專利名稱：結合準一維特異抗原修飾電極的多通道梅毒診斷專用器件的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種結合準一維特異抗原修飾電極的多通道梅毒診斷專用器 件，該梅毒診斷器件是基于抗原/抗體特異性反應來診斷梅毒抗原的專用微流控 芯片，屬于分析測試領域。
背景技術：
梅毒(Syphilis)是由梅毒螺旋體(T. pallidum, TP)引起的一種性傳播疾病 (Sexually transmitted disease, STD)。在自然情況下梅毒螺旋體只感染人類， 人是梅毒唯一傳染源，主要通過性接觸傳播。另也可通過胎盤垂直傳播，引起 胎兒先天性梅毒。少數人也可經輸血感染。80年代以來，梅毒在我國再次死灰 復燃，據全國性病控制中心統計，我國梅毒發病率年增長率達52.7%,且先天性梅
毒和神經梅毒發病率增加明顯，在全球亦有逐漸上升的趨勢，梅毒不僅已經成 為世界性的嚴重社會和公共衛生問題，而且也是危害人群健康的主要疾病之一。 因此，選擇簡單、快速、高敏感性和特異性診斷方法和試劑，對梅毒早期診斷， 發現傳染源，控制梅毒傳播具有重要意義。
目前常用的梅毒診斷方法有病原學檢査、非梅毒螺旋體抗原血清試驗、TP 快速檢測試紙條、梅毒螺旋體血球凝集試驗(TPHA)和聚合酶鏈反應(PCR) 等。病原學檢査的原理是取患者損害的滲出物或淋巴結穿刺術得到的組織液， 觀察螺旋體的特征性形態和運動方式，在理論上對早期梅毒有較高的檢出率， 但受到條件的制約(包括就診用藥、高質量的熒光顯微鏡、試劑和技術等)也 較多，因此實際檢出率并不高。TP快速檢測試紙條雖克服了檢測時間長、試劑昂貴等缺陷，但國內暫時未有詳細報道其靈敏性和特異性效果，因此不可用于 確診試驗。非梅毒螺旋體抗原血清試驗的原理是目前診斷梅毒常用的血清學初 篩試驗，在很多文獻中都提到非梅毒螺旋體抗原血清試驗雖然簡易、快速、易 于觀察結果，適合于大量人群的血清篩査，但敏感性、特異性較差，有時會出 現生物學假陽性和假陰性反應，容易造成漏檢和誤檢，所以不適合用于一期梅
毒、先天梅毒、神經梅毒的診斷。TPHA雖然其敏感性和特異性高，主要被用 于梅毒確診試驗，但對療效觀察意義不大。PCR法是較新的診斷方法，它能對 生殖器潰瘍進行早期鑒別診斷，區分梅毒、生殖器皰疹及軟下疳。但當前診斷 梅毒的PCR仍存在引物的非特異性、對血清/全血等敏感性低等缺點。而且當皮 損開始愈合、分泌物減少、血清學試驗陽性反應時，采用PCR方法就不合適。 另外，PCR方法易受標本中的組織和細胞碎片等物質抑制，導致PCR假陰性結 果。所以PCR檢測不宜用作判愈。
TP快速檢測試紙條、非梅毒螺旋體抗原血清試驗、TPHA以及PCR等檢測 方法均屬于免疫分析。以上免疫分析本身有很強的選擇性，對傳染病的早期診 斷，判斷療效及預后等方面均有重要的意義。然而重大傳染病的檢測非常復雜， 傳統的免疫分析通常只針對單一抗原進行檢測。由于一種診斷抗原可出現在不 同致病菌，或不同診斷抗原可在同一致病菌同時出現，因此，開展高效的多重 免疫分析方法(SMIAs)，從生物相關性的角度真實地定性、定量反映各種致 病菌抗原的種類和數量，在早期預防和聯檢多種傳染病、判斷傳染病菌發展程 度、觀察和評價治療效果等方面都具有重要的醫學價值。
電化學免疫傳感器具有自動化程度高、廉價、易制備、快速靈敏等獨特優 勢，配合免疫反應的高效專一，非常適合構建重大傳染病多重免疫分析檢測的 分析儀。有"生命科學集成電路"之稱的微流控芯片(lab-on-chip)是構建微型化、集成化的電化學免疫傳感器的理想技術。微流控芯片技術是將采樣、預處 理、加試劑、反應、分離、檢測等集成在一塊微芯片上完成的一門前沿技術， 具有分析速度快、信息量大、試劑消耗少、污染小、操作費用低、儀器使用簡
