專利名稱：MWCNTs-TiO<sub>2</sub>/Nafion 復合介質的酶電極的制備方法
技術領域：
本發明屬于電化學領域，具體涉及一種使用電化學方法測定樣品中某些 物質的酶電極的制備方法。
背景技術：
目前，越來越多的學者致力于氧化還原蛋白質的直接電化學研究，因為 這些研究工作不僅能幫助我們理解蛋白質的結構、蛋白分子氧化還原轉化機 理及代謝過程，還能促進安培型生物傳感器和生物電催化系統的進一步發展。 血紅蛋白是血紅素蛋白質的一種，在血紅細胞中負責運輸氧氣和二氧化碳分 子。血紅蛋白是由兩條a-和兩條p-多肽鏈組成的四聚體寡聚蛋白，每條鏈上各 結合一個亞鐵血紅素集團，每條多肽鏈的螺旋結構形成一個疏水性的空間， 可保護血紅素分子不與水接觸，Fe2+不被氧化。因為血紅蛋白容易購買和結構 明了，是研究血紅素蛋白質直接電子轉移的理想模型分子。但是，血紅蛋白 具有擴展的三維結構，由此產生其電活性中心的難以接近，另外它很容易吸 附到電極表面而使其鈍化，所以血紅蛋白很難在裸電極表面發生直接電子轉 移。研究者們做出了極大的努力去加強血紅蛋白的電子轉移。
納米材料具有量子尺寸效應和表面效應，為促進生物活性物質與電極之 間的直接電子轉移提供了一個重要平臺。納米Ti02具有比表面積大、表面活 性基團多、優秀的生物兼容性和化學穩定性等特點，此外，Ti原子與蛋白質 分子之間具有特殊的螯合作用，已成功用于生物分子的固定。最近人們發現 蛋白質分子與Ti02之間存在強烈的靜電吸附作用，通過這種靜電作用可以實 現蛋白質在Ti02表面的固定，但Ti02本身導電性不是很好，需要對Ti02進行修 飾或改性。碳納米管是一種具有優良導電性能的新型一維納米新材料，因為 其優良的電子導電性和特殊的孔腔立體選擇性等被認為是一種優良的催化劑載體。我們合成了多壁碳納米管(MWCNTs)和Ti02的核-殼型納米復合材料， 希望綜合兩者的優點，制備出具有高選擇性和催化性能的第三代生物傳感器。
無機-有機雜化復合功能材料是當今材料科學研究和應用的熱點之一，這 種材料綜合了各成分之間的物理化學性能并改善了它們的特征，其主要優點 是兼具有無機物的剛性及穩定性和有機物的柔性及易修飾性。 一些具有良好 生物兼容性的無機-有機納米復合材料已用于構制生物傳感器。
Nafion (全氟化磺酸酯)是一種優良的陽離子交換劑，它是由碳氫聚合 物主鏈微晶、含側鏈、水和磺酸基的界面間區域以及離子簇區三相所組成， 其磺酸基基伸于骨架外內部分為憎水基(類似于聚四氟乙烯的氟碳骨架部分) 及親水基(離子化磺酸基SCV ),在后者上聚集著極化了的溶劑分子，它就 是Nafion中起陽離子交換作用的基團。Nafioii具有好的電子傳導性、好的生 物兼容性、優秀的成膜性和吸附能力、高化學穩定性和具有抗陰離子和生物 大分子的能力，是固定生物分子的良好介質。
發明內容
本發明的目的是提供一種MWCNTs-TiCVNafion復合介質的酶電極的制 備方法，本發明以血紅蛋白為模型，通過研究血紅蛋白在電極上的電化學行 為，預測其他氧化還原蛋白的在類似電極上的應用，探測如何使生物大分子 在電極上既保持天然結構又保持生物活性。
本發明的目的可以通過以下措施達到
一種MWCNTs-Ti02/Nafion復合介質的酶電極的制備方法，包括如下步
驟
A、 MWCNTs-Ti02核-殼型納米復合材料的制備
將酸處理過的MWCNTs多壁碳納米管，分散于十二烷基硫酸鈉溶液中， 進行超聲吸附處理，再將吸附十二烷基硫酸鈉的MWCNTs置于乙醇水溶液 中，加入鈦酸正丁酯，進行超聲處理制得懸浮液，將懸浮液水浴加熱進行反 應，反應后清洗、干燥，制得MWCNTs-Ti02核-殼型納米復合材料；
