專利名稱：檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及生化領域，具體涉及檢測病毒的試劑。
背景技術：
豬繁殖與呼吸綜合癥(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS) 是以母豬的繁殖障礙、仔豬及成豬的呼吸道癥狀為主要特征的一種病毒性傳染病，其高死 亡率在世界范圍內給養豬業造成巨大的經濟損失。自1987年在美國某個豬場發現PRRS以 來，該病先后席卷整個北美、歐洲及亞洲。1990-1991年間該病在歐洲暴發流行，5000多個 豬場發現本病，100多萬頭豬死亡。我國自1995年從加拿大引進種豬后，年底于華北地區爆 發PRRS，1996-1998年更是出現“流產風暴”，發病母豬流產率達10-50 %，母豬的死亡率高 達10%。由于沒有有效的防治手段，PRRS在我國愈演愈烈，并于2006年出現嚴重疫情，26 省300多個縣，379. 8萬頭豬發病，死亡99. 2萬頭，給養豬業帶來沉重打擊。PRRS爆發的原 因在于其病毒復制過程存在變異，一般的疫苗難于預防，早發現，早隔離成為預防爆發流行 的主要手段。經研究表明引起PRRS的病原體為豬繁殖于呼吸綜合癥病毒(Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome Virus, PRRSV),屬于尼多病毒目(Nidovirales) 動脈炎病毒科(Arteriviridae)動脈炎病毒屬(Arterivirus)。PRRSV的基因組為不分節段 的單股正鏈RNA，直徑約40-80nm，大約為15kd，含9個開放讀碼框(ORFs)。病毒上的囊膜 蛋白是病毒的結構和保護性抗原的組成部分，在致病和免疫過程中發揮著重要的作用。根 據序列分析及血清學試驗結果，將PRRSV分為兩個亞型，即美洲型(代表株VR_2332)和歐 洲型(代表株Lelystad Virus, LV) 0 PRRSV存在較大的基因變異，造成二者抗原性的差異 也較大，因此兩個亞型在血清學試驗中很少有交叉反應。引起我國PRRS大規模暴發流行的 主要是美洲型，流行病學調查發現我國亦存在歐洲型PRRSV。隨著病毒基因組的變異，抗原 決定簇的改變或轉換，PRRSV的侵襲力和致病性可能還會不斷增強，對養豬業將造成更大的 威脅。對豬繁殖與呼吸綜合癥做出快速、準確診斷，及時有效掌握PRRSV的流行特點和 監測其高致病毒株的出現，對流行趨勢做出預測，盡早隔離并做出相應的防范，將能夠最大 限度地減低疾病所造成的危害。PRRS病毒的檢測方法主要有病毒分離鑒定、免疫過氧化酶技術及RT-PCR檢測等。 病毒分離培養是最確切方法，但很多豬場不能開展，而且費時；RT-PCR檢測技術含量及成 本較高，同時易出現假陽性結果；抗體檢測方法以美國IDEXX和法國LSI最為經典，由于目 前各豬場均使用PRRS疫苗預防，上述兩種方法都很難區分是疫苗免疫產生的抗體還是豬 感染PRRSV所產生，易出現假陽性；另外有些豬可能感染PRRS病毒但尚未產生抗體或曾感 染過而現在血清轉陰等，出現假陰性。PRRSV基因組0RFs7編碼的核衣殼蛋白(Nucleocapsid Protein，NP)包含所有 PRRSV毒株保守的共同抗原決定簇，又有具歐洲型和美洲型特異性的抗原決定簇。同時NP在病毒粒子中含量較高，約占病毒總蛋白的40%，具有極強的免疫原性。該蛋白是一種能夠早期檢測PRRSV感染的有效標志，及早確診PRRSV感染，以便于快速采取有效的治療和 隔離措施，是防止PRRSV感染的擴散及降低死亡率的前提，也是減少經濟損失的有效措施， 而目前在國際上尚未有核衣殼蛋白抗原的檢測方法。