便等優點。且非常適合工業化生產。微流控技術代表著21世紀分析儀器走向微 型化、集成化的發展方向。構建適合于重大傳染病檢測的微流控安培檢測芯片
具有以下優勢(1)通過微加工技術很容易在芯片上集成多個檢測通道和檢 測電極，做到多目標物同時分析，技術可行性高。(2)通過微流動注射技術， 樣品在管路中流動保證了電極表面時刻更新，較好克服了電極易被污染，造成
假陽性率高、結果平行性差等問題。(3)微流控傳感器上管路直徑只有!Jm級， 反應池體積也只有IJL級，分析時所需試劑用量極少，分析物到達電極表面的擴 散距離短、因此可以大大減少溫育時間，實現快速聯檢目標。(4)目前微流 控傳感器多基于光學檢測系統，儀器昂貴體積大，全集成很難，而且檢測成本 很高，限制了其推廣。而傳感器中采用電化學檢測，體積小、自動化程度高、 成本低。
目前，在微流控芯片技術領域，利用梅毒多種特異性抗體來同時檢測、快 速診斷多種梅毒抗原的相關技術和方法尚未見報道。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是，在微流控芯片技術這樣一個總的技術框架 內，研發出一種能夠利用梅毒多種特異性抗體來對多種梅毒抗原進行同時檢測、 快速診斷的專用微流控芯片。
本發明通過如下方案解決所述技術問題，該方案提供的裝置是一種結合準 一維特異抗原修飾電極的多通道梅毒診斷專用器件，該器件是微流控芯片，該 微流控芯片的結構包括貼合裝設在一起的兩片板狀物，所述兩片板狀物分別是微流控芯片的蓋片以及微流控芯片的基片，在所述兩片板狀物之間的相互貼合 的位置上裝設有管道，以及，三個池狀物，管道的一端經由歧管狀流體通道分 別與其中的兩個池狀物聯通，管道的另一端與余下的一個池狀物聯通，以及，
依序分別裝設在所述管道內不同位置上的工作電極以及對電極以及參比電極， 所述工作電極由導電性電極以及貼附在所述導電性電極上的包埋了梅毒特異性 抗體的金膠敏感膜構成，本案特別之處在于，所述管道的構造呈并聯構造，所 述呈并聯構造的管道由四條分支管道并聯構成，以及，所述工作電極的數量是 四個，該四個工作電極的裝設位置分別位于所述四條分支管道內，以及，該四 個工作電極其表層金膠敏感膜結構中的特異性抗體分別是對梅毒抗原能特異性
結合的四種梅毒抗體物質，該四種抗體物質分別是梅毒特異性抗體TP0684、 TP0453、 TP0821及TP0319，以及，每一個工作電極其形貌均呈串珠狀。
所述金膠敏感膜是將殼聚糖金膠溶液與梅毒特異性抗體溶液充分混合均 勻，并使其干燥成膜而成。所述金膠敏感膜中的梅毒特異性抗體均為辣根過氧 化物酶或者葡糖糖氧化酶標記的梅毒抗體，所述金膠敏感膜已包含為固定上述 各梅毒特異性抗體而引入其中的輔助性介質，所述輔助性介質例如殼聚糖、醋 酸纖維素、明膠其中的一種或它們的混合物。
所述微流控芯片結構中的所述管道以及所述分支管道以及所述歧管狀流體 通道，其內徑尺寸均可以是任意選定的尺寸，但是，出于盡量少用待測液樣以 及降低試劑損耗等方面的考慮，所述管道以及所述分支管道以及所述歧管狀流 體通道最好均選用毛細管級的通道，所述毛細管級的通道意即毛細管通道，其 內徑與通常意義上的毛細管的內徑相當。所述毛細管其內部通道的橫截面形狀 可以是任意的形狀，所述橫截面形狀例如圓形、橢圓形、方形、矩形、條形， 當然也可以是任意的存在彎曲的線形，并且，所述毛細管的內部形狀隨著管道的延伸，不同部位的橫截面形狀也可以允許是不同的形狀。僅就毛細管一詞而 言，其技術含義是公知的。
結構中涉及的對電極以及參比電極均為微小尺寸的電極，其電極形狀均可 以是任意選定的形狀，所述任意選定的形狀例如方片形狀、矩形片狀、條狀或 圓形片狀等等。
