專利名稱：分析循環抗體的方法
技術領域：
本發明涉及一種分析循環抗體的方法。
背景技術：
快速、可靠、花劍氏廉的分析和診斷方法是非常需要的。
PCT/SE03/00919 (AmicAB)涉及一種微^^、統，它包含基底，基底上體 有至少一條流路，該流路包含復數個微型柱，它們從基底上向上伸出，微型柱 之間的間距足夠小從而可以引起液體樣品的毛細作用，迫使，液體移動。公 開了裝置可包含更密集的區，其可以起到篩網的作用，阻止例如細M過。還 公開了關于微結構的實施方式，其中的形狀、尺寸和/或中心到中心間距形成了 梯度使得細胞以及諸如此類的物質被遲滯或分離。
PCT/SE2005/000429 (AmicAB)公開了一種^g和方纟去，用來在檢測液體 樣品中的分析物之前對所述液##品中的成分進行分離，其中樣品添加到基底 上的接收區，戶腿基底任選地還包含反應區，分別連接接收區和反應區并在基 底上形成了流路的皿^t顯育區，其中所述基底是無 L基底，而且至少部分所
述流路由基本上垂直于戶;M基底表面的凸起區域組成，凸起區域具有高度、直
徑和相互間距，從而在戶脫區實5^脫液勝品的橫向毛細流動，并且分離部 件配置成與接收樣品的區鄉比鄰。公開了除去紅細胞的實施方式。
PCT/SE2005/000787 (AmicAB)涉及處理液,品的，，包括帶有至少 一個用于接收樣品的區的流路、和錢鄉育區，戶脫區通過具有基本垂直于 其表面的凸起的區連接或包括這樣的區，所，置衛，能接iB^f述液,品 的槽，戶腿槽包括具有基本垂直于其表面的凸起的區，并且戶脫槽適合于響應
外部影響并調節它接iB^M液體樣品的能力。公開了該裝置可以用于顆粒物質 如細lfe/人大量樣品中分離。描述了紅細胞能被分離且沒有出現顯著的破裂。
PCT/US2003/030965 (The General Hospital Corporation, and GPB Scientific LLC)公開了從樣品中分離細胞的方法。還公開了具有不同性質的細胞的分離。該裝置是封閉的，具有輸入和輸出通道和蓋子。裝置包括障礙物陣列，其能夠 結合細胞群體。
US2007/0059718A1公開了用于檢觀,、鵬具有生物危險的分析物的方法， 如細菌、原生動物、病毒病原體和毒素。
目前需要E^有力和可靠的分析循環抗體的方法。
發明
本發明的一個目的是掛共改進的用于分析循環抗體的方法。 本發明提供了用于分析循環抗體的方法，包括如下步驟
a. 提供包含基底的分析裝置，戶艦基底上設有至少一個加樣品區，至少一 個阻留區，至少一個槽(sink)，至少一條連接加樣品區、阻留區和槽的流路， 其中、 是開放的并包括基本上垂直于戶，基底表面并具有高度(H)、直徑(D) 和相互間距(tl， t2)的凸起，從而實^^M樣品的橫向毛細流動并且細胞可以 流經凸起，其中所述阻留區包含至少一種結合細胞結構的親和結合工具 CmeansX
b. 在加樣品區加入至少一個樣品，且
c. 讀出結果，
其中針對細胞結構的循環抗術皮觀啶。
有關本發明的更深入的方面和實施方式在所附的權禾腰求中被限定，在此 通過援引并入。
通^^f共包含聯合了阻留區的凸起的基底，^E^M阻留區中顆粒和/或細胞
由于吸弓i力會穀y阻留，產生了^ra點。
這些凸起會使得基底產生很大的表面積，而且阻留區的大的表面積帶來益 處，這是因為細胞能更有效的結合。凸起與親和結合的齢使分t碟置的動力 學得到提高。
這些與親和結合工具聯合的凸起能夠使得在裝置中產生適宜的樣品液體 流。這使得一些問題例如不希望的堵塞可以被避免。
本發明具有進一步的益處，根據本發明，在開放的系統中對結果讀數更容 易。而且在開放的系統中不存在滯留氣體的問題。
使用基本上垂直的凸起來分析細胞帶來了另一個益處，這些凸起的設計使