B、 修飾電極的制備將電極進行拋光和清洗處理；將血紅蛋白溶解于磷酸鹽緩沖溶液中制得 血紅蛋白溶液；將MWCNTs-Ti02核-殼型納米復合材料分散于二次蒸餾水中 制得MWCNTs-Ti02懸浮液；
先將MWCNTs-TiCb懸浮液與Nafion溶液混合后，再加入血紅蛋白溶液， 混合均勻，然后滴在拋光清洗好的電極表面，在密封條件下晾干。
在步驟A中酸處理的具體過程為將MWCNTs多壁碳納米管在濃硝酸 (質量分數65%)中于130 15(TC下氧化9 llh，優選的條件為于140'C回 流氧化10 h。步驟A中將十二烷基硫酸鈉吸附在MWCNTs表面的具體過程 為將酸處理過的MWCNTs分散于十二烷基硫酸鈉溶液中，超聲2 4 h， 使十二垸基硫酸鈉吸附，然后反復沖洗干凈，干燥；其中十二烷基硫酸鈉溶 液的質量含量為0.8 1.5%，優選為1%。
步驟A中Ti02引入的具體過程為將鈦酸正丁酯和吸附十二烷基硫酸 鈉的MWCNTs投入乙醇水溶液中，先超聲處理形成懸浮液，再水浴加熱進 行反應。其中乙醇水溶液的體積濃度為3 5%，優選為4%。鈦酸正丁酯與 乙醇水溶液的體積比為1:0.9 L1，優選1:1 1.1;鈦酸正丁酯的用量以吸附 十二垸基硫酸鈉的MWCNTs的質量計為19 21pL/mg，優選為20pL/mg。 水浴時的反應條件為在75 85'C下反應2.5 3.5h，優選為80"C下反應3h。
本發明所采用的電極為石墨電極、碳電極、玻碳電極、鉬-碳電極、金電 極、鈀電極、銀電極或鉑電極，優選為玻碳電極(GCE)。對電極進行拋光和 清洗處理為將電極分別用l.O、 0.3和0.05 |im Y-氧化鋁粉末拋光，再分別 在丙酮和去離子水中超聲清洗。
步驟B中磷酸鹽緩沖溶液的濃度為0.08 0.12mol/L，優選為0.12mol/L, pH為6.5;所述的血紅蛋白溶液的濃度為5.5 6.5mg/mL，優選為6mg/mL。 Nafion溶液的質量濃度為1.8 2.2%,優選為2%。 MWCNTs-Ti02懸浮液的 濃度為0.9 1.1mg/mL，優選為lmg/mL。
步驟B中MWCNTs-Ti02懸浮液與Nafion溶液和血紅蛋白溶液混合過程
6中，其體積比為1.9 2.1:1: 1.9 2丄優選為2:1:2。
本發明采用的血紅蛋白可以為各種動物的血紅蛋白，也可以是其他血紅 素蛋白，優選為牛血紅蛋白(Hb)。
本發明制得的生物傳感器(即復合電極)可用于測定過氧化氫和三氯乙 酸，過氧化氫是一種十分重要的工業原料,在廢水處理、消毒、產生氧等方面 均有重要用途，三氯乙酸(TCA)是一種重要的有機鹵環境污染物，檢測環 境污染物中的三氯乙酸對于控制環境污染具有重要的意義，另外，此生物傳 感器作為一個模型成功測定了過氧化氫和三氯乙酸，說明方法的有效性，當 改換用不同酶(本實驗中使用的是血紅蛋白)時，就可以測定不同的物質。
為驗證本發明制備方法以及最終所得電極的效果，對各級合成產物做各 種表征和分析檢測
(1) MWCNTs-Ti02核-殼型納米復合材料的TEM、 SEM和XRD表征。(2) 紫外-可見光譜分析，證明了血紅蛋白修飾到電極上后保持原來的結構。
(3) Hb/MWCNTs-Ti02/Nafion復合膜的FT-IR表征。
(4) 分別對MWCNTs-Ti02/Nafion/GCE和Hb/MWCNTs-Ti02/Nafion/GCE 修飾電極做了電化學阻抗譜，表明血紅蛋白能很容易地吸附到 MWCNTS-Ti(VNafion膜上。
(5) 對Hb/MWCNTs-Ti02/Nafion/GCE修飾電極的直接電化學研究表明， MWCNTs-Ti02通過與Nafion的協同作用對血紅蛋白的直接電子轉移起了重要 作用。