本案芯片中的工作電極呈串珠狀，其串珠狀電極外形有助于大幅度地擴展 它的有效工作界面，并且，進一步地，串珠狀形貌還使得該工作電極具有良好 的擾流性，這有助于強化工作電極與流經其周邊的被測物液流之間的接觸。
本案微流控芯片結構中涉及若干個池狀物，所述池狀物是用于過渡性儲液 的池形或囊形構造，其中的每一個池狀物的內腔其形狀均可以是任意選定的形 狀，所述內腔形狀例如圓柱形空腔狀、方柱形空腔狀、橢圓形空腔狀或球形空 腔狀等等。所述池狀物的尺寸可以是任意選定的尺寸，但是，為了能夠盡量少 用待測液樣以及降低試劑損耗，所述池狀物最好是能夠與毛細管匹配的微小型 的池狀物。
本案裝置當然還可以進一步包括一些附件，所述附件例如多道電化學工作 站以及微流動泵等等，所述多道電化學工作站的技術含義以及微流動泵的技術 含義是公知的。本案微流控芯片結構中涉及的各個串珠狀工作電極以及對電極 以及參比電極等，可以分別經由相應的專用串線與所述多道電化學工作站的相 應接口進行聯接。所述專用串線是用來將各所述電極與所述多道電化學工作站 的各相應接口進行相互聯接的專用電纜。所述微流動泵專用于驅動微量液體流 動，所述微流動泵可以與按需選定的任意一個所述池狀物聯通。
所述形貌呈串珠狀的工作電極，既可以是一體化壓制成型的串珠狀導電性
電極，也可以是澆注成型的串珠狀導電性電極；所述工作電極其結構當然也可以允許是導電性的磁珠串結構，在這一情形下，所述形貌呈串珠狀的工作電極 其材質是具有導電能力的四氧化三鐵材質，以及，所述形貌呈串珠狀的工作電 極是由許多的四氧化三鐵材質的磁珠在外加磁場條件引導下相互拼接而成的準 一維導電性電極。
所述形貌呈串珠狀的工作電極，即所述磁珠串結構的工作電極，其結構中 的磁珠直徑不限，所述磁珠的直徑可以是根據需要設定的任意的尺寸，但是，
所述磁珠的優選直徑范圍是介于20納米至2000納米之間，以及，每一個所述 工作電極的結構中所含有的相互拼接在一起的磁珠的個數可以允許是根據需要 設定的任意的個數，所述個數不限，但是，構成一個所述工作電極的磁珠的個 數的優選值是在100個至100000個之間。
鑒于每一支所述串珠狀工作電極占用的空間寬度較小，該工作電極能夠允 許被直接安置于毛細管通道內，相對窄小的流體通道更有利于展現串珠狀電極 的對周邊流動液體的擾動能力，并且，還有利于將其有效工作界面的潛力充分 發揮出來。
通過噴涂或點樣儀點樣或其它合適工藝涂布裝設于所述工作電極表面層的 所述金膠敏感膜，其膜層厚度可以允許是任意設定的可對待測樣液發生電性信 號響應的厚度，但是，推薦的厚度或者說是優選的厚度是介于10納米與200 納米之間。
芯片結構中的所述蓋片及基片，其材質可以允許是任何的電絕緣性材質， 例如聚丙烯、玻璃，等等，優選的材質是聚甲基丙烯酸甲酯。
結構中的所述蓋片及基片其寬度可以允許是能夠達成相關測試目的的任意 設定的寬度值，但是，優選的所述寬度值是均介于2厘米與4厘米之間；所述蓋片及基片的長度值也一樣可以允許是任意設定的能夠達成相關測試目的的長
度值，但是，優選的長度值或曰推薦的長度值是介于3厘米與6厘米之間。
所述蓋片及基片其厚度可以允許是任意設定的便于器件裝配的厚度，推薦 的厚度或曰優選的厚度是介于0.5毫米與5毫米之間。較小的厚度有利于節省 材料。
本案微流控芯片的使用方法
采用外加微泵驅動液流在四通道微流控芯片的毛細管通道中穩定流動，利 用四通道電化學分析儀器分別對四種梅毒診斷抗原加以檢測。 本案微流控芯片的具體檢測使用步驟如下
1、 在微管路中加入血清樣品液，在外加微泵驅動下，各種梅毒抗原分子 被各通道中電極表面上金膠敏感膜包埋的相應的辣根過氧化物酶標記的梅毒特 異性抗體捕獲。