4得細胞可以被仔細的處理。 定義
在描述本發明的裝置和方法之前，應明白本發明不受限于本文公開的特別 的構造、方法步驟和材料，因為該構造、方法步驟和材料可以有些變化。還應 明白本文所用的術謝又僅是用于描述特別的實施方式，并不作為限制，因為本 發明的范圍只受限于所附上的權利要求以及其等同物。還必須指出，如本說明 書和所附權利要求洲頓的單數形式"一"和"該'繊織指示物，上下文中明 確指出的除外。因此，例如提到貪'一種抗體'的反應混合物，則包括兩種或更 多種抗體的混，。
術語"約"用于數值上下文中，是指本領職術人員所熟悉和會繊受的準確
度區間。所述區間&10%。
在描述和請求f^t戶裝置和方法時，按照此處列舉的定義使用以下術語。 在權禾腰求書和說明書中的術語"結合細胞的親和結合工具"表示通過在結 合工具與細胞之間的吸弓l力與細胞結合的元件。
在權利要求書和說明書中的術語"分析'標至少一種分t胸被測定的過程。
在權利要求書和說明書中的術語"分析，"表示借助于其才能執行分析的 體。
在權禾腰求書和說明書中的術語"分析物表示在分析過程中其一種或更多 種性質被測定的物質或化學或生物組分。分析物或成分本身經常不會被測量， 但是分析物的可觀懂盼頓會被測量。比如，可以觀糧分析物的濃度。 在權利要求書和說明書中的術語"毛細流動",主要由毛細力產生的流動。 在權利要求書和說明書中的術語"殼罩"^^寸閉i分^^r^s的元件。 在權利要求書和說明書中的術語"循環抗體'，在溶液中的抗體。 在權禾腰求書和說明書中的術語"可檢觀隨團"表示存在于基底上時能夠被 檢測的樹可^^或原子排列。
在權利要求書和說明書中的術語" "表示其中液體能夠在不同區之間流 動的裝置上的區域。 在權利要求書和說明書中的術語"流體連接"，流體能在其中傳送的連接。 在權利要求書和說明書中的術語"蓋子"標蓋住部分或^i^s的元件。在權禾腰求書和說明書中f頓的與毛細流動有關的術語"開放的"表示系統 是開放的，也就是系統不是封閉的。有關開放系統的例子包括其中沒有蓋子與 樣品液體毛細接觸的系統。在開放系統中蓋子不會與樣品液體毛細接觸，即蓋 子不會參與毛細力的產生。
在權禾腰求書和說明書中的術語"相互間距'標舭鄰的凸起之間的間距。 在權利要求書和說明書中的術語"阻留區"表示至少部分樣品在其中被阻留 的區域。
在權禾腰求書和說明書中的術語"樣品"標被分析的混儒或溶液。 在權利要求書和說明書中的術語"加樣品區"新樣品被添加的區域。
在權利要求書和說明書中的術語"槽(sink)"標能接收液糊品的區域。 在權利要求書和說明書中的術語"物質' ^壬何純的化學或生物實體，或包 含至少一種化學或生物實體的樹可混合物或溶液。
詳細描述
首先一方面樹共了分析循環抗體的方法，包括如下步驟
a) 提供包含基底的分D^置，戶，基底上設有至少一個加樣品區，至少一 個阻留區，至少一個槽，至少一條連接加樣品區、阻留區和槽的流路，其中流 路是開放的并包括基本上垂直于所述基底表面并具有高度(H)、直徑(D)和 相互間距(tl, t2)的凸起，從而實S^M樣品的橫向毛細流動并且細胞可以流 經凸起，其中戶脫阻留區包含至少一種結合細胞結構的親和結合工具，
b) 在加樣品區加入至少一個樣品，且
c) 讀出結果，
其中針對細胞結構的循環抗術皮測定。
相互間距(tl， t2) ^^El:角坐標系統中x和y方向上的相互間距。在一 個實施方式中所有的凸起在x方向和/或y方向上具有相同的間距。在可選擇的 實施方式中凸起在x方向上具有不同的間距。在一個實施方式中不同凸起在x 方向上的間距為仏、tl2、 tl3……在另一實施方式中凸起在y方向上具有不同的 間距。在一個實施方式中不同凸起在y方向上的間距為t2！、 122、 t23......
