定了它們對Hg^檢測干擾程度的大小，即方法對Hg的特異性。數據結果列于表1。從表中可以看出，其他9種金屬對抗體的最大抑制率均低于50%，交叉反應率均小于0.13%。實驗結果表明，本發明制備的單克隆抗體對汞具有良好的特異性，其對他金屬離子的親合力比較弱。因此，在使用本發明的單克隆抗體進行酶聯免疫吸附測定分析時，能非常準確的檢測樣品中是否存在重金屬汞，從而進行定量分析。
實施例3:重金屬汞酶聯免疫吸附測定方法 1:抗原抗體最佳工作濃度的確定
采用方陣滴定法對包被抗原和抗體的最佳工作濃度進行優化用CBS將包
被抗原Hg(ll)-ITCBE-BSA系列稀釋為1000倍、2000倍、4000倍、8000倍包被酶標板的1-3， 4-5， 6-9， 10-12列；用1%明膠作為封閉液；抗體分別倍比稀釋為5000倍、10000倍、20000倍、40000倍、80000倍、160000倍、320000 倍和640000倍，于酶標板的A-H行；加羊抗鼠二抗IgG-HRP (1:5000， PBS 稀釋)；tmb顯色，2M硫酸終止，測OD4so值。以00450值為略大于而趨近于 1且抗原和抗體濃度均為最低的組合時為最佳工作濃度。實驗結果表明抗原稀釋度為4000-8000，抗體稀釋度為80000時，00450值為1.092-1.247。本實驗以抗原稀釋度5000做為最佳抗原稀釋濃度。 2: ELISA方法的建立
按照發明內容中間接競爭酶聯免疫吸附測定方法的具體限定步驟，建立滎的測定方法
(1) 包被以包被緩沖溶液cbs稀釋包被原至抗原工作濃度，100ijL/孔， 4'C過夜或37'C2小時；
(2) 洗板以PBST為洗液，在洗板機上進行洗滌，每板洗三次，每次每孔注液300pL，拍干；
(3) 封閉以1%明膠為封閉液，200ijL/孔，37。C孵育1h。
(4) 洗板；同步驟(2)，拍干；
(5) 預混合取系列濃度的HgZ+溶液各100|jL與900pLEDTA混合后，將混合液與PBS稀釋后的抗體等體積混合至1mL，在室溫下作用一段時間。同時以EDTA與稀釋抗體混合液做陽性對照；
(6) 加樣反應將預混好的各濃度的標準樣品加入96孔酶標板中，100 |j|_/ 孑L， 37'C孵育2h;(7) 洗板同(2)，拍干；
(8) 加羊抗鼠酶標二抗羊抗鼠IgG-HRP以封閉液稀釋(1:10000)， 100 |jL/ 孑l， 37"C孵育1 h;
(9) 洗板同(2)，拍干；
(10) 加底物液(100 pL 10 mg/mL的TMB和25 |jL 0.65%H2O2溶于9.875 mLCPBS，使用前現配使用)100yL/孔，37。C顯色15min;
(11) 終止反應加濃度為2 M的硫酸溶液終止顯色反應，50ijL/孔；
(12) 測定，計算酶標儀測定OD45o值，以空白對照調零，以EDTA與
抗體混合液孔作為陽性對照，陽性對照孔與加樣孔測得的OD450的差值與陽性對照孔測得的OD450的比即為抑制率，計算公式如下
(9化—ODc /i = ~^-xl00%w 。
3:條件優化
在最佳ELISA分析方法工作濃度基礎上，用不同pH值和離子強度的包被液包被，選擇出空白OD45o值相對較高的包被條件作為最佳。本發明采用pH=9.6 的CBS作為包被緩沖液。
考察不同的鹽離子濃度對抗原抗體結合反應的影響，使反應體系中NaCI的濃度依次改變，選擇出空白OD45o值相對較高的鹽離子濃度。本發明采用0.15 M 的溶液作為稀釋緩沖液。
封閉液的作用是消除非特異性吸附。競爭ELISA反應中，在抗原抗體最佳工作濃度及最適鹽離子強度的條件下，本發明分別采用了 1%明膠、3%BSA、 1%OVA、及5%脫脂奶粉作為封閉液(200pL/ l),比較其對檢測曲線的影響。根據實驗結果本發明采用1%明膠作為封閉液。