(6) 在10-1000mV^范圍內，隨著掃速的增加，血紅蛋白的陰極和陽極峰 電位發生微小的偏移，而峰電流則線性增加，表明電極過程為表面控制過程， 計算表明在Hb/MWCNTs-Ti02/Nafion/GCE修飾電極上發生的為單電子轉移 反應，血紅蛋白在該修飾電極上的轉移系數和電子轉移速率常數分別為0.53 和1.23 s"，表明血紅蛋白在復合膜內電子轉移是非常容易的。
(7) 在實驗的pH范圍(4.0-9.0)內，復合膜中的血紅蛋白均能得到穩定可 逆的氧化還原峰。蛋白質的氧化峰電位、還原峰電位及式電位(Epa、 Epe和EG')都隨pH值的增加而負移，說明血紅蛋白在氧化還原過程中伴隨有質子 轉移，此現象與水分子以及血紅素周圍氨基酸的質子化作用有關，稱為氧化 還原波爾反應。
制備的酶電極使用循環伏安法和計時安培法測定了過氧化氫
當向電解池中加入 0.06 mmol七-'過氧化氫時， Hb/MWCNTs-Ti02/Nafion/GCE修飾電極響應的還原峰電流顯著增加而氧化 峰電流顯著減少，表明血紅蛋白對過氧化氫的還原過程具有典型的電催化性 質，且還原峰電流隨過氧化氫濃度的增加而增加，而在 MWCNTs-Ti02/Nafion/GCE修飾電極上沒有觀察到該現象，計算 Hb/MWCNTs-Ti02/Nafion/GCE修飾電極對過氧化氫還原的濃度校正曲線得 到其線性范圍為5 - 160 ,l.L",回歸方程為I OiA) = 0.085C (,l.L") + 0.032 (R2=0.997)，三倍噪聲時的檢測限為0.13 pmol'I/1。
向pH 7.0 PBS中不斷加入不同體積的過氧化氫，過氧化氫加入后的5 s 內，還原電流已達到最大響應電流的95%，說明該修飾電極對過氧化氫有良 好的響應。
循環伏安法測定三氯乙酸
Hb/MWCNTs-Ti02/Nafion/GCE修飾電極對不同濃度的三氯乙酸的電催 化還原實驗表明，三氯乙酸在修飾電極上的還原峰電流隨著三氯乙酸濃度的 增大而增大；基于MWCNTs-Ti02和Nafion復合膜構建的血紅蛋白修飾電極 對三氯乙酸具有很好的電催化活性，可用于檢測環境中有機鹵污染物的濃度。
研究了修飾電極穩定性和重復性
通過兩種方法考察了 Hb/MWCNTs-Ti02/Nafion膜修飾電極的循環伏安 曲線，以證明其穩定性。首先，在pH7.0的PBS溶液中循環伏安法掃描100 圈(-0.8 0.2V， 100mV's")后，其氧化還原峰電流基本不變。其次，制備 的該修飾電極保存在4 'C冰箱中保存，電極在20天后仍能保持97%的初始 響應電流值，顯示了很好的長期穩定性。這種很好的長期穩定性進一步說明 了復合膜好的生物兼容性。為考察修飾電極的重復性，在相同的獨立條件下制備了6個傳感器并用于 測定20 pmol丄"過氧化氫，實驗結果表明催化電流的相對標準偏差為4.4%， 這表明修飾電極的重復性很好。
本發明將MWCNTs-Ti02核-殼型納米復合材料分散在Nafion中制得無機 -有機復合膜作為生物分子的固定基質構建血紅蛋白電極的制備方法，利用 MWCNTs-Ti02核-殼型納米復合材料的比表面積大、表面反應活性高、吸附 能力強和導電性大等性能和Nafion的成膜、高化學穩定性和抗干擾性等性 能，制成了響應快速、靈敏度高、催化能力強的血紅蛋白生物傳感器。該傳 感器優選主要有以下部分組成玻碳電極(GCE)、多壁碳納米管(MWCNTs)、 二氧化鈦(Ti02)、全氟化磺酸酯(Nafion)、牛血紅蛋白(Hb)。電化學阻抗譜表 明通過靜電力血紅蛋白能很容易地吸附到MWCNTS-TiCVNafion膜上。固載 于MWCNTS-Ti02/Nafi0n無機-有機復合膜內的血紅蛋白不僅保持了自身天 然構象并且能夠實現電極之間直接電子轉移。Hb/MWCNTs-Ti02/Nafion修飾 電極對過氧化氫和三氯乙酸表現出很好的催化性能。該修飾電極的催化還原 過氧化氫的靈敏度和米氏常數分別為0.78 A/M/cmS和34.9 ^M。該生物傳感 器具有很好的生物兼容性、穩定性和重復性。這表明該復合介質適合Hb的 固定，在構建生物傳感器上具有潛在應用。此傳感器可用于檢測過氧化氫、 三氯乙酸等物質，具有靈敏度低、檢出限低等優點。