為此我們利用基因工程技術，表達該 PRRSV核衣殼蛋白，并制備抗該蛋白的單克隆抗體，在此基礎上構建雙抗體夾心ELISA法檢 測PRRSV中的N蛋白，此抗原檢測方法對于PRRS的早期診斷、預防PRRS的爆發流行、疫苗 評測以及流行病學調查具有重要意義。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提高檢測PRRS病毒的靈敏度和特異性。本發明解決上述問題的技術方案是一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測抗體，該抗體由保藏號為CCTCC NO. C200851的雜交瘤細胞株G2C51A2分泌得到，記為單抗G2C51A2。一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的捕獲抗體，該抗體由保藏號為CCTCC NO. C200850的雜交瘤細胞株V1C12A1分泌得到，記為單抗V1C12A1。本發明所述的單抗G2C51A2和單抗V1C12A1均能特異性結合PRRSV核衣殼蛋白， 與臨床PRRSV感染的豬血清及肺組織研磨液分離所獲病毒培養上清反應均為陽性；而與其 他常見豬感染性病毒培養上清的反應均為陰性，如偽狂犬病毒、豬圓環病毒等。所述單抗G2C51A2和單抗V1C12A1可分別由雜交瘤細胞株V1C12A1和G2C51A2分 泌得到。雜交瘤細胞株V1C12A1和G2C51A2是分別用重組的PRRSV核衣殼蛋白免疫Balb/ c小鼠，然后用免疫后的小鼠脾細胞和商品化的小鼠骨髓瘤細胞NS-I融合，最后用HAT培養 基篩選得到，已于2008年10月30日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)。所述單抗G2C51A2和單抗V1C12A1配對用于檢測PRRSV，主要是結合雙抗體夾心 方法的檢測，如雙抗體夾心ELISA方法、膠體金免疫層析或免疫化學發光方法的檢測，其中 單抗V1C12A1作為捕獲抗體，單抗G2C51A2單獨或者結合各種能發出可檢測信號的物質作 為檢測抗體。基于上述原理，本發明所述的單抗用于制備成可產業化的檢測PRRSV的試劑 盒，該試劑盒包括檢測抗體和捕獲抗體，其特征在于所述的檢測抗體是保藏號為CCTCCN0. C200851的雜交瘤細胞株G2C51A2分泌的單抗G2C51A2，所述的捕獲抗體是保藏號為CCTCC NO. C200850的雜交瘤細胞株V1C12A1分泌的單抗V1C12A1。所述的試劑盒可以是雙抗體夾 心ELISA試劑盒、免疫化學放光試劑盒或膠體金快速免疫層析檢測試紙等，例如雙抗體夾 心ELISA試劑盒由以下試劑組成包被單抗V1C12A1的微孔反應板、樣品處理液、與標記物 結合的單抗G2C51A2、陽性對照物、陰性對照物、濃縮洗液、顯色液和終止液，其中所述的標 記物是指能標記在抗體非活性部位且可定量分析的物質(如酶、生物素或發光物質等)；而 相應的顯色液則含有能與所述標記物反應并產生顏色變化的物質(例如酶的底物)。可以 變換和選擇相應標記物與顯色液，如生物素親和素系統，再如辣根過氧化物酶及其底物過 氧化氫尿素和四甲基聯苯胺(簡稱TMB)，也同樣適用于本發明。所述的樣品處理液、濃縮洗 液和終止液均是雙抗體夾心ELISA方法中的常用試劑，所述的陽性對照物是指PRRSV核衣 殼蛋白，所述的陰性對照物是不含PRRSV核衣殼蛋白的空白對照物。本發明所說的檢測PRRSV的試劑盒操作簡單、快速，特異性高，與其它豬易感性病毒無交叉反應，既可用于豬只進出口檢疫及豬場的檢測監控，又可用PRRSV的診斷及流行 病學調查。