改變金屬標液稀釋緩沖液中EDTA濃度，使反應體系中EDTA濃度分別為 2.5 mM， 5.0 mM， 10mM， 20 mM，比較不同EDTA濃度對抗體的抑制作用。根據結果，本發明采用5.0 mM EDTA作為樣品緩沖液中EDTA的濃度。
反應體系中pH值分別取3-4、 7.4、 7.8，比較不同pH值對ELISA檢測曲線的影響。根據實驗結果，反應環境pH在7和7.8之間沒有明顯的差異，本發明采用反應體系pH值為7.4。4:標準曲線
在上述最佳反應條件下，建立間接競爭酶聯免疫吸附測定方法，以抑制率
Inhibition rate為縱坐標(Y)， Hg^濃度(pg/L)的負對數值為橫坐標(X)繪制標準競爭抑制曲線，如圖1所示。從圖中可以看出Hg"在0.1 ng/L 1000yg/L 范圍內，抑制率與Hg^濃度pg/L的負對數值相關系數達0.999，方法的檢測范圍較寬。從圖中也可以得到ICso為13.27 yg/L， 1020為0.468叩/L，以1020的濃度為最低檢測限，則該方法對Hg"濃度的檢測限為0.459 pg/L。我國生活用水和農田灌溉用水的最高允許濃度均為0.001 mg/L (1叩/L)。可見間接競爭 ELISA方法完全適用于水質檢測的要求。 5:定量計算與分析
對4中的標準抑制曲線進行Logit轉換，即以Logit(B/Bo)為縱坐標(Y)， Hg2+ 濃度(pg/L)的負對數值為橫坐標(X)，做標準Logit曲線，其中B為標準系列濃度下的OD45o值，Bo為陽性對照的OD45o值。Logit(B/Bo)與Hg2+濃度0ig/L)的負對數值呈線性關系，如圖2所示。線性方程為Y = 0.86837 + 0.22795 X， R2=0.994。
根據待測樣品的OD45o值，計算出各樣品的Logit值，代入上述標準曲線的線性方程，求出相應Logit值對應的樣品中汞的濃度負對數，即可方便的計算出待測樣品中汞的含量。
實施例4:應用本法對實際水樣加標回收測定
取一定量超純水、自來水、經過濾處理的太湖水，在于建立標準檢測曲線時條件一致的情況下，分別添加一定量的HgS+標準溶液，經系列稀釋后用于間接競爭ELISA分析。根據OD45o值及抑制率值從標準曲線上得到相應的Hf+濃度，添加回收率按下式計算添加回收率％=實測濃度/理論濃度"00%。
結果說明，超純水、自來水、太湖水空白與PBSE空白得到的OD4so值無顯著性差異，說明樣品空白對抗原抗體結合反應不產生干擾。采用ELISA方法測定超純水、自來水、太湖水的添加回收率分別為94.3% 123.5%， 91.85% 117.9%, 92.26% 115.6%; CV。/。分別為2.43% 6.57%， 1.21% 4.79%， 1.12% 9.4%，符合分析要求。表1抗體特異性實驗結果
競爭離子最大抑制率/%ICso/mg/L交叉反應率/%
Hg8513.27100%
Zn30.06>104<0.1327
Pb40.85>104<0.1327
Cd45.23>104<0.1327
Al26.4>104<0.1327
Ni32.94>104<0.1327
Mg39.25>104<0.1327
Ca26.57>104<0.1327
Co41.17>104<0.1327
Cu37.05>104 <0.132權利要求
1.一種重金屬汞間接競爭酶聯免疫吸附測定方法，其特征在于以特異性識別汞-螯合劑EDTA復合物Hg-EDTA的單克隆抗體為基礎，將包被原汞-螯合劑-蛋白包被在96孔酶標板上；4℃孵育過夜后用含1％明膠的磷酸鹽緩沖液PBS封閉，洗板后加入特異性汞單克隆抗體與待測樣品的混合溶液，37℃孵育后洗版，加入酶標二抗，37℃孵育，洗板后加入酶反應底物，孵育后加入終止反應液終止反應，然后用酶標儀測定各孔吸光度值。