圖1為酸處理后的MWCNT(a)及MWCNTs-Ti02核-殼型納米復合材料 TEM圖2為MWCNTs-Ti02核-殼型復合材料的SEM圖； 圖3為MWCNTs (a)和MWCNT-Ti02 (b)的XRD圖； 圖4為Hb在pH7.0PBS (a)和MWCNTs-Ti02/Nafion復合膜(b)中 的紫外-可見光譜；
圖5為Hb (a)、 Hb/MWCNTs-Ti02/Nafion (b)和MWCNTs-Ti02/Nafion
(C)的傅里葉紅外光譜；
9圖6為MWCNTS-TIO2/NAFION/GCE修飾電極(a)和的MWCNTs分散于1%十二烷基硫酸鈉溶液中，超聲3 h，使十二垸基硫酸 鈉吸附在MWCNTs表面，反復沖洗干凈，干燥。在4 mL無水乙醇中加入 100 鈦酸正丁酯、100 nL水和5 mg吸附十二烷基硫酸鈉的MWCNTs。超 聲30 min后將此懸浮液轉移到燒杯A中(體積為10 mL)。在燒杯B (體積 為20 mL)中注入4mL 二次蒸餾水，然后將燒杯A置于燒杯B中，將此裝 置密封，置于烘箱中于8(TC加熱3 h。反應結束后，將離心得到的固體樣品 用無水乙醇和二次蒸餾水反復沖洗干凈，然后在真空干燥箱中干燥，制得 MWCNTs-Ti02核-殼型納米復合材料。
(2) 修飾電極的制備
制備電極之前，玻碳電極(GCE，直徑為3mm)分別用l.O， 0.3和0.05 pm
Y-氧化鋁粉末拋光，分別在丙酮和去離子水中超聲清洗，室溫下晾干備用。
為了制備Hb電極，將6mg牛血紅蛋白溶解在l mLO.l mol/L pH 6.5的磷酸 鹽緩沖溶液(PBS)中制得6mg/mL的血紅蛋白溶液；將1 mgMWCNTs-Ti02 核-殼型納米復合材料分散于lmL二次蒸餾水中制得MWCNTs-Ti02懸浮液。
將200 ^L上述懸浮液與100 pL 2% Nafion溶液超聲混合均勻，然后加入200 (iL血紅蛋白溶液，混合均勻。將5pL制得的上述懸浮液滴在拋光好的玻碳電 極表面，在密封條件下晾干，制得Hb/MWCNTs-Ti02/Nafion/GCE修飾電極， 當電極不用時在4'C的條件下儲存。
(3) 空白對照
將5pL的MWCNTs-Ti02懸浮液、血紅蛋白溶液、Nafion溶液或Hb-Nafion 混合液單獨或兩兩組合滴在拋光好的玻碳電極表面，在密封條件下晾干，制 得各種空白對照電極。 2.對各級合成產物做各種表征和分析檢測 (1 )MWCNTs-Ti02核-殼型納米復合材料的TEM、 SEM和XRD表征(見圖1~3)
(2) 紫外-可見光譜分析(見圖4)
(3) Hb/MWCNTs-Ti02/Nafion復合膜的FT-IR表征(見圖5)
(4) 電化學阻抗譜(見圖6)(5) Hb/MWCNTs-TKVNafion/GCE的直接電化學研究(見圖7)
(6) 掃描速度的影響(見圖8)
(7) pH的影響(見圖9)
3.使用制備的酶電極循環伏安法(見圖10)和計時安培法(見圖11)測定過 氧化氫，循環伏安法測定三氯乙酸(見圖12)，確定修飾電極穩定性和重復 性。
權利要求