本發明試劑盒與現有檢測PRRSV的技術相比有以下優點1、用于進出口檢疫及豬場的檢測監控，與現有PRRSV檢測技術相比，可利用本發 明酶聯免疫技術試劑盒，對進出口豬只進行檢測嚴格控制PRRSV毒株的引入及輸出，可以 對豬的排泄物及血清樣本初步篩查，可簡易、快速、準確地檢測出樣本中PRRSV ； 2、用于豬場的檢測監控，可利用本發明酶聯免疫技術試劑盒，對可疑感染PRRSV 的豬場大規模的初步篩查，可簡易、快速、準確地檢測出樣本中PRRSV ；3、與目前用于診斷PRRSV的早期診斷試劑盒相比，具有相似的靈敏度，但技術要 求低，特異性好，與偽狂犬病毒、豬圓環病毒等無假陽性反應，成本低，適合各大豬場及獸醫 防疫站使用。
圖1是本發明獲得單抗V1C12A1和單抗G2C51A2所用的免疫源，誘導表達純化獲 得重組PRRSV核衣殼蛋白的結果。其中條帶M為低分子量Marker，條帶1為經IPTG誘導后 蛋白表達菌體，條帶2為經Glutathione Sepharose 4B結合柱純化的重組PRRSV核衣殼蛋 白(箭頭所示)。圖2是本發明獲得單抗V1C12A1和單抗G2C51A2所用的免疫源，誘導表達純化獲 得重組PRRSV核衣殼蛋白免疫印跡鑒定結果。其中條帶1為Anti-GST單抗，條帶2為PRRSV 減毒疫苗免疫小鼠血清，條帶3為無關抗體。圖 3 是本發明單抗 V1C12A1 和單抗 G2C51A2 對經 Glutathione Sepharose 4B 結 合柱純化的重組PRRSV核衣殼蛋白進行免疫印跡的結果，其結合條帶的分子量為41kDa ；其 中條帶1是V1C12A1，條帶2是單抗G2C51A2，條帶5是單抗Anti-GST單抗，條帶6是單抗 Marker,條帶3，4為無關單抗。圖4是誘導表達純化獲得重組歐洲株PRRSV核衣殼蛋白的結果。其中條帶M為低 分子量Marker，條帶1為經IPTG誘導后蛋白表達菌體，條帶2為經Glutathione Sepharose 4B結合柱純化的重組歐洲株PRRSV核衣殼蛋白(箭頭所示)。圖5是本發明獲得單抗V1C12A1和單抗G2C51A2，與誘導表達純化獲得重組歐洲 株PRRSV核衣殼蛋白免疫印跡鑒定結果。其中條帶1為無關單抗，條帶2和3分別為本發 明獲得單抗G2C51A2和單抗V1C12A1，條帶4為PRRSV減毒疫苗免疫小鼠血清。圖6是本發明檢測PRRSV N蛋白的雙抗體夾心ELISA試劑盒檢測歐洲株及美洲株 N蛋白的結果曲線圖，其中+表示美洲株N蛋白，+表示歐洲株N蛋白，★表示陰性對 照。
具體實施例方式例1本發明單克隆抗體的制備和鑒定1、單抗V1C12A1和單抗G2C51A2的制備1)豬繁殖與呼吸綜合癥病毒抗原制備利用基因工程技術，設計美洲株PRRSV基因組0RFs7編碼的核衣殼蛋白基因兩端 引物，上游引物5，-CGCGGATCCGTATGCCAAATAACAACGGCAAG-3，引入BamH I限制性內切酶位點，下游引物5，-CCGCTCGAG TTATCATGCTGAGGGTGATGCTGT-3，引入Xhol限制性內切酶位點， 以PRRSV(ch-la株，與美洲株同源性為93. 5% )擴增所得細胞上清提取RNA為反轉錄模板， 合成N蛋白基因CDNA，進而獲得其dsDNA，構建進入PGEX-5X-3原核表達系統，IM IPTG，28°C 誘導表達PRRSV核衣殼蛋白，并純化獲得該蛋白(圖1所示)，同時以PRRSV減毒疫苗免疫 小鼠血清及Anti-GST單抗、無關抗體鑒定所得重組蛋白后(圖2所示)，并儲存于-80°C備 用。