裝置包括基底。在一個實施方式中基底部分或全部由殼罩或蓋子封閉。如 果使用了殼罩或蓋子，它們與基底之間的距離使得罩殼或蓋子對作用在樣品液體上的毛細力沒有影響。
至少有一個用于加液體樣品的加樣品區。流路與加樣品區、阻留區和槽形 成流體連接。
在一個實施方式中樣品在、2^各內流動從加樣品區纟S1阻留區至U達槽。
在一個實施方式中阻留區被設置成穿過樣品液體流經的全部路徑，這樣樣 品液體就不能避過阻留區。在一個可選擇的實施方式中阻留區被設置成部分樣 品液體鄉M阻留區但是不與阻留區發生倒可基本的相互作用。
在一個實施方式中a)加樣品區、b)阻留區和c)槽中的至少一^括基本 上垂直于戶，基底表面并具有高度(H)、直徑(D)和相互間距(tl, t2)的凸 起從而實5I0M樣品的橫向毛細流動并且細胞可以流經凸起。
在一個實施方式中a)流路、b)加樣品區、c)阻留區和d)槽的高度、直 徑和相互間距是相同的。在一個可選擇的實施方式中，a) ^ 各、b)力口樣品區、 c)阻留區和d)槽中的至少一個的高度、直徑和相互間距是不同的。
在一個實施方式中親和結合工具選自抗體、適配體、受體、配體、單鏈抗 體、抗體片斷和麟素。
在一個實施方式中微型柱被排列成微型柱間距為5-200(im。在另一實施方式 中微型柱間距設為20-100pm。
在一個實施方式中微型柱被排列成微型柱高度為l-1000pm。在另一實施方 式中微型柱高度設為l(MOOMm。
在一個實施方式中液體樣品選自人或動物血液、尿液、肺液、滑液、傷口 液、唾液、淚液和汗液。
在一個實施方式中液體樣品是取自人的血液。
在一個實施方式中細胞結構是部分血液抗原系統。
在一個實施方式中細胞結構是部分涉及HIV感染或檢測的抗原。
在一個實施方式中液體樣品是取自人的血液，并且被用于針對細菌、病毒 或小粒徑單或多細胞傳染性介質的循環抗體的測定。
在一個實施方案中液##品是取自人的，。
對本領域技術人員來說，在閱讀了說明書和實施例后，本發明的其它特點 和應用以及它們連帶的優點^M而易見的。
必須理解的是本發明并不限于此處公開的特定實施方式。下面的例子只是用來提供例示的作用而不是為了限定本發明的保護范圍，本發明的保護范圍只 受限于所附上的權利要求以及其等同物。
實施例 實施例1
細胞與根據本發明的分t ^a的附著 芯片上的凸起具有不同的中心到中心間距，在流動方向上具有最大間距。
凸起向著頂部逐iW小。凸起的高度為65pm。凸起的底部的直徑為70Mm，頂 部的直徑為50nm。凸起間在凸起底部的間距為tl=!2=31.77nm，在凸起頂部的 間距為tl=t2=51.77nm。
細胞附著到裝置表面的原理以紅細胞(RBC)的牢固結合為例說明。在自 由流動歪U芯片的規定區域的過程中，RBCs M不同原理包括RBC 7驗素、電 荷和針對表面抗原的抗體被牢固的附著。
取少量(O.ImJ)的 素濃度為lmg/ml的50mM磷,緩沖液加入芯片上 單通道，pH值為7.5，然后20pl 0.8%RBCs懸浮液被加入，并讓它們 1^包含 7麟素的檢測區。結果顯示RBC與不同 麟素(PHA-E、 PHA-M、 WGA、榴 蓮凝素)的結合是不同的，其中最有效的是WGA。在使用了包括如0.1%洗滌 劑吐溫20的緩沖液50m1沖洗后，剛艮清晰可見的結合的RBCs仍為附著的。通 過加入10nl兔抗人RBC齢10^1 Cy5山羊抗兔IgG即可定量測定結合的RBCs。
ili^頓針對RBC表面抗原例如血型糖蛋白， 一種主要的人RBC表面蛋 白，的抗體也可以使得芯片表面牢固結合RBC。
在細胞培養中通常用來牢固結合細胞的大分子量聚賴氨酸也可以用于與 RBC結合，在數量上可與WGA相比。
RBC與4castohip的附著也可以通過i頓生物素f恭己的RBC g沉淀的鏈 霉親和素來實現。鏈霉親和素(0.13^1的2mg TO親和素/ml)置于pH7.5的PBS 中，加入芯片上的單通道中。利用磺基-NHS-生物素的生物素標記的20^1 1.6%RBCs 、艦包含鏈霉親和素的檢測區。結果顯示RBC與鶴親和素清楚可 見的牢固結合，并且在使用80^含例如0.1%洗滌劑吐溫20的緩沖液沖洗后， 臓保持附著。
8實施例2