2. 根據權利要求書1所述的重金屬汞間接競爭酶聯免疫吸附測定方法，其特征在于通過以下步驟作進一步的具體限定(1) 包被以包被緩沖溶液CBS稀釋包被原至抗原工作濃度，100pL/ L， 4°C 過夜或37'C2小時；(2) 洗板以PBST為洗液，在洗板機上進行洗滌，每板洗三次，每次每孔注液300 pL，拍干；(3) 封閉以1%明膠為封閉液，200pL/孔，37。C孵育lh。(4) 洗板；同步驟(2)，拍干；(5) 預混合取系列濃度的Hg^溶液各100)_iL與900pLEDTA混合后，將混合液與PBS稀釋后的抗體等體積混合至lmL，在室溫下作用一段時間。同時以 EDTA與稀釋抗體混合液做陽性對照；(6) 加樣反應將預混好的各濃度的標準樣品加入96孔酶標板中，100pL/孔， 37'C孵育2h;(7) 洗板同(2)，拍干；(8) 加羊抗鼠酶標二抗羊抗鼠IgG-HRP以封閉液稀釋(1:10000)， 100nL/孑L， 37"孵育1 h;(9) 洗板同(2)，拍干；(10) 加底物液(100 pL 10 mg/mL的TMB和25 pL 0.65%1!202溶于9.875 mL CPBS，使用前現配使用)100pL/孔，37'C顯色15min;(11) 終止反應加濃度為2M的硫酸溶液終止顯色反應，50pL/孔；(12) 測定，計算酶標儀測定OD45o值，以空白對照調零，以EDTA與抗體混合液孔作為陽性對照，陽性對照孔與加樣孔測得的OD450的差值與陽性對照孔測得的OD450的比即為抑制率，計算公式如下<formula>formula see original document page 3</formula>
3. 根據權利要求2所述的重金屬汞間接競爭酶聯免疫吸附測定方法，其特征在于重汞單克隆抗體能特異性的識別汞-螯合劑EDTA復合物Hg-EDTA，與 Zn2+、 Pb2+、 Cd2+、 AI3+、 Ni2+、 Mg2+、 Ca2+、 0>2+或Cu2+的交叉反應率低于 0.13%。
4. 根據權利要求1 3中任一項所述的重金屬汞間接競爭酶聯免疫吸附測定方法，其特征在于反應體系中以pH=9.6的CBS作為包被緩沖液，包被抗原 Hg(ll)-ITCBE-BSA稀釋倍數為1:5000，抗體稀釋倍數為1:80000，最佳封閉物為1%明膠，金屬標液稀釋緩沖液中EDTA濃度為5.0 mM，抗原抗體反應體系PBS中氯化鈉的離子強度為0.15mol/L，最佳pH值為7.4，在上述反應條件下獲得競爭抑制標準曲線。
全文摘要
一種重金屬汞間接競爭酶聯免疫吸附測定方法，屬于環境水樣中重金屬汞的測定方法。以特異性識別汞-螯合劑EDTA復合物Hg-EDTA的單克隆抗體為基礎，將包被原汞-螯合劑-蛋白包被在96孔酶標板上；4℃孵育過夜后用含1％明膠的磷酸鹽緩沖液PBS封閉，洗板后加入特異性汞單克隆抗體與待測樣品的混合溶液，37℃孵育后洗版，加入酶標二抗，37℃孵育，洗板后加入酶反應底物，孵育后加入終止反應液終止反應，然后用酶標儀測定各孔吸光度值。得到標準競爭抑制曲線，再對曲線進行Logit轉換，繪制出樣品中汞的標準曲線，從而進行定量分析。本方法適合環境水樣中痕量汞的測定，同時為重金屬污染突發事故的現場快速檢測提供技術支持，便于及時對污染事故進行補救和恢復工作。
文檔編號G01N33/577GK101655499SQ20091018460
公開日2010年2月24日申請日期2009年8月21日優先權日2009年8月21日
發明者歡何, 愷喻, 成孫, 徐敏杰, 楊紹貴申請人:南京大學

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