2)免疫小鼠取4-6周齡雌性BALB/c小鼠，第一次采用弗氏完全佐劑與等體積PRRSV核衣殼蛋 白抗原混勻乳化，皮下注射100 μ g/只小鼠，以后每10天以弗氏不完全佐劑與50 μ g抗原 等體積乳化，腹腔和皮下多點注射，小鼠免疫4次后，于融合前3天靜脈加強100 μ g/只抗原。3)免疫血清效價測定采用間接ELISA法測定免疫血清效價。配制10yg/ml PRRSV核衣殼蛋白抗原的 50mMpH9. 6碳酸鹽緩沖液，包被聚苯乙烯微96孔板，100 μ 1/孔，4°C過夜。次日，含0. 25% 酪蛋白(Sigma)的封閉液300 μ 1/孔4°C過夜，甩干包被板條，真空干燥12 24h，用鋁膜 袋真空包裝4°C保存，用于鼠免疫血清效價測定。于第三次免疫后10天眼眶采血，鼠免疫 血清用含BSA IOmM PBS以1(Γ3 1(Γ6倍稀釋，加入96孔板，100 μ 1/孔37°C 30min, IOmM PBS含0. Tween-20洗滌液洗板四次后，加入1 1000倍稀釋辣根過氧化物酶標 記羊抗小鼠IgG(Sigma, INC)，100 μ 1/孔37°C 30min,同上洗板后，加入含有0. 05% (W/V) TMB和0.06% (W/V)雙氧pH5. O檸檬酸緩沖液，100 μ 1/孔，室溫避光lOmin，加100 μ 1/孔 IM H2SO2終止反應，測450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作為陰性對照，以測定值與對照值 得比> 2. 1為陽性來判斷免疫血清的效價。4)雜交瘤制備選擇血清抗體效價達1 X IO5的小鼠，于融合前3天尾靜脈注射100 μ g PRRSV核衣 殼蛋白抗原。無菌取小鼠脾臟，制成脾細胞懸液與對數生長期的小鼠骨髓瘤細胞株NS-I按 10 1的比例混合，用45%聚乙二醇(PEG，MW4000，Sigma)作用下進行融合。按下述步驟 將聚乙二醇溶液加入細胞。在37°C水浴中，在l-2min內緩慢加入1. Oml PEG，邊加邊輕輕 搖勻，分別于 lmin、2min、3min、4min、5min 內加 lml、2ml、3ml、4ml、5ml 無血清 RPMI-1640 培 養基終止融合，最后加入IOml含15% FBS的二合一培養基，室溫IOOOrpm離心5min，棄上 清，用36ml含15%胎牛血清的培養基輕輕懸起細胞。將此細胞懸液加入6塊96孔培養板 上，在二氧化碳培養箱中溫度為37°C、5% C02的培養箱中。一天以后，于每孔加入100 μ 1 含次黃嘌呤、氨基喋呤-胸腺嘧啶脫氧核苷(HAT，Sigma)篩選培養基。以后每3天用此篩 選培養基給培養物換液一次，直到克隆細胞形成。5)篩選分泌抗PRRSV核衣殼蛋白抗原單克隆抗體的雜交瘤細胞間接ELISA法篩選細胞培養上清，選擇強陽性克隆雜交瘤細胞進行亞克隆化，并 用有限稀釋法連續克隆化2-3次，得到2株穩定分泌抗體的雜交瘤細胞株。將克隆化后陽 性率達100%的細胞擴增培養后液氮凍存。小鼠體內接種陽性雜交瘤細胞，制備腹水，并采用辛酸_硫酸銨沉淀法純化腹水 中的抗體。