針對RBC表面抗原的可溶性A^體的檢測(間MC珠蛋白實驗，IAT) 抗懶觀啲原理以在AJ&清中低滴定度存在的抗D抗體的檢測為例說明。 分析原理涉^M;沉積有傳染性的例如針對RBC表面抗原抗懶每存活的RBCs 牢固附著或結合到芯片表面。這里^ffi了與實施例1相同的裝置。于是，通過 自由流過芯片上的微柱而轉運的RBCs被設在檢測區的芯片結合抗體俘獲。少 量(IOmO的AifiL清樣品，其已經以1:100的比例在含有0，/。明膠的LISS緩沖 液稀釋，戶皿樣品含有不同滴度的抗D抗體，Mffi于敏化RBCs。洗滌(30pl) 之后RBC表面IgG的存在4頓lOpl綴合了 transfluosphere的抗人珠蛋白抗體 (AHG)進行檢測。結果顯示了相對于抗D抗體的滴度，AHG綴合物與RBCs 的齊懂 性結合。在沒有洗滌劑的存^a使用了含有0.5%明膠的低離子強度 鹽(LISS)洗滌緩沖液時達至撮佳敏化。
在高敏感性IAT分析中，利用AHG綴^t;的檢測iM:具有極大斯托克斯位 移(激發峰位和發射峰位之間的間距)的熒光染料組合而進行，比如在 Transfluosphere和銪的綴^tl中。
實施例3
abo血型抗原實驗
在RBCs上的ABO血型抗原被高度特異地檢測。從供體血液樣品中取得的 RBCs用LISS緩沖液洗滌兩次后重懸浮得到0.8%的RBC溶液。在LISS緩沖液 中的洗滌后的供體RBCs (4%， 20Ml)iM 沉積的Ml型糖蛋白(lm^ml， 0.13mJ/ 芯片)附著到裝置。先〗細10Ml單克隆的抗RBC-A和RBC-B抗體，接著l頓 10mJ的Cy5綴合的抗小鼠IgM抗體，分別檢測a-和B-抗原。最后使用60pl分 析緩沖液(20mMTris， 0.135MNaCl， 10mMEDTA， 0.1%吐溫20， 1%BSA， pH7.4)洗滌芯片。4頓了抗RBC-A抗體時A陽性RBCs的熒光信號在635nm 處為明顯正值，B陽性RBCs的熒光信號在635nm處為負值(等于背景信號)。 在B陽性RBCs的實驗中得到了同樣的高特異性。
9
權利要求
1、一種分析循環抗體的方法，包括如下步驟a)提供包含基底的分析裝置，所述基底上設有至少一個加樣品區，至少一個阻留區，至少一個槽，至少一條連接加樣品區、阻留區和槽的流路，其中流路是開放的并包括基本上垂直于所述基底表面并具有高度(H)、直徑(D)和相互間距(t1，t2)的凸起，從而實現所述樣品的橫向毛細流動并且細胞可以流經凸起，其中所述阻留區包含至少一種結合細胞結構的親和結合工具，b)在加樣品區加入至少一個樣品，且c)讀出結果，其中針對細胞結構的循環抗體被測定。
2、 根據權禾腰求l的方法，其中戶腿液條品選自人或動物血液、尿液、 肺液、滑液、傷口液、唾液、淚液和汗液。
3、 根據權利要求1-2中任一項的方法，其中Blf^液儲品取自人的血液。
4、 根據權禾腰求1-3中任一項的方法，其中戶脫細胞結構是部分血液抗原 系統。
5、 根據權利要求14中任一項的方法，其中戶腿細胞結構是部分涉及HIV 感染或檢測的抗原。
6、 根據權利要求1-5中任一項的方法，其中所述液##品取自人的血液并 且Mffi于針對細菌、病毒或小粒徑單或多細胞傳染性介質的循環抗體的測定。
7、 根據權利要求1-6中任一項的方法，其中所述液體樣品取自人的骨髓。
全文摘要
本發明提供了一種分析循環抗體的方法，包括如下步驟a)提供包含基底的分析裝置，所述基底上設有至少一個加樣品區，至少一個阻留區，至少一個槽，至少一條連接加樣品區、阻留區和槽的流路，其中流路是開放的并包括基本上垂直于所述基底表面并具有高度(H)、直徑(D)和相互間距(t1，t2)的凸起，從而實現所述樣品的橫向毛細流動并且細胞可以流經凸起，其中所述阻留區包含至少一種結合細胞結構的親和結合工具，b)在加樣品區加入至少一個樣品，且c)讀出結果，其中針對細胞結構的循環抗體被測定。
文檔編號G01N33/569GK101672843SQ20091016397
公開日2010年3月17日 申請日期2009年7月3日 優先權日2008年7月3日
發明者C·彼得森, G·倫德斯特倫, I·門德爾-哈特維格 申請人:阿米克股份公司