2、 辣根過氧化物酶標記的梅毒特異性抗體與血清樣品中的梅毒抗原形成
免疫復合物。
3、 采用多通道電化學分析儀，加入鄰苯二酚等電子媒介體，采用安培法 檢測上述反應引起的電流變化，由此獲得各種分析物的種類和含量。
4、 將結果進行綜合分析，對梅毒抗原進行綜合診斷。 本發明的優點是，在一塊物理器件即微流控芯片上集成了分別包覆有四種
梅毒特異性抗體物質的四個串珠狀工作電極，該四個串珠狀工作電極分別針對 檢測梅毒的四種特征診斷抗原，本案微流控芯片是一種能夠利用梅毒多種特異 性抗體進行同時檢測的梅毒診斷專用微流控芯片，其集成構造的結構特點以及 特異的串珠狀工作電極形貌有助于提高梅毒疾病診斷效率、降低梅毒診斷費用。
圖1是本案微流控芯片實施例構造示意圖，所展示的是該例結構的俯視角 度下的透視的形態，圖中未描繪出所述附件，并且，圖中也未對所述串珠狀工 作電極的詳細形貌進行放大描繪、展示。
圖中，1、 2、 10分別是三個裝設位置不同的池狀物，3是歧管狀流體通道， 4、 7、 11、 14分別是裝設位置不同但相互并聯形成并聯聯通結構的四條分支 管道，5是裝設在分支管道4內的其表層金膠敏感膜結構中的特異性抗體物質 為梅毒特異性抗體TP0684的串珠狀工作電極，6是裝設在分支管道7內的其表 層金膠敏感膜結構中的特異性抗體物質為梅毒特異性抗體TP0453的串珠狀工 作電極，12是裝設在分支管道11內的其表層金膠敏感膜結構中的特異性抗體 物質為梅毒特異性抗體TP0821的串珠狀工作電極，13是裝設在分支管道14 內的其表層金膠敏感膜結構中的特異性抗體物質為梅毒特異性抗體TP0319的 串珠狀工作電極，8是對電極，9是參比電極。
具體實施例方式
在圖1所展示的本案實施例中，該器件也即微流控芯片的結構包括貼合裝 設在一起的兩片板狀物，兩片板狀物分別是微流控芯片的蓋片以及微流控芯片 的基片，在兩片板狀物之間的相互貼合的位置上裝設有管道，以及，三個池狀 物，該三個池狀物分別是池狀物1、池狀物2和池狀物10,所述管道的一端經 由歧管狀流體通道3分別與池狀物1以及池狀物2聯通，所述管道的另一端與 余下的一個池狀物10聯通，以及，依序分別裝設在所述管道內不同位置上的 串珠狀工作電極以及對電極8以及參比電極9，串珠狀工作電極由導電性電極 以及貼附在所述導電性電極上的包埋了梅毒特異性抗體的金膠敏感膜構成，所 述管道的構造呈并聯構造，該呈并聯構造的管道由四條分支管道并聯構成，該 四條分支管道分別是分支管道4以及分支管道7以及分支管道11以及分支管道14，以及，串珠狀工作電極的數量是四個，該四個串珠狀工作電極分別是串 珠狀工作電極5以及串珠狀工作電極6以及串珠狀工作電極12以及串珠狀工 作電極13，其中，串珠狀工作電極5是裝設在分支管道4內的其表層金膠敏感 膜結構中的特異性抗體物質為梅毒特異性抗體TP0684的串珠狀工作電極，串珠 狀工作電極6是裝設在分支管道7內的其表層金膠敏感膜結構中的特異性抗體 物質為梅毒特異性抗體TP0453的串珠狀工作電極，串珠狀工作電極12是裝設 在分支管道11內的其表層金膠敏感膜結構中的特異性抗體物質為梅毒特異性 抗體TP0821的串珠狀工作電極，串珠狀工作電極13是裝設在分支管道14內 的其表層金膠敏感膜結構中的特異性抗體物質為梅毒特異性抗體TP0319的串 珠狀工作電極。圖1中沒有繪出作為附件的微流動泵及多道電化學工作站等附 屬件。本例結構中的各池狀物可以根據需要與作為附件的微流動泵按任何方式 聯通。本例結構中的各串珠狀工作電極以及對電極以及參比電極可以分別經由 各自專用的電纜或曰串線分別與作為附件的多道電化學工作站的對應電纜接口 或曰串線接口聯接。似乎有必要在這里作一點額外的補充說明抗體與抗原是 彼此相關的但又不同的物質，它們之間的相互關系，通俗一點地比喻，就好比 是一套鎖具中的鎖與鑰的關系。