2、本發明單克隆抗體的特異性鑒定 (1)實驗材料豬繁殖與呼吸綜合癥減毒疫苗(ch-la株)(購自廣州市動物防疫 監督所)(2)抗原制備利用基因工程技術，設計PRRSV核衣殼蛋白基因兩端引物，合成NP蛋白基因，構建 入PGEX-5X-3原核表達載體，ImM IPTG 37°C誘導4h，，并純化獲得PRRSV核衣殼蛋白，并儲 存于-80°C備用。(3)抗體亞類鑒定Ig亞類鑒定采用間接ELISA，包被PRRSV核衣殼蛋白抗原，封閉后與雜交瘤細胞 培養上清孵育，再分別與為1 1000倍稀釋HRP標記的兔抗小鼠不同亞類特異性免疫球 蛋白，這些抗體包括兔抗小鼠IgGl (Sigma, Inc)，兔抗小鼠IgG2a(Sigma，Inc)，兔抗小鼠 IgG2b(Sigma, Inc)，兔抗小鼠 IgG3 (Sigma，Inc)，兔抗小鼠 IgM (Sigma，Inc)。檢測結果兩 株雜交瘤細胞株均為IgGl陽性(4)間接ELISA法進行單克隆抗體特異性分析用PRRSV核衣殼蛋白抗原包被微孔板，按照常規的間接ELISA法進行檢測。在包 被的微孔板中加入本專利發明的雜交瘤細胞培養上清液，37°C再孵育lh，加入1 1000稀 釋辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG (Sigma，Inc)，100 μ 1/孔37°C 30min，加TMB顯色液 室溫避光IOminJn IM H2SO2終止反應，測450nm吸收值(A45tl)。表1結果顯示本專利發明 的單克隆抗體與PRRSV核衣殼蛋白抗原產生很強的特異性的免疫反應。表1 =PRRSV核衣殼蛋白單克隆抗體與PRRSV核衣殼蛋白抗原反應間接ELISA結果
權利要求
一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測抗體，該抗體由保藏號為CCTCCNO.C200851的雜交瘤細胞株G2C51A2分泌得到。
2.一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的捕獲抗體，該抗體由保藏號為CCTCCN0. C200850的雜交瘤細胞株V1C12A1分泌得到。
3.—種產生權利要求1所述抗體的雜交瘤細胞株，其保藏號是CCTCC N0.C200851。
4.一種產生權利要求2所述抗體的雜交瘤細胞株，其保藏號是CCTCC N0.C200850。
5.一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒，該試劑盒包括檢測抗體和捕獲抗體， 其特征在于權利要求1所述的單克隆抗體，所述的捕獲抗體是權利要求2所述的單克隆抗 體。
6.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒是雙抗體夾心ELISA試劑盒。
全文摘要
本發明提供了檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的檢測抗體和捕獲抗體，這兩種抗體分別由保藏號為CCTCC NO.C200851的雜交瘤細胞株G2C51A2分泌得到和由保藏號為CCTCC NO.C200850的雜交瘤細胞株V1C12A1分泌得到。上述抗體均能特異性結合PRRSV核衣殼蛋白，可用于制備PRRSV的試劑。本發明還提供了一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒，該試劑盒包括檢測抗體和捕獲抗體，其特征在于所述的檢測抗體由保藏號為CCTCC NO.C200851的雜交瘤細胞株G2C51A2分泌的抗體，所述的捕獲抗體由保藏號為CCTCC NO.C200850的雜交瘤細胞株V1C12A1分泌得到。該試劑盒對PRRSV的美洲株和歐洲株都具有較高的準確度和靈敏度。
文檔編號G01N33/577GK101955531SQ20091016162
公開日2011年1月26日 申請日期2009年7月17日 優先權日2009年7月17日
發明者王壓娣, 蔡建飄, 袁國勇, 車小燕 申請人:南方醫科大學;香港大學