1、一種MWCNTs-TiO2/Nafion復合介質的酶電極的制備方法，其特征在于包括如下步驟A、MWCNTs-TiO2核-殼型納米復合材料的制備將酸處理過的MWCNTs多壁碳納米管，分散于十二烷基硫酸鈉溶液中，進行超聲吸附處理，再將吸附十二烷基硫酸鈉的MWCNTs置于乙醇水溶液中，加入鈦酸正丁酯，進行超聲處理制得懸浮液，將懸浮液水浴加熱進行反應，反應后清洗、干燥，制得MWCNTs-TiO2核-殼型納米復合材料；B、修飾電極的制備將電極進行拋光和清洗處理；將血紅蛋白溶解于磷酸鹽緩沖溶液中制得血紅蛋白溶液；將MWCNTs-TiO2核-殼型納米復合材料分散于1mL二次蒸餾水中制得MWCNTs-TiO2懸浮液；先將MWCNTs-TiO2懸浮液與Nafion溶液混合后，再加入血紅蛋白溶液，混合均勻，然后滴在拋光清洗好的電極表面，在密封條件下晾干。
2、 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟A中所述的酸處理為 將MWCNTs多壁碳納米管在濃硝酸中于130 150'C下氧化9 llh。
3、 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟A中所述的十二烷基 硫酸鈉溶液的質量含量為0.8 1.5%。
4、 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟A中，所述的乙醇水 溶液的體積濃度為3 5%;所述的鈦酸正丁酯與乙醇水溶液的體積比為 1:0.9 L1，鈦酸正丁酯的用量以吸附十二烷基硫酸鈉的MWCNTs的質量計 為19 21|iL/mg。
5、 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟A中水浴加熱的反應 條件為在75 85。C下反應2.5 3.5h。
6、 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的電極為石墨電極、碳 電極、玻碳電極、鉑-碳電極、金電極、鈀電極、銀電極或鉑電極。
7、 根據權利要求1或5所述的制備方法，其特征在于對電極進行拋光和清洗 處理為將電極分別用l.O、 0.3和0.05 ,Y-氧化鋁粉末拋光，再分別在丙 酮和去離子水中超聲清洗。
8、 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的磷酸鹽緩沖溶液的濃 度為0.08 0.12 mol/L， pH為6.5;所述的血紅蛋白溶液的濃度為5.5 6 .5mg/mL。
9、 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟B中，所述的Nafion 溶液的質量濃度為1.8 2.2%; MWCNTs-Ti02懸浮液與Nafion溶液和血紅蛋 白溶液混合過程中，其體積比為1.9 2.1:1: 1.9 2.1。
10、 根據權利要求1、 8或9所述的制備方法，其特征在于所述的血紅蛋白為 牛血紅蛋白。
全文摘要
本發明公開了一種MWCNTs-TiO<sub>2</sub>/Nafion復合介質的酶電極的制備方法，本發明將MWCNTs-TiO<sub>2</sub>核-殼型納米復合材料分散在Nafion中制得無機-有機復合膜作為生物分子的固定基質構建血紅蛋白電極的制備方法，利用MWCNTs-TiO<sub>2</sub>核-殼型納米復合材料的比表面積大、表面反應活性高、吸附能力強和導電性大等性能和Nafion的成膜、高化學穩定性和抗干擾性等性能，制成了響應快速、靈敏度高、催化能力強的血紅蛋白生物傳感器。該生物傳感器具有很好的生物兼容性、穩定性和重復性，在構建生物傳感器上具有潛在應用。此傳感器可用于檢測過氧化氫、三氯乙酸等物質，具有靈敏度低、檢出限低等優點。
文檔編號G01N27/327GK101603940SQ200910181438
公開日2009年12月16日 申請日期2009年7月16日 優先權日2009年7月16日
發明者娟 徐, 楊孝榮, 田丹碧, 偉 馬 申請人:南京工業大學