權利要求
1.結合準一維特異抗原修飾電極的多通道梅毒診斷專用器件，該器件是微流控芯片，該微流控芯片的結構包括貼合裝設在一起的兩片板狀物，所述兩片板狀物分別是微流控芯片的蓋片以及微流控芯片的基片，在所述兩片板狀物之間的相互貼合的位置上裝設有管道，以及，三個池狀物，管道的一端經由歧管狀流體通道分別與其中的兩個池狀物聯通，管道的另一端與余下的一個池狀物聯通，以及，依序分別裝設在所述管道內不同位置上的工作電極以及對電極以及參比電極，所述工作電極由導電性電極以及貼附在所述導電性電極上的包埋了梅毒特異性抗體的金膠敏感膜構成，其特征是，所述管道的構造呈并聯構造，所述呈并聯構造的管道由四條分支管道并聯構成，以及，所述工作電極的數量是四個，該四個工作電極的裝設位置分別位于所述四條分支管道內，以及，該四個工作電極其表層金膠敏感膜結構中的特異性抗體分別是對梅毒抗原能特異性結合的四種梅毒抗體物質，該四種抗體物質分別是梅毒特異性抗體TP0684、TP0453、TP0821及TP0319，以及，每一個工作電極其形貌均呈串珠狀。
2. 根據權利要求1所述的結合準一維特異抗原修飾電極的多通道梅毒診斷 專用器件，其特征在于，所述管道以及所述分支管道以及所述歧管狀流體通道 均為毛細管通道。
3. 根據權利要求1所述的結合準一維特異抗原修飾電極的多通道梅毒診斷 專用器件，其特征在于，所述形貌呈串珠狀的工作電極其材質是具有導電能力 的四氧化三鐵材質，以及，所述形貌呈串珠狀的工作電極是由許多的四氧化三 鐵材質的磁珠在外加磁場條件引導下相互拼接而成的準一維導電性電極。
4. 根據權利要求3所述的結合準一維特異抗原修飾電極的多通道梅毒診斷 專用器件，其特征在于，所述磁珠的直徑介于20納米至2000納米之間，以及，每一個所述工作電極的結構中所含有的相互拼接在一起的磁珠的個數在100個 至100000個之間。
5. 根據權利要求1所述的結合準一維特異抗原修飾電極的多通道梅毒診斷 專用器件，其特征在于，所述金膠敏感膜的厚度介于10納米與200納米之間。
6. 根據權利要求1所述的結合準一維特異抗原修飾電極的多通道梅毒診斷 專用器件，其特征在于，結構中的所述蓋片及基片其材質均為聚甲基丙烯酸甲 酯。
7. 根據權利要求1所述的結合準一維特異抗原修飾電極的多通道梅毒診斷 專用器件，其特征在于，結構中的所述蓋片及基片其寬度均介于2厘米與4厘 米之間，其長度均介于3厘米與6厘米之間。
8. 根據權利要求1所述的結合準一維特異抗原修飾電極的多通道梅毒診斷 專用器件，其特征在于，結構中的所述蓋片及基片其厚度均介于0.5毫米與5 毫米之間。
全文摘要
本發明涉及一種結合準一維特異抗原修飾電極的多通道梅毒診斷專用器件，該器件是微流控芯片，屬于分析測試領域。快速且廉價地診斷梅毒病患是相關診療技術進步的目標之一，本發明提供一種指向上述目標的診斷器件。本案要點是，該器件也即微流控芯片內含有呈并聯構造的管道，該并聯構造含有四條相互并聯的分支管道，共有四個串珠狀工作電極分別裝設在所述四條分支管道內，所述串珠狀工作電極由導電性電極以及貼附在所述導電性電極上的包埋了梅毒特異性抗體的金膠敏感膜構成，該四個串珠狀工作電極表層的各自的金膠敏感膜分別包埋了四種不同的梅毒特異性抗體物質，該四種抗體物質分別是梅毒特異性抗體TP0684、TP0453、TP0821及TP0319。
文檔編號G01N27/327GK101581724SQ200910151218
公開日2009年11月18日 申請日期2009年6月19日 優先權日2009年6月19日
發明者巫遠招, 寧 干, 李天華, 李榕生, 欣 楊, 峰 王, 王魯雁 申請人:寧波大學